Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (panax sp ) phân bố tự nhiên tại lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
__________________

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG
DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ
TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

ĐÀ LẠT, 2017
A


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
__________________

LÊ NGỌC TRIỆU

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN
TẠI LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62.42.02.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN VĂN KẾT
GS.TSKH. TRẦN DUY QUÝ

ĐÀ LẠT, 2017
B


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở
bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017
Tác giả luận án

Lê Ngọc Triệu

i


LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận án, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Nguyễn Văn Kết, GS.TSKH. Trần Duy Quý, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng
dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi có thể tôi hoàn thành luận án.

Xin đƣợc trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện
Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Đà
Lạt đã truyền đạt các kiến thức, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh
hoạt chuyên môn và thực hiện luận án.
Để có đƣợc các kết quả nghiên cứu trong luận án này, tôi xin chân thành cám
ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và đặc biệt là TS. Trần Văn Tiến
đã tạo điều kiện cho tôi tham gia, thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá
đa dạng di truyền chi sâm (Panax L.) ở Việt Nam”. Xin đƣợc tri ân đến Lãnh đạo Viện
Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng nhƣ các anh em, bạn bè đồng nghiệp gần
xa,…..đã chia sẻ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án.
Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ tôi, ngƣời đã sinh
thành, nuôi dƣỡng tôi nên ngƣời và vợ tôi đã luôn động viên và chia sẻ để tôi phấn đấu
hoàn thành luận án này.

Lê Ngọc Triệu

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ...................................................................................................................... i
Lời cám ơn ......................................................................................................................... ii
Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... vi
Danh mục bảng ................................................................................................................ vii
Danh mục hình.................................................................................................................. ix
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................. 1
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................................ 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................... 2

4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ................................................................. 3
5. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................. 4
Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 5
1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống ..................................................................... 5
1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh
chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ................. 7
1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ............................................................................... 7
1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái ..................................................... 7
1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử ........................................................... 8
1.2.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và
quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật ................................................................. 10
1.2.2.1. Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại .......................... 11
1.2.2.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân
tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật .......................................................... 11
1.2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể ............................................ 14
1.3. Vị trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae ...................................... 16
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................................. 16
1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................................ 22
1.4. Quan hê ̣ phát sinh chi Panax L. dƣ̣a trên hê ̣ thố ng ho ̣c mƣ́c đô ̣ phân tƣ̉ ................. 23
1.4.1. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong
chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA .......................................................... 25
1.4.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới............................................................................... 25
1.4.1.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 26
iii


1.4.2. Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ .............................. 27
1.4.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 27
1.4.2.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 32
1.4.3. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong

chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ ............................ 33
1.5. Các nghiên cứu đánh giá đa da ̣ng di truyề n quần thể ở chi Panax .......................... 34
1.6. Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax .................................................... 39
1.7. Nhận xét chung ......................................................................................................... 41
Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 33
2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................... 44
2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của
sâm Lang Bian và các taxon Panax khác ............................................................... 44
2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian .................... 46
2.1.3. Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian ............... 46
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 47
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 47
2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu ............................................................................................ 47
2.3.1.1. Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ và
nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại ................................................................ 50
2.3.1.2. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể ......................... 50
2.3.1.3. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin .......................... 51
2.3.2. Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân loại
sâm Lang Bian ........................................................................................................ 51
2.3.3. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA trong các mẫu ........... 52
2.3.4. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo
thủ .......................................................................................................................... 52
2.3.4.1. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ ................................................. 52
2.3.4.2. Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ
cao ........................................................................................................................... 55
2.3.5. Phân tích đa dạng và biến động di truyền trong quần thể dựa trên DNA
fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR................................................................. 55
2.3.5.1. Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DN A fingerprint .............................. 56
2.3.5.2. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu
nhận đƣợc ................................................................................................................ 57

2.3.6. Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin ....................................................... 59
iv


Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 61
3.1. Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số
loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ .............. 61
3.1.1. Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái ............ 61
3.1.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa
trên các trình tự bảo thủ .......................................................................................... 66
3.1.2.1. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi
dựa trên vùng gene matK ........................................................................................ 66
3.1.2.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi
dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 .................................................. 75
3.1.2.3. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi
khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA .......................................................... 84
3.1.2.4. Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các vùng
trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK .................... 90
3.1.3. Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại với
các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái ........................... 102
3.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian.......................................... 104
3.2.1. Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa
dạng di truyền quần thể ......................................................................................... 104
3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD ................................................ 110
3.2.3. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR ................................................ 116
3.2.4. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu .......................... 122
3.3. Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm
Lang Bian và một số taxon cùng chi khác ............................................................ 129
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 132
1. Kết luận...................................................................................................................... 132

2. Kiến nghị ................................................................................................................... 132
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 134
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 135
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC
TAXON ĐƢỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON
KHẢO SÁT
PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR
v


AFLP:

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Amplified Fragment Length Polymorphism

CAPS:

Cleaved Amplified Polymorphic Sequence

DDBJ:
DR:

DNA Data Bank of Janan
Đam Rông

G-Rb1:

Ginsenoside Rb1

G-Rd:

Ginsenoside Rd

G-Re:

Ginsenoside Re

G-Rg1:

Ginsenoside Rg1

He:

expected heterozygosity

ISSR:

Inter Simple Sequence Repeats

ITS:

Internal transcribed spacer

IUCN:

International Union for Conservation of Nature

LD:

Lạc Dƣơng

M-R2:

Majonoside R2

NCBI:
N-R1:

National Centre for Biotechnology Information
Notoginsenosid R1

PPB:
PS:

percentage of polymorphic bands
Panax stipuleanatus (lá chét nguyên)

PSDL:

Panax stipuleanatus (lá chét xẻ)

PV:

Panax vietnamensis

PVF:

Panax vietnamensis var. fuscidiscus

PVL:

Panax vietnamensis var. langbianensis

RAPD:

Random Amplified Polymorphic

RFLP:

Restriction Fragment Length Polymorphism

rRNA:

ribosomal RNA

SCAR:

Sequence Characterized Amplified Region

SNP:

Single Nucleotide Polymorphism

SSR:

Simple sequence Repeat - Microsatellites

VNTR:

Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites
vi


DANH MỤC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

1.1.

