Hoàn chỉnh quy trình 5 brom paps để xác định nồng độ kẽm trong tinh dịch ở nam giới vô sinh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2009 – 2015

Hà Nội – 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
-------***-------

BỘ Y TẾ

CAO THỊ HOÀNG YẾN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ Y KHOA
KHÓA 2009 – 2015


Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ TRANG

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khoá luận này,
tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các Thầy, các Cô, các
anh chị và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được bày tỏ lòng cảm
ơn chân thành tới:
Ban Giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, phòng Quản lí đào tạo Đại
học, phòng Quản lí Nghiên cứu Khoa học.
Bộ môn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội cùng các thầy

cô và anh chị trong bộ môn đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi tận tình trong
nghiên cứu và hoàn thành khoá luận.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Trang,
người đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, dìu dắt, hướng dẫn tôi trong suốt quá
trình làm khoá luận. Cô đã khích lệ tôi, chỉ dẫn tôi rất nhiều để tôi có thể
hoàn thành được khoá luận như ngày hôm nay.
Các Thầy cô trong hội đồng khoa học thông qua đề cương và bảo vệ
luận văn đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình học
tập và nghiên cứu.
Xin cảm ơn các bệnh nhân đã nhiệt tình tham gia vào nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi – những người dù
không bên cạnh nhưng luôn động viên tôi, những người bạn đã giúp đỡ, chia
sẻ khó khăn với tôi trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 6 năm 2015
Cao Thị Hoàng Yến


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài khoá luận “Hoàn chỉnh quy trình 5-BrPAPS để xác định nồng độ kẽm trong tinh dịch ở nam giới vô sinh” là
hoàn toàn do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Trang. Các
số liệu và kết quả nêu trong khoá luận là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kì công trình nào khác.

Tác giả
Cao Thị Hoàng Yến


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................. 3
1.1.

Lịch sử nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam ......................................... 3

1.1.1. Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam trên thế giới .................. 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam ................. 4
1.2.

Một số nguyên nhân gây vô sinh nam .................................................. 4

1.2.1. Nhóm nguyên nhân do di truyền .................... 5
1.2.2. Nhóm nguyên nhân không do di truyền ................ 6
1.3. Vai trò của kẽm trong cơ thể người
7
1.3.1. Vai trò của kẽm ở nam giới.......................................................... 10
1.3.2. Vai trò của kẽm ở nữ giới…………………………………………….11
1.3.3. Vai trò của kẽm đối với sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)….12
1.4.

Các xét nghiệm cần thiết để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ kẽm đến
chất lượng tinh dịch đồ……………………………………………….12

1.4.1. Xét nghiệm tinh dịch đồ………………………………………………12
1.4.2. Định lượng kẽm trong tinh dịch............................................................ 14

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..15
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 15

2.1.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu ............................................................................ 15
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ …………………………………………………...15
2.2.

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 15

2.2.1. Quy trình nghiên cứu ............................................................................ 15
2.2.2. Định lượng kẽm bằng phương pháp 5-Br-PAPS .................................. 15
2.2.3. Các chỉ tiêu nghiên cứu......................................................................... 17


2.2.4. Xử lí số liệu .......................................................................................... 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................... 19
3.1. Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm bằng phương pháp 5-BrPAPS ............................................................................................................... 19
3.2. Mối liên quan giữa nồng độ kẽm trong tinh dịch với độ di động của tinh
trùng................................................................................................................. 23

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................. 27
4.1. Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật định lượng kẽm trong tinh dịch bằng
phương pháp 5-Br-PAPS ............................................................................... 27
4.2. Mối liên quan giữa nồng độ kẽm trong tinh dịch với độ di động của tinh
trùng................................................................................................................ 30
4.3. Chỉ định và ý nghĩa của xét nghiệm kẽm ................................................ 31

KẾT LUẬN ..................................................................................... 33
KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2.1. Tác dụng của việc bổ sung kẽm đối với nhóm nam giới vô sinh 11
Bảng 1.3.1 Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 1999 và 2010 ...................... 13
Bảng 3.1.1: Bảng kiểm quy trình kĩ thuật định lượng kẽm trong tinh dịch bằng
phương pháp 5-Br-PAPS ............................................................................... 19
Bảng 3.1.1(tiếp): Bảng kiểm quy trình kĩ thuật định lượng kẽm trong tinh dịch
bằng phương pháp 5-Br-PAPS........................................................................ 20
Bảng 3.1.2: Bảng kiểm chứng quy trình định lượng kẽm bằng phương pháp
5-Br-PAPS ............................................................................................... 21
Bảng 3.1.3. Nồng độ kẽm trước và sau bảo quản ........................................... 22
Bảng 3.1.4. Nồng độ kẽm ở nhóm đối tượng nghiên cứu và nhóm chứng ..... 23
Bảng 3.2: Tương quan giữa nồng độ kẽm trong tinh dịch với độ di động của
tinh trùng ......................................................................................................... 24


