Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp trong dòng tế bào thuốc lá By-2 (Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN
MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG
TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2
(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN HOÀI NAM

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN
MIRACULIN TÁI TỔ HỢP TRONG DÒNG
TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2
(Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã ngành : 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. LÂM ĐẠI NHÂN

HÀ NỘI, 2014


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan, nghiêm túc và không sao
chép trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn
toàn trách nhiệm.
Tác giả

Nguyễn Hoài Nam


ii

LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, em Ÿã nhận được rất nhiều sự
giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy, cô, các anh chị công tác trong Viện
Công nghệ Sinh học và các bạn đồng nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Lâm
Đại Nhân và TS. Phạm Bích Ngọc đã dành nhiều thời gian, tận tình chỉ bảo,
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập thí nghiệm.
Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, NCS. La Việt Hồng,
Th.s Nguyễn Thu Giang, các cán bộ, anh, chị công tác tại Viện Công nghệ
Sinh học cũng như thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Sinh học, phòng
Sau đại học - Trường đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi, giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia

đình đã luôn ở bên em, động viên em và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này. Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2014
Học viên

Nguyễn Hoài Nam


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN............................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................ vi
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... viii
PHẦN I. MỞ ĐẦU............................................................................................ 1
PHẦN II. NỘI DUNG ....................................................................................... 4
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4
1.1. Cây Thần kỳ ............................................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại........................................................................... 4
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ ................................... 4
1.2. Miraculin .................................................................................................... 6
1.2.1. Tính chất của miraculin ........................................................................... 6
1.2.2. Cấu tạo của miraculin.............................................................................. 7
1.2.3. Cơ chế tác dụng của miraculin ................................................................ 9
1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới ...... 10
1.2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen ở Việt Nam ... 12
1.2.6. Tính an toàn và ứng dụng sản xuất của protein miraculin .................... 12
1.3. Những ưu điểm của dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 .......... 14

1.4. Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens.......... 15
1.4.1. Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ............................... 16
1.4.2. Cấu trúc của Ti-plasmid và T-DNA ....................................................... 17
1.4.3. Cơ chế quá trình chuyển gen ngoài tự nhiên của vi khuẩn........................
Agrobacterium tumefaciens............................................................................. 19
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 22
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 22
2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 22


iv

2.1.2. Vật liệu thực vật .................................................................................... 22
2.1.3. Sơ đồ cấu trúc vector pBI121/35S/Mir và cấu trúc vector……………..
pBI121/HSP/Mir mang gen miraculin……………………………………

22

2.1.4. Hóa chất................................................................................................. 23
2.1.5. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 24
2.1.6. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ............................................................. 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 26
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 26
2.2.2. Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển gen pBI121/35S/Mir và
pBI121/HSP/Mir .............................................................................................. 26
2.2.3. Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen miraculin bằng kỹ thuật PCR. ..... 29
2.2.4. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của dòng tế bào BY-2 đã được chuyển
gen ................................................................................................................... 33
2.2.5. Đánh giá sự biểu hiện protein trong dòng tế bào BY-2 bằng kỹ thuật

Dot Blot. .......................................................................................................... 34
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 39
3.1. Kết quả chuyển gen mã hóa miraculin vào tế bào BY-2 thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens .................................................................. 39
3.1.1. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc mang gen mã hoá protein miraculin trong
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens................................................................ 39
3.1.2. Sự hình thành và phát triển của mô sẹo ................................................ 40
3.1.3. Tỷ lệ các dòng tế bào sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần chọn
lọc .................................................................................................................... 42
3.2. Đánh giá các dòng tế bào BY-2 chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ............ 44
3.3. Đánh giá sinh trưởng của một số dòng tế bào BY-2 chuyển gen ............ 48
3.4. Đánh giá biểu hiện protein miraculin tái tổ hợp bằng kỹ thuật Dot Blot ..... 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 57


v

1. Kết luận ....................................................................................................... 57
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Deoxyribonucleic acid

BY-2

Bright Yellow No. 2

CTAB

Cetyl trimetyl amoni bromua

LB

Môi trường theo Luria và Bertani

PCR

Polymerase Chain Reaction

Taq

Thermus aquaticus

MS

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

bp

Base pair

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

OD

Optical density

Ti-plasmid

Tumor inducing plasmid

EDTA

Ethylene diamine tetra- acetate acid

GB

Glycine betaine

Mir

Miraculin


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu sinh trưởng . .................................................................. 4

