Nghiên cứu nhân giống cây ba kích Tím bằng phương pháp In Vitro. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

TRẦN VĂN PHÚ

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Thái Nguyên - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
----------------------

TRẦN VĂN PHÚ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH TÍM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Lớp

: 44-CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn

: ThS. Nguyễn Thị Tình
ThS. Nguyễn Xuân Vũ

Thái Nguyên - 2016


i

LỜI CẢM ƠN
Được sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em đã
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân giống cây ba kích Tím bằng
phương pháp In Vitro”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Phòng Thí nghiệm trung tâm lâm nghiệp, đến
nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em
xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm cùng
các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian
thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo Nguyễn Thị Tình và các kỹ
sư trong trung tâm lâm nghiệp của trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận
tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập và mình cũng cảm ơn
bạn bè đã giúp đỡ mình trong thời gian vừa qua xin chân thành cám ơn.
Trong thời gian thực tập vừa qua em đã có sự cố gắng rất nhiều nhưng vì thời
gian có hạn lên em vẫn còn nhiều thiếu sót trong bài khóa luận của em, em rất mong
nhận được ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2016
Sinh viên

Trần Văn Phú


ii

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

BA

: 6-Benzylaminopurine

MS

: Murashige & Skoog (1962)

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/c

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trường

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


1

PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Cây Ba kích tím ( Morinda officinalis How ) là một cây thuốc quý trong y
học cổ truyền. Củ của cây ba kích được sử dụng như một loại dược liệu có tác
dụng bổ thận âm, bổ thận dương tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng sức dẻo
dai và trừ phong thấp. Dịch chiết của củ cây ba kích có tác dụng giảm huyết áp
tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon.
Do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây
nên cây Ba Kích Tím bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên
cạn kiệt . Mặt khác, vùng phân bố của ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến
loài cây này rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ
Việt Nam cần phải được bảo vệ (nghị định số 48/2002/NĐ-CP).
Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống ba kích có chất
lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống ba kích
hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm cành, nhưng hệ số nhân rất thấp
(chỉ đạt 0,61/năm); chất lượng giống lại không cao.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì việc ứng dụng
nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) trong nhân giống đã trở nên phổ biến.
Nuôi cấy in vitro tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, đồng đều
cao và hệ số nhân lớn trong thời gian ngắn. Giải quyết được phần nào khó khăn
trong nhân giống hữu tính cho đối tượng cây trồng này, góp phần bảo tồn và phát
triển giống cung cấp nguyên liệu cho thị trường tiêu thụ và ngành y dược.
1.2. Mục đích và yên cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích của đề tài
- Đề tài nhằm nghiên cứu xây dựng cải tiến quy trình nhân giống cây ba
kích tím bằng phương pháp in vtiro có hệ số nhân giống cao và dễ ứng dụng
sản xuất.


2

1.2.2. Yêu cầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ, thời gian chất khử trùng
HgCl2 0.1mg/l đến khả năng tạo vật liệu vô trùng cho nuôi cấy in vtiro.
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
auxin và cytokinin đến khả năng tái sinh chồi cây Ba kích tím (Morinda
officinalis How )
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng
auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Ba kích tím
(Morinda officinalis How )
- Xác định được ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng auxin
và cytokinin đến khả năng ra rễ cây Ba kích tím (Morinda officinalis How )
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học về ảnh
hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của
giống cây ba kích tím bằng phương pháp in vitro.
- Là tài liệu tham khảo thêm cho việc nghiên cứu và sản xuất tại các cơ sở.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Góp phần nhân nhanh tạo số lượng lớn cây giống phục vụ mục tiêu bảo
tồn loài dược liệu quý theo Nghị định số 48/2002/NĐ-CP, đảm bảo chất
lượng cung cấp nguyên liệu cho việc phục hồi và phái triển lại cây ba kích tím


3

PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh thái và phân bố
Cây Ba kích tím (Morinda officinalis How) thuộc họ cà phê Rubioceae.
Ba kích tím hình thái cây Ba kich tím Cây thường xanh sống lâu năm, leo
cuốn vào cây khác hoặc tự cuốn tạo thành bụi lớn.