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.2: Quá trình tổng hợp ADN, chu trình folate và chuyển hoá
glutathione ....................................................................................................... 8

DANH MỤC BIỂU
3.2.2. Biểu đồ tương quan giữa độ di động tiến tới của tinh trùng với nồng độ
kẽm trong tinh dịch ........................................................................................ 25
3.2.3. Biểu đồ tương quan giữa tinh trùng không di động với nồng độ kẽm
trong tinh dịch ................................................................................................. 26


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tỉ lệ vô sinh trên thế giới cũng như trong nước ta ngày càng
tăng. Nếu trước kia, người ta quan niệm nguyên nhân vô sinh chỉ do phụ nữ
thì các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nguyên nhân vô sinh là do cả nam
giới và nữ giới. Theo tổ chức y tế thế giới, trong số các cặp vợ chồng ở độ
tuổi sinh sản gặp vấn đề về việc sinh con thì 30 – 40% do nam giới, 40% do
nữ giới, 10% do cả nam và nữ, 10% không rõ nguyên nhân [1]. Từ đó, vô sinh
nam đã trở thành vấn đề có tính chất thời sự, được nghiên cứu một cách sâu
sắc và toàn diện hơn.
Vô sinh ở nam giới do nhiều nguyên nhân gây nên, do đó việc chẩn
đoán nguyên nhân là rất quan trọng, giúp bác sỹ lâm sàng quyết định phương
pháp điều trị để đạt được kết quả tốt nhất. Có nhiều xét nghiệm hỗ trợ giúp
chẩn đoán nguyên nhân như tinh dịch đồ, xét nghiệm di truyền, nội tiết tố…và
gần đây là xét nghiệm về các marker hóa sinh, bao gồm kẽm, fructose… đang
được triển khai tại Bộ môn Y sinh học – di truyền, có ý nghĩa đáng kể trong
chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới.
Trên thế giới, nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kẽm trong tinh dịch
đến tính chất của tinh trùng qua các thông số tinh dịch đồ đã công bố từ khá
lâu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, kẽm đóng vai trò quan trọng trong quá
trình phát triển bình thường của tinh hoàn, tuyến tiền liệt và khả năng di động
của tinh trùng [2]. Thiếu hụt kẽm trong hệ thống sinh sản gây yếu sinh lí và
vô sinh [3]. Tuy nhiên, ở Việt Nam, đây còn là một vấn đề rất mới, chưa có
một báo cáo hay nghiên cứu cụ thể nào, dù vai trò của kẽm trong quá trình
sinh sản, đặc biệt với nam giới đã được biết đến từ lâu. Vì vậy, để tham gia
vào công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản của người dân Việt Nam và góp


2

phần vào việc chẩn đoán nguyên nhân của tình trạng vô sinh ở nam giới,
chúng tôi tiến hành đề tài “Hoàn chỉnh quy trình 5 – Brom – PAPS (5-BrPAPS) để xác định nồng độ kẽm trong tinh dịch ở nam giới vô sinh”.
Mục tiêu của đề tài:
Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật để định lượng kẽm trong tinh dịch

1.

theo phương pháp 5-Br-PAPS.
2.

So sánh độ di động của tinh trùng giữa nhóm có nồng độ kẽm

thấp với nhóm có nồng độ kẽm bình thường theo tiêu chuẩn của thế giới.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Lịch sử nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam
Theo WHO, vô sinh (infertility) là tình trạng một cặp nam nữ trong độ

tuổi sinh đẻ, chung sống và quan hệ tình dục thường xuyên trong vòng 12
tháng mà không có thai dù không sử dụng bất cứ biện pháp tránh thai nào [4].
Vô sinh được phân thành hai loại: vô sinh nguyên phát và vô sinh thứ
phát. Vô sinh nguyên phát là khi người phụ nữ hay người đàn ông chưa từng
có con lần nào. Vô sinh thứ phát là vô sinh mà trong tiền sử đã từng có con ít
nhất một lần nhưng sau đó không thể có thai dù quan hệ tình dục bình thường
trong một năm mà không áp dụng bất kì biện pháp tránh thai nào.