Bảng 1.2. Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ........................................................ 5
Bảng 1.3. Chuỗi phân tử đường của miraculin ................................................. 7
Bảng 2.1. Danh mục hóa chất ......................................................................... 23
Bảng 2.2. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................................ 24
Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy tế bào BY-2................................................... 24
Bảng 2.4. Thiết bị thí nghiệm.......................................................................... 25
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 31
Bảng 2.6. Chu kì nhiệt ..................................................................................... 31
Bảng 2.7. Hóa chất chạy điện di SDS-PAGE ................................................. 36
Bảng 3.1. Thống kê các dòng tế bào mô sẹo thuốc lá BY-2 chuyển gen ....... 44
Bảng 3.2. Kết quả đo ADN tổng số bằng máy đo quang phổ ......................... 45
Bảng 3.3. Tổng hợp đánh giá sinh trưởng các dòng tế bào huyền phù BY-2..... 50
Bảng 3.4. Kết quả đo protein tổng số ............................................................. 54


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các amino acid của miraculin ......................................................... 8
Hình 1.2. Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận ........... 9
Hình 1.3. Dược phẩm miraculin tại Nhật Bản ............................................... 14
Hình 1.4. Sản phẩm chứa miraculin sản xuất tại Hoa Kỳ .............................. 14
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid ............................................................... 18
Hình 1.6. Quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ....... 21
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện gen nhân tạo miraculin…………22
Hình 3.1. Kết quả colony-PCR khuẩn lạc ....................................................... 39
Hình 3.2. Kết quả chuyển gen vào tế bào BY-2 ............................................. 41
Hình 3.3. Chọn lọc mô sẹo chuyển gen qua 2 lần nuôi cấy chuyển ............... 42
Hình 3.4. Chọn lọc các dòng tế bào mô sẹo chuyển gen ổn định ................... 43
Hình 3.5. Kết quả tách chiết ADN tổng số ..................................................... 46

Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp
mồi mir đặc hiệu gen mir ................................................................................ 47
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR các dòng tế bào BY-2 chuyển gen với cặp
mồi đặc hiệu gen vir ....................................................................................... 48
Hình 3.8. Các dòng tế bào huyền phù sau 14 ngày nuôi cấy .......................... 49
Hình 3.9. Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2
chuyển gen (khối lượng tươi thu được)........................................................... 51
Hình 3.10. Sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY-2
chuyển gen (khối lượng khô thu được) ........................................................... 51
Hình 3.11. Kết quả điện di protein tổng số ..................................................... 55


1

PHẦN I. MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay tình trạng béo phì đã tăng lên đáng báo động và nó trở thành
một vấn đề sức khỏe của thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. Tổ
chức Y tế thế giới định nghĩa: “Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và
không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới
sức khỏe. Béo phì là tình trạng sức khỏe có nguyên nhân dinh dưỡng.” Hiện
nay, tổ chức Y tế thế giới thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index BMI) để nhận định tình trạng gầy béo [30].
Ở Việt Nam, trong gần hai thập niên qua, tình trạng thừa cân và béo phì
đang có xu hướng tăng lên cùng với sự phát triển kinh tế nhất là các thành phố
lớn và các đô thị. Trong vòng 3 năm (2007-2010), số người thừa cân béo phì
tại Việt Nam đã tăng khoảng 10%, theo số liệu điều tra của Viện dinh dưỡng
quốc gia Việt Nam. Cứ 100 người trong độ tuổi 25-74 thì đến 26 người bị béo
phì. Viện Dinh dưỡng quốc gia cho biết, tình trạng thừa cân, béo phì tăng
nhanh qua mỗi năm. Khoảng 20 năm trước, 5% người Việt Nam bị thừa cân,
béo phì. Năm 2007, hơn 16% người Việt Nam trưởng thành gặp tình trạng

này, 40% bị béo bụng. Chỉ trong vòng 3 năm sau, đến 2010, tỷ lệ này đã tăng
thêm gần 10%, ở mức xấp xỉ 26%. Tình trạng thừa cân béo phì chủ yếu tập
trung ở các thành phố lớn. Điều tra của Viện Dinh dưỡng năm 2010, tình
trạng thừa cân, béo phì tại các thành phố lớn chiếm tỷ lệ khoảng 40,4%, còn ở
vùng nông thôn là 25,2% [29]. Béo phì không chỉ đơn giản là ảnh hưởng đến
thẩm mỹ mà còn có nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe, bệnh tật của con người.
Nó là nguyên nhân của hàng loạt bệnh như tim mạch, đái tháo đường, rối loạn
hô hấp, viêm xương khớp, sỏi đường mật, ung thư. Béo phì có liên quan mật
thiết với bệnh đái tháo đường không phụ thuộc vào insullin. Một trong những
nguyên nhân gây nên bệnh béo phì đó là do chế độ ăn uống liên quan đến