Cây ba kích có lá mọc đối, khi non màu xanh hoặc màu tím, khi già
màu xanh, cuống lá dài từ 4 - 8mm. Lá kèm màu nâu dạng mo, ôm thân.
Phiến lá thường hình mác thuôn nhọn, hình ellip thuôn dài nhọn hoặc hình
mác ngược hay hình trứng. Hiếm khi thấy hình mác hẹp dài phiến lá dài 3 16cm, rộng 1,9 - 6,5 cm đầu lá thuôn nhọn hay nhọn sắc, gốc lá nhọn hình
nêm, tròn hay gần bằng, có khi hơi lõm dạng tim. Rễ dạng trụ tròn phân
nhánh nhiều cấp thành bộ phận rễ, phân bố tỏa tròn xung quanh gốc, nhìn
ngoài có vết thắt từng đoạn, thịt củ dày, nạc, màu tím hoặc trắng ngà. Rễ
cây Ba kích - Cành non dạng bốn cạnh, màu tím hoặc xanh, có lông, khi
già tròn không lông. - Cụm hoa chủ yếu là xim tán kép, ít khi là cụm hoa
tán đơn. Ở cụm sim tán kép, hoa hầu như không cuống, cụm tán đơn hoa có
cuống rõ ràng.
Hoa của cây nhỏ ống đài dạng chén, có 3 - 4 răng nhỏ không đều. Tràng màu trắng, ống tràng dài 2 - 3mm, họng có lông, ở đầu có 3 - 4 cánh
tràng dạng tam giác nhỏ. - Nhị 3 - 4 bao phấn nhọn đầu, hai ô, đính lưng, chỉ
nhị cực ngắn. Vòi nhụy ngắn, đầu nhụy hai thùy. Hoa Ba Kích - Cụm quả kép
do nhiều quả dính liền với nhau đính trên các cuống xim nhỏ tạo thành. - Ở
cụm quả đơn, quả có cuống rõ ràng. Mỗi quả có 4 hạt. - Hạt có lông màu
hồng, khi khô màu trắng.


4

Mùa hoa tháng 4 - 5, quả chín tháng 10 - 11, cá biệt có thể quả chín từ
tháng 9 hoặc kéo dài tới đầu tháng 12-1 hay 3. Cây ưa ẩm, ưa sáng và có khả
năng chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ. Ba Kích thường mọc tự nhiên trong các
kiểu rừng thường xanh nhưng đã trở nên thứ sinh, bao gồm cả rừng xen tre
nứa và rừng non phục hồi sau nương rẫy. Độ cao dưới 400m, cá biệt có thể tới
1000m. Đất ở nơi có Ba kích thường còn tương đối mầu mỡ, tơi xốp, trung
tính hoặc hơi chua.
Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện nhiệt đới gió mùa nóng và
ẩm, ra hoa quả hàng năm.

Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt hoặc mọc cụm chồi từ các phần còn
lại sau khi chặt, phần rễ còn sót lại khi khai thác cũng có thể nảy mầm thành
cây mới.
Yêu cầu về nhiệt độ trung bình năm 22,5oC - 23,1oC. Độ ẩm không khí
trung bình năm từ 82 - 89%. Ba kích mọc tự nhiên trên các loại đất feralit đỏ vàng hay vàng - đỏ, tầng đất thịt ở trên tương đối dày, có kết cấu tượng hạt và
kết vón nhưng không có đá ong chặt. Đất luôn ẩm hơi chua, pH từ 3,6 đến
4,1, hàm lượng mùn 3,78 - 5,91%. Hàm lượng tổng số các chất trong 100g đất
lần lượt là: nitơ 0,24 - 0,34mg, lân 0,7 - 1,5mg và kali 7mg.
Ngoài ra, Ba Kích có thể sống trên đất feralit đỏ sẫm. Tầng đất mặt ở
đây tương đối dày (tới 1m), thành phần cơ giới nặng, cấu tạo hạt chắc và tơi
xốp, pH hơi chua đến trung tính 4,5 - 6, hàm lượng mùn ở mức trung bình 3 4%. Tại Hoành Bồ - Quảng Ninh và Sơn Động - Bắc Giang còn thấy Ba kích
mọc trên đất bồi tụ, pha cát ở chân núi. Loại đất này thường nghèo dinh
dưỡng hơn so với loại đất trên.
Chú ý: Ba Kích không thích hợp với đất phù sa và các loại đất khác ở
đồng bằng.


