Nghiên cứu định lượng kháng sinh erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN PHƯỚC MINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH
ERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ
THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰC
GIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số chuyên ngành: 62.54.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Tp. Hồ Chí Minh năm 2012


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trần Bích Lam
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Trọng Giao

Phản biện độc lập 1:……………………………………………………
Phản biện độc lập 2:……………………………………………………
Phản biện 1:…………………………………………………………….
Phản biện 2:…………………………………………………………….
Phản biện 3:…………………………………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại:
…………………………………………………………….....................

……………………………………………………………….................
vào lúc

giờ

ngày

tháng

năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học tổng hợp Tp. HCM
- Thư viện Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM


DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyen Phuoc Minh et al., “Simultaneous determination of
erythromycin A in giant prawn and tilapia in Mekong region by
stripping square wave voltammetry,” European Journal of Food
Research and Review, vol. 1, no. 1, pp. 01-14, 2011.
2. Nguyen Phuoc Minh et al., “Accumulation and clearance of orally
administered erythromycin in adult Nile tilapia (Oreochromis
niloticus),” International Food Research Journal, vol. 18, no. 1,
pp. 95-100, 2011.
3. Nguyen Phuoc Minh et al., “Tissue distribution and elimination of
erythromycin in

giant

freshwater

prawn (Macrobrachium

rosenbergii) depletion,” African Journal of Food Science, vol. 4,
no. 9, pp. 578-584, 2010.
4. Nguyễn Phước Minh và cộng sự. “Quá trình tích tụ và đào thải
kháng sinh erythromycin trên cá rô phi (Oreochromis niloticus),”
Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học: Phát Triển Nông Nghiệp Bền Vững
Thích Ứng Với Sự Biến Đổi Khí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 430437.
5. Nguyễn Phước Minh và cộng sự. “Chuyển hóa sinh học và đào
thải kháng sinh erythromycin trong tế bào tôm càng xanh trưởng
thành (Macrobrachium rosenbergii),” Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học:
Phát Triển Nông Nghiệp Bền Vững Thích Ứng Với Sự Biến Đổi
Khí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 472-479.


4
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ở
nước ta hiện nay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng kháng
sinh trong thực phẩm vượt quá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe của
người tiêu dùng và uy tín hàng xuất khẩu của chúng ta. Do tính chất kháng
khuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để phòng và trị bệnh
trên tôm cá. Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá rô phi
có sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trước
thu hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép.
Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia,
v.v thì dư lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phải
nhỏ hơn 30 ppb. Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 của

Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộc
nhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép là
200 ppb. Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinh
này trong các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS. Mục tiêu và nội
dung thứ nhất đặt ra là phải tìm được phương pháp phân tích dư lượng
kháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy và
tính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin.
Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trình
đào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thu
hoạch trên đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi. Vậy nên trong đề tài này em
sẽ tiến hành nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycin
trong cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra quy luật và ước lượng
được thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn.
Từ hai yêu cầu trên, em đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượng
kháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quét
nhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải”.


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Một là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất
xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóng
vuông quét nhanh trên cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm
quốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phí
phân tích.
Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ
thịt thủy sản (tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật về
thời gian thu hoạch an toàn khi sử dụng erythromycin.
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
 Ý nghĩa khoa học:
1.

Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu sử dụng
kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích định
tính và định lượng kháng sinh eythromycin trong mẫu thủy sản.

2.

Sự xuất hiện của sóng khử vùng thế khoảng -1,4 V là do sự khử của
nhóm C = O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm ái
điện tử chứa nguyên tử oxi bên cạnh. Quá trình khử là không hoàn toàn
thuận nghịch với sự trao đổi hai điện tử.

3.

Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycin
trên bề mặt giọt thủy ngân. Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hành
phân tích erythromycin ở các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật stripping
hấp phụ trên cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo.

4.

Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông số
chạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tích
erythromycin trong các mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có kết quả tin
cậy. Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật phân tích truyền thống
LC-MS là có sự tương đồng.


5.

Chứng minh rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyển
hoá bởi Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men mà còn
chứng minh được erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá còn có sự
chuyển hoá sinh học sang các dẫn xuất erythromycin C, E, F.
 Ý nghĩa thực tiễn:

1.

Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và
định lượng erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹ
thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZER
SQF-505 do Việt Nam sản xuất với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tác
dễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước ngoài. Các số liệu đã được
kiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phương pháp hiện đại
khác.

2.

Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phương
có phương tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường,
hóa chất, tôm cá trong quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra các
sản phẩm có uy tín quốc tế.

3.

Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mới
sử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kém
để phân tích nhiều kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khác
nhau nhằm giúp các địa phương tự giám sát tốt vấn đề này.

4.

Rút ra được quy luật đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơ
thịt tôm càng xanh và cá rô phi sau khi ăn thức ăn có trộn
erythromycin, từ đó ước lượng thời gian ngưng thuốc an toàn, góp
phần có được một nền công nghiệp chế biến thực phẩm chủ động, an
toàn và bền vững.


