Nghiên cứu nhân giống loài Nưa Krausei (Amorphophallus Krausei Engl.) bằng phương pháp nuôi cấy mô

MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Trong xã hội công nghiệp hóa hiện nay, một mặt cuộc sống của con
ngƣời ngày càng đƣợc cải thiện, đời sống đƣợc nâng cao hơn nhƣng công
nghiệp hóa cũng làm nảy sinh nhiều bệnh tật mang tính xã hội nhƣ: tiểu
đƣờng, mỡ máu, béo phì…. Chính vì vậy, các nhà dƣợc học, thực vật học
luôn mong muốn tìm ra các loài thực vật có thể dùng làm thuốc hay làm thức
ăn có thể phòng và chữa trị đƣợc những bệnh này.
Cây Nƣa (Amorphophallus spp.) đƣợc dùng làm thức ăn từ lâu đời ở
Trung Quốc và các nƣớc Đông Nam Á. Ở Trung Quốc và Nhật Bản, bột từ củ
Nƣa đƣợc chế biến thành nhiều loại thức ăn khác nhau nhƣ mì, miến, thạch,
bánh, kẹo... Hơn nữa, trong bột Nƣa có chứa đƣờng glucomannan với hàm
lƣợng khá cao, giúp làm giảm mỡ máu, chống béo phì đƣợc chế biến thành
các viên giảm béo là một loại thực phẩm chức năng phổ biến. Ngoài ra, bột
Nƣa còn đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm làm đẹp da.
Theo các nghiên cứu mới đây của viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Việt Nam là nơi phân bố của một số loài Nƣa có hàm lƣợng
glucomannan tƣơng đối cao, Nƣa krausei (Amorphophallus krausei Engl.)
là một trong số đó. Để phát triển nguồn nguyên liệu củ cây Nƣa krausei thu
glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm và thực phẩm chức
năng thì vấn đề nhân giống cây Nƣa krausei là rất cần thiết.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ
thuật rất quan trọng và phổ biến của công nghệ sinh học giúp nhân nhanh
giống cây trồng và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm. Xuất phát từ những lý
do trên tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống loài Nƣa krausei
(Amorphophallus krausei Engl.) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô” để phục
vụ sản xuất.
1


Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng đƣợc quy trình nhân giống loài Nƣa krausei bằng phƣơng pháp
nuôi cấy mô.
Nội dung nghiên cứu
- Xác định điều kiện khử trùng hiệu quả.
- Xác định công thức môi trƣờng thích hợp tạo mô sẹo và tái sinh cây trong
ống nghiệm.
- Xác định công thức môi trƣờng thích hợp tạo đa chồi và cây hoàn chỉnh
trong ống nghiệm.
- Xác định giá thể thích hợp cho cây con nuôi cấy mô nuôi trồng ngoài tự
nhiên.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học: Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy trong
ống nghiệm đối với nhân giống và bảo tồn loài Nƣa krausei.
- Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả đề tài góp phần nhân giống phục vụ trực tiếp cho
các ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, y dƣợc học...
Điểm mới của đề tài
- Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về nhân giống loài Nƣa krausei bằng
phƣơng pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam.
Bố cục của khoá luận: gồm 41 trang, 12 bảng, 16 hình ảnh đƣợc chia thành
các phần chính nhƣ sau: Mở đầu (2 trang), chƣơng 1 (Tổng quan tài liệu: 15
trang), chƣơng 2 (Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu: 8 trang), chƣơng 3
(Kết quả và thảo luận: 14 trang), Kết luận và kiến nghị (1 trang), Tài liệu
tham khảo: 42 tài liệu, phụ lục.