Đặc điểm hình thái tƣơng đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax ......... 18

1.2.

Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu
hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975 ......................................................... 19

1.3.

Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu
hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 ......................................................... 20

1.4.

Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981) ........................................................... 21

2.1.

Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh chủng
loại ........................................................................................................................ 44

2.2.

Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một
phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên
cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại ..................................................... 45

2.3.

Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ
Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ....... 45

3.1.

So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P.
vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 62

3.2.

Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các
taxon đƣợc khảo sát .............................................................................................. 68

3.3.

Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên
cứu so với các taxon khác cùng chi ...................................................................... 69

3.4.

Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một
phần vùng gene matK ........................................................................................... 70

3.5.

Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp., P. vietnamensis và P.
vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 72

3.6.

So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax
vietnamensis từ các nguồn khác nhau................................................................... 77

3.7.

Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo
sát .......................................................................................................................... 78

3.8.

Những vị trí khác biệt ở trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 của đối tƣợng
nghiên cứu so với các taxon cùng chi ................................................................... 79

3.9.

Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dự trên trình tự vùng ITS1–
5,8SrRNA–ITS2 ................................................................................................... 81

3.10. Sai khác giữa sâm Lang Bian với Panax vietnamensis và P. vietnamensis
var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 ............................ 84
vii


3.11. Phành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự vùng 18S rRNA ở các taxon
đƣợc khảo sát ........................................................................................................ 86
3.12. Các vị trí khác biệt giữa các taxon Panax khảo sát dựa trên trình tự vùng
gene 18S rRNA ..................................................................................................... 87
3.13. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dựa trên trình tự 18S rRNA ...... 88
3.14. Đặc điểm thành phần và số lƣợng nucleotide của các trình tự phối hợp ở các
taxon khảo sát ....................................................................................................... 94
3.15. Khoảng cách di truyền giữa các taxon Panax đƣợc khảo sát dựa trên sự phối
hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một
phần gene matK .................................................................................................... 95
3.16. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể LD ................... 105
3.17. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể DR ................... 106
3.18. Đặc điểm các mồi ISSR đƣợc chọn lọc và sử dụng để làm nảy sinh DNA
fingerprint làm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền ............................................... 107
3.19. Tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể và các
nhóm tuổi trong quần thể .................................................................................... 109
3.20. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể
LD ....................................................................................................................... 111
3.21. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể
LD ....................................................................................................................... 112
3.22. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở
quần thể LD ........................................................................................................ 113
3.23. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể
DR ....................................................................................................................... 117

3.24. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể
DR ....................................................................................................................... 118
3.25. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở
quần thể DR ........................................................................................................ 119
3.26a. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần
thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR............................................................ 123
3.26b. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần
thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR ............................................................ 124
3.27. Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát............................... 130

viii


DANH MỤC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

1.1. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và cộng
sự (1996) ................................................................................................................. 28
1.2. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phối hợp trình tự gene trnK và
gene 18S rRNA theo Komatsu và cộng sự (2003) ................................................. 32
2.1. Bản đồ địa hình điều tra thu thập mẫu đối với sâm Lang Bian ............................... 48
2.2. Bản đồ không ảnh tổng thể khu vực phân bố sâm Lang Bian ................................. 49
3.1. So sánh hình thái giữa sâm Lang Bian, Panax vietnamensis và Panax
vietnamensis var. fuscidiscus .................................................................................. 63
3.2. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian ..................................... 64
3.3. Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian............................................. 65

3.4. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự một phần gene matK ............................ 66
3.5. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 71
3.6. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 71
3.7. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 5
chuẩn ngoại ............................................................................................................. 73
3.8. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 5 chuẩn
ngoại........................................................................................................................ 73
3.9. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 8
chuẩn ngoại ............................................................................................................. 74
3.10 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 8 chuẩn
ngoại........................................................................................................................ 75
3.11 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 ................... 76
3.12. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2
giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ............. 82
3.13 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa
các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining............................ 82
3.14. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Yang và cộng
sự (2001) ................................................................................................................. 83
ix


3.15 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 18S rRNA............................................. 85
3.16 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 89

3.17. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 89
3.18. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S
rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 96
3.19. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S
rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các
taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 97
3.20. A. Mẫu tiêu bản Panax bipinnatifidus; B. Mẫu Lectotype của P.
bipinnatifidus; C. Mẫu P. stipuleanatus ở Lai Châu, Việt Nam ; D. Mẫu P.
bipinnatifidus ở Lai Châu, Việt Nam...................................................................... 99
3.21. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng
gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa
các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ................... 100
3.22. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng
gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa
các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining.......................... 101
3.23. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S
rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon
thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum parsimony ................................... 101
3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 844A ở quần thể LD .................... 107
3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD ............... 108
3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 814 ở quần thể DR ....................... 108
3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR ................... 108
3.28. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể LD ............ 115
3.29. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR ............ 121
3.30. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên
cứu......................................................................................................................... 126
3.31. Sơ đồ dạng cây vềquan hệ di truyền các cá thể thuộc hai nhóm lá chét nguyên
và lá chét xẻ loài P. stipuleanatus theo Trieu và cộng sự (2016) ......................... 127

