Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm,tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





TIỂU LUẬN
CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME
Đề tài: Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm,
tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật
Giáo viên hướng dẫn: TS. Đặng Xuân Nghiêm
Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thủy
Lớp : CNSH55A
MSV : 550404
A. Đặt vấn đề
Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào
nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất
ở các tế bào nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau
khi được biểu hiện ở vi khuẩn. Điều này đặc biệt đúng với những protein cần
sự biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification). Có nhiều loại biến đổi
sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tạo ra.
Chúng bao gồm:
(a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide.
(b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụinsulin).
(c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vịtrí nhất
định trên phân tử protein. Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa
và sẽ không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu
thiếu thành phần đường.
(d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các
nhóm acetyl, phosphate và sulfate.

(e) Cắt tiền chất protein. Việc này có thểxảy ra ởvài bước như được minh họa
bởi insulin. Việc cắt bỏnày có thểliên quan đến việc tiết, cuộn gấp đúng và/hoặc
hoạt hóa protein. Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xửlý thường vắng
mặt trong tếbào vi khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tếbào nhân chuẩn.
Các enzyme xửlý sau dịch mã có liên quan thường hiện diện ởmột loạt sinh vật
bậc cao; do đó rất ít trường hợp cần biểu hiện protein tái tổhợp ở đúng sinh vật
đó. Ở đây chúng ta quan tâm đến việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy. Tuy
nhiên, người ta có thể biến đổi gene của toàn bộmột động vật hay thực vật để
sản xuất protein tái tổhợp. Thuận lợi tiếp theo trong việc sử dụng hệ thống biểu
hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được nguy cơ nhiễm tạp các
protein vi khuẩn. Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn tồn dư với lượng
rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật nhân chuẩn,
gây sốt. Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế đểdi chuyển gen qua
lại giữa các nhóm sinh vật khác nhau. Bởi vì thao tác gene ở tế bào nhân chuẩn
khó khăn hơn nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi
Những vector như vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ởvi khuẩn, thường
là E. coli, và cho phép chuyển vào các sinh vật khác đểbiểu hiện gene. Chúng ta
sẽ xem xét tếbào nấm men, côn trùng và động vật có vú nhưlà những hệthống
biểu hiện protein tái tổ hợp
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-
applying the genetic revolution. Academic Press)
B. NỘI DUNG
I. Nấm men
I.1 Đặc điểm
Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như một sinh vật nhân chuẩn mẫu
trong nghiên cứu sinh học phân tử. Bộ gene của nấm men đã được giải trình tự và
nhiều gene đã được nghiên cứu đặc điểm. Dưới góc độ công nghệ sinh học, vài yếu tố
tạo thành ưu thế của nấm men trong việc biểu hiện một số protein nhân chuẩn tái tổ
hợp.

(a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn.
(b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được
công nhận là sinh vật an toàn với con người. Chúng có thể được dùng để biểu hiện các
protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản lý.
(c) Nấm men tiết rất ít protein. Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một
protein tái tổhợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng.
(d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác
nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo lỗ
nhờ sung điện.
(e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector
biểu hiện.
(f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát
việc biểu hiện protein tái tổ hợp.
(g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện
nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, như
thêm các gốc đường (quá trình glycosylation). Tuy nhiên nấm men chỉ đường hóa các
protein tiết. Protein tái tổhợp có thểthiết kế để được tiết bởi nấm men
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)
II.2. Các hệ thống vector
Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa. Các vector
này đều sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng
Chúng có thể được chia thành 3 loại chính:
Các vector plasmid (YEp) được sửdụng nhiều nhất.
Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip)
Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC).
1. YEp( yeast episomal plasmids )
Đặc điểm:
- Dựa vào plasmid 2µm