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu chi Nƣa trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Trên thế giới
Chi Nƣa (Amorphophallus) là một chi lớn thuộc họ Ráy (Aracae). Trên

thế giới chi Nƣa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới
thuộc Châu Phi và Châu Á. Hiện nay nhiều loài đƣợc nghiên cứu và triển
khai trồng với diện tích lớn ở nhiều nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản,
New Zealand, Ấn Độ, Thái Lan, In đô nê xi-a, v.v.
Ở Trung Quốc, chỉ riêng tỉnh Vân Nam, hàng nghìn hecta đất đồi núi
đƣợc sử dụng để trồng Nƣa, ngoài ra Nƣa còn đƣợc trồng ở Nam Ninh,
Quảng Đông, Quảng Tây, Trùng Khánh... Ở Nhật Bản, chỉ 2 vùng Jinnejo và
Uedama, ngay từ những năm 70 của thế kỷ trƣớc, hàng năm khoảng hơn 15
nghìn ha Nƣa đã đƣợc trồng với sản lƣợng đạt tới hàng nghìn tấn. Do tầm
quan trọng của nguồn lợi từ củ Nƣa, nên cây này đã đƣợc nhập trồng từ Nhật
Bản vào New Zealand từ hàng chục năm trƣớc [23].
Nƣa là cây trồng có thể mang lại nguồn lợi kinh tế lớn, nên trong
những năm qua đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học cũng
nhƣ kỹ thuật canh tác cây Nƣa.
Hiroshi Kurihama (1979) đã đƣa ra các định hƣớng và kinh nghiệm
trong trồng trọt Nƣa konjac trên đất bằng và đất dốc tại 2 tỉnh Jinnejo và
Uedama ở Nhật Bản, cũng nhƣ các yếu tố về nhiệt độ, đất, sâu bệnh và thời
vụ [26].
Dhua và cs (1988) đã có nghiên cứu về ảnh hƣởng của các chất hoá
học đến quá trình nảy mầm, phát triển và sản lƣợng của củ Nƣa chuông
(Amorphophallus paeoniifolius Nicols.) [20].


Liu & cs (1998) khi nghiên cứu về sinh trƣởng và phát triển của một
số loài Nƣa ở Trung Quốc đã chỉ ra các điều kiện sinh thái của Nƣa. Theo
nhóm nghiên cứu, Nƣa không phải là cây đòi hỏi nhiều nƣớc, có khả năng
chịu hạn tốt nhƣng không chịu đƣợc ngập úng. Về nhiệt độ, Nƣa là cây ƣa
o

ấm, có khả năng chịu biến thiên nhiệt độ từ 5 - 43 C, nhiệt độ tối thích là 20

o

- 25 C, khi
o

o

nhiệt độ xuống dƣới 0 C và lên trên 48 C cây sẽ chết sau 5 ngày. Nghiên cứu
này cũng đƣa ra một số mức nhiệt tối thích cho sự phát triển của củ và rễ, khả
năng lai của một số loài Nƣa và thu đƣợc nhiều kết quả khả quan. Cũng theo
nghiên cứu cho biết Nhật Bản và Trung Quốc là hai nƣớc có lịch sử trồng và
sử dụng bột Nƣa (bột konjac) nhƣ loại thực phẩm truyền thống từ hàng nghìn
năm trở về trƣớc. Dựa trên những nghiên cứu rộng rãi về an toàn thực phẩm,
Bộ Y tế Trung Quốc cho phép đƣa bột Nƣa vào trong những thực phẩm quản
lý thông thƣờng từ năm 1998. Ở Mỹ ngƣời ta chấp nhận bột Nƣa nhƣ thực
phẩm bổ sung (năm 1997), và cũng cho phép sử dụng bột Nƣa nhƣ nhân tố
làm đặc, tạo màng, chất chuyển thể sữa và chất ổn định trong các thực phẩm.
Ngày nay Nhật Bản, Trung Quốc và một số nƣớc đã sử dụng bột Nƣa làm
nguyên liệu trong công nghệ dƣợc phẩm, sản xuất thực phẩm chức năng, hỗ
trợ nhiều bệnh nhƣ đái tháo đƣờng, hạ cholesterol máu, điều trị táo bón, hỗ
trợ giảm cân [29].
Long Chu Lin (1998) đã có công trình nghiên cứu thực vật dân tộc học
của các loài Nƣa, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ngƣời dân Trung Quốc đã sử
dụng Nƣa làm thức ăn từ 3000 - 4000 năm trƣớc, nhiều kiến thức về kỹ thuật
trồng cây Nƣa theo lối cổ truyền cũng đƣợc đề cập. Theo nghiên cứu này, hạt
của một số loài Nƣa khó nảy mầm ở ngoài tự nhiên, tuy nhiên nó lại nảy mầm
dễ dàng sau khi qua đƣờng tiêu hóa của một số loài chim. Theo cách nảy
mầm nhân tạo, quả Nƣa chín sau khi rửa sạch vỏ và cơm quả, trộn lẫn với cát