CHƯƠNG I TỔNG QUAN
Erythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B,
C, D, E, F. Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythrea bằng con
đường lên men. Sản phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycin
A, còn lại là các erythromycin khác (≤ 5%). Erythromycin gồm 2 phân tử
đường gồm desosamin và cladinose gắn vào Erythronolide. Nó dễ dàng hút
ẩm và tan ít trong nước (0,2%). Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn là
pH trung tính và không bền ở pH acid.
Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+]
và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã kháng
lại Penicillin. Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria,
Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella,
Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin. Erythromycin được
sử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin

Nguyên lý của cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọt
chậm và stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Nhúng
vào dung dịch nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực: Cực làm việc: là
cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy ổn định khoảng 7 giây một giọt. Nếu áp

dụng kỹ thuật stripping nhanh ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảy
trên 10 giây một giọt. Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa có thế không
đổi. Cực hỗ trợ: dùng cực Platin. Đặt lên cực làm việc 2 thành phần: Thế
một chiều tăng dần theo thời gian dạng hình bậc thang với các bước thế 2,


4, 6, 8, 10 mV. Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độ
xung: 10, 20, 30, 40 mV và tần số vài trăm Hz. Để triệt tiêu dòng tụ điện
gây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoay
chiều ở đầu xung và cuối xung. Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sự
biến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều. Đường
thu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh. Phổ thường chứa nhiều đỉnh.
Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hóa của một
chất. Thế bán sóng (E1/2) với một dung dịch nền nào đó là một giá trị đặc
trưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính.
Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh
(công suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trên
cực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng.
Stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Dùng một
cực giọt thủy ngân chạy rất chậm, khoảng 10 giây một giọt, làm cực làm
việc. Phần mềm PSA-F cho phép đặt một giá trị thế một chiều tùy ý để tích
góp chất cần phân tích lên bề mặt của một giọt thủy ngân đang lớn dần lên.
Sau quá trình này, máy sẽ tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóng
vuông quét nhanh.
Các nghiên cứu định lượng erythromycin: Nghiên cứu ở trong
nước, chưa thấy có nghiên cứu nào về quá trình định lượng erythromycin,
ngay cả các nghiên cứu ở nước ngoài cũng có rất ít nghiên cứu về phương
pháp Von-ampe để định lượng erythromycin mà chủ yếu là các phương
pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đặc biệt chưa thấy một công trình nghiên
cứu nào dùng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng để

định lượng erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô phi.
Một số công trình nghiên cứu về khả năng đào thải, chuyển hóa
erythromycin trên một số loài thủy sản như: Esposito cùng cộng sự
(2006) nghiên cứu quá trình đào thải erythromycin trên cá hồi vân dòng
Oncorhynchus mykiss. Moffitt cùng cộng sự (1988) đã nghiên cứu sự tích


9
lũy và đào thải của erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchus
tshawytscha. Moffitt cùng cộng sự (1999) tiến hành nghiên cứu độc tính,
khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mg
erythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngày
tiêm 1 lần và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục. Moffitt và cộng sự
(2001) kiểm tra tính độc cấp tính và độc mãn tính của erythromycin trên cá
hồi Oncorhynchus tshawytscha ở 2 nhiệt độ nước khác nhau. Haukenes và
cộng sự (2002) tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi cái Oncorhynchus
tshawytscha trước khi đẻ trứng. Fairgrieve và cộng sự (2005) cho cá hồi
Oncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn có chứa azithromycin (30 mg/kg cá
trong 14 ngày) hoặc erythromycin (100 mg/kg cá trong 28 ngày).
Tóm lại, những nghiên cứu trước về biến đổi của erythromycin trên
cơ thể thủy sản chủ yếu mới tập trung trên đối tượng cá hồi, là cá nước lạnh
và cũng chỉ mới dừng lại ở việc theo dõi sự đào thải erythromycin ở cá.
Chưa có báo cáo về erythromycin trên thủy sản nhiệt đới và cũng chưa có
báo cáo nào cho biết trong cơ thể thủy sản erythromycin sẽ chuyển hóa thế
nào, vì vậy đây sẽ là những nội dung mà đề tài này nghiên cứu.
Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tôm
càng xanh và cá rô phi: Đây là hai loại thủy sản được nuôi rất phổ biến ở
Việt Nam và có sử dụng erythromycin. Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh trên
tôm càng xanh bao gồm protozoans như Epistylis, Zoothamnium, và
Vorticella; các vi khuẩn gây bệnh như Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas,

Edwardsiella. Trong khi đó các bệnh chủ yếu trên cá rô phi khi nuôi
thường là Streptococcus iniae, Aeromonas hydrophila, Trichodina,
Flexibacter

Columnaris,

Edwardsiella.

