NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
*********************************

VÕ THỊ THU OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ
ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM
Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN
CÔN TRÙNG GÂY HẠI
Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã số: 62. 62. 10. 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP. Hồ Chí Minh, năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
*********************************

VÕ THỊ THU OANH

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ
ĐỘC TÍNH CỦA CÁC MẪU PHÂN LẬP NẤM
Beauveria VÀ Metarhizium KÝ SINH TRÊN
CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật
Mã số : 62. 62. 10. 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học
1. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến
2. TS. Lê Đình Đôn

TP. Hồ Chí Minh, năm 2010


i

LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
PGS.TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn xây dựng các nội dung nghiên
cứu và phương pháp lý luận khoa học.
TS. Lê Đình Đôn đã luôn quan tâm hướng dẫn phương pháp thực hiện, gợi ý
cho thảo luận và đúc kết kết quả của luận án.
Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.
HCM đã tạo điều kiện thuận lợi và nguồn kinh phí trong quá trình thực hiện đề tài.
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, PGS.TS. Phạm Văn Hiền và tập thể cán bộ phòng
Sau Đại Học Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều
kiện để hoàn thành luận án này.
Phòng Sinh học phân tử Thực vật và Bảo vệ Thực vật - Viện Nghiên Cứu
CNSH và Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện và giúp
đỡ thực hiện thí nghiệm liên quan đến luận án.
Xin trân trọng cám ơn Ban chủ nhiệm Khoa Nông Học, Bộ môn Bảo vệ Thực
vật - Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi

nghiên cứu và thực hiện luận án này.
Các em sinh viên Khoa Nông Học, Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại
Học Nông Lâm TP.HCM cộng tác triển khai và thu thập kết quả thí nghiệm.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn bạn bè đồng nghiệp gần xa và gia đình đã động
viên khuyến khích, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Tác giả luận án

Võ Thị Thu Oanh


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi được thực hiện dưới sự
hướng dẫn của PGS.TS. Bùi Cách Tuyến và TS. Lê Đình Đôn tại Trường Đại Học
Nông Lâm TP.HCM. Số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực đã được công bố
trong các tạp chí, hội nghị khoa học bởi tác giả, nhóm tác giả, cộng tác viên và chưa
được ai công bố.

Tác giả luận án

Võ Thị Thu Oanh


iii

TÓM TẮT
VÕ THỊ THU OANH – “Nghiên cứu đặc tính sinh học và đánh giá độc tính của

các mẫu phân lập nấm Beauveria và Metarhizium ký sinh trên côn trùng gây hại”
Chuyên ngành: Bảo vệ Thực vật
Mã số: 62.62.10.01
Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, 2003 – 2007
Luận án nghiên cứu xác định tên loài từ chi nấm Beauveria và Metarhizium ký
sinh côn trùng bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học, và
kỹ thuật sinh học dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA. Nghiên cứu một số đặc điểm
sinh học, khả năng gây bệnh của các mẫu Beauveria và Metarhizium đến một số côn
trùng gây hại qua các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và đồng ruộng nhằm thiết lập cơ sở
dữ liệu cho các mẫu nấm bản địa, cung cấp những đặc điểm cơ bản để chọn mẫu nấm
có độc tính cao sử dụng trong phòng trừ dịch hại cây trồng.
Mười ba mẫu nấm Beauveria được phân lập và sử dụng trong nghiên cứu là loài
bassiana và 16 mẫu Metarhizium đều thuộc loài anisopliae. Trình tự vùng ITS-rDNA
của tất cả các mẫu phân lập đã được đăng ký và so sánh với dữ liệu cơ sở trên
GenBank cho thấy có ít nhất 3 nhóm di truyền của B. bassiana và 6 nhóm của M.
anisopliae hiện diện trong quần thể mỗi loài, và tách biệt với mẫu nấm của các quốc
gia khác. Sử dụng nested-PCR với các primer chuyên biệt trên vùng gen Pr1, gen liên
quan đến tính độc của nấm Metarhizium là phương pháp tuyển chọn nhanh mẫu nấm
Metarhizium gây bệnh cho côn trùng với độ tin cậy cao.
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học cho thấy nhiệt độ 25 - 280C thích hợp
cho sự phát triển của B. bassiana, của M. anisopliae là 28 - 300C. Trên môi trường dinh
dưỡng, cả hai nấm đều có số lượng bào tử hình thành đạt tối đa vào 14 ngày sau nuôi
cấy. Tuy nhiên, trong cùng điều kiện thí nghiệm, nấm M. anisopliae hình thành nhiều
bào tử, bào tử nảy mầm sớm và kháng nhiệt hơn B. bassiana. Môi trường SDAY+K rất
thích hợp cho nghiên cứu sinh học về nấm ký sinh côn trùng tương tự như môi trường
SB+KC, đã ghi nhận 8 mẫu B. bassiana và 9 mẫu M. anisopliae có thể phát triển được
ở 350C sau 24 giờ nuôi cấy.


iv

Hiệu quả phòng trừ côn trùng gây hại của các mẫu B. bassiana và M. anisopliae
bị ảnh hưởng khi dùng chung với các loại thuốc trừ nấm gốc mancozeb, zineb,
carbendazim, benomyl và không bị ảnh hưởng khi dùng với thuốc trừ sâu
thiamethoxam, triazophos, deltamethrin và azadirachtins ở nồng độ khuyến cáo. Thuốc
trừ nấm thí nghiệm đã hạn chế sự nảy mầm của bào tử và ngăn cản sự phát triển của sợi
nấm in vitro, ngay cả khi thuốc được sử dụng ở nồng độ thấp.
Cả hai nấm B. bassiana và M. anisopliae đều có hiệu lực diệt trừ rầy nâu và sâu
xanh da láng trong in vitro, nhà lưới và ngoài đồng ruộng khi sử dụng ở nồng độ 107 và
108 bào tử/ml. Đối với nấm B. bassiana, các mẫu Bb(RN-LA), Bb(RN-BTh) và
Bb(BXĐ-Q9) và các mẫu Ma(RN-LA), Ma(BXĐ-Q9), Ma(BXĐ-BT) của M.
anisopliae có khả năng ký sinh rất cao cho ấu trùng (85,5% - 91,8%) và thành trùng
(80,3% - 86,7%) của rầy nâu. Các mẫu nấm Bb(SXĐP-TN) và Bb(SXN-PT) ký sinh từ
74,7% - 78,0% sâu xanh da láng trên cây hành lá, nhưng Ma(SXH-BD) và Ma(SXĐPTN) có khả năng ký sinh tới 90,4% - 94,1% ở 10 ngày sau phun xử lý. Riêng các mẫu
B.b(RN-LA), B.b(RSM-Q2), B.b(RSM-BC) và Ma(RN-LA), Ma(RS-Q9) phân lập từ
nhiều vật chủ khác nhau nhưng ký sinh rất cao trên sâu xanh da láng cho thấy có sự
hiện diện các cá thể nấm trong tự nhiên với độc tính không chọn lọc loại ký chủ hoặc
phát triển tính thích nghi theo hướng phổ ký chủ rộng.
Sử dụng nấm B. bassiana Bb(RN-LA) và M. anisopliae Ma(RN-LA), Ma(SXHBD) đã khống chế được mật số rầy nâu ở mức thấp 945-1011 con/m2 ở 75 ngày sau sạ
(đối chứng là 2140con/m2) và 35-36 con/20 bụi hành đối với sâu xanh da láng (đối
chứng 204con/m2), năng suất thu được ở ruộng phun nấm tương đương hoặc cao hơn
ruộng phun thuốc trừ sâu của nông dân. Đặc biệt các mẫu nấm B. bassiana và M.
anisopliae thử nghiệm không tác động bất lợi cho nhện bắt mồi ăn thịt (Lycosa sp.) và
bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) trong hệ sinh thái ruộng lúa, khi so sánh với
thuốc hóa học Actara 25WG (thiamethoxam). Do vậy, bảo tồn và khai thác quần thể
nấm ký sinh côn trùng bản địa trên đồng ruộng nên được xem là ưu tiên hàng đầu cho
chương trình phòng trừ sinh học hiện nay.


v

SUMMARY
VO THI THU OANH - “Studies on biological characteristics and virulence of
Beauveria and Metarhizium isolates parasite on harmful insects”
Major: Plant Protection

Code: 62. 62. 10. 01

Nong Lam University Hochiminh City, 2003 - 2007
The thesis objectives were species identification of Beauveria and Metarhizium
isolates, the entomopathogenic fungi, by using a traditional method based on
morphological characteristics and a molecular method based on ITS-rDNA sequences;
biological characteristics and pathogenicity ability of isolates to harmful based on tests
in vitro, net house, and field condition. Results of the research were to establish
biological database of indigenous Beauveria and Metarhizium isolates and to provide
basic characters in order to select high virulent isolates using in plant pest control.
All of thirteen isolates of Beauveria and 16 isolates of Metarhizium were
identified as bassiana and anisopliae species, respectively. ITS-rDNA sequences of all
isolates were submitted into and comparion with ITS-rDNA database in GenBank.
Results indicated that there were three genetic groups of B. bassiana and six of M.
anisopliae presenting in population of each species, and distiguishing with isolates
from other countries. Using nested-PCR with specific primers on Pr1 gene, a gene
relating to pathogenesis, could be a good selective method of M. anisopliae isolates
parasiting on harmful insects with high confidence.
Results obtained from biological experiments showed that the optimum
temperature for development of B. bassiana isolates was 25 - 280C and 28 - 300C for
M. anisopliae. Beside that, the SDAY+K was a good medium for entomopathogenic
fungal researches, it is similar with SB+KC medium. In this condition, the spore
number was produced in maximun at 14 days after incubation. Interestingly, M.
anisopliae produced more spores, spore germinated quickly, and temperature tolerance

better than B. bassiana. There were eight isolates of B. bassiana and nine of M.
anisopliae to be able to grow in high temperature 35ºC after 24 hours on SDAY+K
cultures.


vi

Based on in vitro and field experiments, the insecticides as thiamethoxam,
triazophos, deltamethrin and azadirachtin used at recommendated doses were not
effective on survive and parasitism of M. anisopliae or B. bassiana isolates, while the
fungicides, mancozeb, zineb, carbendazim and benomyl were strong effective even at
low dose used. The fungicides effected negatively on spore germination and mycelium
growing.
Pathogenicity tests conducted in labs, a net house and a field condition on two
harmful insects, beet armyworm (Spodoptera exigua) and brown planthopper
(Nilaparvata lugens) resulted that isolates of B. bassiana and M. anisopliae were high
efficacy when used at 107 and 108 spores/ml. Isolates Bb(RN-BTh), Bb(RN-LA),
Bb(BXĐ-Q9), and Ma(RN-LA), Ma(BXĐ-Q9), Ma(BXĐ-BT) were high effective on
larva and adult of brown planthopper, with 85,5 - 91,8% larva killed and 80,3 - 86,7%
adult colonized. The control efficacy of Bb(SXĐP-TN), Bb(SXN-PT) isolates on beet
armyworm was from 74,7% to 78,0%, and that of Ma(SXH-BD) and Ma(SXĐP-TN)
was from 90,4% to 94,1%, after ten days sprayed. However, a few isolates as B.b(RNLA), B.b(RSM-Q2), B.b(RSM-BC) and Ma(RN-LA), Ma(RS-Q9) collected from other
host insects were also high virulence on beet armyworm, suggesting that there were
particular isolates with non-host specific virulence and towards to wide host spectrum.
Based on results, the using of B. bassiana Bb(RN-LA) and M. anisopliae
Ma(RN-LA) for controlling of beet armyworm and brown planthopper was high
efficacy to keep the pest density at low number as 945 – 1.011 brown planthoppers/m2
at 75 days after sowing, while control treatment (no insecticide used) was 2140
individuals and as 35 – 36 beet armyworms per 20 onion bushes while control
treatment was 284 individuals. The productivity on the fields treated with the isolates

was higher or similar with that on the fields treated with pesticides from farmers.
Results indicated that many isolates of M. anisopliae and B. bassiana were not
attacked on useful insects such as wolf spider (Lycosa sp.) and plant bug (Cyrtorhinus
lividipennis) in rice fields, while the pesticide Actara 25WG (thiamethoxam) did.
Therefore, preservation and exploitation of the native entomopathogenic fungi in the
field should be a priority way for biological control program recently.


vii

MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn .................................................................................................................. i
Lời cam đoan.............................................................................................................. ii
Tóm tắt ...................................................................................................................... iii
Summary .................................................................................................................... v
Mục lục .................................................................................................................... vii
Danh mục các chữ viết tắt.......................................................................................... xi
Danh mục các bảng .................................................................................................. xii
Danh mục các hình .................................................................................................. xiv
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................... 1
2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................................. 3
3. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ............................................................................... 4
4. Thời gian, đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................... 5
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 6
1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng ......................................................... 6
1.2 Triệu chứng côn trùng bị bệnh do vi nấm.............................................................. 7
1.3. Đặc điểm nhận biết nấm B. bassiana và M. anisopliae ........................................ 7
1.4. Độc tố và cơ chế tác động của nấm B. bassiana và M. anisopliae ..................... 12