5

Ánh sáng: ánh sáng là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng trực tiếp tới
sinh trưởng và phát triển của Ba Kích. Trong tự nhiên cây mọc xen lẫn với
các loài cây khác dưới tán rừng, độ che tán 20 - 60%. Tuy nhiên để sinh
trưởng phát triển được, cây thường leo lên các cây bụi hay cây gỗ nhỏ để tiếp
cận với ánh sáng. Cây được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả nhiều hơn và nhiều
hạt chắc hơn cây bị che bóng.
Ba Kích mọc hoang ở vùng rừng thứ sinh, trung du và miền núi các tỉnh
phía Bắc, dưới tán một số kiểu rừng nhiệt đới ẩm lá rộng thường xanh, nay trở
nên thứ sinh gồm cây bụi và dây leo chằng chịt hoặc ở bờ nương rẫy. Độ cao
phân bố khoảng 100m so với mặt biển. Càng lên cao cây càng thưa dần, đến
độ cao khoảng 100m thì hầu như hiếm gặp. Có nhiều nhất ở các tỉnh Quảng

Ninh, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Lạng Sơn.
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học lịch sử của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình
nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng
Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho
việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các
bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ .
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy
mô và nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các
phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích
khác nhau .
2.2.2. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Haberland (1902)là người đầu tiên đề xuất ra phương pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông
mỗi tế bào bất kỳ cơ thế sống đều mang toàn bộ thông tin di truyền của loài


6

đó. Vì vậy ghặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào sẽ phát triển thành một cá thể
hoàn chỉnh. Ông đã thí nghiệm với tế bào khỉ khổng và thành công. Điều này
đã làm cho những nhà hoa học thời bấy giờ mất hy vọng về việc sây dựng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong 1 thời gian dài. Tuy nhiên sau đó
Garrison(1904-1907) đã nuôi được tế bào thần kinh của ếch trong huyết tương
chưng minh khả năng nuôi cấy mô tế bào động vật nhân tạo. Trên cơ sở thành
công của các nhà khoa học nuôi cấy mô tế bào động vật các nhà khoa học
nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi trường dinh dưỡng tự nhiên nhưng
khong thành công. Năm 1922 Robins và Kotte đã thành công nuôi cấy đầu rễ
trong vòng 12 ngày. Từ nhưng năm 30 của thế kỉ 20 phương phái nuôi cấy tế

bào đã mang nhưng nét của nuôi cấy mô tế bào hiện đại với kỹ thuật ko khác
với hiện nay nhiều lắm. Trong thời gian này White nhà bác học người Mỹ và
Ghautheret (Pháp) đã có nhiều đóng ghóp trong việc nghiên cứu môi trường
nuôi cấy, nhiều môi trường đến nay vẫn được sử dụng.
Từ năm 1931 phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật được coi chính
thức bắt đầu bằng công trình nghiên cứu của White với việc nuôi cấy rễ cây
cà chua và ông là người đầu tiên chỉ ra rằng mô phân sinh trưởng trong thời
gian dài nêu được cáy chuyển trong môi trường dinh dưỡng mới. Trong cùng
thời gian Ghautheret cũng đã thành công trong việc nuôi cấy mô tượng tầng
và tìm được môi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau đó Miller và Skoog trong
khi nuôi cấy nõi cây thước lá đã xác định được vài trò của Kinetin trong sự
kích thích phát triển của mô.
Những thí nghiêm về môi trường dinh dưỡng đã chỉ ra răng môi trường
dinh dưỡng tính chất vật lý tính chất hóa học là những điều quan trọng quyết
định đến thành công trong nuôi cấy mô, cơ quan và tế bào. Những thành
phần băt buộc của môi trường bao gồm chất khoáng từ các muối khác nhau
của các nguyên tố đa lượng và vi lượng, thành phần hydrocacbon trong đường


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full