Phổ

biến

nhất

là

do

Streptococcosis, vi khuẩn gram dương, đã gây thiệt nặng nề mà không có
vacccine nào phòng được, thậm chí trên cá trưởng thành và khỏe mạnh. Vì
vậy, erythromycin cũng là kháng sinh từ lâu được dùng để phòng và trị
bệnh trên cá rô phi do Streptococcus.


1
0
CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
2.1.1 Nguyên vật liệu
- Tôm càng xanh (≈ 50 g/con), cá rô phi (500÷550 g/con).

- Erythromycin base 96,5% từ cty Cổ Phần Dược Hậu Giang.
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị Analyzer SQF-505 của Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga.
- Bộ chiết pha rắn SPE của Phenomenex, cột HLB của Waters.
- Các dụng cụ phân tích thông thường khác.
2.1.3 Hóa chất
- Erythromycin A, chloramphenicol, florfenicol, furazolidone, ciprofloxacin,
enrofloxacin, danofloxacin chuẩn có độ tinh khiết > 98% của hãng Sigma
Aldrich, Fluka Chemical.
- Các dung môi, hóa chất phân tích khác.
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Thuyết minh nghiên cứu
Nội dung thứ I: Nghiên cứu các điều kiện cơ bản của kỹ thuật
stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để định lượng
erythromycin. Sau đó tiến hành đánh giá thẩm định hiệu năng phương
pháp. Cuối cùng là lấy mẫu tôm càng xanh, cá rô phi thực tế tại 10 tỉnh
ĐBSCL để đánh giá bức tranh thực trạng nhiễm erythromycin.
Nội dung thứ II: Theo dõi quá trình đào thải và chuyển hoá
erythromycin theo thời gian khi kháng sinh này đi vào cơ thể tôm càng
xanh và cá rô phi bằng con đường thức ăn. Từ đó rút ra quy luật thời gian
ngưng thuốc an toàn trước thu hoạch.
2.2.2 Phương pháp thực nghiệm
2.2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc định lượng erythromycin trên
thiết bị Analyzer SQF - 505


1
1
 Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền: Amoni axetat, Natri
axetat, Borax, Tris, Citrat - phosphat

 Khảo sát nồng độ dung dịch nền: 0,05 ÷ 0,25 M.
 Khảo sát dung môi hòa tan erythromycin: Methanol, Ethyl axetat,
Acetonitril.
 Nghiên cứu kỹ thuật đo Stripping SWV: chiều quét, Vstart, Vstep, Vpulse, Tdrop,
Velectrolise, Telectrolise
 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu: các ion vô cơ.
 Xây dựng đường chuẩn trong khoảng 50 ÷ 900 ppb.
 Lựa chọn quy trình trích ly mẫu: sử dụng cột chiết pha rắn để tách loại tạp
và làm giàu erythromycin.
 Độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu hồi
 Khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác: Khảo sát
sự hiện diện của lần lượt các kháng sinh chloramphenicol, florfenicol,
furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin xem có tách biệt và
nhận danh rõ so với erythromycin A.
 So sánh đối chứng kết quả Stripping SWV với LC-MS/MS: Tôm càng xanh
(cá rô phi) được nuôi đến trọng lượng thương phẩm, được lấy 3 mẫu và
phân tích tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam để dùng làm mẫu
trắng “blank”. Sau đó tôm (cá) nuôi được gây nhiễm erythromycin bằng
con đường thức ăn; liều gây nhiễm 100 mg erythromycin/kg thể trọng/
ngày; thời gian gây nhiễm 7 ngày liên tiếp và tiến hành lấy mẫu sau ngày
thứ 7, 8 và 9 kể từ thời điểm ngưng thuốc. Lúc này ta sẽ có 3 nhóm mẫu
nhiễm erythromycin (cao, trung bình, thấp). Ở mỗi nhóm nồng độ gây
nhiễm (6 mẫu), chia làm 2 phần bằng nhau:
- Phần I: Phân tích bằng Stripping SWV (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng
độ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).