- Vị trí đa nhân dòng (MCS)
- Promoter điều khiển quá trình phiên mã và dịch mã
- Gốc tái bản trong E.coli và trong nấm men ori.E và ori.2µ plasmid
- Gen chọn lọc kháng ampiciline
- Gen mã hóa cho leuxin 2 (LEU2)
- Trong gen đích cần cài vào vector ngoài đoạn DNA quan tâm còn có các trình
tự như :
+ Có đoạn DNA mã hóa cho trình tự amino acid giúp protein sau khi tạo thành
sẽ đi ra khỏi tế bào giải phóng ra môi trường → thuận lợi cho việc tinh sạch ,
trình tự sử dụng là gen nhân tố giao phối α
+ Đoạn DNA làm tăng độ bền của protein
+ Các trình tự amino acid được bổ sung nhằm tăng độ bền và tăng khả năng
tinh sạch sẽ được cắt bỏ bởi các protease đặc hiệu
2. YIp (yeast integrating plasmid )
Do các plasmid có thể mất đi, đặc biệt trong các mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên
ứng dụng vector dung nhập sẽ làm tăng sự ổn định của gene ngoại lai. Điều bất lợi là
chỉ một bản sao của gene chuyển có mặt, trừ khi các cấu trúc lặp lại liên tiếp được sử
dụng. Những trình tự lặp liên tiếp này lại không ổn định vì xảy ra trao đổi chéo
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-
Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản
năm 2007)
hp://www.discoverbiotech.com/wiki/-/wiki/Main/Cloning+Vectors
3. YAc (yeast artificial chromosome )
- Sử dụng để nhân dòng những đoạn DNA có kích thước lớn
- Có độ bền cao dùng để lập bản đồ vật lý của AND hệ gen người, phân tích các
đơn vị phiên mã lớn, lập thư viện gen người
- Nó giống NST bình thường vì có vùng khởi đầu sao chép(ARS) , trình tự tâm
động của nấm men (CEN), Các telomere nằm ở cuối nhiễm sắc thể, bảo vệ
DNA khỏi tác động của nuclease (TEL)
- Ngoài ra còn có các gen đánh dấu chọn lọc và vị trí nhận biết của enzyme cắt

giới hạn
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ
hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật xuất bản năm 2007)
hp://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php
Ứng dụng
Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces
cerevisiae. Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và
protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong
chuẩn đoán. Mặc dù nhiều protein tái tổhợp đã được biểu hiện thành công ở nấm
men, năng suất của chúng thường thấp.
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)
Các khó khăn bao gồm:
(a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men
lớn.
(b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và
thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường.
(c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường
có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng
Vì sự biểu hiện trong S.cerevisiae có một số nhược điểm là :
- sự biểu hiện thấp năng suất không đáng kể
- sự gắn gốc đường không chính xác làm biến đổi chức năng và làm cho protein
tái tổ hợp có tình kháng nguyên
- protein tái tổ hợp thường bị giữ lại tại nhu chất do đó làm tăng thời gian và chi
phí để tinh sạch
- trong quá trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh ra etanol là chất độc đối với tế
bào → giảm lượng protein tiết ra
vì vậy người ta tìm kiếm các hệ thống nấm men khác để khắc phục những nhược

điểm của S.serevisiae và P.pastoris có những ưu điểm
- có promoter hiểu quả cao
- không tổng hợp etanol
- tiết rất ít loại protein nên dễ tinh sạch
có rất nhiều vector biểu hiện của P. pastoris đã được thiết kế cấu trúc của mối loại đều
có những điểm chung như:
- các plasmid cài nhập
- có gen quan tâm chịu sự điều khiển của promoter
- trình tự kết thúc phiên mã từ gen AOX1 của P.pastoris
- gen đánh dấu chọn lọc trong nấm men
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ
hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ
thuật xuất bản năm 2007)

cấu tạo của vector biểu hiện trong P.pastoris
hp://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3118338_1472-6750-11-47-6&req=4
II. BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG
II.1 Đặc điểm
Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng phức tạp.
Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế bào nấm men hay
vi khuẩn. Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được nuôi cấy trong các môi
trường đơn giản hơn các tếbào động vật. Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào
côn trùng đã được phát triển. Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến
hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú.
Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ
một họ virus có tên là baculovirus, chỉxâm nhiễm côn trùng (và các động vật
không xương có họ hàng như lớp nhện và giáp xác). Baculovirus có kiểu hình thành
hạt virus dị thường dạng polyhedrons (đa diện) Nhưng khi côn trùng bị chết, các hạt
virus được giải phóng gắn vào một chất nền protein. Protein chất nền được gọi là
polyhedrin, và cấu trúc polyhedron bảo vệ các hạt virus khi chúng ở ngoài môi trường.