3.32. Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon đƣợc khảo sát và các chất
chuẩn ..................................................................................................................... 129

x


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chi sâm (Panax L.) thuộc ho ̣ Araliaceae là một chi thực vật làm thuốc quan trọng
và kinh điển trong Đông dƣợc cũng nhƣ trong y học hiện đại. Panax ginseng là một
trong số các loài thuộc chi sâm đã góp phần đƣa Hàn Quốc trở nên nổi tiếng khắp thế
giới về dƣợc liệu . Hiê ̣n nay trên thế giới đã phát hiê ̣n đƣơ ̣c nhiề u loài sâm nhƣ : Panax
ginseng C.A.Mey., P. japonicus (T.Nees) Mey., P. quinquefolius L., P. notoginseng
(Burkill) F.H.Chen, P. zingiberensis C.Y.Wu & Feng, P. vietnamensis Ha et Grushv.,
P. pseudoginseng Wall., P. stipuleanatus Tsai & Feng, P. trifolius L.…, phân bố ở
Đông Á, vùng Himalaya, Indochina và Bắ c Mỹ . Do có giá trị làm thuốc cao nên nhiều
loài sâm đã bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt trong tự nhiên. Các quốc gia trên thế
giới có phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi này nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung
Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và hạn chế khai thác tự
nhiên để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này.
Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên nhiều phƣơng diện về các loài thuộc chi Panax
đã đƣợc tiế n hành tƣ̀ khá lâu , đă ̣c biê ̣t là loài P. vietnamensis vốn là đă ̣c hƣ̃u của Viê ̣t
Nam và đế n nay đã trở thành cây thuốc trọng điểm quốc gia và đã đƣợc đầu tƣ nhiều
tiền của, công sức để bảo tồn, phát triển. Kết quả từ các nghiên cứu gần nhất về thành
phần loài và phân loại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 loài: P.
vietnamensis Ha và Grushv., P. bipinnatifidus Seem., P. stipuleanatus Tsai & Feng và
một thứ là P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai là các taxon
có phân bố tự nhiên và đang trong tình trạng nguy cấp theo tiêu chuẩn IUCN.
Loài đầu tiên đƣợc Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970 ở miền Nam Việt Nam là
Panax schingseng Nees var. japonicum Mak.. Theo tác giả, loài này mọc dƣới tán rừng

râ ̣m lá rô ̣ng, thƣờng xanh, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng. Trong các công
trình xuất bản sau đó về thành phần loài thực vật Việt Nam, tác giả này vẫn luôn ghi
nhận về sự tồn tại của taxon này nhƣng dƣới tên khoa học khác là P. japonica (Nees)
Mayer. Tuy vậy, trong những tài liệu gần nhất về thành phần loài chi Panax ở Việt
Nam, taxon do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận có phân bố ở vùng Lạc Dƣơng, Lâm Đồng
không đƣợc nhắc đến, thay vào đó, một số tài liệu ghi nhận có sự phân bố tự nhiên của
P. vietnamensis tại đây.
Trong quá triǹ h điề u tra khảo sát khu hê ̣ thƣ̣c vâ ̣t ta ̣i vùng núi Lang Bian, huyện
Lạc Dƣơng, tỉnh Lâm Đồ ng vào tháng 10 năm 2010, nơi mà Phạm Hoàng Hộ đã ghi
nhận có sự phân bố của một taxon Panax từ năm 1970, chúng tôi đã phát hiê ̣n mô ̣t
1


quầ n thể sâm nhỏ thuô ̣c chi Panax mọc tự nhiên. Qua nghiên cứu về hình thái thân rễ,
lá, hoa, quả ban đầ u cho thấ y các cá thể thuô ̣c quầ n thể có sự khác biệt về cấu trúc cơ
quan dinh dƣỡng và sinh sản so với các taxon thuộc chi Panax khác.
Do mới đƣợc tái phát hiện và rất thiếu các dữ liệu khoa học liên quan đến taxon
này, trƣớc mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử và sơ bộ về thành
phần saponin để xác định rõ vị trí phân loại trong hệ thống phát sinh chi Panax và
bƣớc đầu tìm hiểu khả năng làm thuốc của taxon này. Bên cạnh đó, do khu phân bố
của quần thể sâm mới tái phát hiện rất hẹp, số lƣợng cá thể ít nên cần thông tin về tính
đa dạng và biến động di truyền làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển.
Để có thêm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c phân loa ̣i , khẳ ng đinh
̣ nguồ n tài nguyên quý
hiế m vừa phát hi ện nói trên của Viê ̣t Nam đố i với thế giới cũng nhƣ bảo tồ n và phát
triể n chúng phu ̣c vu ̣ cho công tác nghiên cứu và sử dụng về sau , đề tài “Nghiên cứu
phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên
tại Lâm Đồng” đƣợc tiến hành.
2. Mục tiêu của đề tài
Đề tài đƣợc tiến hành hƣớng tới mục tiêu làm sáng tỏ các vấn đề:

