thực tập tốt nghiệp y dược

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Bách khoa–
Đại học Đà Nẵng, cùng Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho
tôi thực hiện đợt thực tập này. Tôi gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô trong ngành đã tận tình
dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình theo học tại ngành. Đặc biệt
cảm ơn TS. Lê Lý Thùy Trâm – Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trưởng Bộ
môn Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng đã quan tâm,
hướng dẫn để tôi có thể hoàn thành bài báo cáo thực tập này.
Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Bệnh viện Phổi Đà Nẵng đã tạo điều kiện về
nhân lực và vật lực để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình thực tập. Tiếp đến, tôi xin gửi
lời cảm ơn đến BS. Bảo Thuyết cùng các anh chị trong khoa xét nghiệm đã nhiệt tình
hướng dẫn và truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong thời gian tôi thực tập.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường và hoàn
thành quá trình thực tập. Đặc biệt xin cảm ơn các bạn Đinh Thị Thu Hiền đã giúp đỡ tôi
rất nhiều trong quá trình cùng nhau thực tập tại Bệnh viện Phổi Đà Nẵng.
Trải qua quá trình thực tập với rất nhiều sự giúp đỡ cũng như sự cố gắng và nỗ lực
học hỏi của bản thân, đến nay báo cáo thực tập của tôi đã được hoàn thành. Tuy vậy,
trong quá trình thực tập tốt nghiệp vẫn còn nhiều kiến thức mới mẻ nên cũng không tránh
khỏi những thiếu sót. Vì vậy, rất mong cán bộ hướng dẫn, quý thầy cô, các anh chị và các
bạn có những ý kiến đóng góp để bài báo cáo thực tập của tôi được hoàn thiện hơn nữa.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, ngày tháng năm 2017
Sinh viên thực tập

SVTH[Type text]

Trang 1

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

DANH MỤC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AFB

Acid-fast bacillus (trực khuẩn kháng acid)

ATSH

An Toàn Sinh Học

BSC

Bio Safety Cabinet (Tủ an toàn sinh học)

CSDL

Cơ sở dữ liệu

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

MDR

Multiple drug resistant (Đa kháng thuốc)

MTB

Mycobacteria Tuberculosis

NTP

National Tuberculosis Program (Chương trình chống lao quốc gia)

PCC

Probe Check Control (Đối chứng kiểm tra mẫu dò)

PCR

Polymerase Chain Reaction

PXN

Phòng Xét Nghiệm

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

RIF

Rifampicin

SVTH[Type text]

Trang 2

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
UBND

Ủy ban nhân dân

SOP

Standard Operating Procedure (Quy trình chuẩn)

SPC

Sample Processing Control (Đối chứng quá trình xử lý mẫu)

XN

Xét Nghiệm

DANH MỤC BẢNG
Số hiệu
Bảng 2.1
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9

Tên bảng
Ưu, nhược điểm của một số phương pháp chẩn đoán lao đa
kháng.
Hóa chất, mẫu bệnh phẩm và dụng cụ thí nghiệm nhuộm soi
trực tiếp
Hóa chất và thiết bị dùng trong xét nghiệm Xpert
Một số lỗi thường gặp trong xét nghiệm Xpert
Kết quả tương ứng ghi trên phiếu xét nghiệm
Hóa chất và thiết bị dùng trong nuôi cấy môi trường lỏng
Quy định trả kết quả môi trường lỏng
Hóa chất và thiết bị dùng trong nuôi cấy môi trường đặc
Quy định trả kết quả môi trường đặc
Hóa chất và thiết bị dùng trong định danh TbcID

SVTH[Type text]

Trang 3

Trang
10
11
15
20
21
22
27
29
34
36

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 1.7
Hình 1.8
Hình 1.9
Hình 1.10
Hình 2.1
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5

Tên hình
Bệnh viện Phổi Đà Nẵng
Sơ đồ tổ chức của bệnh viện Phổi Đà Nẵng
Tủ ATSH cấp 2 Telstar
Tủ ATSH cấp 2 Esco
Máy ly tâm Thermo
Máy Vortex Ika Genius 3 IKA
Máy GenXpert Cepheid