1.4.1 Độc tố và cơ chế tác động của nấm B. bassiana. ...................................... 12
1.4.2 Độc tố và cơ chế tác động của nấm M. anisopliae .................................... 14
1.5. Sự phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng ..................................................... 17
1.6. Đặc điểm di truyền của nấm B. bassiana và M. anisopliae................................. 18
1.6.1. Vai trò vùng rDNA-ITS .......................................................................... 19
1.6.2. Sự khác biệt di truyền của nấm Beauveria .............................................. 19
1.6.3.Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về di truyền của B. bassiana ..... 23
1.6.4. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về di truyền của M. anisopliae .. 25
1.7. Đặc điểm sinh học của nấm B. bassiana và M. anisopliae ................................. 30
1.7.1. Điều kiện để nấm gây bệnh côn trùng phát triển ..................................... 30
1.7.2.Một số kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học của
B. bassiana và M. anisopliae .................................................................. 31
1.7.2.1 Một số kết quả nghiên cứu trong nước .......................................... 32
1.7.2.2. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới ....................................... 34


viii

1.8. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng gây bệnh
của B. bassiana và M. anisopliae đối với sâu hại cây trồng .............................. 40
1.8.1. Kết quả nghiên cứu trong nước ............................................................... 40
1.8.2. Kết quả nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 43
1.9. Chế phẩm sinh học từ nấm B. bassiana và M. anisopliae ................................... 47
1.9.1. Các chế phẩm sinh học từ B. bassiana và M. anisopliae trên thế giới...... 47
1.9.2. Các chế phẩm sinh học từ B. bassiana và M. anisopliae ở Việt Nam ...... 48
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 49
2.1 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 49
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 49
2.3 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 49
2.4 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 51

2.4.1 Phân lập và xác định loài nấm Beauveria và Metarhizium
theo phương pháp phân loại truyền thống ................................................ 51
2.4.2 Phân loại xác định loài, phân tích sự khác biệt di truyền của
nấm Beauveria và Metarhizium dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA........... 52
2.4.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm
B. bassiana và M. anisopliae ký sinh trên sâu hại cây trồng .................... 56
2.4.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm............................................... 56
2.4.3.2. Khả năng hình thành bào tử của nấm B. bassiana
và M. anisopliae........................................................................... 57
2.4.3.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử
của nấm B. bassiana và M. anisopliae .......................................... 58
2.4.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển
của nấm B. bassiana và M. anisopliae ......................................... 58
2.4.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử
của nấm B. bassiana và M. anisopliae ......................................... 59
2.4.3.6. Ảnh hưởng của ẩm độ đến sự hình thành và nảy mầm của
bào tử nấm B. bassiana và M. anisopliae ..................................... 59
2.4.3.7 Ảnh hưởng của một số hoạt chất trừ sâu, trừ nấm đến
sự phát triển và nảy mầm của B. bassiana và M. anisopliae ......... 60
2.4.4. Đánh giá độc tính của nấm B. bassiana và M. anisopliae trên
một số sâu hại hại cây trồng ........................................................ 60
2.4.4.1. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)
của nấm B. bassiana và M. anisopliae trong điều kiện in vitro .... 61


ix

2.4.4.2. Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N. lugens)
của nấm B. bassiana và M. anisopliae trong điều kiện nhà lưới ... 61
2.4.4.3. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)

của nấm B. bassiana và M. anisopliae trong điều kiện nhà lưới ... 61
2.4.4.4. Khả năng gây bệnh của nấm B. bassiana và M. anisopliae
trên một số sâu hại cây trồng trong nhà lưới và ngoài đồng........ 62
2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................. 68
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 69
3.1. Những kết quả nghiên cứu về nấm Beauveria ................................................ 69
3.1.1. Phân lập, định danh nấm Beauveria theo phương pháp
phân loại truyền thống............................................................................. 69
3.1.2. Phân loại và phân tích sự khác biệt di truyền của nấm B. bassiana
dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA ............................................................ 75
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm B. bassiana .................... 81
3.1.3.1. Xác định thời gian bào tử nảy mầm.............................................. 81
3.1.3.2. Khả năng hình thành bào tử của nấm B. bassiana ........................ 83
3.1.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử
của nấm B. bassiana .................................................................... 84
3.1.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển
của nấm B. bassiana .................................................................... 85
3.1.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử
của nấm B. bassiana .................................................................... 87
3.1.3.6. Ảnh hưởng của ẩm độ lên sự hình thành và nảy mầm
của nấm B. bassiana ................................................................... 92
3.1.3.7 Ảnh hưởng của một số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến
sự phát triển và nảy mầm của bào tử B. bassiana ......................... 93
3.1.4. Đánh giá độc tính của nấm B. bassiana trên một số sâu hại cây trồng ..... 97
3.1.4.1. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)
của nấm B. bassiana trong điều kiện in vitro ............................... 97
3.1.4.2. Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N. lugens)
của nấm B. bassiana trong điều kiện nhà lưới .............................. 98
3.1.4.3. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)
của nấm B. bassiana trong điều kiện nhà lưới .............................. 99

3.1.4.4. Khả năng gây bệnh của nấm B. bassiana trên
một số sâu hại cây trồng trong nhà lưới và ngoài đồng ............. 101


x

3.2. Những kết quả nghiên cứu về nấm Metarhizium .......................................... 110
3.2.1. Phân lập, định danh nấm Metarhizium theo phương pháp
phân loại truyền thống........................................................................... 110
3.2.2.. Phân loại và phân tích sự khác biệt di truyền của nấm M. anisopliae
dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA .......................................................... 117
3.2.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm M. anisopliae
ký sinh trên sâu hại cây trồng ............................................................... 126
3.2.3.1 Xác định thời gian bào tử nảy mầm............................................. 126
3.2.3.2 Khả năng hình thành bào tử của các MPL M. anisopliae ............. 128
3.2.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử
của nấm M. anisopliae ............................................................... 129
3.2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển
của nấm M. anisopliae .............................................................. 130
3.2.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và hình thành bào tử
của nấm M. anisopliae ............................................................... 133
3.2.3.6. Ảnh hưởng của ẩm độ lên sự hình thành và nảy mầm
của nấm M. anisopliae ............................................................... 137
3.2.3.7 Ảnh hưởng của một số thuốc trừ sâu, trừ nấm đến sự phát triển
và khả năng nảy mầm của nấm M. anisopliae ............................ 138
3.2.4. Đánh giá độc tính của nấm M. anisopliae trên sâu hại cây trồng ........... 143
3.2.4.1. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)
của nấm M. anisopliae trong điều kiện in vitro .......................... 143
3.2.4.2. Xác định nồng độ trừ rầy nâu (N. lugens)
của nấm M. anisopliae trong điều kiện nhà lưới......................... 144