2

những loại thức ăn chứa nhiều calo trong đó có đường. Sử dụng đường đã trở
thành một thói quen, sở thích của hầu hết mọi người và vị giác mỗi người đều
chấp nhận vị ngọt như một phần tất yếu của thực đơn hàng ngày [2].
Vấn đề được đặt ra là việc tìm kiếm một loại thực phẩm tạo ngọt an toàn
mà không chứa nhiều calo để đáp ứng được thói quen sử dụng đồ ngọt trong
khẩu phần ăn của những người béo phì và mắc bệnh tiểu đường và cải thiện vị
giác của những bệnh nhân điều trị ung thư. Ở Nhật, người ta đã sử dụng
miraculin một loại glycoprotein đánh lừa vị giác để tạo cảm giác ngọt thay thế
đường dành cho người béo phì và mắc bệnh tiểu đường [9].
Với công dụng của miraculin và đứng trước thực trạng khó khăn của
những bệnh nhân béo phì và tiểu đường về chế độ khẩu phần ăn chúng tôi
quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu biểu hiện protein miraculin tái tổ
hợp trong dòng tế bào thuốc lá BY-2”. Tính mới của đề tài chúng tôi thực
hiện đó là việc nghiên cứu về miraculin một chất tạo ngọt an toàn thay thế
đường mà ở Việt Nam nó hoàn toàn mới, chưa có một công trình nghiên cứu
khoa học nào ở Việt Nam công bố về chuyển gen miraculin.

2. Mục đích nghiên cứu
Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 biểu hiện protein tái tổ hợp miraculin.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Chuyển gen vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3.2. Chọn lọc các dòng tế bào chuyển gen.
3.3. Đánh giá các dòng tế bào chuyển gen ở mức độ ADN và protein .
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu


3

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Cv58 mang vector chuyển
gen pBI121/35S/Mir hoặc pBI121/HSP/Mir do phòng Công nghệ tế bào thực
vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
- Dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 do phòng Công nghệ tế
bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Chuyển gen mã hoá miraculin vào dòng tế bào thuốc lá BY-2 thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, sau đó đánh giá biểu hiện của protein
miraculin tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và Dot Blot. Các thí nghiệm
được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung cho các tài liệu nghiên cứu khả
năng chuyển gen quy định tổng hợp protein miraculin vào cây trồng thông
qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và biểu hiện của protein miraculin
sau khi chuyển gen.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo dòng tế bào thuốc lá chuyển gen miraculin trên quy mô phòng thí
nghiệm và là cơ sở cho việc thử nghiệm, sản xuất protein miraculin trên quy
mô công nghiệp.


4

PHẦN II. NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cây Thần kỳ

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây Thần kỳ đã được nhắc đến vào năm 1725 bởi một nhà thám hiểm người
Pháp có tên là Des Marchais sau khi đi khảo sát vùng Tây Phi. Đến năm 1852,
cây Thần kỳ đã được tiến sĩ W.F.Daniell mô tả tỉ mỉ về đặc tính kỳ lạ này và
định danh khoa học là: Synsepalum dulcificum, thuộc giới: Plantae, ngành:
Magnoliophyta, lớp: Magnoliopsida, bộ: Ericales, họ: Sapotaceae, chi:
Sideroxylon, đồng thời đặt tên là cây “Thần kỳ” [17]. Sở dĩ cây được gọi là
cây Thần kỳ vì quả của nó khi ăn vào thì sau đó ăn các loại thức ăn có vị chua
đều cảm thấy có vị ngọt.
1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng, sinh thái của cây Thần kỳ
Cây Thần kỳ thuộc loại cây tiểu mộc, chậm phát triển, không rụng lá
mùa đông, tán rộng tối đa là 1 – 2 m.
Bảng 1.1. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây Thần kỳ [4].
STT

