Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
-----------------------------

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP. GÂY BỆNH THỐI NHŨN
TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ
MAI MỰC ỐNG

Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số

: 62540105

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HÒA - 2017


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG
Trường Đại học Nha Trang
2. PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN
Trường Đại học Nha Trang

Phản biện 1:

GS.TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Thành phố Hồ Chí Minh

Phản biện 2:

GS.TS. NGUYỄN THỊ HIỀN
Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Phản biện 3:

PGS.TS. NGUYỄN ANH DŨNG
Trường Đại học Tây Nguyên

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp trường
họp tại Trường Đại học Nha Trang
vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Nha Trang


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LUẬN ÁN

1. Hoàng Ngọc Cương, Nguyễn Công Minh, Trang Sĩ Trung (2013). “Thu nhận
chitosan từ xương mực phế liệu và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây
bệnh thối nhũn (soft rot) trên cà chua sau thu hoạch”. Hội nghị khoa học Công nghệ
sinh học toàn quốc 2013.
2. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung
(2016). “Preparation and characterization of high purity β-chitin from squid pens

(Loligo chenisis)”. International Journal of Biological Macromolecules 93 (2016) 442–
447.
3. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Trang Si Trung
(2016). “High purity and high molecular weight β-chitin from squid pens (Loligo
chenisis)”. 11th Asia pacific chitin and chitosan & 5th Indian chitin and chitosan society
symposium, Kochi, Kerala, India, 28-30 September, 2016.
4. Hoang Ngoc Cuong, Nguyen Cong Minh, Nguyen Van Hoa, Khong Trung
Thang, Nguyen Anh Tuan, Trang Si Trung (2017). “Hight molecular weight and high
degree of deacetylation of chitosan prepared from squid pens (Loligo chenisis)”.
Journal of Polymer Material, Vol. 34, No. 1, 103-114.
5. Hoang Ngoc Cuong, Huynh Thanh Tung, Nguyen Cong Minh, Nguyen van
Hoa, Pham Thi Dan Phuong, Trang Si Trung (2017). “Antibacterial activity of
chitosan from squid pen (Loligo chenisis) against Erwinia carotovora from soft rot
postharvest tomato fruit”. Journal of Polymer Material, Vol. 34, No. 1, 319-330.


ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án:

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia
sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan
từ mai mực ống.

Ngành:

Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số:

62540105

Nghiên cứu sinh:

Hoàng Ngọc Cương

Khóa:

2011

Người hướng dẫn: PGS.TS. Trang Sĩ Trung
PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn
Cơ sở đào tạo:

Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:
1) Đã xác định được thành phần thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai
mực Loligo sp. tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở
khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo.
2) Đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn
thương mại. Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn
nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật
cao. Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn.
3) Đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu
chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn.
Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo
chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao
như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm. Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản
xuất ở qui mô lớn.
4) Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối
lượng phân tử khác nhau. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo
quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng
khuẩn của chitosan.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

NGHIÊN CỨU SINH


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Hiện nay Việt Nam là nước xuất khẩu thủy sản sang 156 thị trường trên thế giới với
tổng kim ngạch đạt 6 tỷ USD/năm đóng góp tích cực vào sự phát triển kinh tế cả nước. Tuy
nhiên thực trạng hiện tại đang diễn ra là một lượng rất lớn phế liệu thủy sản (phế liệu cá, tôm,
cua, ghẹ, mực,…) bị thải ra sau quá trình chế biến gây ô nhiễm nghiêm trọng đến môi trường
và cân bằng hệ sinh thái. Do đó việc xử lý kịp thời và hiệu quả lượng phế liệu này không
những góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường mà còn nâng cao hiệu quả sản xuất kinh doanh
và hiệu quả sử dụng tài nguyên thông qua việc thu hồi các hợp chất có hoạt tính sinh học. Gần
đây nguồn phế liệu mai mực được giới khoa học quan tâm nghiên cứu vì đây là nguồn nguyên
liệu tốt để thu nhận -chitin và chitosan có độ tinh khiết cao và có thể ứng dụng trong các lĩnh
vực như y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm và bảo quản nông sản sau thu hoạch. Tuy nhiên
các thông tin công bố về điều kiện thu nhận và tính chất của β-chitin và chitosan từ mai mực
ống còn rất hạn chế, trong đó có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn của chúng. Ở Việt Nam
chưa có nghiên cứu chính thức nào về quy trình thu nhận, đánh giá các hoạt tính sinh học và
ứng dụng β-chitin và chitosan thu được từ β-chitin. Đây là một rào cản khi tiếp cận với nguồn
nguyên liệu mai mực ống.
Song song với sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến thủy sản, lĩnh vực xuất
khẩu nông nghiệp đang tích cực hội nhập, trong đó chỉ tính riêng kim ngạch xuất khẩu rau quả
2015 đạt 1,8 tỷ USD. Tuy nhiên tổn thất nông sản sau thu hoạch ở hiện nay nước ta là rất cao,
chiếm tới hơn 20% tổng sản lượng gây tổn thất lớn cho nền kinh tế. Trong đó, thối nhũn (soft

rot) là bệnh phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng. Trên thực tế việc sử dụng tràn lan các thuốc
hóa học, chất bảo quản không rõ nguồn gốc trong phòng trừ bệnh sau thu hoạch khiến sản phẩm
nông sản sau thu hoạch có giá trị kinh tế cao mất an toàn vệ sinh, giảm giá trị thương phẩm. Do
đó, việc sử dụng các sản phẩm nguồn gốc tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn phòng trừ bệnh
thối nhũn trên rau quả là rất cần thiết nhằm hạn chế tác hại của dư lượng các thuốc hóa học đến
sức khỏe con người. Vì vậy, hướng nghiên cứu thu nhận các polyme sinh học từ phế liệu thủy
sản và ứng dụng bảo quản nông sản sau thu hoạch đang được các nhà khoa học quan tâm. Do
vậy, luận án tiến hành "Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây
bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống" được thực hiện với
mục đích là thu nhận -chitin và chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực
Loligo sp. thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu. Từ đó đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn (soft rot) trên cà chua sau thu hoạch của chitosan thu
được ở điều kiện in vitro và in vivo, làm cơ sở khoa học ứng dụng chitosan trong bảo quản nông
sản sau thu hoạch.
2. Mục đích của Luận án
1. Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực Loligo sp.
thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu.
1


2. Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên.
3. Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái cà chua
sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp. gây ra.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Phế liệu mai mực Loligo sp. được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thải ra
sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu thuộc tỉnh Kiên Giang. Mẫu thu nhận ở dạng tươi,
có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
1. Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và thành phần khoáng của nguồn

phế liệu mại mực Loligo sp.
2. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ
và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu
chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch -chitin trong quá trình
thu nhận.
3. Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá
trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan có độ deacetyl trên 90% đạt tiêu chuẩn
thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl.
4. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua
sau thu hoạch. Sau đó, khảo sát đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm chitosan thu
được ở các khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp. ở điều kiện in vitro và
in vivo.
4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại: Xác định hàm lượng protein còn lại trên
chitin (hàm lượng protein < 3%) bằng phương pháp MicroBiuret được mô tả bởi Aye và
Stevens 2006; Xác định độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của chitin dựa vào đo độ hấp phụ
quang học sau khi thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein và cộng sự 2008; Phân tử lượng trung
bình (Mw) của chitin được xác định thông qua độ nhớt nội và tính theo công thức Mark–
Houwink theo Einbu và cộng sự 2007; Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) đo trên máy PANalytical,
X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia chiếu xạ CuKα (λ = 1,54Å) với hiệu điện thế 40kV và cường
độ 40mA, góc quét 4o < 2θ < 44o, bước quét 0,05o, tốc độ quét 1o/min, ở nhiệt độ 25oC; Phổ
hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo trên máy Nicolet iS10, Thermo Scientific, bước sóng từ 548–
4000cm-1; Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng dung
môi DCl và D2O; Kính hiển vi điện tử SEM được chụp trên máy Hitachi S-4800; Kính hiển
vi điện tử truyền qua TEM được chụp trên máy H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện
2


thế 100 kv; Độ hòa tan của chitosan: được phản ánh thông qua mức độ hòa tan của 1g mẫu
trong 100ml dung dịch acid acetic 1% theo thủ tục được Samar và cộng sự 2013 ; Xác định độ

rắn của chitin, chitosan: được xác định thông qua chỉ số kết tinh (CrI - Crystalline Index) theo
phương pháp được mô tả bởi Pareek và cộng sự 2013 và mức độ kết tinh (χcr - Degree of
Crystallinity) theo phương pháp được Chebotok và cộng sự 2007.
Các kết quả thí nghiệm đều được xử lý thống kê, kiểm định so sánh các giá trị trung bình giữa
các nhóm bằng phần mềm SPSS, ANOVA và T test.
5. Kết cấu của Luận án
Luận án gồm 127 trang nội dung, 138 tài liệu tham khảo và 23 trang phụ lục. Nội dung
luận án được trình bày trong 3 chương với 25 bảng biểu và 45 hình ảnh, đồ thị và 18 sơ đồ,
qui trình.
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN

1.1. TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP. ĐỂ THU
NHẬN -CHITIN
1.1.1. Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp. và phế liệu từ mực sau chế biến

Mực ống Loligo sp. sống ở độ sâu, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu
khoảng 30-50 m. Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến
tháng 4 năm sau (vụ Bắc). Trong đó chủ yếu có 4 loài được đánh bắt với số lượng
chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica, Loligo chinensis, Loligo
beka và Todarodes pacificus.
Mai mực chiếm tỷ lệ khoảng 0,3-0,5% trọng lượng của toàn thân mực ống nguyên
liệu tươi hoặc 10-15% phế liệu nội tạng mực thải ra sau quá trình chế biến. Theo số liệu
thống kê của của Công ty Việt Nam Food thuộc tỉnh Cà Mau, lượng phế liệu từ chế
biến mực ống được công ty thu mua mỗi tháng khoảng 130 tấn. Do đó, lượng mai mực
thu được ước đạt trung bình 10-15 tấn/tháng. Tuy nhiên, hiện nay nguồn nguyên liệu
này chủ yếu là được phơi khô và bán thô cho các nhà máy chế biến làm thức ăn chăn nuôi
hoặc bán trực tiếp với giá thành thấp cho các thương lái sang thị trường Trung Quốc.
1.1.2. Thành phần hóa học của nguyên liệu và qui trình thu nhận chitin, chitosan
Các nghiên cứu cho thấy chitin tồn tại trong tự nhiên ít khi ở dạng tự do mà luôn liên
kết với các thành phần khác dưới dạng phức hợp với protein, cacbonat canxi và nhiều hợp

chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách chiết và thu nhận chitin (Hình 1.1).
Thành phần hóa học của nguồn nguyên liệu được xem là yếu tố quyết định đến việc
lựa chọn qui trình tách chiết và chất lượng của sản phẩm chitin thu được. So với các nguồn
phế liệu vỏ tôm, cua và ghẹ, phế liệu mai mực có hàm lượng chitin cao hơn nhiều (khoảng 303


50%) trong khi đó hàm lượng khoáng lại rất thấp (dưới 2%). Hàm lượng lipid cũng rất thấp
hoặc không phát hiện. Do đó, khi tách chiết thu nhận chitin có thể bỏ qua quá trình khử
khoáng và khử lipid mà chỉ tập trung vào quá trình khử protein (Hình 1.2).
O

HOH 2C
H

H
HO

HO

NH

HH
O
Ester bond
H3C

O
H

C

CH3

CH3

CH3

H
HOH 2C

R

CH3

CH3

O

H

Imine bond
H3C

H3C

HO

O

CH3

NHH

H

OH

HO

H

Chitin

CH3

O
C

O

C

H
H

O

HO

O

HOH 2C
H

H
NH

H

HO

CH3
C

H

O
NH
O

H3C

CH3

n

O

H
H
HOH 2C

C R
Fatty acid
O

Ester bond

Astaxanthin

N
Imine bond

R CH
C

O

NH
Protein

R CH
C

O
n

NH
R CH2

Hình 1.1. Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa astaxanthin với
các phân tử khác trong phế liệu tôm (Armenta và Guerrero-Legarreta, 2009).