3.2.4.3. Xác định nồng độ trừ sâu xanh da láng (S. exigua)
của nấm M. anisopliae trong điều kiện nhà lưới......................... 144
3.2.4.4. Khả năng gây bệnh của nấm M. anisopliae trên
một số sâu hại trong nhà lưới và đồng ruộng ............................ 146
3.3 THẢO LUẬN CHUNG .................................................................................. 158
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................... 164
1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 164
2. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 166
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ ............ 167
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................... 168


xi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AFLP: amplified fragment length polymorphism
B. bassiana: Beauveria bassiana
bp: base pair
BD: bọ dừa
BXĐ: bọ xít đen
CC: cào cào
Cca: câu cấu
cs: cộng sự
DUL - R: dulmage- Rhodes
ETS: external transcribed spacer
GNN: gián nâu nhỏ
IGS: Intergenic Spacer
ITS: Internal Transcriberd Spacer
M. anisopliae: Metarhizium anisopliae
MPL: mẫu phân lập

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
PCR: Polymerase Chain Reaction
PEG: Polyethylen Glycol
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
Pr1: Protease
rDNA: Ribosomal DNA
rRNA: Ribosomal RNA
RN: rầy nâu
RSM: rệp sáp mềm
RS: rệp sáp
SB + KC: sabouraud khoáng chất
SCG: sâu cắn gié
SCL: sâu cuốn lá
SDAY: sabouraud dextrose agar yeast extract
SK: sâu khoang
SSU-RNA: small subunit ribosomal RNA
ST: sâu tơ
SXĐP: sâu xanh đậu phọng
SXH: sâu xanh hành
SXC: sâu xanh cà
SXN: sâu xanh nho
LA: Long An; BTh: Bình Thuận; BT: Bến Tre; CC: Củ Chi; TN: Tây Ninh
Q.2: Quận 2; Q,9: Quận 9; TG: Tiền Giang; TV: Trà Vinh; KG:Kiên Giang


xii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.Các kỹ thuật phân tử được sử dụng để nghiên cứu di truyền

của nấm Beauveria ................................................................................... 20
Bảng 2.1. Số đăng ký và chiều dài trình tự (bp) vùng ITS-rDNA
của các mẫu B.bassiana trên thế giới dùng để so sánh. ............................. 55
Bảng 2.2. Số đăng ký và chiều dài trình tự (bp) vùng ITS-rDNA
của các mẫu M. anisopliae trên thế giới dùng để so sánh.......................... 56
Bảng 2.4. Các nghiệm thức phun nấm B. bassiana ở thí nghiệm đồng ruộng............ 64
Bảng 2.5. Các nghiệm thức phun nấm M. anisopliae ở thí nghiệm đồng ruộng ........ 65
Bảng 2.6. Các nghiệm thức phun nấm M. anisopliae ở thí nghiệm đồng ruộng ........ 66
Bảng 3.1 Các nguồn nấm B. bassiana phân lập được từ một số sâu hại
ở các tỉnh, thành phía Nam ....................................................................... 70
Bảng 3.2. Kích thước bào tử của các MPL B. bassiana ............................................ 74
Bảng 3.3 Chiều dài (bp) và số đăng ký trình tự trên GenBank của 13 MPL
B. bassiana nghiên cứu ............................................................................. 77
Bảng 3.4. Tỷ lệ nảy mầm (%) của các MPL B.bassiana ở thời gian khác nhau ......... 82
Bảng 3.5. Khả năng hình thành bào tử của các MPL B. bassiana
sau 10 ngày nuôi cấy ............................................................................... 83
Bảng 3.6. Sự hình thành bào tử của các MPL B. bassiana ở các
thời gian nuôi cấy khác nhau .................................................................. 84
Bảng 3.7 Sự phát triển của khuẩn lạc của các MPL B. bassiana
ở các mức nhiệt độ khác nhau ................................................................. 88
Bảng 3..8. Sự hình thành bào tử của các MPL B. bassiana ở nhiệt độ khác nhau ............89
Bảng 3.9. Tỷ lệ nảy mầm (%) của các MPL B. bassiana ở nhiệt độ cao .................. 90
Bảng 3.10. Sự hình thành và nảy mầm của bào tử B. bassiana ở các mức ẩm độ ...........91
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sự nảy mầm của B. bassiana ............. 93
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến sự nảy mầm của nấm B. bassiana .... 95
Bảng 3.13. Tỷ lệ sâu xanh da láng chết (%) khi phun nấm B. bassiana ................... 96
Bảng 3.14. Hiệu lực trừ rầy nâu của các MPL B. bassiana ...................................... 98
Bảng 3.15. Hiệu lực trừ sâu xanh da láng của các MPL B. bassiana ........................ 99
Bảng 3.16. Hiệu lực của B. bassiana kết hợp với thuốc trừ sâu
Actara 25WG đối với rầy nâu tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 ........... 104

Bảng 3.17. Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi
(Lycosa sp.) trên ruộng thí nghiệm tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 .. 105
Bảng 3.18. Các nguồn nấm M. anisopliae phân lập được từ


xiii

một số sâu hại cây trồng ở các tỉnh, thành phía Nam ............................ 110
Bảng 3.19. Kích thước bào tử của các MPL M. anisopliae .................................... 115
Bảng 3.20. Chiều dài (bp) và số đăng ký trình tự trên GenBank
của 16 MPL M. anisopliae nghiên cứu ................................................. 117
Bảng 3.21. Tỷ lệ bào tử nảy mầm (%) của các MPL M. anisopliae ở
các thời gian khác nhau ........................................................................ 126
Bảng 3.22. Khả năng hình thành bào tử của các MPL M. anisopliae
sau 10 ngày nuôi cấy ....................................................................................127
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử
của nấm M. anisopliae ........................................................................ 128
Bảng 3.24. Sự phát triển của khuẩn lạc nấm M. anisopliae ở các mức
nhiệt độ khác nhau ........................................................................................133
Bảng 3.25. Sự hình thành bào tử của nấm M. anisopliae ở các mức
nhiệt độ khác nhau .............................................................................. 134
Bảng 3.26. Khả năng nảy mầm của nấm M. anisopliae ở các mức nhiệt độ cao ..... 136
Bảng 3.27. Sự hình thành và nảy mầm của nấm M.anisopliae ở các mức
ẩm độ khác nhau .................................................................................. 137
Bảng 3.28. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu đến sự nảy mầm của nấm
M. anisopliae ở các nồng độ hoạt chất khác nhau ................................. 139
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm đến sự nảy mầm của
nấm M. anisopliae ở các nồng độ hoạt chất khác nhau ......................... 141
Bảng 3.30. Tỷ lệ sâu xanh da láng chết (%) sau khi phun nấm M. anisopliae
ở các nồng độ bào tử (bt/ml) khác nhau ............................................... 142