Máy MGIT BACTECH
Kính hiển vi
Tủ ấm
Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
Một số hóa chất dùng nhuộm soi trực tiếp
Một số bước nhuộm mẫu bệnh phẩm
Soi tiêu bản dưới kính hiển vi
Hình ảnh mô tả 5 probe A, B, C, D, E để xác định tính kháng
Rifampicin của vi khuẩn lao
Các bước xử lý mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm GeneXpert

SVTH[Type text]

Trang 4

Trang
1
2
3
3
4
5
5
6
7
7
8
11
13
13

14
17


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11
Hình 3.12
Hình 3.13
Hình 3.14
Hình 3.15

Cartridge
Cartridge sau khi mở nắp
Quét mã ID của Cartridge
Khoang đặt Cartridge
Một số hóa chất dùng trong nuôi cấy
Nhập ống MGIT vào máy
Môi trường nuôi cấy đặc
Khuẩn lạc MTB
Tuýp cấy bị ngoại nhiễm
Kết quả test định danh TbcID

SVTH[Type text]

Trang 5

17
18
19
20
23
25
32
33
33
37


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CƠ SỞ THỰC TẬP

1.1. Bệnh viện Phổi Đà Nẵng
1.1.1. Quá trình hình thành và phát triển

Hình 1.1 Bệnh viện Phổi Đà Nẵng
Bệnh viện Phổi Đà Nẵng là bệnh viện chuyên khoa hạng II về lĩnh vực Lao và bệnh
Phổi, trực thuộc Sở Y tế Thành phố Đà Nẵng. Bệnh viện được thành lập theo quyết định
số 91/2005/QĐ-UBND ngày 28 tháng 7 năm 2005 của Chủ tịch UBND Thành phố Đà
Nẵng. Trụ sở của bệnh viện được xây dựng tại phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,
Thành phố Đà Nẵng. Tên gọi đầu tiên khi thành lập là Bệnh viện Lao và Bệnh Phổi Đà
Nẵng, sau đó được đổi tên thành Bệnh viện Phổi Đà nẵng vào ngày 16/08/2016 [3]

SVTH

Trang 6


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
1.1.2. Chức năng và nhiệm vụ
Bệnh viện có chức năng và nhiệm vụ khám, cấp cứu, chữa bệnh, phục hồi chức năng
về lĩnh vực chuyên ngành Lao và bệnh Phổi; đào tạo và tham gia đào tạo nhân lực y tế,
chỉ đạo tuyến và tham gia phòng – chống dịch bệnh; nghiên cứu khoa học, triển khai ứng
dụng khoa học công nghệ, kỹ thuật hiện đại phục vụ người bệnh và phục vụ công tác
chăm sóc sức khỏe nhân dân.
Bên cạnh đó bệnh viện chủ động thiết lập các mối quan hệ, hợp tác về khám- chữa
bệnh, cung cấp thiết bị, đào tạo, nghiên cứu khoa học với các tổ chức quốc tế; xây dựng,
tổ chức các đề án liên doanh, liên kết với các tổ chức cá nhân nước ngoài, kể cả các tổ
chức phi chính phủ cử cán bộ đi học tập nghiên cứu ở nước ngoài; mời chuyên gia nước
ngoài đến nghiên cứu, trao đổi kinh nghiệm và học tập tại đơn vị [3].

SVTH

Trang 7


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
1.1.3. Cơ cấu tổ chức
Tổ chức của bệnh viện gồm 11 khoa phòng:

Hình 1.2 Sơ đồ tổ chức của bệnh viện Phổi Đà Nẵng

1.2. Khoa Xét nghiệm

Khoa xét nghiệm thuộc Bệnh viện Phổi Đà Nẵng, có chức năng hỗ trợ chuẩn đoán
thông qua các kiểm tra về sinh hóa, huyết học, nuôi cấy tế bào, sinh học phân tử.
Khu làm việc của khoa xét nghiệm gồm có 2 tầng, trong đó:
 Tầng 1 chia làm 4 khu vực nhỏ: khu vực hành chính, khu vực xét nhiệm sinh hóa
- huyết học, khu vực nuôi cấy và thanh trùng, khu vực kho dụng cụ- thiết bị.