Vỏ tôm, cua, ghẹ

Mai mực

Khử protein trong
môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Khử protein trong
môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Khử khoáng trong
môi trường acid (HCl, HNO3, )
Khử màu
(H2O2, K2MnO4, NaOCl, )
Thu nhận chitin

Thu nhận chitin

Deacetyl trong
môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Deacetyl trong
môi trường kiềm (NaOH, KOH)

Thu nhận chitosan

Thu nhận chitosan

Cắt mạch chitosan
(H2O2, )

Cắt mạch chitosan
(H2O2, )

Thu các chitosan ứng dụng

Thu các chitosan ứng dụng

Hình 1.2. Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác
nhau.
4


1.2. TỔNG QUAN VỀ -CHITIN VÀ CHITOSAN
1.2.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitin
Mạch phân tử chitin được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu
nối –1,4–glucosid. Công thức phân tử chung của chitin là (C8H13O5N)n. Đặc biệt, các liên
kết hydro nội phân tử xảy ra giữa các nhóm các nhóm hydroxyl và acetamide. Từ cấu trúc
phân tử có thể thấy chitin rất khó bị hòa tan trong các dung môi khác nhau. Dựa vào cấu trúc
hóa học, chitin có thể được chia thành ba dạng α-chitin, β-chitin và γ-chitin. Các dạng chitin
này cũng tồn tại trong tự nhiên trên các đối tượng khác nhau. Các cấu trúc khác nhau dẫn đến
tính chất cũng khác nhau. Cụ thể, α-chitin có độ rắn tinh thể (CrI) cao nhất, còn β-chitin thì có
độ rắn thấp nhất. Các nghiên cứu đã chứng minh độ rắn tinh thể của của α-chitin (85%) từ vỏ
tôm, cua và ghẹ cao hơn nhiều so với của β-chitin (72%) từ mai mực.
1.2.2. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan
Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl khỏi mạch
chitin còn gọi là quá trình deacetyl hoá, vì vậy chitosan là polyme chứa rất nhiều các đơn vị
Glucosamine nên có rất nhiều nhóm amin. Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông
thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic. Hằng số phân li
acid (pKa) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8 nên khi hoà tan trong môi trường acid loãng

chitosan tạo thành dung dịch keo dương. Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính
bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với
các polyme tích điện âm. Chitosan không hoà tan trong nước, kiềm và cồn.
Chitosan có khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với
chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA. Các tính chất này phụ thuộc rất lớn vào độ
deacetyl hóa và khối lượng phân tử. Chitosan có độ deacetyl càng cao thì có khả năng hấp
phụ chất màu, tạo phức với kim loại càng tốt. Tương tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao.
1.2.3. Phương pháp thu nhận chitin và chitosan
Nói chung, quá trình thu nhận chitin bao gồm ba bước: khử protein (deproteinizationDP), khử khoáng (deralization-DM) và khử màu (decolorization-DC). Những quá trình này
thường sử dụng một lượng lớn hóa chất và nước, do đó sẽ tạo ra một lượng lớn chất thải hóa
học độc hại. Đồng thời, một phần quá trình deacetyl (deacetylation-DA) của chitin và quá
trình thủy phân polyme làm cắt mạch chitin có thể xảy ra. Điều này ảnh hưởng đến tính chất
hóa lý và hoạt tính sinh học của sản phẩm chitin thu được.
1.2.4. Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan
Chitosan thu được bởi quá trình deacetyl phân tử chitin. Tác nhân deacetyl có thể là
các baz mạnh như NaOH và KOH hoặc các enzyme như chitinase. Công đoạn deacetyl được
thực hiện ở các chế độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính
chất của sản phẩm chitosan. Ngoài ra, người ta có thể sử dụng acid đặc để thực hiện quá trình
deacetyl. Tuy nhiên, việc xử lý bằng acid đặc thường kèm theo quá trình cắt mạch của polyme, do
đó thực hiện deacetyl trong môi trường kiềm đặc vẫn là phương pháp thường được sử dụng.
5


1.2.5. Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan
Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật như vi khuẩn Gram âm, Gram
dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl (DD)
và phân tử lượng truung bình (Mw). Tính kháng khuẩn của chitosan liên quan đến pH của môi
trường và các yếu tố khác trong môi trường, nhưng trước hết liên quan đến các đặc tính của
chitosan như độ deacetyl, chiều dài mạch (mức độ polyme hóa).

Hiện tại một số cơ chế đã được đề xuất để quan sát đặc tính kháng vi khuẩn của
chitosan và các dẫn xuất. Cơ chế được chấp nhận phổ biến nhất giải thích rằng vách tế bào vi
khuẩn tích điện âm dễ dàng phản ứng với phân tử chitosan tích điện dương, làm biến đổi tính
thấm tế bào, không cho cơ chất vào tế bào và làm cho các thành phần cấu tạo tế bào thoát ra
ngoài, cuối cùng dẫn đến cái chết của vi sinh vật, tác động kháng khuẩn thường diễn ra rất
nhanh (trong vài giờ). Thêm vào đó, chúng đều là các chất có khả năng phân giải sinh học và
không gây độc đối với tế bào động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, cần chú ý là khả năng này bị hạn
chế do tính tan hạn chế của chitosan (không tan trong môi trường pH > 7,0). Bên cạnh đó, độ
nhớt cao của dung dịch chitosan cũng là một trở ngại, gây kết tụ protein ở điều kiện pH sinh
lý.
1.3. BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH DO VI KHUẨN
Bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại nông sản sau thu hoạch chủ yếu do vi khuẩn Erwinia
spp. gây ra. Chi Erwinia spp. thuộc họ Enterobacteria là dòng vi khuẩn kỵ khí tuỳ ý gây bệnh
thối nhũn (soft rot) trên nhiều loại cây trồng và rau, củ, quả như khoai tây, cà chua, cải bắp,
dứa, ớt, cà rốt, hành tây, súp lơ, hướng dương, cây xương rồng và trên thuốc lá. Như các chi
khác thuộc họ Enterobacteria, chi Erwinia spp. là dòng vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử,
hình que, có thể di chuyển bằng các tiêm mao và là dạng vi khuẩn gây bệnh cơ hội có phổ ký
chủ rất rộng và khả năng lây nhiễm rất mạnh khi ở môi trường cận nhiệt đới và ôn đới. Các
nghiên cứu cho thấy các chủng gây bệnh chủ yếu trong chi này là Erwinia carotovora ssp.
carotovora (Ecc), Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca) và Erwinia chrysanthemi (Ech).
Khả năng Erwinnia sp. phá hủy thành tế bào thực vật, làm vết bệnh lan rộng, mềm và
phân rã là do tác động của các enzyme ngoại bào như endo-β-1-4-arabinase và endo-β-1-4xylanases. Các enzyme khác bao gồm nhóm cellulase có pH tối ưu gần 7, phá hủy vách tế bào
thực vật endohydrolysis của liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong cellulose, lichenin và ngũ cốc.
Các enzyme pectinase như lyases pectate (Pel), lyases pectin (PNL), polygalacturonases
(Peh) và methylesterases pectin (PME).
Erwinia sp. là dòng vi khuẩn tuỳ ý yếm khí, có thể tồn tại ở các điều kiện môi trường
khác nhau. Chúng không có khả năng tạo bào tử để có thể tăng khả năng tồn tại khi gặp điều
kiện sống không thuận lợi. Tuy nhiên chúng thường tồn tại trong hạt giống, nguyên liệu nông
sản bị nhiễm bệnh, trong quá trình canh tác, lưu trữ bảo quản và trong đất nông nghiệp tự
nhiên. Vi khuẩn này cũng được tìm thấy trong rễ của một số loại cỏ dại, cây trồng và nước

tưới . Côn trùng và gió đã tham gia vào sự lây lan của Erwinia sp.

