Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.44 MB, 61 trang )

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA
METAGENOME HỆ VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ

Người hướng dẫn

:TS. Nguyễn Thị Trung

Sinh viên thực hiện

:Nguyễn Bảo Hân

Lớp

:1302.K20

HÀ NỘI - 2017
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT
DNA METAGENOME HỆ VI KHUẨN TRONG DẠ CỎ DÊ

Giáo viên hướng dẫn

: TS.Nguyễn Thị Trung

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Bảo Hân

Lớp

: 1302 – K20

Hà Nội - 2017
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể thầy cô giáo trong khoa
Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã trang bị kiến thức cho em
trong suốt quá trình học tập.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn
Thị Trung - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tận
tình và hướng dẫn em những kiến thức và phương pháp nghiên cứu trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Em xin cảm ơn GS.TS. Trương Nam Hải, TS. Đỗ Thị Huyền, Thạc sĩ Lê
Ngọc Giang và các anh chị Phòng Kĩ thuật Di truyền - Viện Công nghệ Sinh
học đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu tại
phòng.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị và các bạn, những
người luôn động viên quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất cũng như tinh
thần giúp em hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Bảo Hân

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

MỤC LỤC
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... I
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... II

DANH MỤC BẢNG .................................................................................... III
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1
A.

Lý do chọn đề tài ................................................................................ 1

B.

Mục tiêu ............................................................................................. 2

C.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................ 2

PHẦN I. TỔNG QUAN ................................................................................. 3
1.1 Tổng quan chung về sự tiêu hóa ở một số động vật nhai lại .................. 3
1.1.1 Khái niệm về động vật nhai lại ...................................................... 3
1.1.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa của động vật nhai lại ...................................... 3
1.1.2.1 Cấu trúc chung về hệ tiêu hóa của động vật nhai lại ................ 3
1.1.2.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa của dê ..................................................... 6
1.1.2.3 Sự nhai lại ............................................................................... 7
1.1.3 Cấu trúc hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của động vật nhai lại ....... 7
1.1.3.1 Vi khuẩn ................................................................................. 7
1.1.3.2 Động vật nguyên sinh ............................................................. 9
1.1.3.3 Nấm ...................................................................................... 10
1.2 Tổng quan về DNA metagenome ........................................................ 10
1.2.1 Các khái niệm về DNA metagenome ........................................... 10
1.2.1.1 Khái niệm về metagenome .................................................... 10
1.2.1.2 Khái niệm về metagenomic ................................................... 11

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.2.2 Khái niệm về thư viện DNA metagenome ................................... 12
1.3 Tổng quan về tách chiết và tinh sạch DNA metagenome .................... 13
1.3.1 Tổng quan về một số phương pháp tách chiết DNA metagenome 13
1.3.1.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) ... 13
1.3.1.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) ......................... 14
1.3.1.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1 (PSP1) . 14
1.3.1.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 2 (PSP2) . 14
1.3.1.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) ............ 14
1.3.2 Tổng quan về một số phương pháp tinh sạch DNA metagenome . 15
1.3.2.1 Tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel ........................ 15
1.3.2.2 Tinh sạch bằng cột ly tâm (cột tinh sạch DNA) ..................... 15
1.3.2.3 Tinh sạch bằng túi thẩm tích (màng bán thấm) ...................... 16
1.3.3 Xác định độ sạch DNA ................................................................ 16
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18
2.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 18
2.1.1 Vật liệu ........................................................................................ 18
2.1.2 Hóa chất, vật tư nghiên cứu ......................................................... 18
2.1.3 Thiết bị nghiên cứu ...................................................................... 19
2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 20
2.2.1 Thu thập, xử lý và bảo quản mẫu dịch dạ cỏ dê ........................... 20
2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA metagenome.................................. 22
2.2.2.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC) ... 22
2.2.2.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB) ......................... 24

2.2.2.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1 (PSP1) . 24
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

2.2.2.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 2 (PSP2) . 26
2.2.2.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA) ............ 26
2.2.3 Kiểm tra chất lượng và tính toàn vẹn của DNA metagenome ....... 27
2.2.4 Nhân bội bằng PCR với cặp mồi 16S rDNA vi khuẩn.................. 29
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 31
3.1 Thu thập mẫu vi sinh từ dạ cỏ dê ........................................................ 31
3.1.1 Thu mẫu dạ cỏ dê......................................................................... 31
3.1.1.1 Hình ảnh và môi trường sống của các loài dê thu mẫu .......... 31
3.1.1.2 Thu dạ cỏ dê ......................................................................... 33
3.1.2 Thu mẫu vi sinh từ dạ cỏ dê ......................................................... 34
3.2 Tách chiết DNA metagenome ............................................................. 35
3.2.1 Tách chiết DNA metagenome bằng phương pháp sử dụng hạt thủy
tinh (RBB) ............................................................................................ 36
3.2.2 Tách chiết DNA metagenome bằng phương pháp sử dụng hạt thủy
tinh và tinh sạch bằng cột Qiagen (RBBC) ........................................... 36
3.2.3 Tách chiết DNA metagenome bằng phương pháp PSP®Spin Stool
DNA Kit, protocol 1 (PSP1) ................................................................. 37
3.2.4 Tách chiết DNA metagenome bằng phương pháp PSP®Spin Stool
DNA Kit, protocol 2 (PSP2) ................................................................. 38
3.2.5 Tách chiết DNA metagenome bằng phương pháp QIAamp® DNA
Stool Mini Kit (QIA) ............................................................................ 39
3.3 Tinh sạch DNA metagenome .............................................................. 40

3.4 Đánh giá chất lượng của mẫu ............................................................ 40
3.5 Đánh giá khả năng tồn tại chất ức chế polymerase trong mẫu DNA
metagenome ............................................................................................. 42
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

3.6 Tách chiết đủ khối lượng DNA metagenome bằng phương pháp PSP1
................................................................................................................. 44
KẾT LUẬN.................................................................................................. 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ETDA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNase

Deoxyribonuclease

dNTPs

Deoxyribonucleotides

OD

Optical Density

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi)

PAGE

Polyacrylamide gel electrophoresis

RNase

Ribonuclease

rRNA

Ribosomal Ribonucleic Acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris- acetate- EDTA

TEMED

Tetramethylethylenediamine

Taq

Polymerase của Thermus aquaticus

TE

Tris- EDTA

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

I

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu tạo dạ dày kép của gia súc nhai lại ....................... .................. 4
Hình 1.2 Cấu trúc hệ tiếu hóa của dê ......................................... ...................6
Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp thu mẫu vi khuẩn từ dịch dạ cỏ dê ................ 21
Hình 3.1 Dê cỏ trên núi ở Ninh Bình ......................................... ................ 31
Hình 3.2 Dê Bách Thảo ............................................................. ................ 32
Hình 3.3 Dê Lai Boer ................................................................................... 33
Hình 3.4 Hình thái vị trí lấy mẫu ............................................... ................ 33
Hình 3.5 Hình thái của mẫu vi sinh vật thu được từ các vùng tương ứng trong
dạ cỏ dê ..................................................................................... ................ 34
Hình 3.6 DNA metagenome tách chiết bằng phương pháp sử dụng hạt thủy
tinh RBB ................................................................................... ................ 36
Hình 3.7 DNA metagenome tách chiết bằng phương pháp sử dụng hạt thủy
tinh RBB và tinh sạch bằng cột Qiagen ..................................... ................ 37
Hình 3.8 DNA metagenome tách chiết bằng phương pháp PSP®Spin Stool
DNA Kit, protocol 1 (PSP1) ...................................................... ................ 38
Hình 3.9 DNA metagenome tách chiết bằng phương pháp PSP®Spin Stool
DNA Kit, protocol 2 (PSP2) ...................................................... ................ 38
Hình 3.10 DNA metagenome tách chiết bằng phương pháp QIAamp® DNA
Stool Mini Kit (QIA) ................................................................. ................ 39
Hình 3.11 Sản phẩm PCR khuếch đại gen mã cho 16s rDNA của các mẫu
DNA thu được từ các phương pháp tách chiết khác nhau .......... ................ 43
Hình 3.12 Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA metagenome tách bằng phương
pháp PSP1 ................................................................................. ................ 45

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

II

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài ...... ................ 19
Bảng 2.2 Trình tự mồi 16s rDNA .............................................. ................ 29
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR ......................................... ................ 30
Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ............................................... 30
Bảng 3.1 Đặc điểm của thức ăn được tìm thấy trong các khoang, giá trị pH và
nhiệt độ ..................................................................................... ................ 35
Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenome sử dụng các phương
pháp tách chiết khác nhau .......................................................... ................ 41
Bảng 3.3 Kết quả đo quang phổ của 10 mẫu DNA metagenome ngẫu nhiên
tách chiết bằng phương pháp PSP1 ............................................ ................ 46

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

III

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

LỜI MỞ ĐẦU
A. Lý do chọn đề tài
Dê cũng như một số động vật nhai lại sử dụng nguồn thức ăn chủ yếu là

cỏ, rơm rạ. Để tiêu hóa được nguồn thức ăn nghèo dinh dưỡng này, động vật
nhai lại có hệ tiêu hóa phù hợp với dạ dày kép gồm bốn ngăn: dạ cỏ, dạ tổ
ong, dạ lá sách và dạ múi khế. Dạ cỏ là dạ lớn nhất và là môi trường sinh sống
của hệ vi sinh vật phong phú. Ước tính có khoảng 1011 tế bào vi sinh vật trên
một gram dịch dạ cỏ, bao gồm vi khuẩn, tảo, nấm, động vật nguyên sinh và
virus thuộc nhiều loài và chi khác nhau. Hệ vi sinh vật này tham gia vào
chuyển hóa lignocellulose thành đường đơn, cung cấp năng lượng cho cơ thể.
Vì vậy đây là nguồn gen tiềm năng cho việc khai khác gen mã hóa enzyme
phân giải lignocellulose.
Nghiên cứu metagenome là phương pháp phân tích DNA metagenome
của tất cả các vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường tự nhiên. Từ
đó, rất nhiều thư viện DNA metagenome của vi sinh vật trong các môi trường
sống đã được xây dựng nhằm khai thác gen cũng như nghiên cứu sự đa dạng
vi sinh vật, ví dụ môi trường nước biển, môi trường đất. Để có được kết quả
phân tích dữ liệu DNA metagenome đáng tin cậy, thì trước hết DNA
metagenome được tách chiết phải đảm bảo về chất lượng và nồng độ. Yêu cầu
đối với mẫu DNA metagenome dùng cho giải trình tự bằng hệ thống giải trình
tự mới là A260/280 phải đạt trên 1,8 và A260/230 trên 1,5, tức là mẫu phải
sạch protein cũng như các chất thứ cấp khác, đặc biệt là axit formic. Nhìn trên
điện di đồ, DNA metagenome phải đảm bảo tính toàn vẹn, không bị phân cắt,
và nồng độ phải đạt trên 50 ng/µl. Đồng thời, mẫu DNA metagenome không
còn chất ức chế enzyme tổng hợp chuỗi ví dụ như enzyme polymerase. Do

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

1

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

vậy, đối với mỗi hệ sinh thái mini (gọi cách khác là mỗi loại mẫu), việc khảo
sát các phương pháp tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật là rất cần
thiết. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm kiểm tra ảnh hưởng của
phương pháp tách chiết tới chất lượng DNA phân lập từ các nguồn khác nhau,
trong đó có dạ cỏ của động vật. Chính vì vậy, bằng kỹ thuật metagenome với
hướng tiếp cận là giải trình tự metagenome, chúng em lựa chọn đối tượng là
dạ cỏ dê để thực hiện đề tài “Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA
metagenome hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê”.
B. Mục tiêu
Đánh giá được hiệu quả của các phương pháp tách chiết DNA
metagenome từ các mẫu dạ cỏ dê thu thập tại Ninh Bình, Ba Vì và Thanh
Hóa.
C. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu này là tiền đề để tiến tới giải trình tự DNA metagenome
phục vụ cho việc khai thác các gen mã hóa protein, enzyme có đặc tính quý,
có giá trị sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược.

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

2

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

PHẦN I: TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan chung về sự tiêu hóa ở một số động vật nhai lại

1.1.1 Khái niệm về động vật nhai lại
Động vật nhai lại là bất kỳ động vật móng guốc nào mà quá trình tiêu
hóa thức ăn của chúng diễn ra trong hai giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất chúng
ăn thức ăn thô và nuốt vào dạ dày. Giai đoạn thứ hai, chúng ợ thức ăn đã phân
hủy một phần trong dạ dày trở lại miệng để nhai lại. Động vật nhai lại thuộc
phân bộ Ruminantia (gồm: trâu, bò, dê, cừu, hươu cao cổ, bò rừng bizon,
hươu, nai, linh dương đầu bò và linh dương) và phân bộ Tylopoda (gồm: lạc
đà, lạc đà không bướu) .
Động vật nhai lại cũng chia sẻ các đặc trưng giải phẫu khác ở chỗ
chúng đều là động vật có số lượng ngón chân chẵn (Bộ Guốc chẵn).
1.1.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa của động vật nhai lại
1.1.2.1 Cấu trúc chung về hệ tiêu hóa của động vật nhai lại
Đường tiêu hoá của gia súc nhai lại được đặc trưng bởi hệ dạ dày kép
gồm 4 túi (Hình 1.1), trong đó ba túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách) được
gọi chung là dạ dày trước, không có tuyến tiêu hoá riêng. Túi thứ 4, gọi là dạ
múi khế, tương tự như dạ dày của động vật dạ dày đơn, có hệ thống tuyến tiêu
hoá phát triển mạnh. Đối với gia súc non bú sữa dạ cỏ và dạ tổ ong kém phát
triển, còn sữa sau khi xuống qua thực quản được dẫn trực tiếp xuống dạ lá
sách và dạ múi khế qua rãnh thực quản. Rãnh thực quản gồm có đáy và hai
mép. Hai mép này khi khép lại sẽ tạo ra một cái ống để dẫn thức ăn lỏng. Khi
dê bắt đầu ăn thức ăn cứng thì dạ cỏ và dạ tổ ong phát triển nhanh và đến khi
trưởng thành thì chiếm đến khoảng 85% tổng dung tích dạ dày nói chung.
Trong điều kiện bình thường ở gia súc trưởng thành rãnh thực quản không
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

3

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

hoạt động nên cả thức ăn và nước uống đều đi thẳng vào dạ cỏ và dạ tổ ong.

Hình A

Hình B
Hình 1.1 Cấu tạo dạ dày kép của gia súc nhai lại
A. Sơ đồ dạ dày của dê; B. Sơ đồ đường tiêu hóa của dê
- Dạ cỏ: là túi lớn nhất, chiếm hầu hết nửa trái của xoang bụng, từ cơ
hoành đến xương chậu. Dạ cỏ được coi là thùng lên men lớn với chức năng

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

4

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

lên men tiêu hóa thức ăn thô xanh và thức ăn tinh. Dạ cỏ chiếm 85-90% dung
tích dạ dày, 75% dung tích đường tiêu hoá, có tác dụng tích trữ, nhào trộn và
chuyển hoá thức ăn. Dạ cỏ không có tuyến tiêu hoá mà niêm mạc có nhiều
núm hình gai. Sự tiêu hoá thức ăn trong đó là nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh. Dạ
cỏ có môi trường thuận lợi cho vi sinh vật lên men yếm khí: yếm khí, nhiệt độ
tương đối ổn định trong khoảng 38 - 42oC, pH từ 5,5 - 7,4. Hơn nữa dinh
dưỡng được bổ sung đều đặn từ thức ăn, còn thức ăn không lên men cùng các
chất dinh dưỡng hoà tan và sinh khối vi sinh vật được thường xuyên chuyển
xuống phần dưới của đường tiêu hoá.

Có tới khoảng 50-80% các chất dinh dưỡng thức ăn được lên men ở dạ
cỏ. Sản phẩm lên men chính là các axít béo bay hơi, sinh khối vi sinh vật, các
khí metan và khí carbonic. Phần lớn axít béo bay hơi được hấp thu qua vách
dạ cỏ trở thành nguồn năng lượng chính cho gia súc nhai lại. Các khí thể được
thải ra ngoài qua phản xạ ợ hơi. Trong dạ cỏ còn có sự tổng hợp các vitamin
nhóm B và vitamin K.
- Dạ tổ ong: là túi nối liền với dạ cỏ, niêm mạc có cấu tạo giống như tổ
ong. Dạ tổ ong có chức năng chính là đẩy các thức ăn rắn và các thức ăn chưa
được nghiền nhỏ trở lại dạ cỏ, đồng thời đẩy các thức ăn dạng nước vào dạ lá
sách. Dạ tổ ong cũng giúp cho việc đẩy các miếng thức ăn lên miệng để nhai
lại. Sự lên men và hấp thu các chất dinh dưỡng trong dạ tổ ong tương tự như ở
dạ cỏ.
- Dạ lá sách: là túi thứ ba, niêm mạc được cấu tạo thành nhiều nếp gấp
(tương tự các tờ giấy của quyển sách). Dạ lá sách có nhiệm vụ chính là nghiền
ép các tiểu phần thức ăn, hấp thu nước, muối khoáng và các axit béo bay hơi
trong dưỡng chấp đi qua.
- Dạ múi khế: là dạ dày tuyến gồm có thân vị và hạ vị. Các dịch tuyến
múi khế được tiết liên tục vì dưỡng chấp từ dạ dày trước thường xuyên được
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

5

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

chuyển xuống. Dạ múi khế có chức năng tiêu hoá men tương tự như dạ dày
đơn nhờ có axit HCl, enzyme pepsine, chimotrysine và lipase.
1.1.2.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa của dê

Dê thuộc lớp Thú (Mammalia) trong họ Bò (Bovidae), bộ Guốc chẵn
(Artiodactyla). Ở Việt Nam, dê đã được nuôi từ lâu nhằm mục đích lấy thịt và
sữa, trong đó các giống dê phổ biến là dê Cỏ, dê Bách Thảo, dê Boer...
Giống như phần lớn các đại diện khác cùng họ, dê là động vật ăn cỏ.
Chúng không có răng cửa cũng như răng nanh. Việc lấy thức ăn hoàn toàn
phụ thuộc vào phần lợi cứng trên, răng cửa dưới, môi và lưỡi. Để tiêu hóa và
hấp thụ được nguồn thức ăn nghèo dinh dưỡng này, dạ dày của dê có cấu tạo
kép gồm bốn ngăn (túi): Ba túi trước (dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ lá sách) và túi thứ
tư tương tự dạ dày của động vật dạ dày đơn, gọi là dạ múi khế (Hình 1.2).

Hình 1.2 Cấu trúc hệ tiêu hóa của dê.
Từ trái qua phải lần lượt là dạ cỏ, dạ tổ ong, dạ múi khế và dạ lá sách

1.1.2.3 Sự nhai lại
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

6

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

Thức ăn sau khi ăn được nuốt xuống dạ cỏ và lên men ở đó. Phần thức
ăn chưa được nhai kỹ nằm trong dạ cỏ và dạ tổ ong thỉnh thoảng lại được ợ
lên xoang miệng với những miếng không lớn và được nhai kỹ lại ở miệng.
Khi thức ăn đã được nhai lại kỹ và thấm nước bọt lại được nuốt trở lại dạ cỏ.
Sự nhai lại được diễn ra 5-6 lần trong ngày, mỗi lần kéo dài khoảng 50 phút.
Thời gian nhai lại phụ thuộc vào bản chất vật lý của thức ăn, trạng thái sinh lý
của con vật, cơ cấu khẩu phần, nhiệt độ môi trường. Thức ăn thô trong khẩu

phần càng ít thì thời gian nhai lại càng ngắn. Trong điều kiện yên tĩnh gia súc
sẽ bắt đầu nhai lại (sau khi ăn) nhanh hơn. Cường độ nhai lại mạnh nhất vào
buổi sáng và buổi chiều. Hiện tượng nhai lại bắt đầu xuất hiện khi động vật
được cho ăn thức ăn thô.
1.1.3 Cấu trúc hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của động vật nhai lại
Hệ vi sinh vật dạ cỏ rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào khẩu phần. Hệ
vi sinh vật dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính là: vi khuẩn (Bacteria), động vật
nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi).
1.1.3.1 Vi khuẩn
Vi khuẩn xuất hiện trong dạ cỏ loài nhai lại trong lứa tuổi còn non, mặc
dù chúng được nuôi cách biệt hoặc cùng với mẹ chúng [14]. Thông thường vi
khuẩn chiếm số lượng lớn nhất trong vi sinh vật dạ cỏ và là tác nhân chính
trong quá trình tiêu hóa xơ. Vi khuẩn trong dạ cỏ chủ yếu là vi khuẩn Gram (), số lượng tăng lên khi tăng lượng thức ăn chứa nhiều năng lượng như ngô và
cỏ khô [18]. Hầu hết chúng chỉ sống được trong điều kiện yếm khí, pH tối ưu
sinh trưởng từ 6,0 đến 6,9 và nhiệt độ tối ưu là 39oC, phù hợp với điều kiện
môi trường trong dạ cỏ [16].
Tổng số vi khuẩn trong dạ cỏ thường là 109-1011 tế bào/g dịch dạ cỏ

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

7

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

[19]. Dựa trên môi trường sống, vi khuẩn dạ cỏ được chia thành 4 nhóm: (1)
vi khuẩn sống tự do trong pha lỏng; (2) vi khuẩn sống bám trên thức ăn; (3) vi
khuẩn trên biểu mô dạ cỏ và (4) vi khuẩn cộng sinh trên bề mặt động vật

nguyên sinh [8], [24]. Trong đó, nhóm liên kết với thức ăn chiếm tỉ lệ cao tới
70% tổng số vi khuẩn và đóng vai trò chủ đạo trong hoạt động của các
enzyme phân giải endoglucanse và xylanse [24], [25]. Trong dạ cỏ còn chứa
các vi khuẩn cổ thuộc nhóm sinh metan. Chúng đóng vai trò trong việc duy trì
nồng độ H+ thấp nhờ việc chuyển hóa CO2, giúp duy trì môi trường pH gần
trung tính phù hợp cho quá trình phân giải lignocellulose.
Ban đầu, các phương pháp định loại truyền thống dựa trên nuôi cấy như
phân lập, liệt kê và xác định đặc tính dinh dưỡng được sử dụng để nghiên cứu
độ đa dạng của hệ vi sinh vật dạ cỏ của động vật nhai lại. Nhóm nghiên cứu
của Dehority và Grubb sau khi phân lập và nuôi cấy vi khuẩn trong dạ cỏ dê
(Capra hircus) chỉ xác định được 11 nhóm vi khuẩn, trong đó có Butyrivibrio
fibriosolvens,

Streptoccous

bovis,

Bacteroides

họ

ruminicola,

Peptococcaceae, một số loài thuộc chi Bacteroides và một số nhóm chưa thể
định loại [9]. Bằng phương pháp này, hơn 200 loài vi khuẩn và ít nhất 100
loài động vật nguyên sinh và nấm đã được xác định trong dạ cỏ của một số
động vật nhai lại. Tuy nhiên, những kết quả này không đại diện được cho tính
đa dạng của toàn bộ hệ vi sinh vật trong khu hệ bởi phần lớn vi sinh vật trong
dạ cỏ không thể nuôi cấy được. Với sự phát triển của công nghệ, nhiều
phương pháp nghiên cứu đa dạng không cần nuôi cấy đã ra đời như phân tích

trình tự gen 16S/18S rRNA, giải trình tự hệ gen, kĩ thuật dấu vân tay DNA
(DNA fingerprinting) hay metagenome. Năm 2011, nhóm nghiên cứu của
Kim và cộng sự (2011) công bố có 13.478 trình tự thuộc về khoảng 7.000 loài
vi khuẩn và 3.516 trình tự thuộc về khoảng 1.500 loài vi khuