Nghiên cứu vi sinh vật sinh methane ứng dụng cho sản xuất biogas trong điều kiện môi trường nước lợ và nước mặn

Header Page 1 of 237.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015

Footer Page 1 of 237.


Header Page 2 of 237.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THU HOÀI

NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT SINH METHANE ỨNG DỤNG
CHO SẢN XUẤT BIOGAS TRONG ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NƯỚC LỢ VÀ NƯỚC MẶN
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62 420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Đinh Thúy Hằng
2. GS. TS. Nguyễn Lân Dũng

Hà Nội - 2015

Footer Page 2 of 237.


Header Page 3 of 237.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác cùng
với các cộng sự khác.
Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tập san và tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của
các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hoài

Footer Page 3 of 237.

Header Page 4 of 237.

LỜI CẢM ƠN
Thành công của Luận án này là kết quả của sự cố gắng nỗ lực bản thân
trong suốt quá trình nghiên cứu, tìm hiểu đề tài. Đồng thời bản thân tôi còn
nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của các thầy cô hướng dẫn, các anh
chị và các bạn đồng nghiệp.
Trước tiên, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ
Phòng Sinh thái Vi sinh vật, Phòng Công nghệ Enzyme - Protein của Viện Vi
sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội vì đã tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ về cơ sở vật chất cũng như khích lệ tôi trong quá trình thực tập
Nghiên cứu sinh.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi cảm ơn tới TS. Đinh Thúy
Hằng - Trưởng phòng Sinh thái Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ
sinh học - ĐHQGHN là người trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và
chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Đồng gửi lời
cảm ơn tới GS.TS Nguyễn Lân Dũng - chuyên gia cao cấp của Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học - người đã cho tôi nhiều lời khuyên bảo và giúp đỡ
trong thời gian nghiên cứu luận án.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Vi sinh vật
và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cơ sở vật
chất giúp tôi hoàn thành Luận án này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Thường vụ Đảng ủy, Ban Tổng Giám
đốc Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã tạo điều kiện giúp đỡ và khuyến khích,
động viên tôi trong suốt quá trình làm Nghiên cứu sinh.
Tôi mong muốn được cảm ơn đến Phân viện trưởng và các bạn đồng
nghiệp của Phân viện Công nghệ sinh học, Trung tâm nhiệt đới Việt - Nga đã

Footer Page 4 of 237.

Header Page 5 of 237.

nhiệt tình giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thời gian và cơ sở vật chất
trong suốt thời gian tham gia làm Nghiên cứu sinh.
Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
- Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật, các thầy cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật học
và Khoa sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên - ĐHQGHN đã trực
tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong khóa học Nghiên cứu sinh.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động viên tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015

Nguyễn Thu Hoài

Footer Page 5 of 237.


Header Page 6 of 237.

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục

1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

5

Danh mục các bảng

6

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

7

MỞ ĐẦU

10

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

12

Xử lý chất thải hữu cơ theo công nghệ phân hủy kỵ khí sinh
methane trong điều kiện nhiễm mặn

12

1.1.1. Ô nhiễm chất thải hữu cơ trong môi trường nhiễm mặn

12

1.1.2. Xử lý ô nhiễm chất hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí

14

1.1.3. Xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí trong điều kiện
nhiễm mặn

18

1.2.

Bản chất sinh học của phân hủy kỵ khí sinh methane

21

1.3.

Đa dạng di truyền và đặc tính sinh học của VSVSMT

25

1.3.1. Phân bố của VSVSMT trong tự nhiên

25

1.3.2. Vị trí phân loại của VSVSMT

26

1.3.3. Đặc tính sinh học của VSVSMT

30

1.4.

1.3.3.1. Cơ chất của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane

30

1.3.3.2. Sinh hóa của quá trình phân hủy kỵ khí sinh methane

32

1.3.3.3. Một số phương pháp nghiên cứu quần xã VSVSMT

35

1.3.3.4. VSVSMT trong môi trường nước lợ và nước biển

37

Công nghệ xử lý chất thải hữu cơ bằng phân hủy kỵ khí sinh
methane

40

1.4.1. Một số công nghệ phổ biến

40

1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phân hủy kỵ khí sinh methane

43

1.4.2.1. Cân bằng dinh dưỡng

43

1.4.2.2. Các yếu tố lý hóa và sinh học

44

1
Footer Page 6 of 237.


Header Page 7 of 237.

