Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hoá học của một số hợp chất Dibenzocyclooctadiên Lignan từ cây Na rừng (Kadsura Coccinea)

Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Trƣờng đại học sƣ phạm hà nội 2
Khoa Hóa học
*************

Phạm thị thu thủy

Nghiên cứu phân lập và
xác định cấu trúc hóa
học
của một số hợp chất
dibenzocyclooctadiene lignan
từ cây na rừng
(Kadsura coccinea)
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: hóa hữu cơ

Hà nội – 2009

Phạm Thị Thu Thủy

1

Lớp K31B – Khoa Hóa Học


Trƣờng đại học sƣ phạm hà nội 2
Khoa Hóa học

*************

Phạm thị thu thủy

Nghiên cứu phân lập và
xác định cấu trúc hóa
học
của một số hợp chất
dibenzocyclooctadiene lignan
từ cây na rừng
(Kadsura coccinea)
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: hóa hữu cơ

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
T.S Nguyễn văn bằng

Hà nội – 2009


Lời cảm ơn
Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại phòng xúc tác hữu cơ, Viện
Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo
– TS. Nguyễn Văn Bằng, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình, tận
tâm hướng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng kính trọng trước sự giúp đỡ tận
tình của thầy giáo – TS Phan Văn Kiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên
nhiên, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo trong bộ

môn Hóa hữu cơ, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ công nhân
viên phòng xúc tác hữu cơ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện thuận
lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Mặc dù bản thân em đã cố gắng nỗ lực rất nhiều trong quá trình thực hiện
khóa luận và được sự quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các
thầy cô giáo nhưng khoá luận vẫn còn nhiều hạn chế, thiếu sót. Vì vậy em kính
mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô giáo và các bạn
sinh viên quan tâm.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009
Sinh Viên

Phạm Thị Thu Thủy


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan các kết quả trong khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu
phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất
dibenzocyclooctadiene lignan từ cây Na rừng (kadsura Coccinea)” là của tôi
thực hiện, không sao chép của bất kỳ một đề tài nào đã công bố trước đây.


Mục lục
Trang
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục những chữ viết tắt
Danh mục các sơ đồ, hình và bảng biểu
Mở đầu

Chƣơng 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về cây Na rừng
1.1.1. Thực vật học
1.1.2. Bộ phận dùng
1.1.3. Phân bố
1.1.4. Những nghiên cứu sơ bộ về cây Na rừng
1.2. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
1.2.1. Chọn dung môi chiết
1.2.2. Quá trình chiết
1.3. Các phương pháp sắc ký
1.3.1. Sắc kí cột
1.3.2. Sắc kí lớp mỏng
1.4. Các phương pháp hóa lí xác định cấu trúc của các hợp
chất hữu cơ
1.4.1. Phổ hồng ngoại
1.4.2. Phổ khối lượng
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Chƣơng 2: Thực nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Mẫu thực vật
2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

1
3
3
3
4
4
4
5
5

7
8
9
10
11
11
12
13
16
16
16


2.2.1. Điểm nóng chảy
2.2.2. Độ quay cực
2.2.3. Phổ khối lượng
2.2.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
2.3. Dụng cụ và thiết bị
2.3.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
2.3.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc
2.4. Hóa chất
2.5. Phân lập các hợp chất
2.5.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.5.2. Quy trình phân lập các hợp chất
2.6. Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các hợp chất
2.6.1. Hợp chất 1 – Binakadsurin A.
2.6.2. Hợp chất 2 – Isovaleroylbinakadsurin A
Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận
3.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 Binakadsurin A.
3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2Isovaleroylbinakadsurin A

3.3. Tổng hợp các hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan đã
phân lập được từ cây Na rừng (Kadsura Coccinea)
Kết luận
Tài liệu tham khảo

16
16
16
16
17
17
17
18
18
18
19
23
23
24
25
25
32
40
41
42


Danh mục những chữ viết tắt

[ỏ]D

Độ quay cực ( Specific Optical Botation)

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

C-NMR

( Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
( Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)

2D-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều
Two – Pimensional NMR

CC

Sắc ký cột

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

DEPT

Distortionless Enhacement By Polarisation Trafer

MS

Phổ khối lượng (Mass Spectranetry)