6


CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mai mực ống Loligo chenisis
Mai mực ống (Loligo chenisis) được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc
tỉnh Kiên Giang ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày trung bình
0,5 mm. Mai mực tươi được rửa sạch loại tạp chất, đóng bao PA hút chân không và cấp đông
-4C cho đến khi được xử lý ở phòng thí nghiệm.
2.1.2. Trái cà chua Lycopersicon esculetum
Trái Cà chua thuộc Bộ: Solaneae; Chi: Lycopersicon; Loài: Lycopersicon esculentum.
Trái cà chua sau thu hoạch được chọn sử dụng trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm có
tên khoa học là Lycopersicun esculetun Mill. Mẫu được lựa chọn, thu mua tại Bình Dương,
Thủ Đức (TpHCM) và Nha Trang đạt tiêu chuẩn TCVN 4845:2007.
2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu
Hóa chất dùng nghiên cứu đều thuộc loại tinh khiết, trong đó hóa chất dùng trong quá
trình thu nhận chitin, chitosan (NaOH) hóa chất dùng trong phân tích các chỉ tiêu chất lượng
do công ty Mecrk, Đức sản xuất. Các loại hóa chất đều được bảo quản theo đúng yêu cầu của
nhà sản xuất ghi trên bao bì.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dùng phương pháp thực nghiệm theo qui hoạch cổ điển để bố trí thí nghiệm và xác
định điều kiện thực nghiệm để thu nhận sản phẩm tốt nhất.
Sử dụng các công cụ phân tích hiện đại, các phần mềm chuyên dụng để đánh giá tính
chất của nguyên liệu, sản phẩm và xử lý số liệu.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ
2.2.1. Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản
Xác định hàm lượng ẩm và khoáng theo chuẩn AOAC 1990; hàm lượng lipid bằng

phương pháp Folch; hàm lượng chitin bằng phương pháp Rao và cộng sự; hàm lượng protein
bằng phương pháp Biuret và MicroBiuret.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng
Xác định thành phần acid amin bằng phương pháp GC với một bộ kit (GC-EZ: FAAST)
để phân tích acid amin tự do theo chuẩn AOAC; thành phần khoáng bằng phương pháp quang
phổ hấp thu nguyên tử AAS theo chuẩn AOAC (2000).
2.2.3. Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan

7


- Xác định hàm lượng protein còn lại (hàm lượng protein > 3%) bằng phương pháp Biuret;
hàm lượng protein còn lại trên chitin (hàm lượng protein < 3%) bằng phương pháp
MicroBiuret được mô tả bởi Aye và Stevens 2006; độ acetyl (DA) hoặc deacetyl (DD) của
chitin dựa vào đo độ hấp phụ quang học sau khi thủy phân mẫu với H3PO4 theo Hein và cộng sự
2008; Phân tử lượng trung bình (Mw) của chitin được xác định thông qua độ nhớt nội và tính
theo công thức Mark–Houwink theo Einbu và cộng sự 2007.
Phổ nhiễu xạ tia X (XRD) đo trên máy PANalytical, X’Pert-PRO –MPD, sử dụng tia
chiếu xạ CuKα (λ = 1,54A) với hiệu điện thế 40kV và cường độ 40mA, góc quét 4 < 2θ <
44, bước quét 0,05, tốc độ quét 1/min, ở nhiệt độ 25C. Phổ hấp phụ hồng ngoại (FTIR) đo
trên máy Nicolet iS10, Thermo Scientific, bước sóng từ 548–4000cm-1. Phổ cộng hưởng từ
hạt nhân NMR đo 1H NMR (400 MHz, Bruker) sử dụng dung môi DCl và D2O. Kính hiển vi
điện tử SEM được chụp trên máy Hitachi S-4800. Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM được
chụp trên máy H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) ở mức điện thế 100 kv.
- Độ hòa tan của chitosan: được phản ánh thông qua mức độ hòa tan của 1g mẫu trong
100ml dung dịch acid acetic 1% theo thủ tục được Samar và cộng sự 2013 có điều chỉnh; độ
rắn của chitin, chitosan: được xác định thông qua chỉ số kết tinh (CrI - Crystalline Index) theo
phương pháp được mô tả bởi Pareek và cộng sự 2013 và mức độ kết tinh (χcr - Degree of
Crystallinity) theo phương pháp được Chebotok và cộng sự 2007.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm SPSS phân tích ANOVA kết hợp với Duncan test để so sánh giá
trị trung bình của các mẫu nghiên cứu. Số liệu báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần phân
tích, giá trị p<0.05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê; Sử dụng Originpro 8.5.1 để vẽ đồ
thị, các phổ FTIR, XRD.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP.
3.1.1. Thành phần hóa học cơ bản
Kết quả cho thấy phế liệu mai mực Loligo sp. có hàm lượng β-chitin là 35,8%. Giá trị
này cao hơn nhiều so với hàm lượng α-chitin có trong vỏ đầu tôm thẻ Penaeus vanamei là
9,3%, vỏ cua Callinectes sapidus là 12,9% và vỏ ghẹ chấm Portunus trituberculatus là
17,1%. Như vậy, phế liệu mai mực Loligo sp. có chứa một lượng lớn chitin và là nguồn
nguyên liệu lý tưởng để thu nhận β-chitin.
Ngoài ra, kết quả phân tích cũng cho thấy hàm lượng khoáng có trong mai mực Loligo
sp. là rất thấp với 1,37%. Đây là thông số rất quan trọng có ảnh hưởng đến việc lựa chọn quy
trình chiết rút và thu nhận -chitin. Đó là việc xem xét bỏ qua quá trình khử khoáng khi thu
8