1.5.

Nghiên cứu về VSVSMT và công nghệ phân hủy kỵ khí tạo biogas
ở Việt Nam

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu

46
48
48

2.1.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

48

2.1.2. Hóa chất, môi trường và thiết bị

48

2.2. Phương pháp nghiên cứu

49

2.2.1. Làm giàu và phân lập VSVSMT

49

2.2.1.1. Làm giàu VSVSMT

49

2.2.1.2. Phân lập VSVSMT

50

2.2.2. Nghiên cứu các đặc tính sinh học của VSVSMT

51

2.2.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái

51

2.2.2.2. Xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sinh
trưởng của VSVSMT

51

2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường và chủng thuần khiết

52

2.2.3.1. Tách DNA tổng số từ mẫu môi trường

52

2.2.3.2. Tách DNA tổng số của chủng thuần khiết

53

2.2.3.3. Điện di DNA trên gel agarose

54

2.2.4. Phương pháp PCR- DGGE

54

2.2.4.1. Khuếch đại đoạn 16S rDNA cho phân tích DGGE

54

2.2.4.2. Điện di biến tính DGGE

55

2.2.4.3. Cắt băng và thôi gel

55

2.2.5. Phân tích trình tự 16S rDNA của các chủng VSVSMT

56

2.2.6. Thiết lập và phân tích thư viện gen mcrA(clone library)

57

2.2.6.1. Nhân PCR và tinh sạch sản phẩm

57

2.2.6.2. Phản ứng ghép nối gen vào vector

57

2.2.6.3. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli DH5α
bằng phương pháp sốc nhiệt

57

2.2.6.4. Tách dòng và giải trình tự gen mcrA

58

2.2.6.5. Phân tích trình tự gen mcrA và dựng cây phân loại

59

2
Footer Page 7 of 237.


Header Page 8 of 237.

2.2.7. Phân tích hóa học

59

2.2.7.1. Phân tích COD hòa tan

59

2.2.7.2. Xác định hàm lượng muối trong nước

60

2.2.7.3. Xác định tổng thể tích khí sinh ra trong quá trình phân hủy kỵ khí

61

2.2.7.4. Xác định hàm lượng methane trong mô hình thí nghiệm

61

2.2.7.5. Xác định hoạt tính sinh methane

62

2.2.8. Thiết lập mô hình phân hủy kỵ khí chất thải hữu cơ ở điều kiện
nước lợ và nước mặn

63
64

2.3. Sơ đồ mô tả các bước thí nghiệm
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Làm giàu VSVSMT từ trầm tích biển Nha Trang và Cát Bà

65
65

3.1.1. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước lợ

65

3.1.2. Làm giàu VSVSMT trong môi trường nước mặn

67

3.2. VSVSMT chiếm ưu thế trong các mẫu làm giàu

70

3.2.1. Mẫu làm giàu bằng methanol và acetate

70

3.2.2. Mẫu làm giàu bằng rong biển Ulva sp.

72

3.2.2.1. Phân tích bằng PCR-DGGE đoạn 16S rDNA
3.2.2.2. Đánh giá VSVSMT trong mẫu làm giàu bằng rong biển qua
thư viện gen mcrA

72
73

3.3. Phân lập VSVSMT từ các mẫu làm giàu

78

3.4. Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng VSVSMT phân lập

84

3.4.1. Khả năng sinh methane của các chủng VSVSMT phân lập

84

3.4.2. Ảnh hưởng của độ mặn tới sinh trưởng của hai chủng M7 và M37

86

3.4.3. Các đặc điểm sinh học của chủng M37

88

3.5. Tạo nguồn VSVSMT để hỗ trợ quá trình phân hủy kỵ khí ở điều kiện
nước lợ và nước mặn

93

3.5.1. Lựa chọn nguồn VSVSMT phù hợp

93

3.5.2. Tạo giống khởi động VSVSMT

95

3.5.3. Bảo quản nguồn VSVSMT trong điều kiện phòng thí nghiệm

99

3
Footer Page 8 of 237.

Header Page 9 of 237.