ẩm ở tỉ lệ 1:4 rồi cất vào chỗ tối hoặc phủ bằng lớp đất dày thì dễ dàng nảy
mầm
[30].


Theo Santosa và cs (2002) Nƣa chuông là cây lƣơng thực quan trọng ở
Java trong những năm 1940 - 1950, sau một thời gian ít đƣợc sử dụng, hiện
nay Nƣa đã trở thành loài có triển vọng kinh tế lớn, sự có mặt của loài cây
này tại các vƣờn nhà ở Java ngày càng nhiều. Trong các nghiên cứu về
sinh trƣởng và ứng dụng của Nƣa chuông từ 2003 đến 2008 của nhóm tác
giả cho biết chu kỳ tăng tƣởng của Nƣa chuông là khác nhau ở một số nƣớc
Nam Á nhƣ: ở Tây nam Trung Quốc, bắc Mianma, bắc Thái Lan chu kì tăng
trƣởng bắt đầu từ tháng 5, kết thúc vào tháng 10, trong khi đó ở In đô nê xia lại bắt đầu từ tháng 11 và kết thúc vào tháng 5, giai đoạn tăng trƣởng kéo
dài 160- 180 ngày ở tất cả các khu vực [37].
Liu (2004) đã đề cập khá kỹ về nguồn gốc, phân bố của chi Nƣa, phân
loại học, hình thái học, chu trình sinh trƣởng và phát triển, sinh thái, sự
chuyển hóa của glucomannan, trồng trọt, nhân giống và chế biến cũng nhƣ
bảo quản sau thu hoạch… của các loài Nƣa. Theo Liu trên thế giới đã biết
khoảng 173 loài Nƣa, trong đó có trên 20 loài đƣợc phát triển thƣơng mại ở
Trung Quốc, Nhật Bản, Malaisia, Ấn Độ và In đô nê xi-a, hàng năm thế giới
sản xuất khoảng 30 nghìn tấn bột konjac. Sản lƣợng củ Nƣa tƣơi có thể đạt
tới 30 - 35 tấn/ha nhƣng chỉ khoảng 2,5 tấn glucomannan đƣợc chiết xuất
từ số lƣợng củ này [28].
Douglas và cs (2005) đã có công trình nghiên cứu về kỹ thuật trồng
Nƣa konjac ở New Zealand và đã thu đƣợc nhiều kết quả về trọng lƣợng,
chất lƣợng củ Nƣa khi trồng dƣới tán rừng và trồng trực tiếp dƣới ánh
sáng mặt trời [22].
Theo Zhang và Liu (2006) Nƣa phát triển theo mùa, chúng thƣờng
rụng lá vào mùa đông hay mùa khô, thời gian ngủ sinh lý của Nƣa kéo dài
từ 60 - 80 ngày và không thể có bất kỳ tác nhân nào có thể phá vỡ trạng thái