Vô sinh nam giới là trường hợp nguyên nhân vô sinh từ nam giới, do
người nam giới có chức năng sinh sản không được đảm bảo được như người
bình thường, cần có sự can thiệp của y tế.
1.1.1. Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam trên thế giới
Theo ước tính của WHO (1991), trên thế giới có khoảng 12%-15% cặp
vợ chồng vô sinh tương đương 50-80 triệu người [5].
Năm 1999, WHO thống kê vô sinh ảnh hưởng đến 15% dân số thế giới
trong độ tuổi sinh sản, và 50% những trường hợp này là nguyên nhân do nam
giới [6].
Hội Y học sinh sản Hoa Kỳ thống kê năm 2001 có khoảng 6,1 triệu
người Mỹ bị vô sinh, một phần ba là do nữ, một phần ba là do nam giới, phần
còn lại là do cả hai hoặc không rõ nguyên nhân [7].
Năm 2003, nghiên cứu của Krauz và cộng sự cũng kết luận nguyên
nhân gây vô sinh do nam giới khoảng 50%. Trong đó, khoảng 40% - 50%
những nam giới này là có bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [8].


4
Tại Ả Rập, năm 2006, Ali Hellani tiến hành nghiên cứu và cũng cho
rằng, khoảng 10%-15% cặp vợ chồng vô sinh, trong đó nguyên nhân do nam
giới chiếm 50% [9].
Đến năm 2010, WHO công bố số liệu mới, cho rằng có 8% - 10% cặp
vợ chồng vô sinh trong đó 35% do vợ, 30% do chồng, 25% do cả hai, 10%
chưa rõ nguyên nhân [10].
Như vậy, theo các nghiên cứu trên, ta có thể thấy tỉ lệ vô sinh ở các
quốc gia trên thế giới thay đổi từ 10% - 20%. Trong đó vô sinh nam thường
chiếm tỉ lệ một nửa.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu vô sinh và vô sinh nam tại Việt Nam
Theo Ngô Gia Hy (2000), trong các cặp vợ chồng vô sinh, nguyên nhân
do người chồng là 40%, do người vợ là 50% và do cả hai chiếm tỉ lệ 10%

[11].
Trần Thị Phương Mai (2001) cho rằng tỷ lệ vô sinh ở Việt Nam chiếm
trên 10%, trong đó nguyên nhân nam giới chiếm 30% các trường hợp [12].
Theo Trần Thị Trung Chiến và cộng sự (2002), tỉ lệ vô sinh chiếm 5%,
trong đó vô sinh do nam giới chiếm 40,8% [13].
Theo Trần Quán Anh (2009) tỉ lệ vô sinh chiếm 15%, và tỉ lệ này đang
có chiều hướng tăng mạnh. Trong đó vô sinh nam chiếm trên 50% [14].
Như vậy, tuy tỉ lệ vô sinh ở Việt Nam khác nhau ở các nghiên cứu, phụ
thuộc vào từng thời điểm khác nhau, nhưng tất cả các nghiên cứu này đều đề
cập đến vai trò tương đương của nam giới với nữ giới trong vấn đề vô sinh.
1.2.

Một số nguyên nhân gây vô sinh nam
Vô sinh nam do nhiều nguyên nhân gây nên, gồm hai nhóm nguyên


5
nhân chính là nguyên nhân do di truyền và nhóm nguyên nhân không do di
truyền.
1.2.1. Nguyên nhân do di truyền
a. Nguyên nhân di truyền ở cấp độ tế bào
Bất thường nhiễm sắc thể (NST) có thể gặp ở cả NST thường và NST
giới tính, có thể là bất thường về cấu trúc hay số lượng NST. Các bất thường
NST thường gặp là:


Hội chứng Klinefelter

Là nguyên nhân di truyền đứng đầu gây ra vô sinh ở nam giới, chiếm tỉ
lệ từ 1 – 500 đến 1 – 1000 trẻ trai được sinh ra [15]. Nam giới bị hội chứng

Klinefelter có tinh hoàn bị teo và hyaline hóa, tế bào mầm sinh dục không có
hoặc bị tiêu hủy, tế bào Leydig bị suy giảm chức năng, thiếu hụt nội tiết tố
androgen. Đây là những nguyên nhân chính gây suy giảm quá trình sinh tinh
dẫn đến vô sinh ở những bệnh nhân này [16].


Hội chứng nam 47,XXY

Hội chứng này có tỉ lệ 1 – 1000 trẻ sơ sinh nam. Nam giới 47,XYY có
thể có con với bộ NST giới tính bình thường. Tuy nhiên một số khác có thể sự
sinh tinh bị suy giảm nghiêm trọng do hầu hết các tế bào mầm YY đều có sự
ghép cặp bất thường trong quá trình giảm phân tạo tinh trùng [17].


Hội chứng DOWN

Người mắc hội chứng này có bộ NST là 47,XX (XY), +21 hay trisomy
21. Người mắc bệnh Down thường biểu hiện chậm phát triển tâm thần, trí tuệ,
có các dị tật bẩm sinh kèm theo và thường không có khả năng sinh sản.