Khi được nuốt bởi các côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải nhờ quá trình tiêu hóa
và polyhedron tách ra. Quá trình này giúp giải phóng các hạt virus có thể xâm nhiễm
các tế bào côn trùng mới. Gene mã hóa polyhedrin có một promoter khỏe, và giai
đoạn muộn của quá trình dịch mã, protein polyhedrin được tạo ra với lượng rất lớn.
Do polyhedrin không thật sự cần thiết cho việc xâm nhiễm của virus vào tế bào côn
trùng nuôi cấy, polyhedrin promoter có thể được sử dụng để biểu hiện các protein tái
tổ hợp. Trình tự mã hóa cho polyhedrin được loại bỏ và thay bằng cDNA mã hóa cho
protein tái tổ hợp quan tâm. Có rất nhiều loại baculovirus khác nhau, và loại thường
được sử dụng nhiều nhất là MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus). Virus này xâm
nhiễm rất nhiều tế bào côn
trùng và sinh sôi tốt ở nhiều dòng tế bào côn trùng nuôi cấy. Một dòng tế bào phổ
thông được sử dụng để nhân virus này lên là từ loài sâu fall armyworm (sâu keo-
Spodoptera frugiperda). Sản lượng của polyhedrin-và cũng là sản lượng của protein tái
tổhợp sử dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt cao trong các dòng tế bào này.
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology- applying
the genetic revolution. Academic Press)
II.2. Hệ thống vectoter biểu hiện baculovirut
DNA Vector
DNA 5’ Pp MCS Pt DNA 3’
AcMNPV AcMNPV
a. Cấu trúc một đơn vị biểu hiện của một vector chuyển nạp baculovirus(AcMNPV ),
MCS vị trí đa nhân dòng, Pp promoter gen polyheđrin,Pt trình tự kết thúc phiên mã
gen polyheđrin 5’,3’ DNA AcMNPV là trình tự khởi đầu và kết thúc phiên mã
Sự thay thế gen polyheđrin AcMNPV bằng một đơn vị biểu hiện từ một vector chuyển
nạp. Trao đổi chéo kép(x) giữa các đoạn DNA tương đồng của vector chuyển nạp và
hệ AcMNPV dẫn đến sự cài nhập của đơn vị biểu hiện vào bộ gen AcMNPV. GOI là
đoạn gen quan tâm
Các tế bào côn trùng sau khi được cấy AcMNPV tái tổ hợp sẽ tạo ra các vết tan trong
quá trình chọn lọc do do các tế bào được có AcMNPV tái tổ hợp thì gen polyheđrin bị