ngủ để hình thành chồi trong giai đoạn này. Sau khi ngủ, cây bắt đầu nảy
mầm, lá


phát triển mạnh để hình thành củ mới, lúc này củ mẹ hết chất dinh dƣỡng và
chết đi. Trong tự nhiên, Nƣa cần ít nhất 3 năm để để phát triển đủ lớn và có
thể ra hoa. Do đó, Nƣa đƣợc đánh giá là cây sinh trƣởng chậm và cho năng
suất thấp [40].
Kết quả nghiên cứu của Nedunchezhiyan và cs (2006) đã giới thiệu khá
cụ thể về các bƣớc nhân giống từ củ, làm đất, tỷ lệ phân bón, mật độ trồng,
tƣới nƣớc, thu hoạch, cũng nhƣ bảo quản củ Nƣa chuông ở Ấn Độ. Theo các
tác giả, Nƣa chuông hoàn toàn có thể nhân giống đƣợc bằng cách cắt củ ra
thành từng phần khoảng 100gram trọng lƣợng. Ở Ấn Độ, Nƣa chuông có tên
gọi là Elephant foot yam, đƣợc biết đến nhƣ là một trong những rau củ giàu
chất dinh dƣỡng và là cây trồng lâu đời ở Tây Bengat, Andhra Pradesh, Tamil
Nadu, Bihar… năng suất của Nƣa chuông khoảng 30 - 35 tấn/ha [33], [35].
Nedunchezhiyan và cs (2012) đã có công trình nghiên cứu về sự phát sinh
chồi của Nƣa chuông, ảnh hƣởng của các loại giá thể, kích thƣớc củ giống và
ảnh hƣởng của các chất nhƣ thiourea, gibberellic acid, kali nitrat.. đến quá
trình hình thành chồi Nƣa chuông [34].
Theo Melinda Chua và cs (2010), ở Trung Quốc, Nƣa đƣợc trồng xen
canh với ngô và kê cũng đạt năng xuất khá cao [31].
Zhang và cs (2010) đã công bố kết quả nghiên cứu nhân giống so le
giữa 2 loài Nƣa là: A.bulbifer và A. muelleri nhằm tìm ra loài Nƣa thích hợp
cho vùng Nam Á. Sau khi nghiên cứu và so sánh với Nƣa konjac (A. konjac),
nhóm nghiên cứu đã kết luận loài A. muelleri có khả năng thích ứng tốt với
khí hậu Nam Á, cho hàm lƣợng glucomannan cao (>70%) có thể phát triển
trồng ở bắc Mianma và Lào. Nghiên cứu đã giải thích tại sao ở Nam Á ngƣời

ta sử dụng củ mà không sử dụng hạt Nƣa làm vật liệu nhân giống. Kết quả
nghiên cứu cho thấy điều kiện khí hậu của khu vực rất thuận lợi cho sự phát


triển của các loài cỏ dại, cây từ hạt thƣờng không đủ sức cạnh tranh. Hơn
nữa,


cây có nguồn gốc từ hạt không thể cho củ lớn trong thời gian 1 năm trong
điều kiện tự nhiên [41].
Mặc dù đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về Nƣa nhƣng các tài liệu
đƣợc công bố chủ yếu là các tài liệu về phân loại học và hình thái học còn các
tài liệu về sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ trồng trọt, nhân giống chủ yếu
đƣợc nghiên cứu ở một số loài nhƣ: A. konjac, A. muelleri, A.bulbifer, A.
paeoniifolius. Các loài Nƣa khác còn ít đƣợc biết đến trong đó có Nƣa
krausei.
1.1.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, chi Nƣa có khoảng 25 loài phân bố từ Bắc vào Nam
nhƣng hầu hết tập trung ở các tỉnh miền núi, một số tỉnh duyên hải và hải
đảo. Một số loài đã đƣợc các dân tộc miền núi sử dụng từ lâu đời không
chỉ làm thực phẩm mà còn là nguồn dƣợc liệu tự nhiên quý giá. Ngƣời dân
thƣờng trồng Nƣa lấy củ làm lƣơng thực, thân và cành lá dùng chăn nuôi,
cuống lá (bèn hay chột) Nƣa dùng nấu canh hoặc muối dƣa ăn. Củ đƣợc
dùng làm thuốc trong nhiều bài thuốc dân gian để chữa trị đờm tích trong
phổi, trúng phong bất tỉnh, cấm khẩu, chứng đau nhức, đầy bụng, tức
ngực, ăn uống không tiêu, sốt rét, trục thai chết...[14], [42].
Tài liệu về Nƣa ở Việt Nam chủ yếu là các công trình về phân loại chi
Nƣa. Các loài Nƣa đầu tiên ở Việt Nam đƣợc Gagnepain tổng hợp và mô tả
trong bộ sách Thực vật chí Đại cƣơng Đông dƣơng (1942) với 5 loài. Đó là
Nƣa chuông (A. campanulatus Bl. = A. paeoniifolius Nicolson), Nƣa rex (A.