1
2
- Phần II: Gửi phân tích đối chứng bằng LC-MS/MS tại trung tâm kiểm

định Intertek Việt Nam (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3
mẫu nồng độ cao).
 Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại các địa
phương: Lấy các mẫu tôm càng xanh, mẫu cá rô phi đại diện ở 10 tỉnh
(mỗi tỉnh lấy mẫu ở 3 huyện) ở đồng bằng sông Cửu Long về phân tích và
xử lý thống kê để đánh giá thực trạng nhiễm erythromycin. Mỗi mẫu được
phân tích 5 lần (n=5) trên máy Analyzer SQF - 505. Kết quả thể hiện: trung
bình ± SD, % RSD.
2.2.2.2 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học, đào thải của erythromycin
trong cơ thể thủy sản khi nuôi
Kiểm soát từ giai đoạn thả giống đến khi đạt kích cỡ thương phẩm
như: mật độ thả giống, kích cỡ thả giống nhiệt độ, pH, độ kiềm, hàm lượng
oxy, khí độc, lượng thức ăn cho ăn, kích cỡ tôm khi xử lý kháng sinh,
kháng sinh nguyên liệu, sàng lọc các dạng erythromycin B, C, D, E, F có
trong nguyên liệu erythromycin base này. Thời gian xử lý kháng sinh, con
đường đưa kháng sinh vào cơ thể, liều kháng sinh xử lý, số lần cho ăn thức
ăn trong ngày cũng được giám sát hết sức chặt chẽ. Mẫu được phân tích
khẳng định dư lượng erythromycin A, phân tích sàng lọc các dạng chuyển
hóa của erythromycin như erythromycin B, C, D, E, F theo phương pháp
LC-MS/MS thông qua Cty kiểm nghiệm TUV Rheinland Aimex Vietnam.
2.2.3 Xử lý số liệu
Tất cả số liệu phân tích đều được xử lý thống kê bằng phần mềm
Statgraphics và WT14.


13
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO VIỆC ĐỊNH
LƯỢNG ERYTHROMYCIN
3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét thế và chiều quét

thế
Erythromycin khá dễ tan trong nước nên các dung dịch nền dùng
cho người cứu chủ yếu là dung dịch nước với các chất điện ly khác nhau.
Trong công thức cấu tạo của erythromycin có nhóm C=O liên kết với một
nguyên tử oxy khác, ngoài ra có một số dị vòng chứa oxy được liên kết một
nguyên tử oxy nữa nên có thể dự đoán sẽ xuất hiện những sóng khử trong
khoảng thế từ -1,0 V đến -1,7 V. Vì thế em sẽ tập trung nghiên cứu ở vùng
thế này.
Qua thăm dò sơ bộ em thấy có một vài sóng trong khoảng thế này,
nhưng sóng ở thế vùng khoảng -1,4 V là tốt nhất đối với mục đích phân tích
định lượng, nên các khảo sát tiếp theo em tập trung để tìm điều kiện tối ưu
cho sóng này.
3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH phù hợp
Cường độ dòng của erythromycin bị ảnh hưởng bởi loại dung dịch
nền. Trong số các dung dịch nền khảo sát như Natri axetat, Amoni axetat,
Citrat-Phosphat, Borax, đệm Tris thì dung dịch nền amoni axetat cho giá trị
cường độ dòng erythromycin cao nhất và hình dạng đỉnh peak đẹp nhất.
Khoảng pH của dung dịch amoni axetat được khảo sát trong
khoảng 7,0 đến 10,0. Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở pH 8,0
(E1/2 = -1.430 mV, I = 351,7 ± 5,7 nA). Vì thế dung dịch nền amoni axetat
(pH 8,0) được chọn để khảo sát tiếp theo.
3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền
Nồng độ dung dịch nền amoni axetat pH 8,0 được khảo sát trong
khoảng 0,05 ÷ 0,25 M. Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở
amoni axetat 0,1 M (E1/2 = -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA).


dòng
270,0
eryt

hro 250,0
myci
n A 230,0
(nA)
210,0
190,0
170,0
150,0
0,000,050,100,150,200,250,30

Nồng độ dung dịch nền ammonium acetate (M)

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền amoni axetat đến cường độ dòng
của erythromycin A

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hòa tan erythromycin
Tiến hành ghi phổ của erythromycin trong dung dịch nền amoni
axetate 0,1 M pH 8,0 với sự có mặt của ba dung môi methanol, acetonitril,
ethyl axetate để hòa tan chuẩn erythromycin. Kết quả thu được thấy khi có
mặt của các dung môi trên vẫn không ảnh hưởng nhiều tới tính chất của
phổ eythromycin, chúng ta vẫn ghi được các phổ rõ ràng ở vùng thế như cũ.
Qua đó, ta thấy trong quá trình chuẩn bị mẫu đo có thể dùng các dung môi
trên.
3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp
3.1.5.1 Nghiên cứu chiều quét
Chiều quét xuôi (0 đến -1.800 mV) và chiều quét ngược (-1.800
mV đến 0) lên tín hiệu của cường độ dòng đã được khảo sát. Chiều quét
xuôi (0 đến -1.800 mV) cho đỉnh peak cao và đẹp. Trong khi đó, chiều quét
ngược (-1.800 mV đến 0) không thể hiện đỉnh peak. Chiều quét xuôi (0 đến
-1.800 mV) được chọn để khảo sát các thông số tiếp theo. Điều này nói lên

rằng tính chất không thuận nghịch của erythromycin khi quét.
3.1.5.2 Nghiên cứu chọn thế bắt đầu ghi phổ Vstart
Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịch
nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các giá trị thế bắt đầu ghi phổ Vstart
khác nhau và thu được các kết quả sau:


dòng
eryth
rom
ycin
A
(nA)