bất hoạt, còn những tế bào không có AcMNPV tái tổ hợp thì gen polyheđrin hoạt động
bình thường
Việc định loại các vết tan bằng mắt dễ gây mệt mỏi và mang tính chủ quan vì vậy
người ta đã thêm một số tác nhân chọn lọc khác như gen lacZ của E.coli ,gen mã hóa
cho β-galactosidase, đặt dưới sự kiểm soát của promoter trong baculovirus, bản thiết
kế này được gắn trong DNA đích →những tế bào côn trùng có AcMNPV tái tổ hợp
thì tạo ra các vết tan và có màu xanh trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm X-gal
b. Để tăng sản lượng baculovirus tái tổ hợp có nhiều quy trình được tìm ra trong đó có
phương pháp thẳng hóa bộ gen AcMNPV trước khi chuyển nhiễm vào trong tế bào
côn trùng
Sử dụng Bsu36I để cắt bộ gen AcMNPV tại hai vị trí của gen polyheđrin,một là gen
603 và vị trí kia là gen 1629 cần thiết cho sự nhân lên của virus, khi DNA từ
baculovirus này được xử lý với Bsu36I và chuyển nhiễm vào các tế bào côn trùng , sự
nhân lên của virus không xảy ra do thiếu gen 1629. Vector chuyển nạp gồm có gen
quan tâm có thể có gen đánh dấu chọn lọc. các vector chuyển nạp này được đưa vào tế
bào côn trùng trước đó được chuyển nhiễm với hệ gen AcMNPV đã thẳng hóa. Sự
trao đổi kép vừa tạo nên phiêm bản có chức năng của gen 1629 vừa gắn kết gưn nhân
dòng vào bộ gen AcMNPV. Với hệ thống này, tới 99% các vết tan baculovirus là
virut tái tổ hợp
Quá trình tạo baculovirus tái tổ hợp
c. Vector con thoi baculovirus E.coli –tế bào côn trùng
- hệ thống có khả năng thực hiện các thao tác di truyền để tạo vector biểu hiện
baculovirus trong E.coli được phát triển, các tế bào côn trùng chỉ cần cho việc
tạo ra protein tái tổ hợp
- plasmid tái E.coli được thiết kế gồm gen kháng Kanamycine, vị trí cài nhập
(att) được chèn vào gen lacZ mà không làm mất chức năng của nó ( hình A)
- sau qua trình tái tổ hợp kép giữa DNA AcMNPV và plasmid E.coli sẽ tạo nên
vector con thoi baculovirut E.coli – tế bào côn trùng được gọi là bacmit
Trong quá trình chuyển nạp của đoạn gen cho vào bacmit cần phải có
- plasmid cho (plasmid E.coli ), gồm có gen kháng gentamycine đơn vị biểu hiện

gen đích được chặn hai đầu bằng trình tự cài nhập và gen kháng ampiciline nằm
ngoài vị trí gắn
- và plasmid phụ trở gồm có các gen chuyển vị, và gen kháng tetraciline
các tế bào virus được biến nạp kép, đoạn DNA được chuyển vị vào vị trí gắn của
bacmit. Sự gắn kết của đoạn DNA plasmid cho với với đơn vị biểu hiện và gen kháng
gentamicine vào vị trí gắn của bacmit sẽ phá vỡ khung đọc của gen lacZ. Vì vậy,vi
khuẩn chứa bacmit tái tổ hợp tạo ra khuẩn lạc trắng trong môi trường có IPTG và
X-Gal, ngoài ra các khuẩn lạc trắng kháng với kanamicine và nhảy cảm với
ampiciline và tetraciline chỉ mang bacmit tái tổ hợp mà không mang plasmid cho hay
trở giúp.Sau tất cả các thao tác này, sự gắn kết của gen nhân dòng có thể được khẳng
định bằng PCR. Cuối cùng bacmit tái tổ hợp có thể được chuyển nhiễm vào các tế bào
côn trùng ở đây các gen nhân dòng được phiên mã và protein tái tổ hợp được tạo ra
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-
Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản
năm 2007)
QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA (glycosylation)
Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn được đường hóa sau dịch mã. Quá trình đường
hóa là cần thiết cho chức năng của một sốprotein. Một thuận lợi khi biểu hiện protein
tái tổ hợp của sinh vật nhân chuẩn ở tế bào côn trùng là chúng có một hệ thống/con
đường đường hóa. Con đường đường hóa sau dịch mã tại các amino acid arginine ở
động vật có vú và côn trùng là giống nhau khi thêm gốc manose. Tuy nhiên các con
đường chuyển hóa khác lại khác nhau. Tuy vậy, được đường hóa một phần còn hơn
không. Hiện nay đã có các dòng tế bào côn trùng khác đã được cải biến gene để biểu
hiện toàn bộcon đường đường hóa ở động vật có vú
Ứng dụng : sản xuất β-iterferol, rhodopsin ở bò, protein vỏ virus HIV-1, interleukin,
lipaza tủy người, kháng nguyên virus hợp bào hô hấp, phức hệ protein vận chuyển,
chấ hoạt hóa plasmid mô, các protein virus bại liệt…
(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved
Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the
genetic revolution. Academic Press)

III. BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔHỢP Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
- Các hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật có vú có vai trò quan trọng để sản
xuất protein tái tổ hợp với đầy đủ các biến đổi sau dịch mã. Một số dòng tế bào đã
được phát triển cho mục đích này. Các tế bào có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu
Phi (COS) thận chuột Hamster non(BHK ), và thận phôi người (HEK-239) được
dung để biểu hiện gen ngắn hạn cho việc tạo nhanh một lượng nhỏ protein. Các tế
bào buồng trứng chuột Hamter Trung Quốc (CHO) thường được sử dụng để biểu
hiện dài hạn và khi cần một lượng lớn protein tái tổ hợp
-Một vector biểu hiện của động vật có vú tiêu biểu chứa vùng khởi đầu sao chép
nhân chuẩn(ori
euk
) thường từ virus động vật Vd virus khỉ (simian virus 40 SV40).
Các trình tự promoter điều khiển cả gen nhân dòng, gen đánh dấu chọn lọc và
trình tự kết thúc phiên mã đều phải là nhân chuẩn và thường được lấy từ virus
người hay từ gen của động vật có vú. Sự biểu hiện của gen quan tâm được tăng
cường bằng việc đặt trình tự của một intron giữa promoter của vùng nhân dòng đa
vị của bản thiế kế phiên mã. Các trình tự cần cho việc chọn lọc và nhân bản vector
biểu hiện của tế bào động vật có vú trong E.coli thường có nguồn gốc từ một
vector nhân dòng chuẩn của E.coli như pBR322
Vector biểu hiện động vật có vú tiêu biểu
Để có kết quả tốt gen quan tâm phải được trang bị các trình tự điều hòa dịch mã. Sự
khởi đầu dịch mã trong các sinh vật nhân chuẩn bậc cao phụ thuộc vào một trình tự
các nucleotide đặc hiệu bao quanh codon mở đầu (AUG) gọ là trình tự kozak (K), đó
là CC(A hoặc G)CCAUGG. Một tín hiệu phiên bản DNA của trình tự kozak gồm có
một trình tự tín hiệu (S) tạo điều kiện cho việc tiết, một trình tự protein đuôi (T) để
tăng khả năng tinh sạch của protein tái tổ hợp và trình tự cắt của protease (P) cho phép
việc cắt bỏ đuôi ra khỏi protein tái tổ hợp được đặt vào đầu của gen quan tâm. Việc bổ
sung một codon kết thúc (SC) đảm bảo cho quá trình dịch mã kết thúc tại vị trí chính
xác. Cuối cùng, trình tự chứa các vùng không được dịch mã (UTR) 3’, 5’ có vai trò
quan trọng đối với việc dịch mã và độ bền của RNAtt

Các yếu tố điều hòa dịch mã
Đa số các vector biểu hiện trong tế bào động vật có vú mang một gen duy nhất mã hóa
cho một polipeptit có chức năng. Tuy nhiên, dang hoạt động của một số proein quan
trọng trong thương mại chứa hai chuỗi protein khác nhau
Vd: hoocmon kích tuyến giáp ở người là một protein có hai chuỗi và cả hemoglobin
và các kháng thể đều có 4 tiểu phần
Có thể nhân dòng gen hay DNA bổ sung cho mỗi tiểu phần của một protein nhiều tiểu
phần tổng hợp và tích sạch mỗi tiểu phần một cách độc lập, và sau đó trộn với nhau
trong một ống nghiệm. nhưng tỉ lệ lắp ráp chính xác trong trường hợp này rất thấp.
ngược lại quá trình lắp protein dime và tetrae invivo lại rất tốt. vì vậy rất nhiều
phương pháp khác nhau được phát triển để sản xuất hai protein tái tổ hợp khác nhau
trong cùng một tế bào. Điều này được giải quyết theo ba cách:
1. Hai vector riêng biệt được sử dụng, mỗi vector mang gene mã hóa một tiểu phần

Tuy nhiên, thường xảy ra hiện tưởng mất một trong hai vector đối với tế bào chuyển
nhiệm kép. Ngoài ra, số lượng bản sao của hai vector không luôn được duy trì bằng
nhau, vì vậy gây ảnh hưởng đến sản lượng của sản phẩm cuối cùng
Để giải quyết vấn đề này các vector duy nhất mang hai gen nhân dòng đã được phát
triển
2. Một vector được sử dụng mang cả hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần,
mỗi gene chịu sự điều khiển của một promoter riêng.
3. Một vector được sử dụng mang cả hai gene tách biệt mã hóa cho hai tiểu phần, cả
hai gen chịu sự điều khiển của một promoter ( vector bixistron) Có thể thực hiện
được điều này là do hai gen nhân dòng được tách biệt với nhau bằng trình tự
IRES (trình tự DNA chứa một vị trí gắn trong ribosom ), cho phép dịch mã đồng
thời các protein khac nhau từ một phân tử RNAtt. Sự phiên mã của cấu trúc “gen
α- IRES- gen β” được điều hòa bởi một promoter và một tín hiệu polyađenyl hóa.
Lưu ý rằng phân tử mRNA đó được dịch mã 2 lần bởi hai ribosome khác nhau
bám vào hai vị trí khác nhau (đầu 5’ bình thường và vịtrí IRES). Quá trình này
khác với dịch mã mRNA polycistronic ở vi khuẩn, nơi mà một ribosome duy nhất

chạy dọc phân tử mRNA qua tất cảcác khung đọc mở có trên đó.

Các hệ thống đánh dấu chọn lọc cho các vector biểu hiện: các hệ thống biểu hiện
được sử dụng để chọn lọc tế bào động vật có vú đã chuyển nhiễm giống với các hệ
thống tương tự ở các vật chủ khác về hầu hết các phần. Một số phương pháp chọn lọc
được thiết kế không chỉ để xác định các tế bào được chuyển nhiiễm mà còn để tăng
sản lượng protein tái tổ hợp bằng việc nhân bội các vector biểu hiện. Hệ thống
đihyđrofolat reductaza – methotrexat (DHFR- MTX) thuộc loại này, DHFR xúc tác
việc khử đihyđrofolat thành tetrahyđrofolat, chất này cần để tổng hợp các purin, MTX
là chất ức chế cạnh tranh với DHFR. Sự mẫn cảm với MTX có thể vượt qua nếu tế
bào tạo ra thừa DHFR , khi nồng độ MTX tăng lên, thì gen DHFR trong các tế bào
nuôi cấy được nhân bội. ngoài ra còn có hệ thống glutamine synthetaza- methionine
sulfoximin(GS- MSX)
VI. ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN
Trong thực tế, động vật biến đổi gen đang được sử dụng để sản xuất protein tái tổ
hợp trong sữa, lòng trắng trứng, máu, urin, huyết tương, và ngay cả trong kén tơ. Ý
tưởng cơ bản là đơn giản: tận dụng lợi thế của cơ chế sản sinh các chất dịch để lắp
ghép các protein tái tổ hợp, với lợi thế của việc tinh sạch dễ dàng. Sử dụng tuyến vú
để sản xuất protein trong sữa là một trong các phương pháp tiếp cận được khám phá
nhiều nhất.ngoài những lợi ích trên thì để tạo ra thế hệ của một động vật biến đổi gen
là tốn kém, đội ngũ nhân viên có trình độ cao là cần thiết, cùng với các cơ sở thiết bị
đặc biệt, tỷ lệ thành công thấp. Có 3 phương pháp để chuyển gen vào động vật
- Các retrovirus nhiễm vào con cái vào giai đoạn phôi sớm trước khi cấy vào con
cái nhận. ưu điểm là có hiệu quả trong việc cài nhập gen chuyển vào bộ của tế
bào nhận, nhược điểm chỉ chuyển được đoạn DNA có kích thước nhỏ,
retrovirus có thể cài vào nhân vật chủ
- Vi tiêm vào nhân nguyên đực đã trương to của trứng thụ tinh. Khắc phục được
các nhược điểm của phương pháp dùng retrovirus, nhược điểm số bản sao quá
nhiều và gây biểu hiện quá mức làm rối loạn sinh lý bình thường của con vật
- Đưa các tế bào gốc phôi đã cải biến gen vào phôi giai đoạn sớm trước khi cấy