Bảng 3.31. Hiệu lực trừ rầy nâu của các MPL M. anisopliae ở các
nồng độ bào tử (bt/ml) khác nhau ......................................................... 144
Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu xanh da láng của các MPL M. anisopliae ở
các nồng độ bào tử (bt/ml) khác nhau .................................................. 145
Bảng 3.33. Hiệu lực của nấm M. anisopliae kết hợp với thuốc trừ sâu
Actara 25WG đối với rầy nâu tại Đức Hòa, Long An, năm 2005 .......... 150
Bảng 3.34. Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi
ăn thịt (Lycosa sp.) trên ruộng thí nghiệm tại Đức Hòa, Long An ......... 151
Bảng 3.35. Hiệu lực (%) của nấm M. anisopliae đối với sâu xanh da láng
tại Tân Hạnh, Đồng Nai, năm 2006 ..................................................... 152
Bảng 3.36. Kết quả sử dụng nấm M. anisopliae để trừ sâu xanh da láng
trên hành lá tại Tân Hạnh, Đồng Nai, năm 2006 .................................. 156
Bảng 3.37. Tỷ lệ (%) sâu xanh da láng bị nấm M. anisopliae ký sinh trên
ruộng hành sau thí nghiệm, Tân Hạnh - Đồng Nai, năm 2007 ............. 156


xiv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Triệu chứng sâu hại bị bệnh do nấm. .......................................................... 7
Hình 1.2. Beauveria bassiana (Bals.) Vuill ................................................................ 8
Hình 1.3. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. .............................................. 10
Hình 1.4. Metarhizium flavoviride W. Gam & Rozsypal .......................................... 10
Hình 1.5.Cấu trúc hóa học độc tố beauvericin của nấm B. bassiana ......................... 13
Hình 1.6. Cơ chế xâm nhiễm của nấm B. bassiana ................................................... 14
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học độc tố destruxin A, B của nấm M. anisopliae ................ 15
Hình 1.8. Cơ chế xâm nhiễm của nấm M. anisopliae. ................................................... 17
Hình 1.9. Sơ đồ vùng ITS - rDNA của nấm............................................................. 19
Hình 2.1 Sơ đồ vùng rDNA của nấm và các vị trí primer dùng khuếch đại

vùng rDNA –ITS ...............................................................................................53
Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nested-PCR ............................................................... 54
Hình 2.3. Nuôi cấy nấm trên môi trường SDAY +K để xác định số lượng bào tử .... 57
Hình 2.4. Máy vortex VELP ................................................................................... 58
Hình 2.5 Thí nghiệm xác định nồng độ bào tử đối với sâu xanh da láng
trong phòng thí nghiệm, năm 2005. ............................................................... 62
Hình 2.6 Thí nghiệm phun nấm trên rầy nâu hại lúa trong lồng lưới, năm 2005 ..... 62
Hình 2.7 Thí nghiệm phun nấm trên sâu xanh da láng hại hành lá
trong lồng lưới, năm 2005 ........................................................................ 62
Hình 2.8. Nhân sinh khối nấm trong môi trường dịch .............................................. 63
Hình 2.9. Thí nghiệm phun nấm trừ rầy nâu ngoài đồng .......................................... 63
Hình 3.1. Nấm B. bassiana. ký sinh trên một số sâu hại cây trồng ........................... 71
Hình 3.2. Nấm B. bassiana ký sinh trên một số sâu hại cây trồng ............................ 72
Hình 3.3. Khuẩn lạc của các MPL B. bassiana nuôi cấy trên môi trường PDA......... 73
Hình 3.4 Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. .............................................................. 73
Hình 3.5. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS- rDNA của 13 MPL
B. bassiana sử dụng 2 primer ITS5 và ITS4. ............................................ 76
Hình 3.6. Sơ đồ phân nhóm loài của 13 MPL B. bassiana nghiên cứu
với mẫu B. bassiana của thế giới dựa trên trình tự vùng ITS - rDNA. ...... 78
Hình 3.7. Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B. bassiana
dựa trên trình tự vùng ITS - rDNA. .......................................................... 79
Hình 3.8. Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B. bassiana
dựa trên trình tự vùng ITS1-rDNA ........................................................... 79


xv

Hình 3.9. Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 13 MPL B. bassiana
dựa trên trình tự vùng ITS2 - rDNA. ........................................................ 80
Hình 3.10. Khuẩn lạc nấm B. bassiana trên các môi trường dinh dưỡng

khác nhau ở 14 ngày sau cấy. ................................................................. 85
Hình 3.11. Tốc độ phát triển trung bình của các MPL B. bassiana trên các
môi trường dinh dưỡng khác nhau ........................................................ 86
Hình 3.12. Khả năng hình thành bào tử của các MPL B. bassiana trên các
môi trường dinh dưỡng khác nhau .......................................................... 87
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên sự phát triển của
nấm B. bassiana trong in vitro................................................................ 93
Hình 3.14. Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm lên sự phát triển của
nấm B. bassiana trong in vitro............................................................... 95
Hình 3.15. Hiệu lực trừ rầy nâu (%) của nấm B. bassiana
trong nhà lưới ..................................................................................... 102
Hình 3.16. Hiệu lực trừ sâu xanh da láng (%) của nấm B. bassiana
trong nhà lưới...................................................................................... 103
Hình 3.17. Kết quả phun nấm B. bassiana trừ rầy nâu trong
nhà lưới, năm 2005 ............................................................................. 103
Hình 3.18. Mật số rầy nâu trên ruộng thí nghiệm và ruộng nông dân
sau khi phun nấm B. bassiana. ............................................................. 107
Hình 3.19. Tỷ lệ rầy nâu (%) bị nhiễm nấm B. bassiana sau thí nghiệm
tại Đức Hòa, Long An vụ hè thu 2006 và đông xuân 2006-2007 .......... 108
Hình 3.20. Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi
ăn thịt (Lycosa sp.) .............................................................................. 108
Hình 3.21. Ảnh hưởng của việc phun nấm B. bassiana để trừ rầy nâu đến
năng suất lúa ........................................................................................ 109
Hình 3.22. Nấm M. anisopliae ký sinh trên một số sâu hại cây trồng .................... 112
Hình 3.23. Nấm M. anisopliae ký sinh trên một số sâu hại cây trồng ..................... 113
Hình 3.24. Khuẩn lạc của các MPL M. anisopliae nuôi cấy
trên môi trường PDA............................................................................ 114
Hình 3.25. Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok ............................................. 115
Hình 3.26. Sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA của các MPL
M. anisopliae, sử dụng hai primer ITS5 và ITS4 .................................. 117