Chuyển đoạn, đảo đoạn NST

Chuyển đoạn NST là sự trao đổi đoạn giữa các cặp NST không tương
đồng. Còn đảo đoạn NST là trường hợp 1 đoạn NST bị đứt ở 2 điểm, đoạn bị
đứt quay 180º rồi nối lại theo trật tự mới. Những nam giới mang bất thường


6
NST này có thể xảy ra các bất thường trong quá trình giảm phân tạo giao tử,

là một nguyên nhân gây vô sinh nam.
b.

Các yếu tố di truyền ở cấp độ phân tử



Đột biến gen trên NST Y

AZF là một đoạn ở phần xa của nhánh dài NST Y (Yq11). Đột biến gen
tại vùng này được coi là nguyên nhân bất thường di truyền thứ hai sau hội
chứng Klinefelter gây ra vô sinh ở nam giới [18].


Đột biến gen trên NST X

Gen AR là gen thụ thể của androgen, thuộc nhánh dài NST X. Nếu gen
này bị đột biến sẽ dẫn đến mất một phần hay toàn bộ thụ thể androgen gây hội
chứng kháng androgen trên lâm sàng, là một nguyên nhân gây vô sinh nam.


Đột biến gen trên NST thường

Gen CFTR được tìm thấy trên nhánh dài của NST số 7. Nam giới bị
bệnh này sẽ không có ống dẫn tinh hoặc tắc ống dẫn tinh, dẫn đến không có
tinh trùng trong tinh dịch.


Đứt gãy ADN của tinh trùng

Những tinh trùng bị đứt gãy ADN dẫn tới chất lượng tinh trùng giảm
sút, giảm khả năng thụ tinh, tăng nguy cơ sẩy thai.
1.2.2. Nhóm nguyên nhân không do di truyền
a. Một số yếu tố sinh hoá
Kẽm, fructose, acid citric, … là các yếu tố sinh hoá có ảnh hưởng đến
khả năng sinh sản ở nam giới. Kẽm đóng vai trò quan trọng trong quá trình
phát triển bình thường của tinh hoàn, tuyến tiền liệt và khả năng di động của
tinh trùng [2]. Thiếu hụt kẽm trong hệ thống sinh sản gây yếu sinh lí và vô
sinh [3]. Ngoài kẽm, fructose cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình
trao đổi chất, là nguồn dinh dinh dưỡng, nguồn năng lượng chính của tinh
trùng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự giảm sút nồng độ fructose trong


7
tinh dịch có liên quan đáng kể với các bất thường về cấu trúc, số lượng, chức
năng túi tinh và ống dẫn tinh [19].
Cùng với kẽm và fructose, acid citric cũng được cho rằng có vai trò
quan trọng trong độ di động của tinh trùng và mật độ tinh trùng, đặc biệt đối
với quá trình chuyển hóa năng lượng, tạo năng lượng hoạt động cho các quá
trình sinh tinh, thụ tinh [20].
b. Nội tiết tố
Nội tiết tố sinh dục nam bao gồm 3 chất chủ yếu là FSH, LH và
testosterol. Sự điều hòa của 3 chất này trong hệ trục hạ đồi – tuyến yên – tinh
hoàn đảm bảo cho quá trình sinh tinh bình thường. Giá trị bất thường (tăng
hay giảm) của cả 3 chất này đều có thể chỉ ra có rối loạn trong quá trình sinh
tinh.
c.

Một số yếu tố môi trường

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ cao, cường độ tiếng ồn cao, tia xạ,
hoá chất, các chất kích thích, kim loại nặng,… đều làm giảm chất lượng và số
lượng tinh trùng, ảnh hưởng đến quá trình sinh tinh, từ đó có thể dẫn đến vô
sinh nam [21], [22], [23].
1.3.

Vai trò của kẽm trong cơ thể người

Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào và đặc biệt là tác động đến
hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể. Kẽm có trong thành phần của hơn
80 loại enzym khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzym vận chuyển, thủy
phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN, xúc
tác phản ứng ôxy hóa cung cấp năng lượng. Ngoài ra kẽm còn hoạt hóa nhiều
enzym khác nhau như amylase, pencreatinase... [24], [25]. Hình 1.2 là sơ đồ
tóm tắt vai trò của kẽm đối với các quá trình sống trong cơ thể.