EI-MS

Electron Ionization Mass Spectranetry

EIS – MS

Phổ khối lượng phun mù điện tử
Electron Spray Ionization Mass Spectranetry

FAB – MS

Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectranetry

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Connectivily

HMQC

Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

IR

Phổ hồng ngoại

Me

Nhóm metyl

NOESY

Nucler Overhauser Effect Spectroscopy

1

1

H- H

COSY

(HOMOCOSY)

1

1

H- H Chemical Shift Correlation Spectroscopy


Danh mục các sơ đồ, hình và bảng biểu

Trang
Hình 1.1

Cây Na rừng (Kadsura Coccinea)

3

Sơ đồ 2.5.a

Sơ đồ chiết xuất và phân lớp các hợp chất

19

Sơ đồ 2.5.b Sơ đồ tách phân đoạn cặn KC1 và tinh sạch hợp chất

20

1
Sơ đồ 2.5.c

Sơ đồ tinh chế hợp chất 2 từ phân đoạn KC1D

Hình 3.1.a

Phổ H-NMR của hợp chất 1

25

Hình 3.1.b

Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

26

Hình 3.1.c

Phổ C-NMR của hợp chất 1

27

Hình 3.1.d

Các phổ DEPT của hợp chất 1

28

Bảng 3.1

Kết quả phổ NMR của hợp chất 1

29

Hình 3.1.e

Phổ HMBC của hợp chất 1

30

Hình 3.1.f

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1

31

Hình 3.2.a

Phổ H-NMR của hợp chất 2

32

Hình 3.2.b

Cấu trúc hóa học của hợp chất 2

33

Hình 3.2.c

Phổ C-NMR của hợp chất 2

33

Hình 3.2.d

Các phổ DEPT của hợp chất 2

34

Bảng 3.2

Kết quả phổ NMR của hợp chất 2

35

Hình 3.2.e

Phổ HSQC của hợp chất 2

36

Hình 3.2.f

Phổ HMBC của hợp chất 2

37

Hình 3.2.g

Phổ NOESY của hợp chất 2

38

Hình 3.2.h

Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 2

39

1

13

1

13

22


Mở đầu
Các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên hay nguồn tài nguyên sinh học
ngày càng được con người quan tâm, sử dụng rộng rãi trong các ngành kinh tế
quốc dân bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ, không làm tổn hại đến môi sinh và đặc
biệt là nếu sử dụng hợp lý chúng ta có thể làm phong phú thêm về số lượng và
chất lượng để phục vụ con người. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, thuốc bảo vệ thực
vật, chất kích thích, điều hòa sinh trưởng động, thực vật và làm nguyên liệu cho
công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm.
Theo các tài liệu công bố hiện nay có khoảng 60 – 70% các loại thuốc chữa
bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn
gốc từ thiên nhiên [10].
Nước Việt Nam chúng ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa,
nóng ẩm, lượng mưa lớn, đó là điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của
các loài sinh vật. Do đó nước ta có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và
phong phú đặc biệt là tài nguyên rừng. Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong
phú vào loại bậc nhất trên thế giới với khoảng 12.000 loài, trong đó 4.000 loài
được nhân dân sử dụng làm thảo dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc
sống con người [1]. Đó là một nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá và là
tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở nước ta để
phục vụ con người trong đời sống lao động và sản xuất.

Cùng với bề dày hơn 4000 năm lịch sử, ngành Đông y của nước ta đã thu
được những thành tựu rực rỡ: nhiều phương thuốc từ cây cỏ, động vật được ứng
dụng hiệu quả và lưu truyền đến ngày nay. Cùng với sự phát triển của khoa học
công nghệ nói chung và y học nói riêng, y học cổ truyền cùng với y học hiện đại
đã và đang có những đóng góp to lớn, góp phần vào việc phòng, chữa bệnh và


làm tăng tuổi thọ cho con người. Vấn đề đặt ra hiện nay là làm như thế nào để
khai thác và sử dụng hợp lí nguồn tài nguyên thiên nhiên đem lại hiệu quả cho
xã hội.
Rễ cây Na rừng được sử dụng làm thuốc từ lâu đời, ngoài ra người ta còn
sử dụng các sản phẩm khác của nó vì cây có hoạt tính sinh học cao, chứa nhiều
thành phần hóa học và có nhiều tác dụng dược lý. Song chưa hề có tài liệu nào
công bố về thành phần hoá học của cây Na rừng một cách đầy đủ, chính xác.
Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và tác dụng dược lý của cây Na
rừng ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách
hiệu quả, hợp lý có ý nghĩa quan trọng đặc biệt đối với sự phát triển của nền y
học Việt Nam hiện đại dựa trên các phương thuốc cổ truyền. Xuất phát từ ý
nghĩa thực tiễn trên em chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phân lập và xác
định cấu trúc hóa học của một số hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan từ
cây na rừng (Kadsura Coccinea)”.
Nhiệm vụ của khóa luận
1. Phân lập một số hợp chất dibenzocyclooctadiene lignan từ cây na rừng.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các
phương pháp phổ.