Các chỉ tiêu

Đơn vị tính Kết quả nghiên cứu

1

Thời gian gieo hạt đến nảy mầm

Ngày

30

2

Thời gian nảy mầm đến lúc có 2 lá mầm

Ngày

28

3

Thời gian nảy mầm đến lúc có hoa

Năm

3 – 3,5

4

Tốc độ tăng trưởng chiều cao/tháng

cm

2–3

5

Từ khi có nụ đến lần hoa nở đầu tiên

Ngày

24 – 28

6

Thời gian nở hết một chùm hoa

Ngày

6–7

7

Thời gian từ hoa nở đến quả chín

Ngày

45 – 50

8

Độ vươn xa của rễ

cm

90 - 100


5

Cây Thần kỳ có thể trồng được ở vùng đất khô ráo, có độ pH axit, có độ ẩm
cao, nắng nhiều. Khả năng chịu lạnh đến -7oC, do đó có thể trồng được ở mọi
độ cao của Việt Nam.
Bảng 1.2. Đặc điểm sinh học cây Thần kỳ
Bộ phận

Kết quả nghiên cứu
Rễ Synsepalum dulcificum thuộc loại rễ nông, có rễ cái, đại bộ

Rễ

phận tập trung ở vùng 0 – 40 cm, độ vươn xa của rễ khá rộng nếu
trồng ngoài tự nhiên, thường cách gốc khoảng từ 0 – 100 cm, có
nhiều rễ tơ. Sự phân bố của rễ còn phụ thuộc đất trồng.
Đây là loại cây tiểu mộc nhỏ, phát triển rất chậm và có thể cao 1,2
–1,5 m nếu trồng trong chậu, cao 3,0 – 4,5 m nếu trồng ngoài tự

Thân và lá

nhiên. Khoảng 10 năm cây mới có thể cao được 1,2 – 1,5 m. Tán

cây tạo thành hình chóp. Có một thân chính, 4 – 5 nhánh phụ.
Hoa Synsepalum dulcificum nhỏ có màu trắng, mùi rất thơm, có
lông tơ ở mặt ngoài, đường kính khi nở khoảng 0,3 – 0,5 mm.
Cuống nhỏ dài 0,2 – 0,3 mm. Đầu tiên ở nách lá xuất hiện mầm

Hoa

hoa, dần lớn lên thành nụ, trên một cành thường có 15 – 20 nụ ở
nách lá, sau này nở thành hoa. Hoa mọc tâp trung hay đơn độc từ
nách lá ở gần ngọn nhánh. Hoa có cánh dính liền ở đáy. Cánh hoa
chia làm 5 thùy, dính nhau ở đáy tạo thành hình ống.
Lá nguyên, dày, dài, bóng, mọc so le hay tạo thành chùm ở đầu

Lá

các ngọn nhánh phụ, lá non màu xanh nhạt và đậm dần khi già.
Lá xanh quanh năm và chỉ thường lá già mới rụng.


6

Chiều dài trung bình của quả khoảng từ 2 – 3,5 cm. Đường kính
quả khoảng từ 1 – 1,8 cm. Trọng lượng quả khoảng 1 – 2 g. Vỏ
quả mỏng, có một lớp phấn trắng trên bề mặt. Khi quả còn non có
màu xanh đậm nhưng khi chín quả có màu đỏ, mọng nước. Thịt
Quả

quả khi chín có màu trắng, hơi nhớt, khi ăn lại có vị hơi chua.
Mỗi quả có một hạt, hạt có dạng hình elip, kích thước từ 1,0 – 1,5
cm. Vỏ hạt cứng và gồm có hai mặt, mặt trên trơn và mặt dưới

nhám có đường kẻ sọc. Bên trong vỏ, hạt gồm 2 tử diệp có màu
xanh và áp sát, dính nhau ở cán phôi [4].