8

Hình 1.2: Quá trình tổng hợp DNA, chu trình folate và chuyển hoá glutathione
1.Methionine-adenosyltransferase;

2.Methyltransferase;

3.S-adenosylhomocysteine

hydrolase; 4.Betaine-homocysteine-methyl transferase (BHMT) (coenzyme là kẽm);
5.Methionine-synthase (coenzyme là vitamin B12 và kẽm); 6.Serineoxidase; 7.Methylenete
trahydrofolate reductase (MTHFR; coenzyme là vitamin B2); 8.Thymidylate synthase;
9.Cystathionine-β-synthase (coenzyme là vitamin B6); 10.γ- Cystathionase (coenzyme là

vitamin B12); 11.γ-Glutamyl-cysteine-synthase; 12.Glutathione-synthase; 13.Gluta thione
peroxidase; 14. glutathione disulphide (GSSG) reductase; 15.γ-Glutamyl transpeptidase;
16.γ-Glutamyl cyclotransferase; 17.5-Oxoprolinase.
dTMP: deoxythymidine monophosphate; dUMP: deoxyuridine monophosphate; GSSG:
glutathione disulphide; Pi: orthophosphate; PPi: pyrophosphate; THF: tetrahydrofolate


9
Đặc biệt, kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng là tác động chọn lọc
lên quá trình tổng hợp, phân giải acid nucleic và protein - những thành phần
quan trọng nhất của sự sống. Vì vậy các cơ quan như hệ thần kinh trung ương,
da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn.. rất nhạy cảm với sự thiếu hụt
kẽm. Trẻ thiếu kẽm sẽ biếng ăn [26].
Một vai trò cũng rất quan trọng khác của kẽm là vừa tham gia cấu trúc
vừa tham gia duy trì chức năng của hàng loạt cơ quan quan trọng. Kẽm có độ
tập trung cao trong não, đặc biệt là vùng hải mã (hippocampus), vỏ não, bó
sợi rêu. Nếu thiếu kẽm ở các cấu trúc thần kinh, có thể dẫn đến nhiều loại rối
loạn thần kinh và có thể là yếu tố góp phần phát sinh bệnh tâm thần phân liệt
[26].
Vai trò hết sức quan trọng nữa của kẽm là tham gia điều hòa chức năng
của hệ thống nội tiết và có trong thành phần các hormon (tuyến yên, tuyến
thượng thận, tuyến sinh dục...). Hệ thống này có vai trò quan trọng trong việc
phối hợp với hệ thần kinh trung ương, điều hòa hoạt động sống trong và ngoài
cơ thể, phản ứng với các kích thích từ môi trường và xã hội, làm cho con
người phát triển và thích nghi với từng giai đoạn và các tình huống phong phú
của cuộc sống. Vì thế thiếu kẽm có thể ảnh hưởng tới quá trình thích nghi và
phát triển của con người [26], [27].
Ngoài ra, kẽm có vai trò làm giảm độc tính của các kim loại độc như
nhôm (Al), asen (As), candimi (Cad)... góp phần vào quá trình chống lão hóa,
thông qua việc ức chế sự ôxy hóa và ổn định màng tế bào. Khả năng miễn

dịch của cơ thể được tăng cường nhờ kẽm, bởi nó hoạt hóa hệ thống này
thông qua cơ chế kích thích các đại thực bào, tăng các limpho T... Vì vậy, khi
thiếu kẽm, nguy cơ nhiễm khuẩn ở bệnh nhân sẽ tăng lên [27].
Cũng cần nói thêm rằng, kẽm không chỉ quan trọng trong hoạt động
sống của cơ thể với vai trò độc lập, mà quan trọng hơn, khi sự có mặt của nó


10
sẽ giúp cho quá trình hấp thu và chuyển hóa các nguyên tố khác cần thiết cho
sự sống như đồng (Cu), mangan (Mn), magnesium (Mg)... Do vậy, khi cơ thể
thiếu kẽm sẽ kéo theo sự thiếu hụt hoặc rối loạn chuyển hóa của nhiều yếu tố,
ảnh hưởng rất lớn đến tình trạng sức khỏe [27].
1.3.1. Vai trò của kẽm ở nam giới
Đối với nam giới, việc cơ thể thiếu kẽm sẽ làm giảm ham muốn, đồng
thời giảm số lượng tinh trùng. Kẽm đóng vai trò rất quan trọng để xác định
chất lượng tinh trùng ở nam giới. Một nghiên cứu được công bố trên tạp chí
sinh sản và vô sinh cho thấy nồng độ kẽm thấp gây ảnh hưởng chất lượng tinh
trùng, điều này không tốt cho những cặp vợ chồng hiếm muộn [28]. Một
nghiên cứu khác cho thấy người đàn ông sử dụng thuốc bổ sung kẽm sẽ có
những cải tiến cả trong số lượng và chất lượng tinh trùng, các yếu tố này có
thể đóng một vai trò đáng kể trong khả năng sinh sản [29].
Kẽm đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe của tuyến tiền liệt.
Hàm lượng kẽm trong cơ thể nam giới nếu ở mức thấp sẽ làm tăng nguy cơ
mắc bệnh ung thư tuyến tiền liệt. Phần lớn những căn bệnh về tuyến tiền liệt ở
mức ác tính đều có nguyên nhân do hàm lượng kẽm thấp [26], [30]. Ngoài ra,
kẽm là một trong những nguyên tố cơ bản, nó chịu trách nhiệm trong hoạt
động của gen chứa thông tin ở các tế bào. Kẽm có khả năng làm tăng sự sản
xuất hormone testosterone, giúp nâng cao khả năng ham muốn của nam giới
[27].
Vì những vai trò quan trọng như vây, nhiều nghiên cứu về tác dụng của