SVTH

Trang 8


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
 Tầng 2 của khoa là nơi dùng để xét nghiệm phân tử bao gồm các phòng chính như
phòng tách chiết DNA, phòng điện di, phòng Xpert, phòng Mix. Phòng tách chiết
DNA có nguy cơ lây nhiễm cao nên được bố trí tách ra với các phòng khác.
1.3. Thiết bị phòng thí nghiệm
1.3.1. Tủ an toàn sinh học

Hình1.3 Tủ ATSH cấp 2 Telstar

Hình 1.4 Tủ ATSH cấp 2 Esco

• Mục đích sử dụng:
Tủ an toàn sinh học là thiết bị hỗ trợ cho các thao tác xử lí mẫu bệnh, tách chiết DNA vi
khuẩn lao, xử lí, thao tác mẫu GenXpert. Đảm bảo thuận lợi và an toàn cho người thao
tác.
• Nguyên tắc hoạt động
B1: Tháo tấm chắn tủ ( đối với tủ Telstar), kéo tấm kính chắn tủ lên giữa tủ ( đối với tủ
Esco) , lau cồn toàn bộ bề mặt tủ.
B2: Bật quạt, bật đèn, bật nguồn điện nối với máy Vortex

SVTH

Trang 9


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
• Lưu ý khi sử dụng:
+ Vệ sinh trước và sau khi làm việc
+ Bật đèn UV trước và sau khi làm việc ít nhất 15 phút.
+ Quạt gió phải chạy ít nhất 5 phút trước và sau khi thực hiện XN
+ Dụng cụ và vật liệu trong tủ phải giữ ở mức tối thiểu, không được che chắn các lỗ

thông gió
+ Mọi thao tác nên được tiến hành ở khoảng 2/3 không gian bên trong tủ.
+ Hạn chế di chuyển trong và ngoài tủ để tránh bị nhiễu dòng khí
+ Không nên dùng đèn cồn trong BSC, sức nóng có thể làm đổi hướng dòng khí, làm

hỏng bộ lọc.
+ Tủ cần được hiệu chuẩn định kỳ.

1.3.2. Máy ly tâm

Hình1.5 . Máy ly tâm Mikro 200R Hettich
• Mục đích sử dụng:
- Máy ly tâm Mikro 200R Hettich: Dùng để phân tách dịc đờm ra khỏi vi khuẩn dựa trên
tỷ trọng của chúng( tỷ trọng của vi khuẩn 1,07-0,79); mặt khác nhằm tách DNA, lắng
DNA vi khuẩn Lao
• Nguyên tắc hoạt động
B1 : Cho bệnh phẩm đã xử lý vào trong các cối ly tâm
B2 : Đậy nắp thết độ tốc độ ly tâm, thời gian ly tâm

SVTH

Trang 10


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
B3 : Bấm starst
• Lưu ý khi sử dụng:
- Cho các mẫu cần ly tâm vào máy với thể tích bằng nhau và đặt chúng tại các vị trí cân
bằng, đóng chặt nắp.
- Cần tuân thủ đúng quy trình của nhà sản xuất
- Kiểm tra thường xuyên, vệ sinh máy móc, thiết bị
- Khởi động các thiết bị trước khi thực hiện xét nghiệm có liên quan
1.3.4. Máy Vortex

Hình 1.6 Máy Vortex Ika Genius 3 IKA
• Mục đích sử dụng: Đồng nhất mẫu với dung dịch xử lí, tăng hiệu quả của dung
dịch xử lí lên mẫu bệnh.
• Nguyên tắc hoạt động:
+ Bật công tắc , điều chỉnh tốc độ vortex bệnh phẩm thích hợp
• Lưu ý khi sử dụng :
+ Đóng chặt nắp ống chứa mẫu trước khi vortex.
+ Nên sử dụng ống đựng mẫu bằng nhựa tổng hợp, vì thủy tinh có thể vỡ phóng thích vật
liệu nhiễm khuẩn.
+ Sau vortex, cần để yên ít nhất 10 phút để vi khuẩn lắng xuống rồi mới mở
+ Vệ sinh trước và sau khi dùng, xử lý ngay khi có sự cố.
SVTH

Trang 11

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
1.3.5 Máy GeneXpert Cepheid