- Quần thể sâm mới đƣợc phát hiện có các đặc điểm khác biệt về di truyền so với
các taxon khác hay không?, quan hệ phát sinh chủng loại của nó đối với các taxon
cùng chi khác thế nào?;
- Tính đa dạng và biến động di truyền trong quần thể của đối tƣợng này ra sao?;
- Taxon mới phát hiện này có chứa các saponin chính nhƣ một số taxon thuộc chi
Panax hay không? và dựa trên các dƣợc chất này, có sự khác biệt giữa taxon khảo sát
so với các taxon cùng chi khác không?.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả đề tài minh chứng cho sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax,
họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng vốn đã gây nhiều tranh luận do một
thời gian dài không tìm thấy mẫu vật, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên
thế giới về phía Nam.
Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật,
Sách đỏ Việt Nam một taxon mới, đặc hữu và góp phần làm rõ về thành phần loài của
chi Panax ở Việt Nam. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA bảo thủ cho các giống/loài,
đăng ký ở ngân hàng gene thế giới là việc làm cần thiết để khẳng định chủ quyền quốc
2


gia về tài nguyên thực vật, đặc biệt là đối với nguồn tài nguyên đặc hữu, quý hiếm mới
phát hiện lại nói trên.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đánh giá đa dạng và biến động di truyền trong quần thể thực vật cho
phép nhận thức rõ hơn về tình trạng các quần thể cũng nhƣ tổng thể taxon Panax phân
bố tự nhiên tại Lâm Đồng, tạo cơ sở cho việc đề xuất phƣơng án bảo tồn và phát triển
trong tƣơng lai. Bên cạnh đó, các dữ liệu sơ bộ về thành phần saponin là cơ sở ban đầu
cho việc xem xét giá trị làm thuốc taxon này.
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Trong nghiên cứu vị trí phân loại của taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm
Đồng, đối tƣợng nghiên cứu là bản thân taxon thực vật này (Panax sp., đƣợc gọi là
sâm Lang Bian), các taxon Panax khác phân bố tại Việt Nam và trên thế giới.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, đối tƣợng nghiên cứu là tập hợp
các cá thể thuộc hai quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng.
Trong nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian, đối
tƣợng nghiên cứu là thân rễ và rễ củ của các taxon thuộc chi Panax có phân bố tại Việt
Nam.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi chuyên môn:
Với hai nội dung chính của đề tài là nghiên cứu vị trí phân loại và đa dạng di
truyền quần thể, sơ bộ phân tích hoạt chất đối với sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu
chuyên môn của luận án là: (1) Xác định vị trí phân loại dựa phƣơng pháp phân loại
thực vật kinh điển dựa trên hình thái giải phẫu; (2) Xác định vị trí phân loại và quan hệ
phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu trình tự DNA bảo thủ trong nhân và lạp thể; (3)
Đánh giá đa dạng di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh thông qua kỹ
thuật ISSR và (4) Sơ bộ phân tích hoạt chất của sâm Lang Bian dựa trên phƣơng pháp
phân tích hóa học kinh điển.
Địa điểm nghiên cứu:
Nghiên cứu điều tra, phân loại và thu thập mẫu thực địa đƣợc tiến hành ở các
vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam, tập trung vào khu vực phát
hiện quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng và các khu vực lân cận.
3


Nghiên cứu về phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sinh học phân tử
cũng nhƣ đa dạng di truyền quần thể đƣợc thực hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học
phân tử của Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp, trƣờng Đại học
Đà Lạt.
Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân loại thực vật truyền thống và sơ bộ về

thành phần saponin đƣợc thực hiện chủ yếu tại Bảo tàng thực vật Trƣờng Đại học Đà
Lạt (DLU), Bảo tàng thực vật (VTN) và Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên. Việc so sánh mẫu vật cũng đƣợc tiến hành tại
một số bảo tàng, phòng lƣu trữ tiêu bản thực vật trong và ngoài nƣớc.
Thời gian nghiên cứu:
Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ năm 2012 đến năm 2016.
5. Những đóng góp mới của luận án
Chứng minh sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại
vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới
về phía Nam.
Tạo cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, danh lục cây
thuốc và Sách đỏ Việt Nam một taxon mới đặc hữu. Góp phần làm rõ về thành phần
loài của chi Panax ở Việt Nam.
Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA cho một chủng loại sâm mới, đăng ký ở ngân hàng
gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên này.
Xây dựng cơ sở khoa học cho việc hình thành chiến lƣợc bảo tồn nguồn tài
nguyên thực vật đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố,
nghiên cứu đa dạng và biến động di truyền trong quần thể.

4


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống
Sâm (Ginseng) đƣợc hiểu là bất kỳ loài nào trong số các loài cây thảo lƣu niên
có củ nạc sinh trƣởng chậm thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Các loài sâm đƣợc đặc
trƣng bởi khả năng làm thuốc nhờ có chứa các loại ginsenoside. Ginsenoside hay còn
gọi là panaxoside có bản chất là steroid glycoside và triterpene saponin vốn có nhiều
hoạt tính sinh học và giá trị làm thuốc cao.
Lịch sử sử dụng sâm bắt đầu từ 4.500 năm trƣớc và tài liệu ghi nhận về sâm
sớm nhất đƣợc biết đã có từ 2.000 năm trƣớc. Về giá trị kinh tế, các loại sâm là những