kẽm đối với chức năng sinh sản ở nam giới đã được tiến hành từ rất lâu
(bảng1.2.1).


11
Bảng 1.2.1. Tác dụng của việc bổ sung kẽm đối với nhóm nam giới vô sinh
Tác dụng của bổ sung kẽm

Tác giả nghiên cứu

1. Cải thiện số lượng
tinh trùng

Marmar et al (1975) [31], Hartoma et al (1977)
[32], Mahajan et al (1982) [33] , Wong et al
(2002) [34].

2. Cải thiện độ di động
và hình thái tinh
trùng

Marmar et al (1975) [31], Caldamone et al (1979)
[35].

3. Cải thiện nồng độ
testosterone

Antoniou et al (1977) [36], Hartoma et al (1977)

4. Cải thiện khả năng

tình dục

Antoniou et al (1977) [27], Mahajan et al (1982)

[32] , Mahajan et al (1982) [33].

[33].

1.3.2. Vai trò của kẽm ở nữ giới
Kẽm đóng vai trò quan trọng trong sức khỏe sinh sản của nữ giới. Cùng
các khoáng chất khác, nó cân bằng các nội tiết tố như estrogen, progesterone
trong suốt chu kỳ kinh nguyệt. Đồng thời, trứng cũng cần được cung cấp một
lượng kẽm nhất định để trưởng thành và sẵn sàng để thụ tinh. Theo nhiều báo
cáo, sự thiếu hụt kẽm còn có thể liên quan đến việc sẩy thai trong giai đoạn
đầu của thai kỳ. Ngoài ra, cung cấp đầy đủ kẽm cũng có thể giúp nữ giới giảm
kích thước u xơ tử cung, một trong những nguyên nhân gây vô sinh [26].


12
1.3.3. Vai trò của kẽm đối với sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)
Ngoài các chức năng chủ yếu đã kể trên, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng
kẽm cũng có những đặc tính chống apoptosis. Các tác dụng ức chế của kẽm
trong apoptosis đã được chứng minh có liên quan đến hai cơ chế. Thứ nhất,
kẽm có thể ức chế caspase (protease tham gia vào chương trình chết tế bào).
Cơ chế thứ hai được cho rằng, kẽm có thể ức chế enzym cắt ADN phụ thuộc
canxi và magiê, gây phân mảnh ADN trong chuỗi dây chuyền phản ứng của
apoptosis [25], [37], [38], [39]. Tuy nhiên, nồng độ kẽm quá cao có thể gây
độc, có thể gây ra apoptosis và thậm chí gây hoại tử tế bào [25], [39]. Sự thiếu
hụt kẽm có thể gây ra apoptosis trên một số loại tế bào. Trong khi đó, bổ sung
kẽm có thể bảo vệ tế bào chống lại các tác nhân oxy hoá khác nhau, ngăn

ngừa sự chết tế bào đã được lập trình [25], [40].
Như chúng ta đã biết, vô sinh có mối liên quan đến quá trình apoptosis
thông qua Fas (death receptor) - một loại protein thụ thể trên bề mặt tế bào.
Protein này liên quan đến sự chết tế bào theo chương trình. Nếu tinh trùng có
Fas là các tinh trùng đã được lựa chọn chết theo chương trình, xuất hiện nhiều
trong tinh dịch, chứng tỏ có sự bất thường. Ở nam giới có bất thường về các
chỉ số tinh dịch đồ, số lượng tinh trùng có Fas cao hơn hẳn nam giới bình
thường. Kẽm có những đặc tính chống apoptosis, tức là góp phần ảnh hưởng
đến khả năng sinh sản của nam giới [41].
1.4.