120,0
100,0
y = 0,1332x + 162,8
80,0
60,0
40,0
20,0

0,0
-200 -300 -400 -500 -600 -700 -800 -900 -1000 -1100 -1200
Vstart (mV)

Hình 3.13: Ảnh hưởng của Vstart đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước thế 1 chiều Vstep
Tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trong

dung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 một số tốc độ quét thế một chiều
tương ứng với thế bước Vstep = 6 , 8 , 10 mV/ bước thế và thu được:
220
dòng
eryt 210
hro
200
myci
n A 190
(nA)
180

y = -12,395x + 284,64

170
160
150
4

6

8

10

12
Vstep (mV)

Hình 3.15: Ảnh hưởng của Vstep đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.4 Nghiên cứu chọn biên độ xung vuông Vpulse
Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong nền amoni
axetat 0,1 M; pH 8,0 với các biên độ khác nhau 10, 20, 30, 40 mV
800
dòng
eryth 700
romy
600
cin
A
500
(nA)
400

y = 15,258x + 78,47

300
200
100
0

10

20

30

40
50
Vpulse (mV)

Hình 3.17: Ảnh hưởng của Vpulse đến cường độ dòng của erythromycin A


3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét thế trong đời sống 1 giọt thủy ngân
Tdrop
Giá trị Tdrop này thể hiện thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểm
hình thành một giọt thủy ngân mới. Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị
1.000 ÷ 5.000 ms để trong quá trình ghi giọt không bị rơi. Giá trị Tdrop càng
lớn sóng càng lớn vì được ghi ở vùng giọt lớn, cường độ dòng qua cực làm
việc càng cao, độ nhạy càng cao.
450
dòng
eryth 400
romy
350
cin
A
300
(nA)
250

y = 0,0631x + 70,59

200
150
100
0

1.000

2.000
Tdrop (ms)

3.000

4.000

5.000

6.000

Hình 3.19: Ảnh hưởng của Tdrop đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.6 Nghiên cứu chọn thời gian điện phân tích góp Telectrolise
Tiến hành ghi phổ erythromycin sau các khoảng thời gian tích góp
3 - 4 - 5 giây và thu được:
1800
dòng 1750
eryth1700
romy
cin 1650
1600
A
1550
(nA)
1500
1450
1400
1350
1300

y = 181,7x + 815,2

2

3

4

5
6
Telectrolise (s)

Hình 3.21: Ảnh hưởng của Telectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.7 Nghiên cứu chọn thế điện phân tích góp Velectrolise
Tiến hành thí nghiệm với các thế tích góp: -400, -900, -1100 mV
và thu được:


1900

dòng
eryt 1850
hro
myci
1800
n A
(nA)

y = -0,2187x + 1620,8

1750

1700
1650
-1200 -1100 -1000

-900

-800

-700

-600

-500

-400

-300

Velectrolise (mV)

Hình 3.23: Ảnh hưởng của Velectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A
+

+

++

++

3+

-

3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion vô cơ Na , K , Ca , Mg , Fe , Cl ,
-2

2-

SO4 , HPO4 tới phổ erythromycin
+
+
2+
2+
2+
3+
Ở nồng độ 0÷5 ppm thì các ion K , Na , Ca , Mg , Mn , Fe ,
2+

-

-

2-

2-

Cu , Cl , I , SO4 , HPO4

ảnh hưởng không đáng kể (<±5%) đến

cường độ dòng của erythromycin.
3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 50 ÷ 400 µg/kg với hệ
số tương quan điều chỉnh radjusted = 1,0; LoD = 0,52 µg/kg.

Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH
8,0

3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫu
Kết quả khảo sát này cho thấy trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô
phi thì quy trình trích ly III cho hiệu suất thu hồi erythromycin cao nhất
(90,59%, 83,57%) nên quy trình trích ly III được chọn để khảo sát các
thông số tiếp theo.


92.00
90.00
88.00
86.00
84.00
Hiệu suất trích 82.00
ly (%)

90.59
88.62

87.90

81.63

80.00
78.00
76.00
74.00
72.00
70.00

77.27

I

II

III

IV

V

Quy trình trích ly

Hình 3.25: Hiệu suất trích ly erythromycin trên tôm càng
xanh
90.00
80.00
70.00

60.00
Hiệu suất 50.00
trích ly (%) 40.00
30.00
20.00
10.00
0.00

70.69

I

75.25

II

83.57
69.33

III

IV

72.34

V

Quy trình trích ly

Hình 3.26: Hiệu suất trích ly erythromycin trên cá rô phi

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
3.2.1 Khoảng tuyến tính
Đường chuẩn erythromycin tuyến tính trong khoảng nồng độ 50
÷ 400 µg/kg với hệ số tương quan điều chỉnh R