rex Prain = A. paeoniifolius Nicolson), Nƣa đứt đoạn (A. interruptus Engl.),
Nƣa rivieri (A. rivieri Dur. = A. konjac K. Koch) và Nƣa Bắc Bộ (A.
tonkinensis Engl.) [24].
Phạm Hoàng Hộ (1993) đã thống kê và mô tả 7 loài, từ năm 1994 2000, nhiều loài Nƣa mới đã đƣợc một số nhà thực vật mô tả từ các mẫu thu
7


đƣợc ở Việt Nam. Dựa trên các mô tả đó Phạm Hoàng Hộ (2000) đã thống kê
đƣợc 18 loài Nƣa ở Việt Nam [4], [5], [10].
Cùng với các nhà thực vật nƣớc ngoài, Nguyễn Văn Dƣ (2001 &
2004), cũng mô tả nhiều loài Nƣa mới cho khoa học và một số loài Nƣa bổ
sung cho hệ thực vật Việt Nam, làm cho số loài của chi này lên tới 25 loài.
Trong đó, 4 loài Nƣa phổ biến nhất là: Nƣa chuông (A. paeoniifolius),
Nƣa bắc bộ (A. tonkinensis), Nƣa đầu nhăn (A. corrugatus) và Nƣa vân nam
(A. yunnanensis) [4], [5], [6].
Gần đây nguồn glucomannan từ củ của một số loài Nƣa ở nƣớc ta đã
đƣợc biết tới. Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đang tiến
hành nghiên cứu theo hƣớng này, theo báo cáo khoa học về sinh thái và tài
nguyên sinh vật tại hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 4 đã công bố 3 loài
Nƣa có triển vọng trong công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam là: Nƣa đầu
nhăn (A. corrugatus), Nƣa vân nam (A. yunnanensis) và Nƣa krausei (A.
krausei) [7]. Hiện nay các loài này đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Đối
với Nƣa krausei, các thông tin về thành phần hóa học, đặc tính sinh
trƣởng và phát triển, trồng trọt, nhân giống và chế biến chƣa đƣợc tài liệu
trong nƣớc nào đề cập.
1.2. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh
giống cây trồng
1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã đƣa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế

bào thực vật. Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng
(totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền
của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp
điều kiện thuận lợi.
8


Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi đƣợc đỉnh sinh trƣởng từ
đầu rễ của một cây hoà thảo trong 12 ngày. Nhƣ vậy, lần đầu tiên tính toàn
năng của tế bào đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất
nhiều công trình nghiên cứu đã tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng
lẻ, một khối mô hay một phần của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn
năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật
[17], [19].
- Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào.
Biệt hoá (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi
cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó.
Các tế bào dùng trong môi trƣờng nuôi cấy đều đã biệt hoá về cấu trúc
và chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào
này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá
trình đó gọi là quá trình phản phân hoá.
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh

Tế bào phân chia

Tế bào chuyên

Phản phân hóa tế

Hình 1.1. Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản
phân hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế
bào càng chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó
xảy ra quá trình phản phân hoá và ngƣợc lại, nhƣ các tế bào mạch dẫn ở thực
vật, tế bào thần kinh ở động vật. Ngƣời ta đã chứng minh rằng: các tế bào


càng gần trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành
công càng cao bấy nhiêu [8].
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế
hoạt động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một
gene nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động đƣợc hoạt hoá để cho
một tính trạng mới. Ngƣợc lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động.
Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chƣơng trình đã đƣợc lập sẵn
trong cấu trúc hệ gene của tế bào, giúp cho sự sinh trƣởng, phát triển của cơ
thể thực vật đƣợc hài hoà. Khi tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích
thƣớc khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gene của tế bào [8].
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát
sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hƣớng dựa vào sự phân
hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái
của tế bào, ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất kích
thích sinh trƣởng thực vật chính là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng của
hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ
từng mục đích nghiên cứu (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) [8].
1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
1.2.2.1. Môi trường nuôi cấy
Nghiên cứu về môi trƣờng nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch
sử phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành
các thí nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dƣỡng

khoáng còn hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng
hầu nhƣ chƣa đƣợc khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành
công [18].