Các xét nghiệm cần thiết để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ kẽm
đến chất lượng tinh dịch đồ

1.4.1. Xét nghiệm tinh dịch đồ
Theo WHO năm 1999, trong các nguyên nhân dẫn đến vô sinh ở nam
giới thì có đến 90% do bất thường tinh trùng, điều này phản ánh mối liên
quan trực tiếp giữa tình trạng vô sinh với kết quả tinh dịch đồ [42]. Vì vậy,


13
tinh dịch đồ được lựa chọn là xét nghiệm đầu tay của các bác sĩ để chẩn đoán
vô sinh nam. Tuy nhiên, tinh dịch đồ chỉ có thể đánh giá, tiên lượng nhưng
không xác định được chính xác nguyên nhân gây vô sinh nam.
Thời điểm tốt nhất để lấy tinh dịch làm xét nghiệm là sau kiêng giao
hợp hoặc xuất tinh 3 – 5 ngày. Mẫu tinh dịch được lấy bằng hình thức thủ
dâm và xuất thẳng vào cốc thủy tinh miệng rộng. Cốc này được bảo quản ở
37ºC trong 30 phút và đưa đến các phòng xét nghiệm để đánh giá. Các chỉ số
tinh dịch đồ được quan tâm bao gồm thể tích tinh dịch, độ nhớt, độ pH, mật
độ tinh trùng, tổng số tinh trùng mỗi lần phóng tinh, độ di động của tinh

trùng, tỉ lệ sống, hình thái tinh trùng bình thường hay bất thường.
WHO đã nghiên cứu và đưa ra bảng giá trị tinh dịch đồ bình thường
(WHO 1999 và WHO 2010), được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.
Bảng 1.3.1 Tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 1999 và 2010 [10], [42].
Tinh dịch đồ

WHO 1999

WHO 2010

≥2

≥ 1,5

pH tinh dịch

≥ 7,2

≥ 7,2

Mật độ tinh trùng(106/ml)

≥ 20

≥ 15

R + S ≥ 50

P + NP ≥ 40

R ≥ 25

P ≥ 32

≥ 30

≥4

Tỷ lệ sống (%)

≥ 75

≥ 58

Bạch cầu (106/ml)

≤1

≤1

Thể tích tinh dịch (ml)

Di động (%)
Hình thái bình thường (%)

Ghi chú: R: Tiến tới nhanh (Rapid progressive), S: tiến tới chậm (Slow
progressive), P: Tiến tới (Progessive), NP: Không tiến tới (Non – progressive).


14

1.4.2. Định lượng kẽm trong tinh dịch
Hiện tại trên thế giới có 2 phương pháp thường được sử dụng để định
lượng kẽm trong tinh dịch. Đó là định lượng kẽm bằng phương pháp quang
phổ hấp thụ và phương pháp so màu 5 – Br – PAPS.
1.4.2.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ
Mẫu tinh dịch để làm xét nghiệm sẽ được lấy bằng cách thủ dâm vào
một lọ polystyrene sau kiêng quan hệ tình dục trong 3 – 5 ngày. Các mẫu này
sẽ được bảo quản ở 37C trong 30 phút để hoàn tất quá trình hóa lỏng.
Tinh dịch sẽ được li tâm với tốc độ 2000 vòng/phút trong 20 phút để
thu lấy dịch nổi, và được bảo quản ở -20C cho đến khi được làm xét nghiệm.
Kẽm được định lượng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử sau khi đã
được pha loãng với nước cất. Việc đo được tiến hành ở bước sóng 231,8 nm;
chiều rộng khe là 0,7 nm. Các đường cong chuẩn dao động trong khoảng 1040 µg/dl với dung dịch kẽm standard, trong đó tương ứng với nồng độ kẽm
trong huyết tương là 50-200 µg/dl [43], [44].
1.4.2.2. Phương pháp so màu
Hàm lượng kẽm trong tinh dịch có thể được định lượng bằng phương
pháp so màu 5–Br–PAPS, dựa vào nguyên lí kẽm phản ứng với phức hợp 5–
Br –PAPS tại pH thích hợp sẽ tạo ra phức chất chelate có màu sắc ổn định.
Độ đậm màu của hỗn hợp tỉ lệ thuận với nồng độ kẽm trong tinh dịch. Sau đó
chúng ta sẽ tiến hành đo mật độ quang học hỗn hợp này, từ đó xác định được
nồng độ kẽm trong tinh dịch [45].