nhân chitin từ mai mực. Nó vừa tránh được việc sử dụng hóa chất, vừa tránh được quá trình
cắt mạch chitin.
Như vậy, dựa trên kết quả phân tích thành phần hóa học cơ bản trong mai mực ống
Loligo sp. cho thấy các thành phần như chitin, khoáng, protein, lipid có trong phế liệu mai
mực ống Loligo sp. khá khác biệt so với trong phế liệu vỏ tôm cua ghẹ. Trong đó, hàm lượng
protein rất cao (57,2%) nhưng hàm lượng khoáng rất thấp (1,37%) so với các phế liệu vỏ
tôm, cua, ghẹ với protein (15-26%) và khoáng (26-35%). Do đó, có thể bỏ qua bước khử
khoáng và tập trung chủ yếu vào bước khử protein.
3.1.2. Thành phần khoáng
Khi so sánh với nguyên liệu vỏ tôm, mai mực chứa thành phần Ca là rất thấp (254
ppm) so vỏ tôm thẻ Penaeus vanamei (4856 ppm). Do đó, có thể suy ra hàm lượng thành phần

CaCO3 trong mai mực Loligo sp. là rất thấp so với hàm lượng CaCO3 trong vỏ tôm Penaeus
aztecus (48,9%), tôm Penaeus durarum (42,2%), vỏ cua (66,5%). Điều này khẳng định quá
trình thu nhận -chitin từ mai mực Loligo sp. sẽ thuận lợn hơn và là cơ sở để xem xét bỏ qua
quá trình khử khoáng bằng acid HCl như trong quy trình thu nhận chitin thông thường hiện
nay từ vỏ tôm, cua, ghẹ. Ngoài ra, không phát hiện thấy thành phần các kim loại nặng như
Hg, Pb, As trong mai mực Loligo sp.
Điều đó khẳng định, mai mực là nguồn nguyên liệu tốt để thu nhận sản phẩm -chitin
và chitosan có độ tinh khiết cao và có thể được sử dụng trong các lĩnh vực như y dược, y sinh
và thực phẩm.
3.1.3. Thành phần acid amin
Kết quả phân tích trong nguyên liệu mai mực Loligo sp., các thành phần Alanine,
Proline, Tyrosine và Histidine chiếm tỷ lệ lớn nhất (4,39-6,68 g/100g) trong khi các thành
phần khác như Leucine, Isoleucine, Serine, Proline, Methionine, Glutamic acid,
Phenylalanine có tỷ lệ thấp hơn (0,53-2,6 g/100g).
Như vậy, nguyên mai mực ống có chứa một hàm lượng acid amin thấp hơn nhiều so
với nguyên liệu tôm thẻ. Điều này, sẽ thuận lợi hơn cho quá trình loại bỏ các acid amin để thu
được chitin và chitosan tinh khiết hơn và có khả năng sử dụng các sản phẩm này cho nhiều
ứng dụng đòi hỏi chitin và chitosan có độ tinh khiết cao.
3.2. THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP.
3.2.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp.
Để có cơ sở tiến hành các khảo sát chi tiết, chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ trong một
khoảng rộng ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thu nhận chitin từ mai mực ống. Kết quả
cho thấy quá trình khử protein thực hiện ở nhiệt độ 30oC đạt hiệu quả rất thấp. Kết quả khẳng
định để đạt được mục tiêu yêu cầu về hiệu quả của quá trình khử protein (hàm lượng protein
còn lại nhỏ hơn 1%), đồng thời giảm thời gian khử, giảm sự cắt mạch chitin và có thể được áp
9


dụng vào sản xuất ở qui mô lớn thì nên tiến hành các khảo sát chi tiết them trong khoảng ảnh
hưởng của nồng độ NaOH 3-6 %, nhiệt độ từ 70-90oC trong khoảng thời gian 4-14 giờ với tỷ lệ

nguyên liệu giữ cố định là (1/10, w/v).

Hình 3.1. Ảnh hưởng của NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả khử protein và Mw của
β-chitin.
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản
phẩm β-chitin
Khi tăng nhiệt độ thì hiệu quả khử tăng nhưng quá trình cắt mạch chitin cũng tăng. Để
đạt mục tiêu về đặt ra hàm lượng protein còn lại thì chỉ cần tiến hành ở 80oC. Ở nhiệt độ này,
hàm lượng protein còn lại và khối lượng phân tử trung bình của chitin lần lượt là 0,7% và
8330 kDa. Do đó, chúng tôi chọn nhiệt độ là 80oC cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein
Kết quả phân tích cho thấy, ở điều kiện khảo sát thì hiệu quả khử tăng nhanh từ 4 giờ
(4,35%) đến 6 giờ (1,85%) sau đó giảm dần và đạt mục tiêu đặt ra sau 10 giờ (0,9%). Trong
khi đó, khối lượng phần tử trung bình của chitin thu được gần như không giảm nhiều từ 4 giờ
(8650 kDa) cho đến 8 giờ (8240 kDa) và sau đó giảm dần đến 14 giờ (5120 kDa). Như vậy,
để đảm bảo hiệu quả cắt mạch và tính chất mạch dài của sản phẩm chitin thì nên chọn thời
gian khử là 10 giờ. Do đó, chúng tôi chọn thời gian khử là 10 giờ cho các thì nghiệm sau.
10


3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein
Kết quả phân tích cho thấy, ở cùng điều kiện nhiệt độ khử 80oC và sau thời gian khử 10
giờ thì quá trình khử protein rất hiệu quả ở nồng độ NaOH từ 3,5% trở lên. Cụ thể ở các mức
nồng độ NaOH 3,5; 4; 4,5 và 5% hàm lượng protein còn lại trong mẫu sau khử lần lượt là
0,93; 0,63; 0,33 và 0,23%. Tuy nhiên, khi mức nồng độ NaOH tăng trên 4% thì quá trình cắt
mạch chitin xảy ra đáng kể, khối lượng phân tử trung bình của chitin Mw = 8545 kDa ở mức
NaOH 4% đã bị phân cắt xuống còn 7940 kDa ở mức NaOH 4,5% và chỉ còn 6320 kDa khi
nồng độ NaOH tăng ở mức 5%. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ NaOH 4% là nồng độ phù
hợp nhất để khử protein khi thu nhận chitin từ mai mực.
Tóm lại, khi tăng bất kỳ một trong 3 yếu tố sẽ là thay đổi hàm lượng protein còn lại và sự cắt