Hình 3.27. Sơ đồ phân nhóm loài của 16 MPL M. anisopliae với các mẫu
M. anisopliae trên thế giới dựa trên trình tự vùng ITS – rDNA ............ 119
Hình 3.28 Sơ đồ phân nhóm quan hệ di truyền của 16 MPL M. anisopliae
dựa trên trình tự vùng ITS-rDNA. ......................................................... 121


xvi

Hình 3.29. Sơ đồ phân nhóm mối quan hệ di truyền của 16 MPL M. anisopliae
dựa trên trình tự vùng ITS1- rDNA. ..................................................... 122
Hình 3.30. Sản phẩm PCR khuếch đại gen Pr1 của các MPL M. anisopliae
với cặp primer METPR1/METPR4 ..................................................... 124
Hình 3.31. Sản phẩm PCR khuếch đại gen Pr1 của 10 MPL M. anisopliae
với cặp primer METPR2/METPR5 ...................................................... 124
Hình 3.32. Sơ đồ phân nhóm di truyền của 10 MPL M. anisopliae
dựa trên trình tự gen Pr1 ..................................................................... 125
Hình 3.33. Khuẩn lạc nấm M. anisopliae trên các môi trường dinh dưỡng
khác nhau ở 14 ngày sau nuôi cấy. ...................................................... 130
Hình 3.34 Tốc độ phát triển trung bình của các MPL M. anisopliae trên
các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau ........................................... 132
Hình 3.35. Khả năng hình thành bào tử của các MPL M. anisopiae trên
các loại môi trường dinh dưỡng khác nhau ở 14 ngày sau nuôi cấy ...... 132
Hình 3.36. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên sự phát triển của nấm M. anisopliae
trong in vitro ........................................................................................ 139
Hình 3.37.Ảnh hưởng của thuốc trừ nấm lên sự phát triển của nấm M. anisopliae
trong in vitro. ....................................................................................... 141
Hình 3.38. Nấm M. anisopliae ký sinh trên sâu xanh da láng trong
nhà lưới, năm 2005. ............................................................................. 148
Hình 3.39. Hiệu lực trừ rầy nâu (%) của nấm M. anisopliae
trong nhà lưới....................................................................................... 149

Hình 3.40. Hiệu lực trừ sâu xanh da láng (%) của nấm M. anisopliae
trong nhà lưới....................................................................................... 150
Hình 3.41. Mật số rầy nâu trên ruộng thí nghiệm và ruộng nông dân sau khi
phun nấm M. anisopliae. ...................................................................... 154
Hình 3.42. Tỷ lệ rầy nâu (%) bị nấm M. anisopliae ký sinh sau thí nghiệm
tại Đức Hòa, Long An, vụ hè thu 2006 và đông xuân 2006-2007 ........ 155
Hình 3.43. Mật số bọ xít mù xanh (Cyrtorhinus lividipennis) và nhện bắt mồi
ăn thịt (Lycosa sp.) .............................................................................. 155
Hình 3.44. Ảnh hưởng của việc phun nấm M. anisopliae đến năng suất ................ 156
Hình 3.45. Nấm M. anisopliae ký sinh trên rầy nâu và sâu xanh da láng. .............. 163
Hình 3.46. Kết quả phun nấm B. bassiana trừ rầy nâu hại lúa
tại Long An, năm 2006 – 2007 ............................................................. 163
Hình 3.47. Bọ xít mù xanh và nhện bắt mồi ăn thịt ............................................... 163


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, sự phát triển tính kháng của sâu hại đối với thuốc trừ
sâu hóa học, ảnh hưởng của thuốc hóa học đến sức khỏe con người, môi trường và
thiên địch tự nhiên của sâu hại đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển việc nghiên cứu và
sử dụng các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp IPM. Nghiên cứu sử dụng các
loại vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus và tuyến trùng để quản lý sâu hại cây trồng là
một trong những biện pháp sinh học lý tưởng với mục tiêu là hạn chế tác hại của thuốc
hóa học, bảo vệ môi trường sống, bảo vệ nguồn tài nguyên sinh vật có ích nhằm tạo ra
một nền nông nghiệp sạch và bền vững.
Trong các loại nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng, Beauveria bassiana và
Metarhizium anisopliae là hai loại nấm được quan tâm phát triển và ứng dụng nhiều do
có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết cho nhiều loại sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp,

đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trên thế giới như tác nhân phòng trừ
sinh học. Nấm Beauveria bassiana gây bệnh trên 700 loài côn trùng thuộc bộ cánh
cứng (Coleoptera), cánh nửa (Hemiptera), cánh đều (Homoptera), cánh bằng (Isoptera)
và sâu non bộ cánh vảy (Lepidoptera) [14], [29], [97], [134]. Metarhizium anisopliae
cũng đã được ghi nhận là gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng
(Coleoptera), cánh thẳng (Orthoptera) và bộ cánh nửa (Hemiptera) [29], [52], [144],
[188], [219]. Hai loại nấm này đang được sử dụng trong việc phòng trừ nhiều loại sâu
hại trên đồng ruộng như rầy hại lúa, sâu tơ, bọ cánh cứng hại khoai tây, bọ xít Blissus,
bọ phấn, bọ trĩ, nhện đỏ, sâu khoang, rầy xanh, rệp phấn, mối, bọ cánh cứng hại dừa,
cào cào và mọt hại kho ở nhiều quốc gia trên thế giới như Hà Lan, Phần Lan, Thụy
Điển, Philippines, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc, Úc, New Zealand, Braxin, Trung
Quốc và Ấn Độ [14], [15], [29], [96, [115], [183], [191], [193]. Hiện nay, nhiều nước
trên thế giới đã sản xuất thành công và thương mại hóa các chế phẩm sinh học từ nấm
B. bassiana như Ostrinil, Boverin, BotaniGard, Naturalis-L, Mycotrol GHA và từ M.


2

anisopliae như BioGreen, Metaquino, Bio-Blast, Cobican, Green Muscle, Bio-Path
[15], [137], [181].
Ở nước ta, hướng nghiên cứu sử dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ
sâu hại được đề cập đến từ những năm 70 của thế kỹ trước, nhưng trong khoảng 15
năm trở lại đây mới có nhiều công trình được công bố về lĩnh vực này. Viện Bảo Vệ
Thực Vật đã nghiên cứu sử nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae để
phòng trừ một số loài sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp với các chế phẩm Boverit,
Muskardin và Mat [20], [29], [32], [33], [168]. Chế phẩm Metavina sản xuất từ nấm
Metarhizium anisoplaie cho hiệu quả cao trong việc trừ các loại mối hại cây công
nghiệp, cây ăn trái và cây cảnh [34], [35], [37]. Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long
đã tuyển chọn được một số mẫu nấm có tiềm năng trừ sâu hại trên cây lúa, rau, màu và
cây ăn trái với hai chế phẩm đã được thương mại hóa là Biovip, Ometar và đang được