1.2. Miraculin
1.2.1. Tính chất của miraculin
Miraculin là một protein có khả năng làm chuyển đổi vị chua chuyển
thành vị ngọt mặc dù chính bản thân miraculin không có vị ngọt. Bên cạnh đó
miraculin còn có khả năng chuyển đổi vị ngọt ngay khi ở nồng độ rất thấp.
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng chỉ với 0.4 mM miraculin tiếp xúc phản ứng
với 0,02 M axit citric thì vị ngọt đạt được ước tính gấp khoảng 3000 lần so
với đường sucrose về trọng lượng [25]. Do ó , để cung cấp các hiệu ứng làm
ngọt như sucrose, chỉ một lượng nhỏ của miraculin cũng có thể tạo ra hiệu
ứng tương tự. Điều này có ý nghĩa rất lớn bởi chỉ một lượng nhỏ miraculin thì
bổ sung gần như không đáng kể đến lượng calo cho cơ thể. Vì vậy, miraculin
có thể được sử dụng như một chất làm ngọt có hàm lượng calo thấp trong tự
nhiên dành cho các bệnh nhân mắc bệnh liên quan đến việc tiêu thụ đường,
bao gồm béo phì, tiểu đường.
Miraculin không bền ở nhiệt độ cao và bị phân huỷ khi đun nóng. Vì
vậy khi nấu chín, miraculin sẽ không còn tác dụng chuyển đổi tạo vị ngọt trên
vị giác nữa.


7

Miraculin là một protein lưỡng tính, tan trong nước, không tan trong
dung môi hữu cơ, không bền trong môi trường acid - base mạnh.
Những thức ăn có vị chua như cam, chanh hoặc các loại đồ chua (như
dưa chua, rau quả ngâm giấm chua...), cay hoặc đắng như tương ớt, rượu bia...
đều trở nên ngọt sau khi nếm miraculin [21].
1.2.2. Cấu tạo của miraculin

Miraculin là glycoprotein có độ dài 220 amino acid, gồm đoạn peptide
tín hiệu dài 29 amino acid ở đầu và chuỗi polypeptide đơn gồm 191 amino
acid. Trọng lượng phân tử của miraculin dựa trên trình tự các amino acid và
hàm lượng carbonhydrate là 24,6 kDa. Hàm lượng carbonhydate chiếm
khoảng 13,9% trọng lượng phân tử, có 5 loại cấu trúc của chuỗi
oligosarcharide bao gồm: glucosamine, mannose, galactose, xylose, and
fucose. Dimer đồng hình (homodimer) miraculin có hoạt động thay đổi vị
giác ở pH acid. Miraculin thường tồn tại ở dạng homotetramer hay dimer của
homodimer [27].
Bảng 1.3. Chuỗi phân tử đường của miraculin
Loại đường

Tỷ lệ (%)

Glucosamine

31

Mannose

30

Glactose

7

Xylose

10

Fucose

22


8

Trình tự acid amin của miraculin

Hình 1.1. Các acid amin của miraculin [27]
Trình tự nucleotide mã hóa miraculin


9

Hình 1.2. Trình tự nucleotide của miraculin và trình tự amino acid suy luận[19].
Chú thích: Các trình tự amino acid gạch chân được sử dụng cho việc
thiết kế mồi PCR. Dấu mũi tên cho biết vị trí phân tách của quá trình dịch mã
miraculin. Dấu (*) đánh dấu codon kết thúc .
1.2.3. Cơ chế tác dụng của miraculin
Khả năng chuyển đổi vị giác của protein miraculin chủ yếu được đảm
nhiệm bởi hai histidine Çó là His29 và His59 [21]. Bình thường, khi chúng ta
ăn thức ăn thì những khẩu vị của thức ăn khi tiếp xúc sẽ làm kích hoạt những
tế bào tiếp nhận đặc thù chứa bên trong các gai vị giác nằm trên lưỡi và tạo ra
sự kết nối với các tế bào thụ thể ngọt, mặn …, sau đó gửi đến não những tín
hiệu cho chúng ta biết là khẩu vị ngọt, mặn, đắng, chua hay những vị khác.
Miraculin là protein có tính chất làm thay đổi cấu hình của các thụ thể
trên tế bào vị giác. Điều này là do kết quả của sự hoạt hoá các thụ quan vị
ngọt trên lưỡi do miraculin tác động và ảnh hưởng này được kéo dài cho đến
khi các chồi vị giác trở lại bình thường. Protein miraculin không kết nối với

bất cứ một tế bào thụ thể mùi vị nào cả do đó miraculin không tạo ra cảm giác
vị giác. Tuy nhiên, protein miraculin có thể thay đổi cấu hình các thụ thể của
tế bào vị giác trên lưỡi. Trong môi trường pH acid, trong đó có vị chua nói
chung, các thụ thể ngọt của G-protein kết hợp cùng thụ thể vị giác trên gai
lưỡi được kích hoạt, hình dạng của các thụ thể thay đổi làm miraculin nối
dính chặt vào chúng, như cơ chế chìa khóa trong ổ khóa. Mà trong phân tử
của miraculin có chuỗi các phân tử đường do đó tạo ra vị ngọt trong thời gian
miraculin lưu lại trên lưỡi. Hiệu ứng này chỉ kết thúc cho đến khi thụ thể vị
giác trở lại bình thường. Vì miraculin kết hợp khá chặt chẽ vào các thụ thể
cảm nhận vị giác ở trên gai lưỡi cho nên ảnh hưởng tạo ngọt của miraculin có
thể kéo dài đến vài giờ [21].