mạch chitin trong quá trình khử. Kết quả này là do các mạch chitin liên kết rất chặt chẽ với
các thành phân protein, khoáng thông qua 4 nhóm liên kết chính: các liên kết cơ sở Schiff,
liên kết O-glycosidic, liên kết N-glycosidic (68-91%) và các liên kết cộng hóa trị rất khó bị
phân cắt. Trong môi trường NaOH, mai mực bắt đầu trương nở cấu trúc và tiếp xúc với
NaOH và cắt đứt các liên kết protein và phức protein chitin từ đó khử dần protein trong mai
mực. Tuy nhiên quá trình cần hỗ trợ của yếu tố nhiệt độ và thời gian để NaOH có thể thấm
sâu vào cấu trúc và khử hoàn toàn protein trong nguyên liệu. Mặt khác, quá trình thấm sâu
vào cấu trúc để khử protein đã là đứt các liên kết nội giữa các mạch chitin và làm giảm khối
lượng phân tử trung bình của chitin. Để đạt được mục tiêu nghiên cứu là sản phẩm chitin thu
nhận có hàm lượng protein nhỏ hơn 1%, đồng thời hạn chế quá trình cắt mạch của sản phẩm
chitin, chúng tôi đề xuất điều kiện khử protein là nồng NaOH 4% ở nhiệt độ 80C trong thời
gian 10 giờ. Sản phẩm -chitin thu được có hàm lượng protein còn lại 0,63% với Mw là 8545
kDa.
3.2.5. Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống
3.2.5.1. Thành phần và tính chất cơ bản của sản phẩm -chitin
Mai mực ống có màu hơi vàng và trong suốt thì sản phẩm -chitin ở dạng bột có màu
trắng sáng. Sản phẩm -chitin thu được có hàm ẩm dưới 10%, có hàm lượng kim loại nặng
không phát hiện, hàm lượng protein còn lại thấp hơn 0,63 %, khối lượng phân tử trung bình
cao (Mw = 8545 kDa) và có độ deacetyl (DD = 19,7%). Đáng chú ý, mặc dù không qua giai
đoạn khử khoáng bằng acid HCl và khử màu như các quy trình thu nhận chitin thông thường
nhưng sản phẩm -chitin vẫn đạt tiêu chuẩn thương mại với độ tinh khiết cao.
3.2.5.2. Cấu trúc bề mặt của mai mực và sản phẩm β-chitin
Quan sát bề mặt bề mặt cắt của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp. (Hình 3.1a) thấy rõ
các tấm chitin được sắp xếp song song có định hướng và liên kết chặt chẽ các với các thành
phần khác như protein, lipid và khoáng tạo nên cấu trúc của mai mực. Sau quá trình khử, các
tấm chitin vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.1b).
11


Hình 3.2. Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin.

3.2.5.3. Độ kết tinh của mai mực và sản phẩm β-chitin
Kết quả phân tích cho thấy, trên phổ của cả mai mực và chitin đều xuất hiện 2 peak tại
góc 2θ = 8.1º là peak đặc trưng cho tính chất vô định hình của chitin và một peak xuất hiện tại
góc 2θ = 19.6º là peak đặc trưng cho tính chất kết tinh của chitin. Kết quả, CrI của nguyên
liệu mai mực và sản phẩm β-chitin lần lượt là 52,5 và 62,1%. Độ kết tinh của sản phẩm chitin
cao hơn của mai mực chứng tỏ hiệu quả của quá trình khử protein.

Hình 3.3. Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực.
3.2.5.4. Độ tinh khiết và cấu trúc hóa học của sản phẩm -chitin
Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của sản phẩm -chitin được đánh giá dựa trên phổ
FTIR và NMR. Kết quả phân tích phổ FTIR cho thấy, mẫu -chitin có xuất hiện tất cả các peak
đặc trưng cho chitin tại các bước sóng 3277 cm−1 (O-H), 2877 cm−1 (C-H), 1627 cm−1 (amide I),
1543 cm−1 (amide II), 1374 cm−1 (C-H) và 950–1200 cm−1 (C-O-C and C-O). Không thấy xuất
hiện các peak lạ, chứng tỏ sản phẩm chitin thu được có độ tinh khiết cao.

12


Hình 3.4. Phổ FTIR của sản phẩm β-chitin và mai mực ống.
Kết quả phổ H1-NMR của β-chitin cho thấy các peak tại độ chuyển dời hóa học 2,58 –
2,62 ppm tương ứng với 3 protons của nhóm N-acetyl glucosamine (GlcNAc-CH3), các peak
tại 3,33 – 3,44 ppm là proton H-2 của glucosamine (GlcN) và các peak tại 5,41 và 5,03 ppm
do dao động của proton α-H-1-A và β-H-1-A. Các peak ở 5.02 và 4.87 ppm lần lượt là của H1-D và H-1-A. Các proton còn lại thể hiện trên các peak tại 3.7-4.27 ppm. Không có các peak
xuất hiện trong khoảng 1-1,5 ppm. Điều này cũng khẳng định độ tinh khiết của sản phẩm chitin thu được từ mai mực Loligo sp. của quá trình thu nhận. Kết quả này cũng phù hợp với
các công bố trước đây.

Hình 3.5. Phổ NMR của sản phẩm β-chitin.

13

3.3. ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN
3.3.1. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng đến hiệu quả deacetyl -chitin
Tương tự như quá trình khử protein để thu nhận chitin từ mai mực. Trước khi tiến hành
quá trình deacetyl, chúng tôi cũng dựa trên các công bố trước đây và tính chất của sản phẩm
-chitin thu được trong nghiên cứu này để tiến hành khảo sát một khoảng rộng ảnh hưởng của
các thông số của quá trình deacetyl. Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ và nồng độ NaOH thì
quá trình deacetyl xảy ra nhanh và hiệu quả deacetyl tăng. Cụ thể, để đạt được chitosan có độ
deacetyl lớn hơn 90% thì nhiệt độ của quá trình phản ứng phải trên 60oC,nồng độ dung dịch
NaOH cần dùng phải trên 40%.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl β-chitin.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan
Khi tăng nhiệt độ từ 50 lên 90oC thì DD của sản phẩm chitosan tăng từ 60,2 lên 90,1%
trong khi MW lại giảm từ 7784 xuống còn 5604 kDa. Nhiệt độ khử càng tăng thì hiệu quả quá
trình deacetyl càng tăng, kết quả DD của sản phẩm chitosan đạt được là 87,9% khi khử ở
80C. Do đó, chúng tôi lưa chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình deacetyl là 80C để làm các
khảo sát sau.
3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch
chitosan
14


Kết quả cho thấy ở cùng điều kiện nhiệt độ 80C và thời gian khử 12 giờ, khi tăng
nồng độ NaOH thì hiệu quả quá trình deacetyl càng tăng (Hình 3.2). Giá trị độ deacetyl của
sản phẩm chitosan là 83,6% ở NaOH 50% và đạt 85,7% ở NaOH 55%. Do đó, để đạt được
mục tiêu nghiên cứu là thu được sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và hạn chế thấp nhất
quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình khử thì nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình
deacetyl là 50%.
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan

Kết quả cho thấy ở cùng điều kiện nhiệt độ 80C và nồng độ NaOH 50% hiệu quả quá
trình deacetyl chỉ đạt tốt trong khoảng 8 giờ khử ban đầu, khi kéo dài thời gian khử thì hiệu
quả deacetyl có tăng nhưng không đáng kể (Hình 3.3).
Tóm lại, các kết quả đánh giá ở trên cho thấy điều kiện deacetyl thích hợp để sản phẩm
chitosan thu được có độ deacetyl cao và hạn chế thấp nhất cắt mạch chitosan trong quá trình
khử là nhiệt độ 80C, nồng độ NaOH 50% với thời gian 8 giờ. Kết quả cũng cho thấy nếu
tăng bất cứ 1 trong 3 yếu tố sẽ đều làm quá trình cắt mạch chitosan xảy ra. Tuy nhiên, sản
phẩm chitosan thu được chỉ đạt độ deacetyl đạt 84% và có khối lượng phân tử trung bình
7567 kDa.
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu với chitosan thu được có DD > 90% có 2 cách:
- Tăng một trong các yếu tố nhiệt độ hoặc nồng độ NaOH hoặc tăng cả hai yếu tố này.
Tuy nhiên, khi đó thì quá trình cắt mạch xảy ra rất mạnh.
- Giữ nguyên nhiệt độ và nồng độ đã tiến hành ở trên nhưng tiến hành deacetyl nhiều lần.
Cách này ít gây cắt mạch polymer và có thể dễ dàng thực hiện ở sản xuất lớn.
3.3.5. Điều kiện deacetyl lần 2
Kết quả cho thấy, khi xử lý bước 2 hiệu quả quá trình deacetyl xảy ra mạnh mẽ và đạt
DD = 91,3% chỉ sau 4 giờ khử và DD = 94% sau 20 giờ khử (Hình 3.4). Tuy nhiên quá trình
cắt mạch cũng xảy ra mạnh ở bước 2 đặc biệt là sau 4 giờ khử đầu tiên Mw = 7567 kDa giảm
còn 6831 kDa.

15


Hình 3.7. Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến đến DD và Mw của chitosan.
Như vậy, để hạn chế sự cắt mạch trong quá trình deacetyl ở mức thấp nhất và sản
phẩm chitosan thu được có mức DD > 90% thì việc chọn phương án deacetyl 2 lần là cần
thiết. Điều kiện deacetyl được lựa chọn là:
- Bước 1: NaOH 50%, nhiệt độ 80oC, thời gian khử 8 giờ với tỷ lệ (1/10, w/v), sau đó
mẫu được rửa sạch trung tính.
- Bước 2: NaOH 50%, nhiệt độ 80C, thời gian khử 4 giờ với tỷ lệ (1/5, w/v). Sản

phẩm chitosan thu được có DD = 91,3% và Mw = 6831 kDa.
3.3.6. Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan
3.3.6.1. Hiệu suất thu nhận và tính chất cơ bản của chitosan
Kết quả cho thấy hàm lượng chitosan thu được từ mai mực ống cao hơn nhiều so với từ
vỏ đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và vỏ tôm sú (Penaeus monodon). Như vậy,
mai mực ống là nguồn nguyên liệu tiềm năng để thu nhận chitin và chitosan.
So với sản phẩm chitosan thương mại (Sigma), chitosan từ mai mực ống sau khi thu
nhận có độ tinh khiết cao hơn do chứa hàm lượng khoáng và protein còn lại rất nhỏ (không
phát hiện). Sản phẩm -chitosan có màu trắng sáng với phân tử lượng trung bình Mw 6831
kDa và độ deacetyl DD 91,3 %. Độ tan của -chitosan là trên 99,7% trong dung dịch acid
acetic 1% và độ đục là 9,5 NTU. Đáng lưu ý, -chitosan thu được có khối lượng phân tử cao,
độ tinh khiết cao nên có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghệ cao như tạo màng
sinh học. Đồng thời -chitosan được dùng làm chitosan nền để cắt mạch tạo thành những
chitosan có phân tử khác nhau tùy theo mục đích sử dụng.
16


3.3.6.2. Thành phần khoáng và acid amine
Kết quả cho thấy hàm lượng acid amin còn lại trong chitosan là rất thấp. Sau quá trình
deacetyl, hầu hết các acid amin được loại bỏ khỏi β-chitosan trừ một lượng rất nhỏ còn lại của
histidine, alanine, valine và serine. Hàm lượng khoáng chứa trong β-chitin và chitosan là rất
nhỏ (không phát hiện), đặc biệt các kim loại nặng như As, Hg, Pb không phát hiện có trong
các mẫu β-chitin và chitosan (số liệu không được thể hiện). Như vậy, sản phẩm -chitin và
chitosan từ mai mực ống có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu cầu cho các nghiên cứu ứng dụng
trong các lĩnh vực thực phẩm và y sinh.
3.3.6.3. Cấu trúc bề mặt của chitin và chitosan
Sự khác nhau về tính chất bề mặt của mai mực, β-chitin và chitosan thể hiện trong Hình
3.5. Bề mặt cắt của mai mực có các tấm chitin được sắp xếp song song xen kẽ các với các
thành phần khác như protein, lipid và khoáng (Hình 3.5a). Sau quá trình khử thì các tấm
chitin vẫn được bảo toàn nhưng độ dày của chúng lại giảm đáng kể (Hình 3.5b). Điều này có

thể giải thích do các thành phần khác như như protein, lipit và khoáng được loại bỏ sau khi xử
lý. Trong khi bề mặt β-chitosan trở nên vô định hình và cấu trúc các lớp song song bị phá hủy
gần như hoàn toàn (Hình 3.5c).