ứng dụng rộng rãi tại các tỉnh Vĩnh Long, Cần Thơ, Sóc Trăng, Trà Vinh ở qui mô hộ
nông dân [8], [10], [12], [13], [14], [15]. Kết quả của các mô hình thực hiện trên diện
rộng đã khẳng định cả hai nấm này đều không ảnh hưởng đến thiên địch của sâu hại, hệ
sinh thái, con người và môi trường. Vì vậy, B. bassiana và M. anisopliae không những
giữ vai trò quan trọng là tác nhân kiểm soát sinh học côn trùng gây hại, có tiềm năng
kinh tế, mà còn là giải pháp an toàn cho môi trường thay thế thuốc trừ sâu hóa học.
Tuy nhiên, các đặc tính sinh học, cấu trúc di truyền quần thể và cả định danh tới
loài cho các mẫu nấm hiện diện ở Việt Nam vẫn còn ít dữ liệu cơ sở và không nhiều
thông tin về di truyền phân tử. Hơn nữa, những biến đổi di truyền giữa các cá thể trong
một quần thể cũng cần thiết được nghiên cứu nhằm xác định những biến dị có ích và
kiểm soát quản lý sự phân hóa dịch chuyển các quần thể phụ mới phát sinh dưới tác
động của ký chủ và điều kiện tự nhiên. Gần đây, với sự phát triển của các kỹ thuật sinh
học phân tử đã giúp cho việc phân tích cấu trúc và sự biến động di truyền của các cá
thể trong quần thể nấm gây bệnh côn trùng nói chung và nấm B. bassiana, M.
anisopliae nói riêng. Bằng cách phân tích rDNA, sự khác biệt di truyền trong B.
bassiana và M. anisopliae, mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nấm trong cùng loài sẽ
được nhận biết một cách dễ dàng và rõ ràng hơn. Trình tự vùng ITS-rDNA đã được sử
dụng trong việc xác định, định danh loài nấm từ chi Beauveria và Metarhizium, hỗ trợ


3

cho việc định danh cấp loài và dưới loài, là cơ sở nền tảng để hiểu biết chi tiết hơn về
vùng phân bố địa lý và đa dạng sinh học, mối quan hệ giữa gen gây bệnh và quá trình
hình thành bệnh côn trùng. Điều quan trọng là phải sử dụng các loài nấm bản địa vì
việc du nhập các loài nấm ngoại lai sẽ tăng thêm khó khăn trong việc xác định hiệu lực
của các loài nấm phân bố ở Việt Nam, và nhất là các loài nấm du nhập này có tồn tại
lâu dài hay không, có tác động lên môi trường sinh thái và côn trùng có ích tại địa
phương hay không là vấn đề cần được xem xét đánh giá.
Hiện nay ở Việt Nam, chi nấm Beauveria chỉ có một loài là B. bassiana và chi

Meatrhizium có hai loài là M. anisopliae và M. flavoviride hiện diện trên đồng ruộng
và đã được các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ dịch hại cây trồng
[20]. Việc nghiên cứu xác định loài nấm dựa trên đặc điểm hình thái học sẽ khó phân
biệt, nhận biết được hết các loài khác nhau trong chi Beauveria và Metarhizium. Ngoài
ra, nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh đối với sâu hại, mối liên hệ giữa
nấm và côn trùng vật chủ cũng như quá trình hình thành bệnh côn trùng cho những
mẫu mới phát hiện còn ít dữ liệu hoặc chưa được nghiên cứu phân tích. Do vậy, sử
dụng các dữ liệu di truyền để định danh, xác định các loài của chi Beauveria và
Metarhizium hiện đang phân bố trên đồng ruộng, xác định những mẫu nấm có độc tính
cao là cần thiết, góp thêm cơ sở khoa học cho việc định danh đến loài nấm ký sinh côn
trùng dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử. Từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu
đặc tính sinh học và đánh giá độc tính của các mẫu phân lập nấm Beauveria và
Metarhizium ký sinh trên côn trùng gây hại” đã được thực hiện.
2. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Bên cạnh phương pháp phân loại truyền thống, các kỹ thuật sinh học phân tử đã
và đang được ứng dụng trong các nghiên cứu phân loại định danh các loài trong chi
nấm gây bệnh côn trùng Beauveria và Metarhizium. Trong đó, phân tích trình tự rDNA
trên vùng ITS-rDNA đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Phương pháp định danh
này còn ít hoặc chưa được thực hiện ở nước ta. Định danh các loài nấm trong chi
Beauveria và Metarhizium không những chỉ dựa vào đặc điểm hình thái học mà còn
kết hợp với dữ liệu trình tự của các đoạn DNA có tính bảo tồn cao hoặc chuyên biệt


4

cao. Định danh loài nấm dựa vào đặc điểm hình thái đòi hỏi phải có nhiều kinh
nghiệm và thời gian nên việc chọn vùng trình tự ITS – rDNA để định danh ở cấp độ
loài của nấm Beauveria và Metarhizium là hướng tiếp cận mới, góp thêm cơ sở khoa
học để phát triển phương pháp định danh nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam.
Kết quả luận án đã cung cấp nhiều dẫn liệu khoa học về sự khác biệt di truyền

của nấm B. bassiana và M. anisopliae phân bố ở phía Nam Việt Nam. Cấu trúc trình tự
vùng ITS-rDNA của 13 MPL B. bassiana và 16 MPL M. anisopliae đã được đăng ký
trên ngân hàng dữ liệu GenBank cung cấp dữ liệu cơ sở cho các nhà khoa học khai thác
sử dụng để nghiên cứu về cấu trúc quần thể, nguồn gốc phân bố địa lý của B. bassiana
và M. anisopliae. Kết quả cũng đã chứng minh quần thể nấm M. anisopliae có sự biến
động di truyền, đa dạng hơn so với B. bassiana và sự biến động di truyền chủ yếu xảy
ra trên vùng ITS1-rDNA của M. anisopliae và vùng ITS2-rDNA của B. bassiana.
Phương pháp nested-PCR trong nghiên cứu với qui trình thực hiện phù hợp có thể sử
dụng để sàng lọc, phát hiện nhanh những mẫu nấm M. anisopliae có độc tính gây bệnh
cao trong nghiên cứu ứng dụng.
Kết quả của đề tài cung cấp những thông tin cần thiết về đặc điểm sinh học của
nấm B. bassiana và M. anisopliae nhằm thiết lập các dữ liệu sinh học cho các mẫu nấm
bản địa. Kết quả nghiên cứu chi tiết, có hệ thống từ in vitro, nhà lưới, đồng ruộng về
hiệu lực của nấm B. bassiana và M. anisopliae, về tác động bất lợi của thuốc trừ nấm
đối với nấm ký sinh côn trùng đã góp thêm cơ sở khoa học để bổ sung thêm vào danh
sách các mẫu nấm gây bệnh côn trùng có độc tính cao hiện đang có ở nước ta.
Kết quả luận án là bằng chứng cho thấy các mẫu phân lập B. bassiana và M.
anisopliae trong nghiên cứu rất có hiệu quả trong phòng trừ sâu hại, an toàn đối với
thiên địch của sâu hại và môi trường, việc sử dụng trên diện rộng để kiểm soát sâu hại
là có cơ sở tin cậy.
3. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Nghiên cứu, định danh xác định các loài từ chi nấm Beauveria và Metarhizium
bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học, và kỹ thuật sinh