10

Sự tác động của các phân tử miraculin đã làm sai lệch sự định hướng
của các thụ thể cảm nhận vị giác trên gai lưỡi, làm cho lưỡi trở nên thích ứng
và nhận định duy nhất với vị ngọt trong một khoảng thời gian nhất định.
Thời gian và cường độ của hiện tượng thay đổi vị giác phụ thuộc vào
các yếu tố khác nhau như nồng độ miraculin, thời gian tiếp xúc của miraculin
với lưỡi, và độ pH acid. Tác dụng này có thể kéo dài từ 1 đến 2 giờ và sẽ biến
mất nhanh chóng nếu dùng trà nóng hay nước nóng để xúc miệng do
miraculin bị phân hủy ở nhiệt độ cao.
1.2.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen trên thế giới
Miraculin đóng vai trò lớn trong việc chuyển đổi vị giác tạo cảm giác vị
ngọt, nhưng nguồn gốc của miraculin được chiết xuất từ quả của cây Thần kỳ
sống ở vùng nhiệt đới nên đã hạn chế về khả năng nhân rộng loại cây này tới
những vùng khí hậu khác, bên cạnh đó nếu chỉ chiết xuất miraculin từ quả của
cây Thần kỳ thì số lượng thu được sẽ không nhiều như mong đợi, chính vì lí
do này các nhà khoa học đã tiến hành nhiều nghiên cứu nhằm mục đích

chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật khác để sản xuất miraculin
trên quy mô công nghiệp. Trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học được
công bố về chuyển gen mã hóa miraculin vào các loài sinh vật.
Năm 2006, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào cây
rau diếp, và đã biểu hiện thành công miraculin tái tổ hợp tích lũy nhiều trong
lá. Cây rau diếp biến đổi gen đã có khả năng cảm ứng vị ngọt. Tuy nhiên, sự
biểu hiện miraculin trên cây rau diếp chuyển gen không thực sự ổn định, qua
các thế hệ tiếp theo thì khả năng tích lũy protein miraculin giảm dần. Mặc dù
vậy, kết quả này cũng đã chứng tỏ được khả năng sản xuất miraculin ở các
loài thực vật ăn được, và nó mở ra một chiến lược mới trong việc sản xuất
protein miraculin trên quy mô lớn ở các đối tượng thực vật [25].
Năm 2007, các nhà khoa học đã chuyển gen mã hóa miraculin vào
chủng Aspergillusn oryzae NS4. Kết quả của quá trình chuyển gen thu được


11

0,5 mg/ml miraculin tái tổ hợp tương đương với 0,1 mg/ml miraculin tự nhiên
về hoạt động làm thay đổi vị giác ở pH = 3,0 [14].
Năm 2008, Sugaya và cộng sự đã hành công trong việc chuyển gen mã
hóa miraculin vào cây dâu tây, kết quả thu được hàm lượng miraculin trong
quả dâu chuyển gen là 0,5 – 2,0 µg/g thấp hơn hàm lượng miraculin trong quả
cây Thần kỳ (145 µg/g ở quả tươi) [24].
Cà chua là một trong những loại cây trồng chính được trồng trên khắp
thế giới, và các nhu cầu về sinh trưởng, phát triển của cà chua từ lâu đã được
các nhà khoa học hiểu rõ. Do đó, sản xuất miraculin tái tổ hợp trong cà chua
biến đổi gen đã được các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu từ năm 2007 bởi
Sun và cộng sự. Trong các đối tượng thực vật ã được chuyển gen tổng hợp
miraculin cho đến nay thì thành công nhất là cà chua mặc dù hàm lượng
miraculin của cà chua biến đổi gen thấp hơn hai lần so với miraculin tự nhiên