3.6.Thiết lập và vận hành mô hình kỵ khí xử lý chất thải hữu cơ theo
phương pháp phân hủy kỵ khí sinh methane ở điều kiện nước lợ và nước
mặn

99

3.6.1. Thiết lập mô hình

99

3.6.2. Vận hành mô hình

101

3.6.3. Đánh giá VSVSMT chiếm ưu thế trong các mô hình

105

KẾT LUẬN

108

KIẾN NGHỊ

109

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN

110

TÀI LIỆU THAM KHẢO

111

PHỤ LỤC

4
Footer Page 9 of 237.


Header Page 10 of 237.

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
AF

Anaerobic Filter

Bp

Base pair

BKM

Bùn kỵ khí ưa mặn

BSA

Bovin serum albumin

VSVSMT

Vi sinh vật sinh methane

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

COD

Chemical oxygen demand

DGGE

Denaturing gradient gel electrophoresis

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate

EDTA

Ethylenediamintetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropylthio - β - D – glucosamine

LB

Môi trường Luria – Bertani

mcrA

Đoạn gen mã hóa cho tiểu phần α của methyl - coenzyme M
reductase

MPN

Most probable number

MQ

Mili – Q

SDS

Sodium dodecyl sunfate

TAE

Tris – acetate – EDTA

TE

Tris – EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

PCI

Phenol - Chloroform - Isoamyl alcohol

PCR

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR

Realtime PCR

UASB

Upflow Anaerobic Sludge Blanket

X-Gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside
5

Footer Page 10 of 237.


Header Page 11 of 237.

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Đặc điểm các chi thuộc 5 bộ VSVSMT

28

2.1

Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE

55

2.2

PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA để định danh VSVSMT

56

3.1

VSVSMT trong mẫu làm giàu NTLRE3 bằng rong biển Ulva
sp.

75

3.2

VSVSMT phân lập từ các mẫu làm giàu của trầm tích biển
Nha Trang và Cát Bà

79

3.3

Vị trí phân loại của mười chủng VSVSMT phân lập dựa trên
so sánh trình tự đoạn 16S rDNA

82

3.4

Khả năng sinh khí biogas và mức độ phát huỳnh quang của tế

bào ở các chủng VSVSMT phân lập

85

3.5

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới sinh trưởng của hai chủng
VSVSMT M7 và M37

86

3.6

Nguồn hữu cơ trong các mô hình

101

3.7

Sự biến động của COD (mg/L) trong các mô hình nghiên cứu

102

6
Footer Page 11 of 237.


Header Page 12 of 237.

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Một số nguồn chất thải hữu cơ tại các vùng ven biển Việt Nam

13

1.2

Chuyển hóa cacbon hữu cơ trong phân hủy hiếu khí và kỵ khí

14

1.3

Hầm biogas loại nhỏ phổ biến ở các gia đình nông thôn Việt
Nam

17

1.4

Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí sinh
methane

21

1.5

Vi khuẩn acetogen và VSVSMT trong bùn kỵ khí từ bể biogas

24

1.6

Cây phân loại thể hiện vị trí của VSVSMT so với các ngành cổ
khuẩn khác dựa trên trình tự 16S rRNA

27

1.7

Hình thái tế bào của một số loài VSVSMT đã được mô tả

29

1.8

Con đường hình thành methane từ acetate, methanol và CO2

32

1.9

Sơ đồ mcr-operon ở VSVSMT Methanosarcina mazei

33

1.10

Hình ảnh VSVSMT dưới kính hiển vi huỳnh quang

34

1.11

Cơ chế tác động của các chất ức chế oxyanion nhóm VI tới quá
trình khử sulfate ở vi khuẩn khử sulfate

39

1.12

Bể tự hoại hai ngăn

40

1.13

Sơ đồ bể biogas xử lý chất thải có hàm lượng hữu cơ cao

41

1.14

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bể UASB

42

1.15

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của tầng lọc kỵ khí

42

2.1

Rong biển (Ulva sp.) sử dụng trong thí nghiệm phân hủy kỵ khí
sinh methane

48

2.2

Các bước phân lập chủng thuần khiết VSVSMT bằng phương
pháp ống thạch bán lỏng

50

2.3

Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí
sinh ra từ bể phân hủy kỵ khí

61

2.4

Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng methane trên thiết bị sắc ký khí

62

2.5

Mô hình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh methane và hệ thống
đo tổng lượng khí sinh ra bằng phương pháp cột nước

63

7
Footer Page 12 of 237.