Hình 1.7 Máy GeneXpert Cepheid
• Mục đích sử dụng:
Thiết bị thực hiện kỹ thuật GeneXpert
• Nguyên tắc hoạt động
B1: Khởi động máy, nhập vào màn hình Desktop.
B2: Mở chương trình GenXpert
B3: Cho các Catridge vào khay chứa mẫu
B4: Quét mã vạch
B5: Đóng khay chứa mẫu. Vận hành máy.
• Lưu ý khi sử dụng:
- Cần kiểm tra thường xuyên trong thời gian chạy mẫu để tránh bị lỗi [11]
1.3.6 Máy MGIT BACTECH
• Mục đích sử dụng
Thiết bị nuôi cấy vi khuẩn lao trong môi trường lỏng
• Nguyên tắc hoạt động
B1: Khởi động máy
B2: Quét mã vạch tuyp MGIT chứa môi trường nuôi cấy lỏng
B3: Xếp ống vào ngăn đèn báo sáng
B4: Đóng máy

SVTH

Trang 12


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

• Lưu ý khi sử dụng: Cần kiểm tra thường xuyên trong thời gian nuôi cấy môi
trường lỏng để lấy mẫu dương và mẫu âm.

Hình 1.8 Máy MGIT BACTECH
1.3.7 Một số thiết bị khác

Hình 1.9 Kính hiển vi

SVTH

Hình 1.10 Tủ ấm

Trang 13


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG 2

SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN LAO VÀ BỆNH LAO

2.1. Vi khuẩn lao và sự lây truyền của vi khuẩn lao
2.1.1. Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis (MTB)
- Giới: Bacteria
- Ngành: Actinobacteria
- Bộ: Actinomycetales
- Phân bộ: Corynebacterineae
- Họ: Mycobacteriaceae
- Giống: Mycobacterium
- Loài: M. tuberculosis

Hình 2.1. Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis (MTB) là một loài vi khuẩn gây bệnh trong
chi Mycobacterium và là tác nhân nhân gây bệnh của hầu hết các ca bệnh lao (nên được
gọi là "vi khuẩn lao").
Vi khuẩn lao có hình dạng thanh mảnh, hơi cong nên còn được gọi là “trực khuẩn
lao”. Kích thước khoảng 0,4 x 3-5 mm. Chúng không có vỏ, không có lông và không có
nha bào. Thành tế bào vi khuẩn lao chỉ chứa một số lượng nhỏ peptidoglycan, nhưng
chứa nhiều lipid, tạo nên tính kháng cồn – acid . Trong bệnh phẩm, trực khuẩn lao đứng
thành đám nhỏ, xếp như hình chữ N, V, Y hoặc đứng riêng lẻ. Nhuộm Ziehl- Neelsen vi
khuẩn lao bắt màu đỏ [9].

SVTH

Trang 14


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Vi khuẩn lao thuộc loại vi khuẩn ưa khí, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 oC. Vi khuẩn
lao không nuôi được ở môi trường thông thường mà phải nuôi ở môi trường đặc biệt giàu
chất dinh dưỡng.
Vi khuẩn lao mọc rất chậm, thời gian phân chia khoảng 18 giờ một lần. Trên môi
trường Lowenstein- Jensen (gồm chủ yếu khoai tây, lòng đỏ trứng gà, asparagin, glycerin
0,75%), sau 4-6 tuần vi khuẩn lao mới hình thành khuẩn lạc điển hình. Khuẩn lạc dạng R,
sần sùi như hình hoa lơ. Trên môi trường lỏng (canh thang Sauton, Middlebbrook 7H9,
7H12) vi khuẩn lao mọc thành váng, đám hoặc lắng cặn [9].
2.1.2. Sự lây truyền của vi khuẩn lao
Bệnh lao lây truyền qua đường hô hấp do hít phải các hạt mù chứa vi khuẩn lao. Hạt
mù tạo ra từ bệnh nhân lao khi ho, hắt hơi hoặc nói. Vì vậy, khu vực cho bệnh nhân khạc
đờm phải có thông khí tốt, ít người qua lại. Mặt khác, trong PXN vi sinh lao, vì phải thao
tác với các mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn lao và thao tác với chủng vi khuẩn lao nên sẽ

có khả năng tạo ra các hạt mù nếu xét nghiệm viên không tuân thủ các bước theo đúng
qui trình. Đặc biệt, PXN phải thực hiện các biện pháp khử khuẩn đối với các vật liệu,
bệnh phẩm và vi khuẩn sau khi kết thúc xét nghiệm với mục đích không làm phát tán
nguồn nguy cơ lây nhiễm ra cộng đồng [1], [4].
2.2. Sơ lược về bệnh lao
2.2.1. Tình hình phát triển bệnh lao ở Việt nam và toàn thế giới [7]
Lao là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis thường gặp nhất
ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ
bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), hệ niệu dục, xương và khớp.
Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới, hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn chính và
thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi năm,
gây 1,5 triệu người tử vong (ước tính 2016), hầu hết ở các nước đang phát triển.Hầu hết
(90%) các trường hợp nhiễm khuẩn lao là tiềm ẩn không triệu chứng. 10% những người
SVTH