Hình 3.8. Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan.
3.3.6.4. Độ rắn tinh thể (CrI)
Kết quả cho thấy, trong tất cả các mẫu đều xuất hiện hai peak đặc trưng tại 2θ 7,90 và
19,60 (Hình 3.6). Tuy nhiên, mai mực có cường độ peak cao nhất sao đó đến β-chitin và
chitosan, chứng tỏ mai mực và β-chitin có độ kết tinh cao hơn và quá trình khử protein và
deacetyl đã làm giảm độ kết tinh của vật liệu. Cụ thể, độ kết tinh tương đối (CrI) của của hai
mẫu được tính là thương số của diện tích peak tại 7,90 và tổng diện tích 2 peak. Kết quả, CrI
của mai mực, β-chitin và β-chitosan lần lượt là 72%, 62% và 43%.

17


Hình 3.9. Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan.
3.3.6.5. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của chitosan
Các peak đặc trưng của cả hai mẫu đều tương tự nhau tại 3428 cm−1 (O-H), 2928-2872
cm−1 (C-H), 1655 cm−1 (amide I), 1593 cm−1 (amide II), 1318 cm−1 (amide III), và 1028–1070
cm−1 (C-O-C và C-O) (Hình 3.7). Điều này khẳng định hiệu quả của quá trình deacetyl βchitin, độ tinh khiết của sản phẩm.

Hình 3.10. Phổ FTIR chitosan từ (a) β-chitin, (b) chitosan thương mại và (c) β-chitin.
Độ tinh khiết của sản phẩm chitosan được khẳng định trong Phổ H1-NMR trình bày trong
Hình 3.8. Các peak đặc trưng cho chitosan tại 5.10 ppm (H1), 3.2 ppm (H2), 3.5~3.9 ppm (H3, H4,
H5, H6) và 2.0 ppm (NHCOCH3). Không có sự xuất hiện các peak trong khoảng 1,0 và 2,0
ppm chứng tỏ sự tinh sạch của sản phẩm chitosan thu được.

18

Hình 3.11. Phổ H1-NMR của β-chitosan.
3.3.6.6. Độ phân tán polymer và phân tử lượng trung bình của chitosan
Để đánh giá khối lượng phân tử và sự phân tán khối lượng tử của sản phẩm chitosan,
chúng tôi tiến hành đo phổ đo tán xạ ánh sáng trung tâm (SEC-MALLS). Hình 3.9 trình bày
phổ SEC-MALLS của sản phẩm chitosan. Kết quả đo xác định kích thước của các hạt
chitosan trong dung dịch Mw = 6831 kDa.

Hình 3.12. Phổ SEC-MALLS của chitosan.
3.4. KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN
3.4.1. Phân lập, xác định chủng Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua
Tiến hành xử lý mẫu và phân lập trên môi trường PDA trong điều kiện pH trung tính ở
nhiệt độ từ 30C thu được 37 dòng khuẩn lạc đặc trưng. Khi nhuộm Gram 37 dòng vi khuẩn
đã phân lập đã chọn được 20 dòng vi khuẩn là gram âm có hình que, hai đầu hơi tròn, kích
19


thước của các tế bào vi khuẩn đều nằm trong khoảng (0,5-1,01,0-3,0m) và có khả năng di
động.
Từ 20 dòng vi khuẩn được chọn, sau khi đánh giá các đặt tính sinh hóa, sinh lý đã chọn
được 6 dòng nằm trong nghi ngờ là Erwinia sp.Từ 6 chủng phân lập được tiến hành chủng bệnh
nhân tạo trên 3 loại ký chủ: trái cà chua, khoai tây và bắp cải. Kết quả sau 72 giờ chủng vi khuẩn,
quan sát thấy có 4 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, vết bệnh đặt trưng trên cả 3 ký chủ.
Kết qủa phân tích trình tự gen 16S rRNA định danh 6 dòng vi khuẩn được chọn trình
bày trong Hình 3.13. Theo đó, chủng EC24-NT có kết quả phù hợp 97% sự tương đồng trong trình
tự của đoạn gen của chủng CP002038 Dickeya dadantii 3937 hay còn gọi là Erwinia sp. Kết quả
này được thu nhận từ thông tin trên ngân hàng gen của NCBI thông qua chương trình BLAST
SEARCH (Hình 3.14). Ngoài ra, dòng vi khuẩn sau khi được định danh được chụp trên kính hiển
vi điện tử SEM cho kết quả hình que, hai đầu hơi tròn, kích thước của các tế bào vi khuẩn đều
nằm trong khoảng (0,5-1,01,0-3,0m).

a

c

b

Hình 3.13. Hình Erwinia sp.; a. Khuẩn lạc Ecc; b. Vi khuẩn Ecc; c. SEM Ecc.

Hình 3.14. Trình tự một đoạn gen 16S rRNA.
3.4.2. Khả năng kháng khuẩn của chitosan ở điều kiện in vitro
Sản phẩm chitosan từ mai mực Loligo sp. có độ deacetyl 91,3% và khối lượng phân tử Mw
6338 kDa được tiến hành cắt mạch bằng H2O2. Kết quả, thu được 4 loại chitosan có khối
lượng phân tử là 6338, 1740, 655 và 138 kDa.

20


Hình 3.15. (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ
khác nhau. C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa.
Kết quả cho thấy β-chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của Ecc tăng lên khi có
khối lượng phân tử (Mw) thấp và ở nồng độ cao. Hiệu quả ức chế 100% khả năng phát triển của
Ecc đạt được đối với chitosan có Mw trong khoảng 138-655 kDa ở nồng độ 1,25 và 1,5%. So
với mẫu chitosan thương mại hiệu quả kháng khuẩn Ecc đạt 100% ở nồng độ 1,25% (Hình
3.15).
Hình 3.16. biểu diễn hình ảnh chụp trên kính hiển vi truyền qua TEM khi vi khuẩn
Erwinia sp. được xử lý bằng 1% chitosan (S-138) hòa tan trong CH3COOH 1% (w/v) trong thời
gian 60 phút. Kết quả cho thấy đầu tiên chitosan gắn lên bề mặt của các tế bào sau 15 phút (Hình
3.13b), sau đó màng tế bào bị phá vỡ, sự rò rỉ của các chất trong tế bào đã được quan sát (Hình.
3.13c) và cuối cùng, bề mặt của tế bào của vi khuẩn Erwinia sp. đã dần bị phá hủy hoàn toàn sau

60 phút và các tế bào trở nên mờ trong dung dịch chitosan sau 30 phút.

Hình 3.16. Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp. được xử lý trong dung dịch β-chitosan
1% (S-138) trong 60 phút. (a) Vi khuẩn Erwinia sp. (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau
30 phút; (d) và kết quả sau 60 phút.
21