CHƢƠNG 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về cây Na rừng [1], [2].
1.1.1. Thực vật học:

Cây Na rừng có tên trong dân gian là Dây xưn xe, Nắm cơm, Ngũ vị nam
và tên khoa học là Kadsura Coccinea (Tên khác là Kasura sinensis hace hay
Schizadra hanceana baill), thuộc họ ngũ vị - Schisandraceae. Cây Na rừng là loại
cây dây leo to có nhánh mọc trườn, mảnh, phủ lớp lông tuyết màu sậm rồi về sau
có lỗ bì hình dải. Lá bầu dục hay thuôn, dạng góc ở gốc, thon hẹp, tù dài 610cm, rộng 3-4cm nhạt màu ở dưới, rất nhhẵn. Hoa đơn tính ở nách lá dài
15mm, rộng 10mm, màu tía. Quả giống như một nắm cơm (nên được gọi là cây
Nắm cơm) hay giống một quả Na to. Hoa Na rừng có vào tháng 5-6, quả có vào
tháng 8-9.

Hình 1.1 Cây Na rừng (Kadsura Coccinea)


1.1.2. Bộ phận dùng:
Chủ yếu là rễ - Radix Kadsura Coccinea, ngoài ra người ta còn dùng quả.
Thu hái rễ quanh năm, rửa sạch, phơi khô dùng dần.
1.1.3. Phân bố:
Theo Petelot cây Na rừng có mọc ở vùng núi cao Lào Cai (Sa Pa), Hà Tây
(Ba Vì), Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Di Linh,
Bảo Lộc tỉnh Lâm Đồng. Cũng phân bố ở Trung Quốc, Lào…
1.1.4. Những nghiên cứu sơ bộ về cây Na rừng:
Trong cây Na rừng có chất nhầy trong thân và quả. Trong quả còn có
pectin, glucoza, tinh dầu, axit hữu cơ, protit và chất béo.
a) Tinh vị, tác dụng:
Rễ có vị cay ấm, hơi đắng, có hương thơm; có tác dụng hành khí chỉ
thống, hoạt huyết, tán ứ, khư phong tiêu thũng.
b) Tác dụng dƣợc lý:
Quả Na rừng ăn được, quả rang lên làm thuốc an thần gây ngủ.
Rễ dùng để trị các bệnh sau:
- Viêm ruột mãn tính; Viêm dạ dày, ruột cấp tính; Viêm loét dạ dày và
thành tá tràng.

- Phong thấp đau xương, đòn ngã ứ đau.
- Đau bụng trước khi hành kinh, sản hậu ứ đau sưng vú.
Liều dùng: 15 – 30 gam rễ khô, sắc nước uống.
Dân gian cũng thường dùng vỏ thân, vỏ rễ làm thuốc bổ kích thích tiêu
hóa, giảm đau. Ngày dùng 8 – 16 gam sắc nước hoặc ngâm rượu uống.
Cây Na rừng với thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cao góp phần
tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm những phương
thuốc mới, cũng như hiểu rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của cây thuốc cổ truyền
dân tộc mà cha ông ta đã từng sử dụng.


1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [4], [5].
Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có
trong mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực vừa phải,…)
mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau
1.2.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không chỉ
dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỷ lệ nhất định để tạo ra hệ
thống dung môi mới. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít được quan
tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận. Nó
cần hòa tan những chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ,
có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc
cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi
sử dụng, nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất
lượng của quá trình chiết. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như
các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylnirat và tributylphotphat. Những chất này
có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo
quản như trong các thùng chứa bằng nhựa hoặc các nút nhựa.
Metanol và clorofooc thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat

hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong
các quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử
nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Clorofoc, metylen clorua
và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ
một phần của cây (như lá, thân, rễ, củ, hoa, quả…)
Những tạp chất của clorofooc như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất như ankaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương


tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit clohidric (HCl) cũng có thể gây ra
sự phân hủy, sự khử nước hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác. Bởi vì
clorofooc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần được thao tác khéo
léo, cẩn thận ở nơi thông thoáng và phải đeo bảo hộ lao động. Metylen clorua ít
độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofooc.
Metanol và các etnaol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm
tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết các dung môi này sẽ thu được lượng
lớn các thành phần trong tế bào.
Trái lại, clorofooc khả năng phân cực tốt thấp hơn, có thể rửa giải các chất
nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực
cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng ancol
thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi ancol trong
nước dường như có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
metanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes lacciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng các quá trình
metyl hóa khi đun nóng với metanol chứa một ít axit, quá trình phân hủy 1hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được chiết
trong metanol nóng.
Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của metanol.

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ
bay hơi, dễ bộc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peoxit dễ nổ,
peroxit của dietylete dễ gây phản ứng oxi hóa với những hợp chất không có khả
năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo
thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết


dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tác đặc
trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo ra những sản
phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về các đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây
được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình
chiết tránh được sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất
mong muốn.Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
0

không quá 30 – 40 C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ
cao hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết các quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet.
- Chiết sắc với dung môi nước
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rỗng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian.
Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để tạo tốc độ
chảy cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh. Trước
kia các máy chiết ngâm đòi hỏi phải bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng
bình thủy tinh.

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24
giờ và sau đó chất chiết được lấy ra. Cần lưu ý sau một quá trình chiết 3 lần
dung môi, cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc
quá trình quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Bởi vì khi
chiết các ankaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra khỏi


bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân
Dragendorff và tác nhân Mayer. Cũng vậy, các flavoloid thường là những hợp
chất màu và bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu là rửa hết
những chất này trong quá trình chiết. khi chiết các chất béo, nồng độ trong các
phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc
quá trình chiết. Trong trường hợp các lacton của secquitecpen và các glicozid trợ
tim, phản ứng kedde có thể được sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng
hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các
hydratcacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy tùy thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi
cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài
ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta
có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.3. Các phƣơng pháp sắc ký [3].
Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903. Năm 1903
nhà bác học người Nga Txvet đã dùng cột nhôm ôxit để tách các picmem của lá
cây thành các chất riêng biệt. Ông đã giải thích hiện tượng này bằng ái lực hấp
phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký
(chromatography). Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và
các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
Sắc ký bao gồm có pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay phổ biến

sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như: silicagel,
YMC, ODS, Al2O3,…) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký lỏng)
hay chất khí (sắc ký khí). Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các dung môi
hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung môi phân cực
hơn, và ngược lại chất ít phân cực hơn sẽ tan tốt hơn trong dung môi kém phân


cực hơn. Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng dần độ phân
cực của dung môi như sau: ete dầu hỏa, xiclohexan, cacbontetraclorua, xylen,
toluen, benzen, clorofom, metylen clorua, axeton, dioxan, etylaxetat, piridin,
propanol, metanol, axit axetic.
Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự
khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ phân cực của
dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước. Tùy thuộc vào cách tiến hành sắc ký
mà người ta chia thành các phương pháp sắc ký chủ yếu như sau:
1.3.1 Sắc ký cột (CC)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao
gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo YMC,
ODS, dianion, …Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột thủy tinh hay cột
bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp
phụ hết sức quan trọng , nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay khả năng tách của chất
hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả
năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng
trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được),
khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp suất cao
(HPLC).
Trong sắc kí cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất quan
trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách,
tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc kí, tỷ lệ giữa quãng đường đi

của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf, với mỗi một chất
sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách
từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan
trọng và tuỳ thuộc vào yêu cầu tách. Nếu tách thô thì tỉ lệ này thấp (từ 1/5 – 1/10),
còn nếu tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và


tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau về Rf của các chất), mà hệ số
này trong khoảng 1/20-1/30.
Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào
lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương
pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến là tẩm chất vào
silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh, thì đưa trực tiếp
chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Cách 1: Nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp
phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi
cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi
chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ
lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt
khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không
được nứt, gẫy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá
thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.3.2. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel
trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất
trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel dày
hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc kí, người ta


có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung
môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản
mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc
sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.4. Các phƣơng pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ
[3], [9].
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương
pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử
dụng phương pháp phổ cụ thể nào. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp
các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác
cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ
xung khác như chuyển hoá hoá học, kết hợp với các phương pháp sắc kí so
sánh…
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các
liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu
liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Chính vì vậy, việc
phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ bản trên
phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là nhóm chức)
và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động hoá trị của
-1

nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300-3450 cm , của nhóm
-1

cacbonyl C=O trong khoảng 1700-1750 cm , của nhóm ete C-O-C trong vùng
-1

-1

1020-1100 cm , của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm , của nhóm N-H
-1

