Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers. (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

VŨ THỊ THÙY
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

VŨ THỊ THÙY
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN
NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp

:

K44 - CNSH

Khoa

:

CNSH - CNTP

Khóa học

:

2012 – 2016

Giảng viên hƣớng dẫn:
1. TS. Phí Quyết Tiến
Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. ThS. Bùi Đình Lãm
Khoa CNSH – CNTP – Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ Phòng Công
nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến –
Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên
men, Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt

quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS. Vũ Thị Hạnh
Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ Lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn
tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn CN. Nguyễn Phú Tâm cùng các cán bộ
Phòng Công nghệ Lên men đã chỉ bảo tôi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện
cho tôi trong suốt quá trình thực hiện tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS. Bùi Đình Lãm cùng các thầy cô giáo
trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô,
cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong
suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những
người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực
tập này.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016
Sinh viên
Vũ Thị Thùy


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược
liệu ................................................................................................................... 11
Bảng 2.2. Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội
sinh trên thực vật ............................................................................................. 14
Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ............................................ 21
Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen
16S rDNA ........................................................................................................ 26
Bảng 4.1. Đặc điểm hình thái của một số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình
phân lập từ các mẫu cây Màng tang ................................................................ 28

Bảng 4.2. Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 45
chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang ...................................... 32
Bảng 4.3. Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ................... 34
Bảng 4.4. Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT25 khi nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau ............................................................................................. 36
Bảng 4.5. Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn
MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C .......................................................... 37
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của
chủng MPT25 .................................................................................................. 38
Bảng 4.7. Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ
khuẩn MPT25 .................................................................................................. 39


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm
anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA ............................................................. 17
Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc đại diện của các chủng xạ khuẩn nội sinh trên
ba môi trường đặc hiệu và 3 bộ phận khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (A-Rễ, BThân, C-Lá) ..................................................................................................... 27
Hình 4.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh được phân bố trên các bộ phận của cây
Màng tang ........................................................................................................ 29
Hình 4.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo các môi trường phân lập .......... 30
Hình 4.4. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh được phân theo nhóm màu ...... 31
Hình 4.5. Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas
aeruginosa CNLM (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh .............................. 33
Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi
bào tử dưới kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) và 20.000 lần (C) của
chủng MPT25 .................................................................................................. 36
Hình 4.7. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel
agarose 1,0% ................................................................................................... 39

iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

STT

Tên đầy đủ

1

CA

Citrate acid-agar

2

DAB

Deacetil baceatin

3

DNA

Deoxyribonucleotide acid

4

DNR

Daunorubicin

5

DOX1

Doxorubicin

6

HV

Humic acid-agar

7

IDA

Idarumycin

8

NaOCl

Sodium hypochlorite

9

RNA

Ribonucleic acid

10

SPA

Sodium propionate-asparagine-salt agar

11

VSV

Vi sinh vật


v
MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2
1.3. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ........................................................................... 3
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4
2.1. Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu......................................................... 4
2.1.1. Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu..................................... 4

2.1.2. Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn............................................... 5
2.1.3. Phân lập xạ khuẩn nội sinh ..................................................................... 7
2.1.4. Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật .......................................... 8
2.1.5. Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật ....................................... 9
2.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh .................................................. 13
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 13
2.2.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ........................................................ 15
2.3. Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline .............. 16
2.4. Cây Màng tang và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh ....................... 18
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................... 20
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20
3.1.1. Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng gống vi sinh vật ......................... 20
3.1.2. Hóa chất................................................................................................. 20
3.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 21
3.1.4. Môi trường nuôi cấy .............................................................................. 21


vi
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 21
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
3.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 22
3.4.1. Lấy mẫu cây Màng tang ........................................................................ 22
3.4.2. Phương pháp xử lý bề mặt mẫu ............................................................ 22
3.4.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ............. 22
3.4.4. Đánh giá khả năng sinh anthracycline .................................................. 23
3.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25 ................ 23
3.4.6. Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa trên phân tích trình tự gen 16S
rDNA ............................................................................................................... 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27
4.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ

......................................................................................................................... 27
4.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang .................................. 29
4.2.1. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang .............. 29
4.2.2. Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập ........ 30
4.2.3. Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty ............ 31
4.3. Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh ................... 32
4.3.1. Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn ........................... 32
4.3.2. Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline ...................... 34
4.4. Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT25 ................. 35
4.4.1. Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 ......................................... 35
4.4.2. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng
xạ khuẩn MPT25 ............................................................................................. 38
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay, con người đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây ra bởi
vi khuẩn, nấm, virus và các vi sinh vật khác. Để điều trị các bệnh truyền
nhiễm gây ra bởi vi sinh vật, kháng sinh được sử dụng là chủ yếu. Tuy nhiên,
vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh đang là vấn đề
nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu của cộng đồng. Vì vậy,
việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên
hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới. Cho
đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự
nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại
thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng

phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra.
Theo nghiên cứu của Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh
có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản
sinh bởi xạ khuẩn [10]. Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất
chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra
rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh
học, các chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét,
chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học và kiểm soát sinh học… [9, 48]. Hơn
nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức năng của chúng đây
là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục những mối đe dọa gia tăng của
kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho con người và thực vật. Tuy nhiên,
so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn
nội sinh trên thực vật vẫn còn rất hạn chế .


2
Một trong những nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh là thực vật, đặc biệt
là cây dược liệu. Trong số đó, cây Màng tang (Litsea cubeba) là loài dược liệu
đã được trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng
nấm, nhức đầu, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học do
thành phần của cây mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây Màng tang
còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp chất
kháng sinh, chất chống ung thư. Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ
khuẩn trên cây Màng tang nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam
vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên
cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea
cubeba (Lour.) Pers.)”
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp các
chất kháng khuẩn và nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại của một chủng

xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao.
1.3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh một số các
chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu
thập tại tỉnh Phú Thọ.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài kế thừa kết quả của một số nghiên cứu trước đây của nhóm
nghiên cứu cũng như những kết quả nghiên cứu trong, ngoài nước về lĩnh vực
khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật, nguồn hợp chất kháng sinh, kháng ung
thư mới. Đề tài chọn đối tượng là cây Màng tang đã được nghiên cứu khá
nhiều trước đây, đặc biệt liên quan đến nghiên cứu tách chiết tinh dầu hoặc
tách chiết các hợp chất tự nhiên có tiềm năng kháng vi sinh vật, kháng tế bào


Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full