2

adjust

= 1,0 và độ lệch

chuẩn tương đối %R.S.D trong khoảng 0,4 ÷ 3,7 %. Phương trình
đường chuẩn Y=1,08*X + 87.
3.2.2 Giới hạn phát hiện LOD
- Giới hạn phát hiện trên nền dung dịch đệm 0,52 µg/kg
- Giới hạn phát hiện trên nền mẫu tôm càng xanh 0,57 µg/kg
- Giới hạn phát hiện trên nền mẫu cá rô phi 0,80 µg/kg
3.2.3 Độ chính xác, độ đúng và hiệu suất thu hồi


Bảng 1.16 (phụ lục): Độ chính xác (RSD %), độ đúng (RE %) và hiệu suất thu hồi
erythromycin A trên mẫu tôm càng xanh

Ngày Nồng độ thêm
-1
(µg*kg )
1
100
2

100
3
100
1
200
2
200
3
200
1
300
2
300
3
300

Nồng độ phân tích được
-1
(TB ± SD, µg*kg )
a
91,45 ± 1,44
a
90,40 ± 1,25
a
90,92 ± 1,43
b
187,23 ± 2,79
b
184,76 ± 1,97
b

185,18 ± 2,43
c
286,03 ± 4,01
cd
288,27 ± 2,71
d
289,50 ± 2,65

RSD
(%)
1,58
1,38
1,57
1,49
1,07
1,31
1,40
0,94
0,91

RE
(%)
91,45
90,40
90,92
93,61
92,38
92,59
95,34
96,09

96,50

* Mỗi giá trị là trung bình của 6 mẫu đo

Bảng 1.17 (phụ lục): Độ chính xác (RSD %), độ đúng (RE %) và hiệu suất
thu hồi erythromycin A trên mẫu cá rô phi
Ngày Nồng độ thêm Nồng độ phân tích được
-1
-1
(µg*kg )
(TB ± SD, µg*kg )
a
1
100
85,07 ± 1.26
a
2
100
85,34 ± 1.79
a
3
100
85,31 ± 1.24
b
1
200
173,25 ± 2.34
b
2
200

173,03 ± 2.09
b
3
200
172,82 ± 1.39
c
1
300
261,62 ± 4.53
cd
2
300
262,57 ± 3.42
d
3
300
265,68 ± 5.38

RSD
(%)
1,48
2,10
1,45
1,35
1,21
0,80
1,73
1,30
2,02

RE
(%)
85,07
85,34
85,31
86,63
86,51
86,41
87,21
87,52
88,56

* Mỗi giá trị là trung bình của 6 mẫu đo

3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác


20
Bảng 3.3: Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh được định danh
bằng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm
Stt
Kháng sinh
Thế bán sóng E1/2
1 Erythromycin
-1.430 mV
2 Chloramphenicol
-168 mV
3 Florfenicol
-78 mV
4 Furazolidone

-1.152 mV
5 Ciprofloxacin
-1.336 mV
6 Enrofoxacin
-214 mV
7 Danofoxacin
-1.120 mV
Sự tách biệt thế bán sóng này chứng tỏ được phương pháp stripping
sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ngoài khả năng sàng lọc mà còn
có khả năng nhận danh và tính khẳng định.
 Giải thích cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin:
Trong công thức cấu tạo của eythromycin (hình 3.1) có hai nhóm
C=O, đó là cơ sở để hy vọng có thể bắt được tín hiệu khử đặc trưng của
eythromycin. Các nhóm C=O, như trong các aldehyde và xeton, thường cho
sóng khử trực tiếp theo cơ chế sau:
•

Trong giai đoạn thứ nhất xảy ra phản ứng khử thuận nghịch với sự
tham gia một điện tử để tạo ra gốc anion:
-

•

+

`

-

RR’C=O + e (+ H ) ↔ RR’C – O

(hay là
`
RR’C – OH)
Các gốc anion tiếp tục khử với sự tham gia thêm một điện tử nữa
và tạo một sóng khử có sự tham gia hai điện tử.
Tuy nhiên tùy nguyên tử cacbon của nhóm C=O liên kết với các

nhóm ái nhân hay ái điện tử mà việc khử nhóm C=O dễ hay khó. Nếu nó
liên kết với các nhóm ái điện tử càng mạnh thì việc khử nhóm C=O càng
dễ, sóng càng chuyển dịch về phía dương.
Ta hãy xét thế bán sóng của một số chất hữu cơ có nhóm C=O sau:
 Formaldehyde H–CH=O
Đệm pH 8
E1/2 = -1,50 V
Đệm pH 10