nguồn cây thuốc có giá trị kinh tế rất cao đối với nhân loại, đƣợc mua bán tại trên 35
quốc gia với kim ngạch đạt đến 2,1 tỷ USD vào năm 2013 và khoảng một nửa trong số
đó là từ Hàn Quốc. Trong nhiều năm lịch sử, Triều Tiên – Hàn Quốc là các quốc gia
cung cấp lớn nhất và Trung quốc là quốc gia tiêu thụ sâm lớn nhất thế giới (Baeg và
So, 2013).
Giá trị của các loại sâm rất khác nhau tùy vào loài, xuất xứ, độ tuổi, có nguồn
gốc trồng hay từ tự nhiên. Theo ghi nhận thực tế của chúng tôi trong quá trình điều tra,
trong khi giá bán của P. vietnamensis 15-30 triệu đồng/kg tại Kon Tum thì giá bán của
P. vietnamensis var. fuscidiscus là 4-6 triệu đồng/kg; của P. stipuleanatus là 3-5 triệu
đồng/kg và của P. bipinnatifidus là 2-4 triệu đồng/kg tại Lai Châu. Trong khi giá bán
tại Hàn Quốc của P. ginseng (Nhân sâm đỏ) trồng là 250 USD/kg thì giá 1 củ sâm tự
nhiên cùng loại là 2.000 – 20.000USD/kg tùy vào tuổi.
Chính vì có giá trị kinh tế cao mà nhiều loài thuộc chi Panax đã đƣợc trồng
dƣới nhiều hình thức: mô hình vƣờn rừng (Li và cộng sự, 2011; Artyukova và cộng sự,
2004), trồng thuần thâm canh cũng nhƣ đƣợc sản xuất in vitro công nghiệp (Nguyen
Trung Thanh và cộng sự, 2014; Grażyna và cộng sự, 2013). Những hoạt động này đã
hình thành nên nghề trồng sâm hay các nhà máy sản xuất lớn, tạo việc làm cho nhiều
ngƣời (Proctor và cộng sự, 2011).
Do có giá trị làm thuốc và giá trị kinh tế lớn mà những quốc gia trên thế giới có
sự phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi Panax nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung
Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và khai thác đôi khi đến
mức nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này (Bai và cộng sự, 1997;
Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus và Leopold, 2013). Ở nƣớc ta đã có nhiều chƣơng
5


trình, dự án nghiên cứu triển khai để bảo tồn, phát triển tập trung vào đối tƣợng đƣợc
xem là đặc hữu của Việt Nam là P. vietnamensis. Hiện nay, Trung tâm Sâm và Dƣợc
liệu thành phố Hồ Chí Minh đƣợc xem là một trong những đơn vị đƣợc đầu tƣ để
nghiên cứu và phát triển Sâm Ngọc Linh. Gần đây nhất là việc xây dựng Trung tâm

quốc gia nghiên cứu phát triển Sâm Ngọc Linh, là hạng mục đầu tiên của Dự án đầu tƣ
“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống, canh tác, mở rộng sản xuất,
xây dựng và phát triển thƣơng hiệu quốc gia cho Sâm Ngọc Linh”, đƣợc thực hiện trên
cơ sở thỏa thuận hợp tác giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Ủy ban nhân dân tỉnh
Kon Tum và giao cho Cục Phát triển thị trƣờng và Doanh nghiệp - Bộ Khoa học và
công nghệ chủ trì thực hiện ().
Do có giá trị cao mà nhiều loài Nhân sâm bị làm giả, có thể bằng các loài khác
cùng chi Panax hay thậm chí những loài có quan hệ phát sinh chủng loại rất xa. Ví dụ,
Mirabilis jalapa L. và Phytolacca acinosa Roxb. là hai loài thƣờng đƣợc dùng làm giả
cho P. ginseng, P. notoginseng, P. japonicus, P. trifolius và P. mayor (Ngan và cộng
sự, 1999); Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) bị làm giả bởi Sâm Lai Châu (Panax
vietnamensis var. fuscidiscus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm Vũ diệp (P.
stipuleanatus lá xẻ, từng đƣợc xem là P. bipinnatifidus) để bán tại các vùng Kon Tum,
Quảng Nam, Lâm Đồng.
Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tƣợng có giá trị dƣợc dụng cao
và đƣợc xem là thần dƣợc cuộc sống bởi khả năng chống các bệnh kinh niên, chống
oxy hóa của chúng (Lee và cộng sự, 2016), do vậy đã có hàng loạt các công trình
nghiên cứu trên thế giới và cũng nhƣ ở Việt Nam đƣợc tiến hành nhằm thúc đẩy sản
xuất, khai thác, sử dụng hiệu quả. Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa
dƣợc và dƣợc lý, tiếp đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống
học thực vật, đa dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gene… và kết quả là có một số
lƣợng lớn các công trình đƣợc công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông
tin trên các phƣơng tiện đại chúng liên quan đến sâm. Nói cách khác, các loại sâm là
đối tƣợng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những ngƣời làm công tác nghiên
cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới. Những công trình nghiên cứu về sâm vẫn
đang đƣợc triển khai cho dù những phát hiện đột phá về mặt thành phần loài gần đây
không nhiều.

6

1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan
hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở
thực vật
1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật
Cơ sở nền tảng của việc phân loại, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại các
taxon và đánh giá đa dạng di truyền ở sinh vật chính là nghiên cứu sự giống hay khác
nhau giữa chúng, sự khác nhau đó có thể nhận biết bằng hình thái hay thông qua các
phƣơng pháp sinh học phân tử. Tùy vào các mục đích và hoàn cảnh nghiên cứu cụ thể
mà sự tƣơng đồng hay khác nhau của sinh vật đƣợc xem xét ở những mức độ khác
nhau về số lƣợng cá thể khảo sát, đặc điểm hình thái ghi nhận hay phƣơng pháp làm
nảy sinh DNA fingerprint bao gồm cả các DNA barcode (Duminil và Michele, 2009).
1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật đƣợc sử dụng từ rất sớm. Nguyên
tắc cơ bản của phƣơng pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm
chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần nhau. Bất cứ sự khác nhau
nào giữa hai cá thể đều đƣợc nghiên cứu, nhƣng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có
thể dùng làm đặc điểm phân loại. Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm,
liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng
để phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan
đến cơ chế cách ly sinh sản đƣợc dùng để xác định các taxon bậc thấp. Các nhà
nghiên cứu thƣờng kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả
so sánh (Pellegrino và cộng sự, 2005).
Mặc dù phƣơng pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ƣu điểm là tiện lợi,
nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các
loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng, nhƣng việc lựa chọn
và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu
khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo
của các nhà phân loại học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này nhiều khi không chính
xác vì có hiện tƣợng đồng quy tính trạng và không phân biệt đƣợc các loài đồng

hình (Krishnan và cộng sự, 2011). Mặt khác, bởi hình thái chính là kết quả của biểu
hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình
thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có
mức độ thƣờng biến cao. Hơn nữa, các đặc điểm hình thái có nhiều điểm hạn chế nhƣ:
các biến đổi hình thái không phát hiện đƣợc ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc
7