có trong quả Thần kỳ [12]. Trong nghiên cứu chuyển gen mã hóa miraculin
vào cây cà chua, kết quả thu được đó là miraculin tái tổ hợp được tích lũy cao
trong bộ phận lá và quả, hàm lượng tích lũy lên đến 102,5 µg /g trong lá và
90,7 µg /g trong quả tươi [26].
Năm 2011, các nhà khoa học cũng đã chiết xuất thành công miraculin
tinh khiết ở quả của cây cà chua chuyển gen và miraculin được chiết xuất
cũng đã cho thấy khả năng hoạt tính mạnh trong việc tạo ngọt tương tự như
của miraculin tự nhiên trong cây Thần kỳ [9]. Những kết quả này ã chứng
minh rằng miraculin tái tổ hợp được chiết xuất từ cây cà chua biến đổi gen có
thể là một lựa chọn tốt để sản xuất miraculin từ thực vật tự nhiên, hơn nữa
miraculin biểu hiện ổn định ở cây cà chua là do độ pH acid ổn định trong cây
cà chua. Đến nay có rất nhiều bài báo nghiên cứu về cà chua biến đổi gen
chứa miraculin [11], [15].
Năm 2011, các nhà khoa học Hàn Quốc đã thành công trong việc
chuyển gen mã hóa miraculin vào cây trồng Miyagawa Wase Satsuma


12

Mandarin thuộc họ cam quýt. Cây trồng Miyagawa Wase Satsuma Mandarin
được trồng phổ biến ở Hàn Quốc và Nhật Bản. Nghiên cứu này cũng chỉ ra
rằng miraculin tái tổ hợp tích lũy một lượng lớn trên lá và thể hiện được hoạt
tính tạo ngọt, điều này có ý nghĩa rất lớn, nó mở ra một hướng mới trong việc
chuyển gen mã hóa miraculin vào cây thân gỗ [5].
Ngoài ra, gen mã hóa miraculin còn được tái tổ hợp trên một số
loài sinh vật khác như vi khuẩn Escherichia coli, yeast (nấm men), cây
thuốc lá [20].
1.2.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất miraculin chuyển gen ở Việt Nam
Ở Việt Nam cũng đã có một số đề tài khoa học nghiên cứu về
miraculin, nhưng còn rất ít. Các đề tài nghiên cứu về miraculin mới chỉ dừng

lại ở việc trồng thử nghiệm cây Thần kỳ và tách chiết hoạt chất miraculin,
chưa có công trình khoa học nào được công bố về việc chuyển gen mã hóa
miraculin vào các loài thực vật.
Năm 2010, nhóm các nhà khoa học Trần Danh Thế và cộng sự của
Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh đã bước đầu trồng thử
nghiệm và tách chiết hoạt chất miraculin trong quả của cây Thần kỳ
(Synsepalum dulcificum Daniell) [4].
Ở Việt Nam chưa có sản phẩm nào liên quan đến protein miraculin
được sản xuất. Cây Thần kỳ được trồng chủ yếu làm cảnh [4].
1.2.6. Tính an toàn và ứng dụng sản xuất của protein miraculin
Miraculin đã được biết đến từ rất lâu với công dụng kì diệu của nó, cho
đến nay chưa có một tài liệu khoa học nào nói về tính bất lợi, gây hại của
miraculin. Bằng thực tế, những người thổ dân ở vùng Tây Phi đã sử dụng nó
từ rất lâu theo mô tả của nhà thám hiểm Des Marchais. Miraculin cũng đã
được nghiên cứu trên khỉ nâu Macaca Mulatta [6], trên chuột [7], và trên cả
con người [7], [28]. Với những nghiên cứu về tác dụng của miraculin trên não
người của các nhà khoa học Chizuko và cộng sự hay của Diamant H. và cộng


13

sự chúng ta có thể hoàn toàn yên tâm về tính an toàn của protein miraculin.
Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration) viết
tắt FDA là cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm của Hoa Kỳ, thuộc Bộ Y
tế và Dịch vụ Nhân sinh Hoa Kỳ cũng đã cho phép sản xuất miraculin như là
một dạng thực phẩm chức năng. Cho đến nay đã có khá nhiều ứng dụng sản
xuất các loại thực phẩm tạo ngọt có liên quan đến protein miraculin.
Tại Nhật Bản, protein miraculin được ứng dụng sản xuất dưới dạng
dược phẩm hỗ trợ những người bị bệnh tiểu đường, ung thư, hay những
người mắc bệnh béo phì. Loại dược phẩm này tuy không có tác dụng làm