Trang 15


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
này trong cuộc đời họ sẽ tiến triển thành bệnh lao có triệu chứng, và nếu không điều trị,
nó sẽ giết 50% số nạn nhân. Tuy số người chết vì bệnh lao đã giảm đi rất nhiều, theo
WHO năm 2016 mỗi ngày vẫn có khoảng 4.100 người chết nhiều hơn so với
bệnh AIDS 3.300 người .
Theo báo cáo toàn cầu về bệnh lao và kiểm soát bệnh lao năm 2014 của Tổ chức Y tế
thế giới, hiện có 1/3 dân số thế giới đã nhiễm lao.Tình hình dịch tễ lao kháng thuốc đang
có diễn biến phức tạp và xảy ra ở hầu hết các quốc gia.
Ước tính năm 2013, trên toàn thế giới có 12 triệu người hiện mắc lao, 9 triệu người
mới mắc lao, 13% dân số mắc lao có đồng nhiễm HIV, 1 triệu rưỡi người tử vong do lao,
trong đó 0,36 triệu người tử vong có đồng nhiễm HIV, 65.000 người mắc lao đa kháng
thuốc.

Tại Việt Nam, mặc dù chương trình chống lao quốc gia đã đạt được nhiều thành tựu
trong kiểm soát, phát hiện và điều trị, song bệnh lao ở nước ta vẫn còn nặng nề, đứng thứ
12 trong số 22 nước có tình hình dịch tễ lao cao nhất, thứ 14 trong số 27 nước có gánh
nặng bệnh lao đa kháng thuốc cao nhất thế giới (báo cáo WHO năm 2014).
2.2.2 Các phương pháp chẩn đoán lao
Trước tình hình cấp bách của việc phòng chống bệnh lao nhiều phương pháp từ
truyền thống đến hiện đại đã ngày càng được cải tiến để đáp ứng kịp thời với nhiệm vụ
quan trọng này.
Bảng 2.1: Ưu, nhược điểm của một số phương pháp chẩn đoán lao
Phương pháp
Ưu điểm
Phương pháp nuộm soi trực Nhanh (2h),giá thành rẻ so
tiếp
với các phương pháp khác
Phương pháp nuôi cấy Dễ dàng phát hiện vi khuẩn
kháng sinh đồ trên môi sống
trường đặc
Dễ phân lập được khuẩn lạc
Phương
SVTH

pháp

nuôi

Nhược điểm
Chỉ phát hiện vi khuẩn
kháng acid AFB
Thời gian phát hiện dài: 812 tuần
Dễ bị ngoại nhiễm do vi

khuẩn, nấm

cấy Thời gian phát hiện ngắn Giá thành cao
Trang 16


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
kháng sinh đồ trên môi hơn: 3-4 tuần
trường lỏng

Dễ bị ngoại nhiễm

Phương pháp phân tử (PCR, Nhanh , nhạy
GeneXpert )
Không yêu cầu cao về bảo
quản mẫu (không cần vi
khuẩn sống)
Phát hiện được vi khuẩn
kháng Rifampicin

Giá
thành
cao
(~
100USD/test) đối với XN
GeneXpert.
Không phân biệt được vi
khuẩn sống, vi khuẩn chết.

CHƯƠNG 3

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO
3.1 Hướng dẫn nhận mẫu trước khi chẩn đoán lao
a. Nguyên tắc
Nhân viên nhận mẫu phải kiểm tra mẫu cẩn thận ngay khi nhận. Mẫu phải đủ thông tin
và đảm bảo an toàn về mặt sinh học và xét nghiệm.
SVTH