điểm hình thái nói chung thƣờng giới hạn trong một hay một vài locus trong toàn bộ
bộ gene; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát đƣợc vào cuối chu kỳ sống;
nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các
sinh vật đƣợc khảo sát gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền
của quần thể (Duminil và Michele, 2009).
1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử
Chỉ thị (Marker) phân tử đã có những đóng góp lớn vào lĩnh vực nghiên cứu sự
đa dạng quần thể thông qua các kỹ thuật làm nảy sinh các DNA fingerprint và phát
hiện những biến động di truyền giữa các cá thể, quần thể và loài. Trƣớc đây, khi sinh
học phân tử và kỹ thuật di truyền chƣa phát triển, thì chỉ thị hình thái thƣờng đƣợc sử
dụng để nghiên cứu sự đa dạng này.
Trong những thập kỷ qua, việc sử dụng các marker phân tử để phản ánh các đa
hình ở mức độ DNA đã đóng vai trò ngày càng quan trọng trong công nghệ sinh học
thực vật và đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu di truyền. Có thể chia marker phân tử thành
hai loại chính: marker sinh hóa và marker phân tử dựa trên cơ sở DNA. Những marker
phân tử dựa trên cơ sở DNA có thể phân biệt thành 2 kiểu, thứ nhất là các marker
không dựa trên cơ sở PCR (RFLP) và thứ hai là kiểu marker dựa trên cơ sở PCR
(RAPD, AFLP, SSR, ISSR SNP …).. Việc phát triển các kiểu marker mới và đặc
trƣng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong tìm hiểu về biến động bộ gene cũng nhƣ
tính đa dạng di truyền ở các thực vật cùng hay khác loài (Kumar và cộng sự, 2009).
Các kiểu khác nhau của marker phân tử đƣợc sử dụng để đánh giá đa hình DNA
đƣợc phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở

phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR). Những marker phân tử thƣờng đƣợc sử dụng bao
gồm: RFLP, RAPD, AFLP, VNTR, SSR, ISSR, CAPS, SCAR, SNP, Kỹ thuật giải
trình tự DNA (Weising và cộng sự, 2005).
Giới thiệu về kỹ thuật ISSR
ISSR là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 100-3000 bp nằm giữa các
microsatellite cận kề và ngƣợc hƣớng nhau. Kỹ thuật này do Zietkiewicz và cộng sự
báo cáo năm 1994. Các mồi dựa trên trình tự microsatellte đƣợc sử dụng để khuếch đại
các trình tự DNA nằm giữa các SSR. ISSR đƣợc khuếch đại bằng PCR sử dụng trình
tự lõi microsatellite với vai trò là các mồi cùng với một số nucleotide chọn lọc với vai
trò là các neo giữ vào các vùng không lặp cận kề (16-18bp). Khi sử dụng kỹ thuật
ISSR, khoảng 10-60 các đoạn DNA từ nhiều locus đƣợc hình thành đồng thời, tách
8


nhau ra thông qua điện di trên gel và đƣợc ghi nhận nhƣ là sự hiện diện hay vắng mặt
của các đoạn có kích thƣớc đặc trƣng.
Ƣu điểm chính là không cần có dữ liệu trình tự dùng cho việc xây dựng mồi.
Bởi tiến trình phân tích bao gồm việc sử dụng PCR, chỉ một lƣợng ít khuôn mẫu DNA
đƣợc yêu cầu (khoảng 5-50ng cho một phản ứng). Hơn thế, ISSR phân bố ngẫu nhiên
trên toàn bộ bộ gene. Phần lớn ISSR là các marker trội, cho dù thỉnh thoảng chúng thể
hiện tính chất nhƣ marker đồng trội. Nhƣợc điểm: bởi ISSR là kỹ thuật đa locus, các
hạn chế của nó có thể là sự di chuyển đồng thời của các đoạn DNA không đồng nhất
có cùng kích thƣớc.
Ứng dụng: do DNA fingerprint đa locus nhận đƣợc, phân tích ISSR có thể đƣợc
ứng dụng để nghiên cứu trong xác định về di truyền, quan hệ bố mẹ, nhân dòng và
nhận dạng dòng, nghiên cứu về hệ thống phân loại học ở mức độ các loài gần nhau.
Thêm vào đó, ISSR đƣợc xem nhƣ hữu dụng trong việc nghiên cứu lập bản đồ gene
(Godwin và cộng sự, 1997), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể (Li và
cộng sự, 2011; Reunova và cộng sự, 2010).
Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing)

Quá trình xác định thứ tự các base nucleotide dọc theo mạch DNA đƣợc gọi là
việc xác định trình tự (sequencing). Giải trình tự đƣợc ứng dụng rộng rãi trong dự
đoán chức năng gene, nhân dòng phân tử hay các mối liên hệ tiến hoá, đa dạng sinh
học và công nghệ sinh học nói chung. Trong lĩnh vực phân loại dựa trên phân tử,
nghiên cứu phát sinh các taxon… thì chỉ cần phân tích xác định và so sánh trình tự một
vài gene chỉ thị (marker) hoặc DNA barcode giữa các loài cần khảo sát mà không cần
thiết phải xác định trình tự toàn bộ bộ gene.
Phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay trong việc giải trình tự
hiện nay đó là giải trình tự bằng máy tự động. Cơ sở của những phƣơng pháp này vẫn
sử dụng các dideoxynucleotide, việc đánh dấu phóng xạ đƣợc thay bằng đánh dấu
huỳnh quang trên các ddNTP, và kết quả đƣợc ghi nhận thông qua một hệ thống máy
tính. Trình tự sau khi đƣợc xác định bằng hệ thống máy tự động chƣa thể sử dụng ngay
cho việc phân tích. Việc đọc base tự động do các máy thực hiện (automated basecalling) có một tỷ lệ sai sót nhất định tuỳ theo phƣơng pháp và loại máy sử dụng. Khi
một base bị đọc sai có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau
này. Do vậy, những biện pháp hiệu chỉnh lại trình tự cần đƣợc chính con ngƣời trực
tiếp thực hiện nhằm khắc phục tối đa việc xác định sai trình tự (Schadt và cộng sự,
2010).
9