Đến nay đã có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng đã đƣợc xây
dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều bao gồm
các thành


phần chính sau:
- Các loại muối khoáng
Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô
tế bào thực vật chia thành hai nhóm theo hàm lƣợng sử dụng là: nhóm đa
lƣợng và nhóm vi lƣợng.
+ Các nguyên tố khoáng đa lượng
Là các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30ppm, bao
gồm các nguyên tố sau: N, P, K, S, Mg và Ca. Các nguyên tố này có chức
năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng nên thành tế
bào. Môi trƣờng nhiều nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi. Môi trƣờng
nhiều kali giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh.
+ Các nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lƣợng là các nguyên tố đƣợc sử dụng với nồng độ dƣới
30ppm, gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lƣợng nhỏ trong
môi trƣờng nuôi cấy nhƣng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh
trƣởng và phát triển của mô. Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị
rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhƣng có hiệu
suất tái sinh thấp. Hàm lƣợng các nguyên tố đa lƣợng và các nguyên tố vi
lƣợng phụ thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy và các đối tƣợng nuôi cấy [9].
- Nguồn cacbon

Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dƣỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là
điều kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trƣờng nguồn cacbon và năng
lƣợng chủ yếu là saccharose và glucose. Ở một số mô thì có thể dùng
mantose, fructose và galactose.


- Vitamin
Mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy trong ống nghiệm (in vitro) vẫn có
khả năng tự tổng hợp đƣợc một số vitamin cần thiết nhƣng không đáp ứng đủ
nhu cầu sinh trƣởng và phát triển nhanh của chúng. Vì vậy, phải bổ sung
thêm các vitamin cần thiết vào môi trƣờng nuôi cấy để góp phần tạo các coenzyme xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào. Các vitamin thƣờng
đƣơc sử dụng nhƣ: B1(Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Panthotenic), B5
(Nicotinic acid) với nồng độ phổ biến là 0,5 - 1mg/l. Myo-inositol cũng
hay đƣợc sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế
bào thực vật [9].
- Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trƣởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết
quả nuôi cấy in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi
cấy. Nó ảnh hƣởng đến sự phân hóa, phản phân hóa và sinh trƣởng của tế
bào, đặc biệt là sự biệt hóa các cơ quan nhƣ chồi và rễ. Nhu cầu về chất kích
thích sinh trƣởng đối với từng loài cây và từng giai đoạn nuôi cấy là khác
nhau. Vì vậy, để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành
nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng nhƣ tỷ lệ các chất kích thích sinh
trƣởng phù hợp. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thƣờng sử dụng 3
nhóm chất kích thích sinh trƣởng là auxin, cytokinin và gibberelin.
+ Auxin
Auxin (Aux) là hormone thực vật đƣợc phát hiện đầu tiên. Qua nhiều
nghiên cứu của các nhà khoa học, ngƣời ta nhận ra rằng Aux là hormone thực
vật quan trọng đối với toàn bộ giới thực vật. Aux dạng tự nhiên gồm có βIndolacetic Acid (IAA), Phenylacetic Acid, β- Indolyacetonitril Acid. Ngoài

ra có các dạng Aux đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng nhân tạo, đáp ứng nhu
cầu của con ngƣời trong lĩnh vực trồng trọt và nghiên cứu nhƣ: β-Indolbutiric


Acid (IBA), α-Naphtylacetic Acid (α-NAA), 2,4 Diclorophenoxiacetic Acid
(2,4D)…[

12], [16].