Trang 17


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
b. Vật dụng, trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học; hóa chất sát khuẩn; găng tay; bông gạc hoặc giấy vệ sinh; dao, kéo
c. Yêu cầu về nhận mẫu
- Mẫu được giao nhận tại khu vực riêng.
- Hộp vận chuyển mẫu được mở trong tủ an toàn sinh học và tuân theo các bước sau:
- Đeo găng tay dùng một lần trong quá trình nhận và kiểm tra mẫu.
- Kiểm tra bên ngoài hộp chuyển mẫu xem có dấu hiệu bị rò rỉ không. Nếu hộp chuyển
mẫu bị rò rỉ phải hủy bỏ như rác thải y tế lây nhiễm. Nếu hộp chuyển mẫu nguyên vẹn và
đặt theo chiều mũi tên mở nắp hộp cẩn thận bằng kéo hoặc dao.
- Lấy phiếu xét nghiệm và danh sách vận chuyển mẫu ra khỏi túi nilon và cất riêng.
- Kiểm tra từng mẫu nếu có dấu hiệu bị rò rỉ hủy bỏ. Mẫu nguyên vẹn lần lượt bỏ chun
buộc, túi nilon dày, màng nilon mỏng và lớp giấy vệ sinh để bộc lộ tuýp mẫu
- Đặt tuýp mẫu vào giá tuýp.
- Nếu hộp chuyển mẫu không đúng theo chiều mũi tên, đặt hộp lại theo đúng chiều, lấy
tuýp mẫu như hướng dẫn ở trên. Lau phần tiếp xúc giữa nắp và tuýp bằng dung dịch sát
khuẩn phù hợp (phenol 5%, hoặc cồn 70%) không làm mất các thông tin mẫu ghi trên
thành tuýp. Ly tâm nhẹ để đờm (hoặc dịch lỏng) chuyển xuống phần đáy tuýp.
-Kiểm tra, đối chiếu thông tin trên mẫu với danh sách vận chuyển mẫu và phiếu xét
nghiệm

- Hộp vận chuyển loại dùng lại phải lau bằng dung dịch sát khuẩn phù hợp
- Thu gom vật liệu đóng gói hủy theo rác thải lây nhiễm
- Hủy bỏ găng tay và rửa tay sau khi nhận mẫu
3.2 Phương pháp nhuộm soi trực tiếp
3.2.1 Nguyên lý
Nhuộm Zielh-Neelsen được sử dụng cho nhuộm soi AFB. Chất nhuộm carbol fuchsin
(Đỏ Fucsin) dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ gắn chất hữu cơ với axit mycolic có trong vách
tế bào vi khuẩn và không bị mất sau khi tẩy mầu và nhuộm với xanh methylene, trực
khuẩn bắt mầu hồng đỏ đặc trưng cho vi khuẩn họ Mycobacteria trong vi trường, khi soi
đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học [2].
3.2.2 Hóa chất , mẫu bệnh phẩm , vật liệu và trang thiết bị
Bảng 3.1 Hóa chất và trang thiết bị dùng trong nhuộm soi trực tiếp
SVTH

Trang 18


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Hóa chất & mẫu thử
+ Mẫu bệnh phẩm
+ Nước cất
+ Cồn tuyệt đối
+ Dung dịch cồn acid 3%
+ Dung dịch fucshin 0,3%

Vật liệu , trang thiết bị
+ Lam kính
+ Giá nhuộm lam kính
+ Giá đựng lam kín
+ Que hơ nóng

+ Que phết đờm
+ Máy sấy
+ Tủ an toàn sinh học cấp 1

+ Dung dịch methylen 0,3%

Hình 3.1 Một số hóa chất dùng soi nhuộm soi trực tiếp
3.2.3 Cách tiến hành
• Chuẩn bị tiêu bản
+ Dùng lam kính mới, ghi mã bệnh phẩm trên nhãn
+ Trong tủ an toàn sinh học , mở hộp bệnh phẩm, chọn vị trí đờm đặc, nhày, màu
vàng, phết và dàn đều bệnh phẩm vào mặt trên lam kính
+ Làm khô tiêu bản bằng máy sấy
• Nhuộm màu fucshin
+ Xếp tiêu bản theo thứ tự trên giá nhuộm, cách nhau 1cm
+ Hơ nóng tiêu bản cho bốc hơi nhẹ, để nguội
SVTH

Trang 19


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
+ Phủ dung dịch fucshin 0,3% lên toàn bề mặt tiêu bản
+ Hơ nóng mặt dưới tiêu bản cho bốc hơi nhẹ, để nguội
+ Nếu fucshin tràn đổ, bổ sung thêm fucshin và hơ nóng lại, để ít nhất 5 phút
+Rửa tiêu bản nhẹ nhàng cho trôi hết thuốc nhuộm
• Tẩy màu
+ Phủ đầy dung dịch cồn acid 3% để trong 3 phút
+ Rửa tiêu bản nhẹ nhàng, nghiêng tiêu bản cho ráo nước
+ Nếu tiêu bản vẫn còn màu hồng, tẩy màu lai lần 2 từ 1-3 phút