1.2.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ
thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật
Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên nền tảng những đặc điểm giống
và khác nhau trong phạm vi nhóm sinh vật nào đó, từ đó xây dựng lại các cây quan hệ
phát sinh chủng loại để thể hiện quá trình tiến hóa (Felsenstein, 1985). Trong hệ thống
học kinh điển, cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng dựa trên các dữ liệu về
hình thái. Từ khi có sự phát triển mạnh mẽ của thông tin di truyền, việc xây dựng cây
quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu phân tử đã trở thành công việc thực hành
thông dụng và đƣợc biết đến dƣới tên gọi là phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử
dụng dữ liệu phân tử - molecular phylogeny (Lio và Goldman, 1998). Các dữ liệu

đƣợc biểu hiện dƣới dạng trình tự DNA, trình tự protein và các DNA fingerprint.
Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại sử dụng dữ liệu phân tử để xây dựng lại
quá trình tiến hóa bao gồm bốn bƣớc. Khi sử dụng các trình tự DNA làm dữ liệu mang
tính thông tin thì bƣớc đầu tiên là chọn và căn trình tự. Việc này đƣợc tiến hành nhằm
xác định các vị trí tƣơng đồng và thăm dò các sai khác về trình tự DNA. Bƣớc thứ hai
là xây dựng mô hình toán để mô tả lịch sử tiến hóa của các trình tự. Mô hình tính toán
cho phép đánh giá khoảng cách di truyền giữa hai trình tự tƣơng đồng. Khoảng cách di
truyền đƣợc đo bằng số lƣợng đƣợc các thay thế tại một vị trí xảy ra trong quá trình
tiến hóa. Các khoảng cách di truyền đƣợc biểu diễn bởi chiều dài nhánh trong cây quan
hệ phát sinh chủng loại. Bƣớc thứ ba là áp dụng một phƣơng pháp phân tích phù hợp
để tìm hình thể của cây và chiều dài các nhánh vốn mô tả mối quan hệ phát sinh chủng
loại. Bƣớc cuối cùng là giải thích, biện luận. Ngày nay, các mô hình toán đƣợc thực
hiện trong rất nhiều các phần mềm máy tính nhƣ MOLPHY (Adachi và Hasegawa,
1995), PHYLIP (Felsenstein, 1995), PASSML (Lio và Goldman, 1998), PAUP*
(Swofford, 2003) and MEGA (Tamura và cộng sự, 2011).
Việc bao gồm thêm một hay một vài taxon ngoài nhóm (outgroup – chuẩn
ngoại) là một tiêu chí quan trọng trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại. Các
taxon ngoài nhóm đƣợc cho là không thuộc cùng nhóm với các taxon đang khảo sát và
có thể là bất kỳ taxon nào có quan hệ gần với nhóm taxon đang nghiên cứu nhƣng
không là tổ tiên của chúng. Chuẩn ngoại đƣợc dùng với mục đích so sánh trong việc
xác định tính khác biệt về đặc điểm và xác định chiều hƣớng thay đổi trong việc thay
đổi trang thái đặc điểm (Swofford và cộng sự, 1996).
Bên cạnh đó, việc kiểm tra độ tin cậy của cây quan hệ phát sinh chủng loại
đƣợc suy luận ra là cần thiết. Phƣơng pháp kiểm tra thông dụng nhất là phân tích
10


bootstrap. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng vào nghiên cứu phân tích phát sinh
(Felsenstein, 1985). Độ tin cậy càng cao khi giá trị bootstrap càng cao.
1.2.2.1. Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại

Cây quan hệ phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng nhằm mô hình hóa lịch sử tiến
hóa của một nhóm các trình tự hay các sinh vật. Việc tái hiện mối quan hệ phát sinh
chủng loại có thể đƣợc thực hiện bằng các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách di
truyền hoặc dựa trên đặc điểm nhƣ trình bày sau đây:
+ Các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách
Hai thuật toán thông dụng dựa trên so sánh khoảng cách theo cặp là phƣơng
pháp lập nhóm không có trọng số dùng trung bình số học (UPGMA - Unweighted Pair
Group Method using arithmetic Averages) (Sneath và Sokai, 1973) và Gom cụm lân
cận (Neighbor joining) (Saitou và Nei, 1987). Bƣớc đầu tiên trong các phép phân tích
này là tính toán xây dựng ma trận khoảng cách theo cặp giữa các taxon đƣợc khảo sát
thông qua các đặc điểm khác nhau về trình tự của chúng. Để hiệu chỉnh, thông thƣờng
ngƣời ta sử dụng hiệu chỉnh khoảng cách bằng một mô hình tiến hóa nào đó, chẳng
hạn nhƣ mô hình Jukes-Cantor, mô hình Felsentein, mô hình hai thông số của Kimura,
mô hình Tamura, mô hình Tamura và Nei.
+ Các phƣơng pháp dựa trên đặc tính
Trong khi các phƣơng pháp dựa trên khoảng cách đƣa thông tin trình tự thành
một con số đơn (biểu diễn khoảng cách) thì các phƣơng pháp dựa trên đặc tính lại cố
gắng suy luận mối quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ các đặc tính riêng lẽ
nhƣ các nucleotide hay amino acid. Thuộc nhóm phƣơng pháp này là các phƣơng pháp
Giản tiện tối đa (Parsimony) không dựa trên mô hình tiến hóa và hai phƣơng pháp
Maximum likelihood và Bayesian, là những phƣơng pháp suy luận dựa vào xác xuất.
1.2.2.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao
trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật
Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới
sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự
trƣớc khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật
phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR đã hình thành nên một
lƣợng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh
DNA fingerprint. Tính phổ biến của các dữ liệu phân tử trên Genbank hiện nay đã cho
phép mở rộng phân tích ra các taxon khác ngoài các taxon thu đƣợc mẫu.