5

học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA, nhằm xác định số loài của chi
Beauveria và Metarhizium phân bố ở những vùng thu thập mẫu.
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng gây bệnh, các yếu tố ảnh hưởng

đến độc tính của các mẫu nấm Beauveria và Metarhizium đã định danh được loài nhằm
thiết lập cơ sở dữ liệu sinh học cho các mẫu nấm bản địa, cung cấp những thông tin cơ
bản cho việc chọn mẫu nấm có độc tính cao sử dụng trong nghiên cứu ứng dụng phòng
trừ dịch hại cây trồng.
4. THỜI GIAN, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
4.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 11 năm 2003 đến tháng 11 năm 2007
4.2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu Beauveria và Metarhizium ký sinh
gây bệnh trên một số ký chủ sâu hại.
4.3. Phạm vi nghiên cứu
Phân lập và định danh đến loài các mẫu nấm Beauveria và Metarhizium dựa trên
đặc điểm hình thái học và trình tự rDNA-ITS, phân tích sự khác biệt di truyền của các
mẫu phân lập đồng thời nghiên cứu đặc điểm sinh học cũng như đánh giá khả năng gây
bệnh trên một số sâu hại trong nhà lưới và đồng ruộng tại TP. Hồ Chí Minh, các tỉnh
Đồng Nai và Long An.


6

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU NẤM GÂY BỆNH CÔN TRÙNG
Từ năm 2700 trước công nguyên, nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìm hiểu về
hiện tượng ong bị bệnh chết hàng loạt, 200 năm sau các nhà khoa học đã chứng minh
được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bị chết là do nhiễm một số
loại vi nấm. Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên mô tả về nấm gây bệnh trên côn
trùng, mở ra hướng nghiên cứu về bệnh lý côn trùng. Đến thế kỷ 18 các nhà khoa học
đã chứng minh nấm gây bệnh côn trùng là loại vi sinh vật có khả năng lan truyền bệnh
từ vật chủ này sang vật chủ khác. Năm 1815, Agrostino Bassi nhà bệnh lý học đầu tiên

đã mô tả khá tỉ mỉ về bệnh nấm trắng muscardin (nấm bạch cương) trên tằm, có thể
phân biệt được mô của ký chủ với nấm ký sinh và đã đưa ra biện pháp ngăn ngừa. Đến
năm 1835 ông đã xác định được nấm trắng muscardin là nguyên nhân chính gây bệnh
cho tằm [29], [136]. Từ năm 1885 đến 1890, Louis Pasteur đã định danh được nấm
trắng gây bệnh trên tằm là Beauveria bassiana và những thí nghiệm nghiên cứu của
ông làm nền tảng cho việc nghiên cứu dùng nấm để trừ côn trùng hại cây trồng. Năm
1944, Steinhaus là nhà khoa học đầu tiên thành lập phòng thí nghiệm chuyên nghiên
cứu về bệnh lý côn trùng mở đường cho hướng nghiện cứu thực nghiệm về khả năng
lây nhiễm bệnh và khả năng ứng dụng để phòng trừ sâu hại ngoài đồng ruộng [3], [29],
[36], [136].
Metschnikoff (1845-1916) đã phát hiện và phân lập được Entomophthora
anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì (Anisopliae austrinia), qua 6 lần đổi
tên đến năm 1883, Sorokin N. đặt tên là Metarhizium anisopliae. Sau đó vài loài được
mô tả mới bởi Petch 1931, 1935, qua nhiều năm kiểm tra đến năm 1976, Tulloch đề
nghị tên gọi nấm M. anisopliae với hai dạng dưới loài là M. anisopliae var. anisopliae
Sorokin và M. anisopliae var. major (Johstom) qua phân lập từ một số mẫu côn trùng
thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và cánh bằng (Isoptera) [210]. Đến nay trên thế giới
đã mô tả được hơn 700 loài nấm gây bệnh côn trùng hầu hết thuộc nấm bất toàn


7

Deuteromycetes và Entomophthorales trong tổng số 100.000 loài nấm được biết [29],
[60], [74], [136].
1.2. TRIỆU CHỨNG CÔN TRÙNG BỊ BỆNH DO VI NẤM
Khi bị bệnh nấm, côn trùng ngừng vận động 2 – 3 ngày, màu sắc thân thay đổi,
ngay tại vị trí nấm phát triển, bên trong thân của sâu non xuất hiện những vệt đen,
không có hình thù nhất định. Cơ thể có màu hồng, vàng nhạt và trắng, thân hơi cứng,
màu sắc thay đổi phụ thuộc vào màu sắc của bào tử nấm gây bệnh. Kích thước cơ thể
bị ngắn lại hoặc bị khô đét do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn và

chết (hình 1.1). Hiện tượng này gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô là đặc trưng của
bệnh nấm và trải qua hai giai đoạn:
Hiện tượng chấn thương: các mô bị tổn thương do nấm gây ra, các lympho máu đọng
lại và mô tái sinh được tạo thành bên trên bề mặt phần thân côn trùng bị tổn thương.
Hiện tượng nhiễm trùng máu: do lympho chứa đầy sợi nấm, ở giai đoạn này xảy ra
hiện tượng thực bào do các tế bào bao vây nuốt một phần tiểu thể nhất định tạo thành
những hợp bào và các tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết [4], [14], [29].

Hình 1.1. Triệu chứng sâu hại bị bệnh do nấm. (V.T.T.Oanh, 2004)
1.3. ĐẶC ĐIỂM NHẬN BIẾT NẤM Beauveria bassiana VÀ Metarhizium
anisopliae KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG
Chi nấm Beauveria thuộc nấm bất toàn (Hypocreales:Clavicipitaceae) có khả
năng làm chết côn trùng do độc tố, thuộc dạng ký sinh không bắt buộc. Beauveria được
xem như là tác nhân sinh học kiểm soát côn trùng gây hại có hiệu quả bởi các đặc điểm
gây bệnh cho côn trùng: không độc với động vật máu nóng và có thể sản xuất ở qui mô
thương mại. Chi Beauveria có 4 loài được nghiên cứu nhiều đó là B. bassiana (Bals.)
Vuill.; B. brongniartii (Sacc.) Petch; B. album (Limber) Saccas và B. vermiconia
DeHoog [29]. Trong 4 loài trên, B. bassiana và B. brongniartii được xem là gây bệnh