-1

trong khoảng 3400-3500 cm , v.v… Đặc biệt vùng dưới 700 cm được gọi là
vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp
so sánh trực tiếp. Hiện nay thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không
nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (nghiền và ép


viên với KBr bằng máy ép thủy lực dưới áp suất thấp khoảng 13-15 atm) lại cần
từ 2-3 mg và khó thu hồi lại. Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất
thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn
chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
1.4.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện ba
nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion phân tử
và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi ghi lại tín hiệu theo tỷ số khối
lượng trên điện tích (m/ze) của chúng. Bởi vì e là điện tích của một electron,
được lấy là 1, nên các ion có z >1 là rất nhỏ, do đó tỷ số m/ze thường chính là
khối lượng của ion. Vì thế phổ thu được có tên là phổ khối khối lượng viết tắt là
phổ MS (Mass Spectroscopy)
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học

của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa
vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài.
Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người
ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học các
hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, những phương pháp chủ
yếu được nêu ra dưới đây:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự
phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ
biến là 70eV.
+ Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ
phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn pha thấp hơn
nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các
píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.


+ Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá
nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ
thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),
cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay ngưòi ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp
với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí -khối phổ), LC-MS (sắc kí lỏng-khối
phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành
phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu
nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ
nói riêng và hợp chất thiên nhiên nói chung. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ
thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định

chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon)
1

13

là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( H và C) dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển
dịch hoá học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác
định dựa vào tương tác spin-spin giữa các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).
1

a) Phổ H-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton: Proton Magnetic
Resonance Spectroscopy)
1

Trong phổ H-NMR, độ chuyển dịch hoá học (ọ) của các proton được xác
định trong thang ppm từ 0-14ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử
cũng như đặc trưng riêng của từng phần. Dựa vào những đặc trưng của độ


chuyển dịch hoá học và tương tác spin mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá
học của hợp chất.
13

b) Phổ C-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13: Cacbon-13
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng
hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ
13

C-NMR là ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến

230ppm).
c) Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer).
Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ
DEPT
, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm về
O

O

một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135 . Trên phổ DEPT 90 chỉ
xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
d) Phổ 2D-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều Two – Pimensional
NMR)
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các
hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ yếu thường
được sử dụng như sau:
+ Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence):
Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ
này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương
tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
1

1

1

1

+Phổ H- H COSY (HOMOCOSY) ( H- H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy):
Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H- H, chủ yếu là các proton đính
với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép
lại với nhau.


+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity):
Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử. Nhờ vào các
tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được
xác định về cấu trúc.
+ Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy):
Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton
không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không
gian. Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử.
Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE differences
để xác định cấu trúc không gian của phân tử. Bằng việc đưa vào một xung đúng
bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía
về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và
cho tín hiệu với cường độ mạnh hơn.
Ngày nay người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hai chiều rất hiện đại
khác ví dụ như kỹ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định (decouplng), ví dụ
như trên phổ proton, xóa tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác
định được vị trí của các proton bên cạnh,…
Ngoài ra, còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu
trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể.
Phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là phải có đơn
tinh thể. Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ.
Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người còn sử dụng

kết hợp với các chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích so
sánh kết hợp khác. Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu
phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch,
cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác
các loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương


pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS hoặc GCMS với các đường chuẩn dự kiến.


CHƢƠNG 2:
Thực nghiệm và phƣơng pháp nghiên
cứu
2.1. Mẫu thực vật
Cây Na rừng được thu hái năm 2008 tại Sa Pa (Lào Cai), mẫu cây đã được
giám định tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
2.2.1.

Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.2.

Độ quay cực [ỏ] D

Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của
Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
2.2.3.

Phổ khối lượng (FAB-MS và ESI)

Phổ khối lượng FAB-MS được đo trên máy JEOL JMS-DX 300
spectrometer của Viện nghiên cứu Khoa học cơ bản Hàn Quốc (KBSI). Phổ khối
lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass) được đo trên máy
AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
2.2.4.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)