E1/2 = -1,63 V

Đệm pH 12

E1/2 = -1,74 V


21
 Axetaldehyde CH3–CH=O

Đệm pH 7

E1/2 = -1,93 V

Đệm pH 9

E1/2 = -2,08 V

 Propionaldehyde CH3–CH2–CH=O LiOH 0,1M E1/2 = -1,96 V
Qua các ví dụ trên ta thấy khi nguyên tử cacbon của nhóm C=O
liên kết với các mạch cacbon càng dài, mật độ điện tử trong nhóm C=O
càng cao, quá trình khử càng khó, thế bán sóng càng tăng về phía âm.
Ngược lại khi các nhóm ái điện tử càng gần nguyên tử cacbon của nhóm
C=O, thì nhóm C=O càng dễ khử như các ví dụ sau:
 Methylglyoxal CH3–CO–CH=O Đệm pH 7 E1/2 = -1,36 V
 Glycoaldehyde HO–CH2–CH=O Đệm pH 7 E1/2 = -1,54 V
Nhóm C=O thứ nhất của erythromycin liên kết với một loạt nhóm
CH và CH3 là các nhóm ái nhân nên mật độ điện tử khá cao nên rất khó
khử. Thế bán sóng của nhóm này phải nằm lân cận vùng -2,0 volt.
Nhóm C=O thứ hai liên kết trực tiếp với một nguyên tử oxy là một
tác nhân ái điện tử, cho nên có thể kết luận sóng của erythromycin có thế
đỉnh vùng -1,4 volt là sóng khử của nhóm C=O thứ hai.
 Khái quát hoá khả năng phân tích một số họ kháng sinh:
a) Họ Phenicol:
Trong công thức cấu tạo của họ kháng sinh phenicol có 3 nhóm
chức điện hoá:
- Nhóm -Cl2: CH2=CCl2 có E1/2 > -0,2 V; CH2=CH-CH2Cl có E1/2: -1,95 V
- Nhóm C=O cũng có thể tham gia phản ứng khử.
- Nhóm nitro có trị số E1/2 dao động trong khoảng -0,2 V đến -1,0 V phụ
thuộc vào giá trị pH, các nhóm liên kết với nhóm NO2 và dung môi sử
dụng. Tuỳ thuộc pH dung dịch nền, nhóm này cho 1 sóng hay 2 sóng khử.
b) Họ Nitrofuran:
Trong họ kháng sinh nitrofuran có 3 nhóm chức điện hoá:
- Nhóm NO2 có E1/2 trong khoảng - 0,2 V đến - 1,0 V.

- Nhóm C=N có E1/2 trong khoảng -1,0 V đến - 1,8 V.


- Ngoài ra còn có nhân dị vòng 2-oxo-1,3-oxolidin cũng có thể tham gia
phản ứng khử.
c) Họ Fluoroquinolon:
Nhóm fluoroquinolon trong công thức cấu tạo có khung quinolon,
nhân quinon, nhóm này có phản ứng khử trên điện cực giọt thuỷ ngân.
3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SSWV với LC-MS/MS
3.2.5.1 Trên mẫu tôm càng xanh
-1

Hiệu suất thu hồi: > 90,92 %, MDL: 0,57 µg.kg ; R_adjust:
0,99999; RSD: 0,91 ÷ 1,58 %. (Hình 3.29)

Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh

3.2.5.2 Trên mẫu cá rô phi
-1

Hiệu suất thu hồi: > 85,07%; MDL: 0,80 µg.kg ; R_adjust: 1,0;
RSD: 0,80 ÷ 2,10 % (Hình 3.30).

Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi

3.2.5.3 So sánh kết quả phân tích bởi SSWV và LC-MS/MS a)
Tôm càng xanh


23

Bảng 3.4: So sánh kết quả phân tích mẫu tôm càng xanh bởi 2 phương pháp
Số nhận diện
GP – Blank
GP – Blank
GP – Blank
GP – I
GP – I
GP – I
GP – II
GP – II
GP – II
GP – III
GP – III
GP – III

SSWV (LOD=0,57 µg*kg-1)
TB ± SD
Dư lượng
RSD
(µg*kg-1)
(µg*kg-1)
(%)
KPH
KPH
KPH
51,37
50,19
1,17
50,75 ± 0,59a
50,68

65,45
64,97
65,48 ± 0,53b 0,80
66,02
80,61
79,16
80,00 ± 0,75c 0,94
80,22

LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1)
TB ± SD
Dư lượng
RSD
(µg*kg-1)
(µg*kg-1)
(%)
KPH
KPH
KPH
50,73
56,89
52,61 ± 3,72a 7,06
50,21
72,82
68,00
70,49 ± 2,41b 3,42
70,65
74,60
85,12
80,23 ± 5,30c 6,61

80,98

* LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát hiện

b) Cá rô phi
Bảng 3.5: So sánh kết quả phân tích mẫu cá rô phi bởi 2 phương pháp
Số nhận diện

TL – Blank
TL – Blank
TL – Blank
TL – I
TL – I
TL – I
TL – II
TL – II
TL – II
TL – III
TL – III
TL – III

SSWV (LOD=0,80 µg*kg-1)
TB ± SD
Dư lượng
RSD
(mg*kg-1)
(mg*kg-1)
(%)
KPH
KPH

KPH
1,31
1,27
1,29 ± 0,02a 1,61
1,30
1,95
2,09
2,02 ± 0,07b 3,47
2,02
2,80
2,80
2,78 ± 0,03c 1,25
2,74

LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1)
TB ± SD
Dư lượng
RSD
(mg*kg-1)
(mg*kg-1)
(%)
KPH
KPH
KPH
1,23
1,28
1,26 ± 0,03a 2,10
1,27
3,14
2,72

2,72 ± 0,43a 15,64
2,29
2,80
2,80
2,80 ± 0,01b 0,21
2,81

* LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát hiện

Qua bảng 3.4 và 3.5, cũng như kết quả phân tích ANOVA ở bảng
3.28-3.31 (phần phụ lục) ta thấy được có sự tương đồng khá chặt chẽ về kết
quả phân tích giữa 2 phương pháp SSWV và LC-MS/MS. Xét về độ lặp lại
của phương pháp thì phương pháp sóng vuông quét nhanh có độ lặp lại tốt


hơn phương pháp LC-MS/MS dựa trên chỉ số % R.S.D trên cả 2 đối tượng
mẫu là tôm càng xanh và cá rô phi.
3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ERYTHROMYCIN TRÊN CÁC MẪU THỰC TẾ
TÔM, CÁ TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG
700
600
500
Dư lượng erythromycin A (ppb)
400
300
200
100
0

Dong Kien

An

Vinh

Ben

Cao Lanh Tam Nong Thap Muoi Go Quao Giong Rieng Vinh
Thuan Thoai Son Long Xuyen Phu Tan Tam Binh Binh Minh
Long Ho
Mo Cay Chau Thanh Giong Trom Duyen Hai Tra Cu
Cang Long
Phung Hiep Long My Vi Thuy My Tu
My Xuyen Ke Sach
Tra Hau Soc Can Bac thap Giang Giang Long Tre Vinh Giang Trang Tho

Lieu Địa phương

Hình 3.31: Tình hình nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL
800
700
600
500
Dư lượng
erythromycin A 400
(ppb)
300

Thoai Son Long Xuyen
Phu Tan Tam Binh Binh

Dong Kien
An
Vinh
thap Giang Giang Long

Ben
Tre

Co Do

Cao Lanh Tam Nong
Thap Muoi Go Quao
Giong Rieng

Giong Trom Duyen Hai Tra Cu
Cang Long Phung Hiep Long My
Vi Thuy My Tu
My Xuyen Ke Sach
Vinh Thanh O Mon
Tra
Hau Soc
Vinh Giang Trang

Can
Tho

Gia Rai

0

Vinh Thuan

100

Mo
Long
Cay
Ho
Chau
Thanh

200

Bac
Lieu

Địa phương

Hình 3.32: Tình hình nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL

Tỷ lệ nhiễm trên tôm càng xanh (45/150 mẫu) cao hơn so với trên
cá rô phi (30/150 mẫu). Người nông dân đã bắt đầu sử dụng loại kháng sinh
này, thậm chí ở nồng độ cao để điều trị bệnh cho thủy sản nuôi và không
tuân thủ thời gian ngưng thuốc cần thiết (hình 3.31 & 3.32).
3.4 XÁC ĐỊNH QUY LUẬT CHUYỂN HÓA SINH HỌC, ĐÀO THẢI
KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRÊN CƠ THỂ THỦY SẢN KHI NUÔI


25
3.4.1 Đào thải erythromycin trong cơ thịt

700.0

Er
yt
hr
o
m
yc
in
A
(µ
g/

600.0
500.0
400.0
300.0
200.0
100.0
0.0

0

100

200

300

400

500

600

700

o

Thời gian ( C - ngày)
50 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày

100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày

Hình 3.33: Khả năng đào thải erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã
-1

-1

được cho ăn 50 và 100 mg.kg thể trọng.ngày trong 7 ngày
50,000
45,000

E
yr
th
ro
m
yc
in

A
(µ
g/

40,000
35,000
30,000
25,000
20,000
15,000
10,000
5,000
0 0

100

200

300

400

500

600

o

700

Thời gian ( C - ngày)

50 mg ery thromy cin/kg thể t rọng/ngày

100 mg ery t hromy cin/kg thể t rọng/ngày

Hình 3.34: Khả năng đào thải erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã được cho
-1

-1

ăn 50 và 100 mg.kg thể trọng.ngày trong 7 ngày


Bằng phương pháp thống kê, rút ra được thời gian ngưng thuốc 976
o

°C_ngày (tương đương 34,86 ngày; ở nhiệt độ 28 C) đối với tôm càng
-1

-1

-1

-1

xanh đã được cho ăn erythromycin 100 mg.kg thể trọng.ngày trong thời
gian 7 ngày. Riêng với mức nồng độ 50 mg.kg thể trọng.ngày trong thời
gian 7 ngày thì dư lượng để lại là không đáng kể và ở mức an toàn.