• Nhuộm nền xanh methylene
+ Phủ dung dịch xanh methylene 0,3% lên toàn bộ bề mặt tiêu bản để trong 30s-1
phút
+ Rửa tiêu bản nhẹ nhàng, nghiêng tiêu bản cho ráo nước
+ Để khô tiêu bản tự nhiên

Hình 3.2 Một số bước nhuộm mẫu bệnh phẩm
• Tiến hành soi chẩn đoán AFB
SVTH

Trang 20


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tiến hành điểu chỉnh tiêu cự thích hợp nhằm soi và phát hiện AFB có trong tiêu bản

Hình 3.3 Soi tiêu bản duới kinh hiển vi
Lưu ý
Trong quá trình hơ nóng tránh để quá lâu làm chết vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm,
sau khi hơ nóng để một lúc cho tiêu bản ngoại bớt rồi mới nhuộm fucshin để khỏi làm
bong tiêu bản khỏi lam kính
3.2.4 Báo cáo kết quả
3.3 Phương pháp xét nghiệm GENE XPERT MTB/RIF
3.3.1. Nguyên lý [6]
Kỹ thuật xét nghiệm GeneXpert dựa trên việc tích hợp 3 công nghệ: tách gen, nhân
gen và xác định gen:
- Tách gen: Vi khuẩn bị tiêu hủy bởi sóng siêu âm mạnh, DNA của vi khuẩn sẽ được chiết
tách và có hệ thống tự kiểm định chất lượng quá trình chiết tách.
- Nhân gen (khuếch đại gen): phản ứng nhân gen gọi là Realtime hemi-nested PCR là yếu
tố quan trọng tạo nên độ nhạy đặc biệt của kỹ thuật.

- Xác định gen: Các đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn lao và tính kháng Rifampicin sẽ
được phát hiện và đánh giá dựa trên việc sử dụng 5 primer đặc hiệu và 5 probe phân tử.
Hình dưới đây mô tả 5 probe A, B, C, D, E để đánh giá tính kháng Rifampicin của vi
khuẩn lao.

SVTH

Trang 21


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Hình 3.4. Hình ảnh mô tả 5 probe A, B, C, D, E để xác định tính kháng Rifampicin
của vi khuẩn lao
• Quy trình tắc vận hành [2].
- Hỗn dịch sau khi đưa vào máy sẽ được tự động lọc và rửa
- Vi khuẩn bị giữ lại trên màng lọc sẽ bị tiêu huỷ bởi sóng siêu âm và DNA của vi
khuẩn sẽ được chiết tách
- DNA sau khi được chiết tách sẽ được tự động hoà trộn với hoá chất
- Phản ứng nhân gen (PCR) xảy ra
- Các đoạn gien đặc hiệu của vi khuẩn lao và tính kháng Rifampicin sẽ được phát hiện
và đánh giá
- Kết quả xét nghiệm sẽ được báo trên màn hình máy tính
3.3.2. Hóa chất, mẫu bệnh phẩm, vật liệu và trang thiết bị
Bảng 3.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong xét nghiệm Xpert
Thiết bị

SVTH

Vật liệu

Trang 22

Hóa chất


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

- Hệ thống GeneXpert
MTB/RIF
- Máy Scan mã vạch 2D
- Máy tính điều khiển phần
mềm
- Máy in (không bắt buộc)
- UPS 1500 AV
- Đĩa CD-R/W để lưu trữ dữ
liệu.
- Tủ ATSH.
- Tủ lưu mẫu.
- Máy vortex, máy ly tâm.

- Pipet nhựa vô trùng chia
vạch
- Thùng rác thải vật liệu
sinh học nguy hiểm có nắp
đậy
- Giấy thấm/khăn
- Tuýp 50ml
- Giá cắm tuýp
- Găng tay, áo choàng,mũ

trùm đầu, khẩu trang.
- Bút, đồng hồ bấm giờ.