giảm đường huyết cho các bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường và người ăn kiêng
nhưng vì khả năng tạo cảm giác ngọt giúp bệnh nhân không muốn dùng thêm
các chất ngọt chứa nhiều calo khác, nhờ vậy lượng đường hấp thu vào cơ thể
họ sẽ giảm, điều này cũng tốt cho những người đang áp dụng chế độ ăn kiêng.
Bên cạnh đó, với những bệnh nhân mắc bệnh ung thư và đang dùng phương
pháp hóa trị liệu, do hiệu ứng phụ của hóa chất trong máu khiến cho vị giác
của họ có mùi vị kim loại, vì thế họ cảm giác ăn không ngon miệng, dược
phẩm chứa protein miraculin sẽ giúp họ có cảm giác ngon miệng hơn.
Miraculin được dùng phổ biến trong số các bệnh nhân tiểu đường và người ăn
kiêng, giảm cân, dưới dạng nước ép sinh tố, nước đóng chai, đóng hộp và
viên nén miraculin. Tại Tokyo có nhiều quán cà phê phục vụ món "cà phê
miraculin". Khách uống không cần dùng đường hoặc chất tạo ngọt tổng hợp
khác mà dùng trái cây Thần kỳ do hãng "Namco" cung cấp [33].


14

Hình 1.3. Dược phẩm miraculin tại Nhật Bản [29]
(Nguồn : />Tại Hoa Kỳ, theo Cục quản lí Dược và Thực phẩm (FDA), những chế phẩm
có liên quan đến protein miraculin đều được ghi nhãn là nhóm thực phẩm bổ
sung (dietary supplement) thay vì gọi tên ‘‘chất làm ngọt’’ (sweetener).
Những người Mỹ ăn kiêng có thể mua miraculin dưới dạng viên nén và sử
dụng nhiều trong các bữa tiệc để đánh lừa vị giác của họ.

Hình 1.4. Sản phẩm chứa miraculin sản xuất tại Hoa Kỳ [31]
(Nguồn: )
1.3. Những ưu điểm của dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2
Dòng tế bào thuốc lá BY-2 là dòng tế bào siêu sinh trưởng, được
các nhà khoa học Nhật Bản chọn lọc từ nuôi cấy mô của lõi thân cây

15

thuốc lá Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow No. 2 vào năm 1968.
Dòng tế bào BY-2 có khả năng phát triển đồng nhất và ổn định trên môi
trường nuôi cấy đơn giản, giá thành thấp, tốc độ nhân dòng khoảng 100
lần trong vòng một tuần. Một đặc điểm ưu việt khác nữa là BY-2 đáp ứng
tốt với quy trình chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Dòng tế bào BY-2 là dòng tế bào thực vật đã được dùng rộng rãi nhất cho
việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp [23].
1.4. Cơ chế chuyển gen vào thực vật nhờ Agrobacterium tumefaciens
Năm 1983, cây thuốc lá chuyển gen đầu tiên kháng kháng sinh
kanamycin thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được công bố,
sau ó , nhiều nghiên cứu về kỹ thuật chuyển gen vào thực vật đã được tiến
hành rộng rãi. Đến nay, số lượng các phương pháp tạo cây trồng biến đổi gen
đã lên đến hàng chục và đã tạo ra hàng trăm loại cây trồng biến đổi gen mang
các đặc tính quý.
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân
thành hai nhóm phương thức chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và
phương pháp chuyển gen trực tiếp. Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp,
gen được chuyển vào tế bào thực vật qua một sinh vật trung gian thường là
virus hoặc vi khuẩn. Ở phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển
trực tiếp vào tế bào thực vật thông qua những thiết bị hoặc thao tác nhất định
mà không cần nhờ các sinh vật trung gian. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp
chuyển gen trực tiếp đòi hỏi kỹ thuật cao, chính xác và rất tốn kém mà khả
năng tái sinh sau chuyển gen lại thấp, vì thế, người ta đã tìm ra phương pháp
chuyển gen gián tiếp hiệu quả hơn, kinh tế hơn. Trong đó, chuyển gen gián
tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng rộng rãi
hơn cả. Vì phương pháp này dễ sử dụng, ít tốn kém nhưng mang lại hiệu quả
cao (lượng bản sao gen biến nạp ít – tạo thuận lợi cho việc phân tích cây

chuyển gen và không gây tổn thương tế bào).