vào con cái nhận ưu điểm tránh được tính cài ngẫu nhiên của gen chuyển
V. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp ở thực vật
V.1 Tế bào thực vật
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được sử dụng để sản xuất các sản phẩm tự nhiên cách
đây hơn 20 năm và gần đây hơn chúng được dùng để sản xuất các protein tái tổ hợp.
Các tế bào thực vật rất thích hợp cho các nguyên liệu tái tổ hợp do chúng có thể sinh
trưởng trên môi trường tương đối đơn giản không cần bổ sung protein Nếu protein
ngoại lai được sản xuất trong nuôi cấy tế bào sẽ được tiết ra trong môi trường, nhiều
hơn phần được tích lũy trong tế bào, thì việc thu hồi và tinh sạch sản phẩm có thể
được tiến hành mà không có nhiều protein nhiễm bẩn. Các protein có nguồn gốc thực
vật an toàn cho người hơn các protein có nguồn gốc từ tế bào động vật bởi vì các chất
nhiễm bẩn và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Phương pháp
thường sử dụng là : Nuôi cây callus và nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào
và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng .Nuôi cấy dịch huyền
phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy
callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương tự với các hệ
thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trường lỏng
Một số protein tái tổ hợp được sản xuất bằng nuôi cấy tế bào thực vật
Proteinđượcbiểuhiện Loàithựcvật
Nhân tố sinh trưởng biểu mô người Nicotianatabacum
Hormone sinh trưởng ở người

N.tabacum
Albumin huyết thanh người
N.tabacum,Solanumtuberosum

Nhân tố sinh trưởng ở cá hồi N.tabacum
α-interferon người Oryzasativa
Hirudin(chống đông máu) N.tabacum
Erythropoietin người N.tabacum

α and β hemoglobin người N.tabacum
( />V.2 Cây chuyển gen
hp://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch22/edible_vaccine.html
Hệ vector thường sử dụng là vector có nguồn gốc từ plasmid Ti của vi khuẩn
A.tumefaciens, vi khuẩn gram âm, có khả năng biến nạp đoạn gen của nó vào thực
vật,có hai vector thường được sử dụng là:
- Thứ nhất là vector đồng cài nhập
- Thứ hai Vector kép có vùng khởi động sao chép DNA của E.coli và A.
tumefaciens
Ứng dụng
- Sản xuất vaccine chống bệnh infectious bursan desease virus (IBDV) ở gà chuyển
vào cỏ Arabidopsis.Chuyển gen ORF2 của virus gây bệnh viêm gan E vào cây cà
chua, cây Pichia pastoris.Sản xuất vaccine viêm gan B trong cây chuối chuyển gen,
cây cherry tomatillo (Physalis ixocarpa), yellow lupin, rau diếp và cà chua.Chuyển
LT-B của E. coli gây bệnh đường ruột vào khoai tây.
Tuy có nhiều ưu điểm hơn động vật nhưng ở thực vật tốc độ biểu hiện protein vẫn còn
chậm, khả năng kiểm soát việc biểu hiện còn thấp so với các hệ thống biểu hiện khác.
2,Khả năng đường hóa và khả năng giúp protein cuộn gấp đúng kém hơn so với tế bào
động vật và côn trùng.
(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-
Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản
năm 2007)
C. KẾT LUẬN
Rất nhiều protein cần biến đổi hậu dịch mã để thành proein hoạt tính nên đã phát triển
hệ thống vector biểu hiện ở eukaryote.Tất cả hệ thống vector biểu hiện ở eukaryote
đều có chung dạng cơ bản: gen quan tâm có thể gắn thêm các trình tự giúp việc tiết và
tinh sạch protein tái tổ hợp, dưới sự điều khiển của các trình tự Promotor, polyadenyl
hóa, kết thúc phiên mã của Eukaryote. Để đơn giản hóa cho duy trì và thao tác AND
tái tổ hợp, các vector biểu hiện ở Euk thường được duy trì trong E.coli
Tùy vào mục đích sử dụng mà chúng ta có thể lựa chọn hệ thống vector biểu hiện ở

nấm men hoặc côn trùng hoặc động vật có vú để sản xuất protein có đầy đủ biến đổi
hậu dịch mã. Nhưng hệ thống biểu hiện trong tế bào côn trung đang là sự lựa chọn
hàng đầu vì những ưu điểm của nó