Dung dịch đệm RS
Cartridge
Cồn 70%
Dung dịch khử nhiễm

3.3.3 Cách tiến hành
a .Xử lý bệnh phẩm
Bệnh phẩm được chứa trong tuýp 50 ml, vặn chặt nắp, ghi đầy đủ thông tin theo quy
định lấy mẫu. Trước khi xử lí, nếu có hiện tượng rò rỉ do đậy nắp chưa chăt, cần vặn chặt
nắp và lau sạch phía ngoài tuýp bằng Presept 1% (lưu ý không lau mất thông tin ghi trên
thân tuýp).
• Đối với bệnh phẩm là đờm
+
+
1
2
3
4
5
•

Yêu cầu bệnh phẩm:
Thể tích: từ 1-3 ml
Chất lượng: nhày mủ, không được lẫn dị vật (máu, mảnh vụn thức ăn, đất…)
Cách xử lí:
Bổ sung đệm RS với tỷ lệ theo thể tích đệm RS : mẫu đờm = 2:1)
Đóng chặt nắp, lắc đều 10-20 lần hoặc voltex ít nhất 10 giây

Để đứng 5 phút
Lắc/ voltex lần 2
Để đứng 10 phút
Đối với bệnh phẩm là dịch dạ dày, dịch soi phế quản

Áp dụng cho trẻ em nghi lao không thể khạc được đờm hoặc lấy đờm tác động
SVTH

Trang 23


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
- Yêu cầu bệnh phẩm:
+ Dịch dạ dày: 10-20 ml
+ Dịch phế quản: 10-20 ml
- Cách xử lí:
1 Thêm nước cất đến vạch 40 ml
2 Li tâm 3000 g trong 15 phút
3 Chắc bỏ hết nước nổi
4 Bổ sung 1.5 ml đệm RS với 0.5 ml huyền dịch (tỷ lệ theo thể tích đệm RS : huyền dịch =
3:1)
5
6
7
8

Đóng chặt nắp, lắc đều 10-20 lần hoặc voltex ít nhất 10 giây
Để đứng 5 phút
Lắc/ voltex lần 2
Để đứng 10 phút

Chú ý:
-

Hỗn hợp (với đệm RS) có thể giữ ở 2-8 oC trong vòng 8h, nếu cần lặp lại xét
nghiệm.

-

Mẫu đờm trước khi xử lý (không dùng đệm RS) có thể để ở 35 oC trong vòng 3
ngày và 4oC trong 10 ngày.

-

Mẫu đờm cần được giữ ở 2-8oC trong thời gian chuyển mẫu.

Hình 3.5 Các bước xử lý mẫu bệnh (từ trái qua phải: ghi thông tin, thuần nhất
mẫu bệnh phẩm bằng đệm RS, Vortex)
b. Cho mẫu vào Xpert Cartridge.
1. Mở gói chứa Cartridge của Xpert MTB/RIF sau 15 phút trộn mẫu với đệm RS.
SVTH

Trang 24


BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Lưu ý: KHÔNG ĐƯỢC
+ Chạm vào phía sau của Cartridge, phần ống PCR
+ Sử dụng Cartridge đã mở gói quá 30 phút.
+ Sử dụng Cartridge đã qua sử dụng

+ Đánh rơi, đánh đổ Cartridge đã tra mẫu.
+ Lưu giữ Cartridge đã tra mẫu vào tủ lạnh

Hình 3.6. Mã code trên Cartridge
2. Ghi số xét nghiệm, tên bệnh nhân hoặc mã số của mẫu ở bên cạnh Cartridge. KHÔNG
viết lên phần mã code.
3. Dùng Pipet vô trùng trong bộ Kít có đánh dấu vạch đo lượng mẫu tối thiểu, để tra mẫu.
Không hút lượng mẫu ít hơn 2ml. Có thể cho lượng mẫu vào Cartridge nhiều hơn 2ml
một chút.
4. Đảm bảo chắc chắn rằng mẫu tra vào Cartridge không tạo bọt vì bọt có thể là nguyên
nhân của một số lỗi, gây ảnh hưởng đến kết quả.
5. Đảm bảo rằng thời gian xử lý mẫu đủ 15 phút. Nếu mẫu vẫn chưa được hòa tan hoàn
toàn sau 15 phút thì lắc đều và để thêm thời gian.
6. Mở nắp và tra mẫu đã xử lý vào Cartridge (lỗ hổng hình vợt phía cạnh).

SVTH

Trang 25