11


Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã đƣợc
ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại và quá trình tiến hóa ở
thực vật. Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene
ty thể và bộ gene lạp thể. Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy ra không
đồng đều (Kimura, 1980). Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất,
trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm. Bộ gene lạp
thể có mức độ thay thế nhanh hơn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9 thay thế cho một vị
trí trong một năm. Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn
gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một
năm (Gaut,1988). Tỷ lệ thay thế nucleotide ở thực vật khác về căn bản so với sự tiến
hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật. Trong lịch sử tƣơng đối ngắn của
hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung nhiều vào bộ gene lục lạp,
về sau đã chuyển hƣớng sang các trình tự gene trong nhân (Soltis và Soltis, 1998).
+ Bộ gene lục lạp: Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông
thƣờng đƣợc đặc trƣng bởi phân tử dạng vòng. Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ
gene, khoảng 135-160kb với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments]
chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng
SSC (small single-copy region) (Judd và cộng sự, 1999). Thành phần, kích thƣớc, cấu
trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã đƣợc xác định là có mức độ bảo thủ cao trong
các nghiên cứu về tiến hóa. Tính bảo thủ cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu
trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh chủng
loại. Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tƣơng đối
chậm ở mức độ trình tự nucleotide (Downie và Palmer, 1992). Tính bảo thủ cao của
DNA lục lạp thực sự là ƣu thế khi sử dụng nó để xây dựng mối quan hệ phát sinh
chủng loại và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật (Soltis
và Soltis, 1998).
Có thể thấy những vùng trình tự ở lục lạp thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên

cứu quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật gồm: gene rbcL, gene atpB (Soltis và
Soltis, 1998), 16S rRNA, gene matK (Sharma và cộng sự, 2012) và vùng trình tự
không mã hóa thƣờng trnL-F (Muller và cộng sự, 2006).
Gene matK có tên đầy đủ là Maturase K, là gene mã hóa cho protein Maturase
vốn đóng vai trò enzyme trong việc loại bỏ các intron trong quá trình chuyển từ tiền
RNA thông tin (pre-mRNA) thành RNA trƣởng thành. Gen này nằm trên vùng LSC
(large single copy region), có độ dài xấp xỉ 1500bp, đồng phiên mã với gene trnK
12


(Chieba và cộng sự, 1996). Gene matK gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm trong
intron của gene trnK và dƣờng nhƣ chƣa rõ chức năng. Các nghiên cứu sử dụng trình
tự gene matK để xây dựng cây phát sinh cho thấy gene matK có tính đa dạng hơn
những gene khác có trong lục lạp, do đó trở thành gene marker quan trọng để giúp
phân loại thực vật (Sharma và cộng sự, 2012). Bởi gene matK có thể dễ dàng đƣợc
khuếch đại cùng với vùng intron không mang mã ở hai đầu của nó, mở rộng trình tự
lên đến 2400-2700bp nên việc sử dụng vùng này đƣợc ứng dụng nhiều trong nghiên
cứu quan hệ phát sinh chủng loại giữa các loài và trong một loài (Soltis và cộng sự,
1996). Mặc khác, một phần gene matK cũng thƣờng đƣợc sử dụng để xây dựng quan
hệ phát sinh chủng loại (Zuo và cộng sự, 2011).
+ Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân: Bộ gene trong nhân có kích
thƣớc lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1,1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao
gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng loại
bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân. Cấu trúc căn bản
của DNA ribosome là một đơn vị lặp đơn, mỗi đơn vị nhƣ thế có thể lặp lại đến hàng
ngàn lần trong bộ gene. Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao
gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho
tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một
gene nhỏ hơn là 5,8S. Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời
những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật:

gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp. Họ
gene rRNA chứa các vùng bảo thủ cao nhƣ 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các
quan hệ phát sinh chủng loại ở các mức độ phân loại cao. Các đoạn tiến hóa nhanh nhƣ
các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong so sánh các loài và những chi gần nhau.
Các trình tự 18S rRNA thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S. Cho
dù cả hai vùng cùng đƣợc có dải ứng dụng rộng nhƣ nhau. Kích thƣớc trên 3000bp của
26S rRNA đã cản trở việc sử dụng nó, đặc biệt là trong việc giải trình tự toàn bộ gene.
Trái lại, kích thƣớc của 18S rRNA khoảng 1800bp giúp cho nó đƣợc ƣu tiên lựa chọn
hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự. Thực tế cho thấy cây quan hệ phát sinh
chủng loại sử dụng trình tự 18S rRNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh chủng
loại sử dụng trình tự rbcL ở nhiều mức độ phân loại thực vật hạt kín (Soltis và Soltis,
1997).
Gene 5,8S rRNA dễ dàng đƣợc khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi
định vị trên các gene 18S và 26S rRNA nhƣng ít khi đƣợc sử dụng để suy luận quan hệ
13