15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu
a. Đối tượng nghiên cứu:

80 mẫu tinh dịch của 80 bệnh nhân nam giới thiểu năng sinh sản đến
làm xét nghiệm tinh dịch đồ tại bộ môn Y sinh học – Di truyền.
b. Nhóm chứng:
80 mẫu tinh dịch của 80 nam giới khỏe mạnh có khả năng sinh sản bình
thường, đến làm xét nghiệm kiểm tra, có cùng lứa tuổi với nhóm nghiên cứu
và có kết quả tinh dịch đồ bình thường theo tiêu chuẩn của WHO 2010.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Nam giới không trong độ tuổi sinh sản.
- Nam giới đang sử dụng kẽm.
- Nam giới bị ung thư.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình nghiên cứu
Trước khi tiến hành định lượng, các hóa chất cần pha thành dung dịch
theo yêu cầu của xét nghiệm.
Định lượng kẽm theo phương pháp so màu và đo mật độ quang học.
2.2.2. Định lượng kẽm bằng phương pháp 5-Br-PAPS
a. Hóa chất cần chuẩn bị
Sodium bicarbonate, Sodium citrate, Dimethylglyoxime, Triton-X100,


16
5-Br-PAPS, Salicylaldoxime, Kẽm standard (0,01mol/l, Merk-Đức), TCA,
Nước khử ion.
Dung dịch A gồm: Sodium bicarbonate (200mmol/l), Sodium citrate
(170mmol/l), Dimethylglyoxime (4mmol/l), Triton – X100 (1%), 5-Br-PAPS
(0,08mmol/l).
Dung dịch B gồm: Salicyaldoxime (2,9mmol/l).
Dung dịch working buffer, pH-9 (C): Pha dung dịch A và dung dịch B
theo tỉ lệ 4:1.
b. Phương pháp tiến hành

Bước 1: Ly tâm tinh dịch (ít nhất 5ml) với vận tốc 3000 vòng/phút để
thu lấy dịch nổi. Nếu mật độ tinh trùng ≥200 triệu/ml, chúng ta sẽ pha loãng
tinh dịch bằng nước muối sinh lý với tỷ lệ 1:100.
Bước 2: Lấy 200µl dịch nổi vào ống tuýp mới, cho tiếp 200 µl dung
dịch TCA 10% để khử protein (deprotein), trộn đều, ly tâm 10 000 vòng/phút
trong 10 phút.
Bước 3: Đối với mẫu nghiên cứu, cho 100 µl dịch nổi thu được từ tinh
dịch đã loại bỏ protein bằng TCA vào ống nghiệm vô trùng đã chứa sẵn 2ml
dung dịch C.
Đối với mẫu chứng, cho 100 µl dung dịch chứa kẽm standard vào ống
nghiệm vô trùng đã chứa sẵn 2ml dung dịch C.
Ở đây, khác với các quy trình kĩ thuật trên thế giới, dung dịch
chromogen (C) này không được pha sẵn từ đầu. Chúng ta chỉ pha sẵn 2 dung
dịch A, B. Khi cần làm xét nghiệm, chúng ta sẽ pha chế dung dịch C bằng
cách pha 2 dung dịch A, B với nhau với tỉ lệ 4 : 1.
Bước 4: Ủ trong 8 phút ở 25C. Lưu ý không nên để phức hợp kẽm –
buffer chromogen quá 2 tiếng.


17
Bước 5: Đo mật độ quang ở bước sóng 560nm với chiều dài curvet
1cm.
Tính nồng độ kẽm theo công thức:
[Zn] µmol/l = (OD mẫu/OD chứng) x C zinc standard (µmol/l)
Trong đó:
- OD mẫu: Mật độ quang học của mẫu ở bước sóng 560nm.
- OD chứng: Mật độ quang học của chứng ở bước sóng 560 nm.
- C zinc standard: Nồng độ kẽm standard.
Bước 6: Kiểm chứng lại quy trình trên 2 nhóm nghiên cứu để đánh giá
độ nhạy của quy trình. Trong đó nhóm 1 là 10 nam giới khoẻ mạnh, có kết

quả tinh dịch đồ bình thường theo tiêu chuẩn của WHO 2010. Nhóm 2 là
nhóm nam giới vô sinh mà kết quả tinh dịch đồ có độ di động của tinh trùng
thấp hơn giới hạn tối thiểu.
Bước 7: Tiến hành bảo quản mẫu tinh dịch:
Với 15 mẫu tinh dịch ngay sau khi xuất tinh đã được xét nghiệm định
lượng kẽm bằng phương pháp 5-Br-PAPS, sẽ được bảo quản ở -18C và
không sử dụng chất bảo quản. Sau 24h, những mẫu tinh dịch này sẽ được tiến
hành định lượng kẽm lại và đánh giá kết quả.
2.2.3. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Hoàn chỉnh quy trình kĩ thuật để định lượng kẽm trong tinh dịch.
- Xác định nồng độ kẽm (mmol/ml) trong nhóm nghiên cứu và nhóm chứng.
Theo tiêu chuẩn thế giới, nồng độ kẽm là bình thường khi đạt 0,31,5mmol/l.
- So sánh độ di động của tinh trùng giữa các nhóm có nồng độ kẽm thấp với
nhóm có nồng độ kẽm bình thường.