Aux là nhóm chất kích thích sinh trƣởng đƣợc sử dụng thƣờng xuyên
trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Aux kết hợp chặt chẽ với các thành
phần khác của môi trƣờng dinh dƣỡng để kích thích sự tăng trƣởng của mô
sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó
đƣợc sử dụng kết hợp với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Aux trong
môi trƣờng nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trƣởng và phát triển cần
nghiên cứu, hàm lƣợng Aux nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại
giữa Aux ngoại sinh và Aux nội sinh [12], [16].
Aux kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to dẫn đến tăng
kích thƣớc của các cơ quan nhƣ tăng diện tích lá, phình to của quả, củ, tăng
đƣờng kính và chiều dài của cành, thân, rễ, tạo quả không hạt, kìm hãm sự
rụng lá, hoa quả...[11].
Aux điều khiển tính hƣớng của cây nhƣ hƣớng sáng, hƣớng đất. Do
sự phân bố không đều của Aux ở hai phía của cơ quan, dẫn đến sự sinh
trƣởng không đều của tế bào trong một cơ quan, gây ra tính hƣớng [11], [12],
[16].
Ở cấp độ tế bào, Aux còn ảnh hƣởng lớn đến quá trình trao đổi chất,
các quá trình sinh lý của cây trồng nhƣ: quang hợp, hô hấp, trao đổi nƣớc hay
khoáng, tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, tăng quá trình trao đổi acid
nucleic, protein…[11].

Quan trọng nhất là Aux kích thích sự hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất
định trên cành chiết, cành giâm và trên mô nuôi cấy. Vì vậy, trong kỹ thuật
nhân giống vô tính, việc sử dụng Aux để kích thích ra rễ là cực kỳ quan trọng
và bắt buộc [12], [16].
+ Cytokinin

13


Cytokinin là chất kích thích sinh trƣởng có tác dụng làm tăng sự phân
chia tế bào. Các cytokinin thƣờng gặp là kinetin, BAP. Kinetin là một dẫn
xuất của bazo nito adenine đƣợc Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất

14


nucleic acid. BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhƣng có hoạt tính mạnh
hơn kinetin. Kinetin và BAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo
dài thời gian hoạt động của tế bào phôi sinh và làm hạn chế sự già hóa của tế
bào. Ngoài ra, các chất này có tác dụng lên qua trình trao đổi chất, quá trình
tổng hợp DNA, tổng hợp protein và tăng cƣờng hoạt tính của nhiều loại
enzyme. Cơ chế tác động của cytokinin ở mức độ phân tử trong tế bào thể
hiện bằng tác dụng tƣơng hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu
mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA. Tác
động phối hợp giữa auxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát
triển và phát sinh hình thái của tế bào và mô. Những nghiên cứu của
Skoog (1963) cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao phù hợp cho sự hình thành
rễ và thấp thì thích hợp cho sự phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức cân
bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo. Miller và Skoog (1957) đã
khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế bào cụ thể là

cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong phân bào và giữ cho quá
trình này diễn ra một cách bình thƣờng. Cytokinin đƣợc hình thành bởi rễ
và hạt đang phát triển [11].
+ Gibberellin
Gibberellin là nhóm hormone thực vật thứ hai đƣợc phát hiện sau
auxin bởi nhà nghiên cứu ngƣời Nhật Kurosawa (1920) từ việc nghiên cứu
bệnh của cây mạ do nấm Gibberella Fujikuroi gây ra, đây là chứng bệnh rất
phổ biến trong nghề trồng lúa ở các nƣớc phƣơng Đông thời bấy giờ, khi
nghiên cứu cơ chế gây bệnh ông đã tách đƣợc hàng loạt các chất là sản
phẩm tự nhiên của nấm G. Fujikuroi cũng nhƣ từ thực vật bậc cao gọi là
gibberellin A. Hiện nay, ngƣời ta đã phát hiện đƣợc trên 50 loại gibberellin
và ký hiệu A1, A2, …,A52 hoặc GA1, GA2, …, GA5,…, trong đó GA3
(gibberellic acid) có hoạt tính mạnh nhất [12], [16].
Gibberellin (GA) đƣợc tổng hợp trong phôi và các cơ quan đang sinh
14


trƣởng khác nhƣ lá non, rễ non, quả non…. GA đƣợc vận chuyển không phân

15


cực, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc tùy vào vị trí cơ quan sử dụng. Trong
tế bào, nơi tổng hợp GA mạnh nhất là ở lục lạp.
Hiệu quả sinh lý rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh
trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lóng cây họ lúa. Hiệu quả này có
đƣợc do ảnh hƣởng kích thích đặc trƣng của GA lên pha giãn của tế bào theo
chiều dọc. Vì vậy, khi xử lý GA làm tăng nhanh sự sinh trƣởng dinh dƣỡng
nên làm tăng sinh khối của chúng [11].
GA ảnh hƣởng rõ rệt lên sinh trƣởng các đột biến lùn. Các nghiên cứu

về trao đổi chất di truyền của GA khẳng định rằng các đột biến lùn của một
số thực vật nhƣ ngô, đậu Hà lan (chiều cao của cây chỉ bằng 20% chiều cao
của cây bình thƣờng) là các đột biến gen đơn giản, dẫn đến sự thiếu những
gen chịu trác nhiệm tổng hợp các enzyme của một số phản ứng trên con
đƣờng tổng hợp GA mà cây không thể hình thành đƣợc GA dù là một lƣợng
rất nhỏ. Với những đột biến này thì việc bổ sung GA ngoại sinh sẽ làm cho
cây sinh trƣởng bình thƣờng [12], [16].
- Các chất phụ gia hữu cơ
Các chất phụ gia hữu cơ đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm kích
thích sự sinh trƣởng của mô sẹo và các cơ quan nhƣ: nƣớc dừa, dịch chiết
khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men. Trong thành phần của nƣớc dừa chứa
các acid amin, acid hữu cơ, đƣờng, Myo-inositol và các chất có hoạt tính
auxin, các gluoxit của cytokinin. Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay đƣợc
sử dụng do trong thành phần của chúng có chứa một số loại vitamin và các
chất kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trƣởng và phát triển của
mẫu cây nuôi cấy.
- Chất giá thể (thạch - Agar)


Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trƣờng nuôi
cấy, hàm lƣợng agar dùng trong nuôi cấy dao động từ 0,6 - 1,0% theo khối
lƣợng.


Khi nồng độ agar cao, môi trƣờng trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất
dinh dƣỡng cũng nhƣ sự hấp thụ của mô gặp khó khăn. Đa số nuôi cấy phôi
đƣợc thực hiện trên môi trƣờng có agar nhƣng phụ thuộc vào từng loại cây
mà sử dụng cho phù hợp. Trong những nghiên cứu về dinh dƣỡng, việc sử
dụng agar đƣợc tránh bởi vì agar thƣơng phẩm không sạch do có chứa một
số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết. Tuy nhiên, các

chất nói trên cũng có thể đƣợc loại bỏ bằng cách rửa agar với nƣớc cất hai
o

lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60 C trong 24 giờ [17].
Giá trị pH môi trường
Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình
thu nhận các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng vào tế bào. Vì vậy, đối với từng
môi trƣờng nhất định và từng trƣờng hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh
độ pH của môi trƣờng về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy mô sẹo (callus)
của nhiều loài cây, pH ban đầu thƣờng là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH
đạt đƣợc giá trị từ 6,0 - 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính
kiềm hoặc tính acid cao nhƣ amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng
NaOH hoặc HCl loãng để chỉnh pH môi trƣờng về từ 5,5 - 6,5.
Giá trị pH của môi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng và phát triển của
nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0 - 6,0. Độ pH cao hơn sẽ làm cho môi
trƣờng rất rắn trong khi pH thấp lại giảm khả năng đông đặc của agar đồng
thời hoạt hóa các enzyme hydrolase, dẫn tới kìm hãm sự sinh trƣởng, kích
thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy [9].
1.2.2.2. Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: là nhân tố quan trọng ảnh hƣởng rõ rệt tới sự phân chia tế
bào và quá trình trao đổi chất trong các mô nuôi cấy, đồng thời nó ảnh hƣởng
đến hoạt động của auxin do đó ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của


cây nuôi cấy mô. Nhiệt độ nuôi cấy cần đƣợc giữ ổn định trong khoảng 25 0

27 C.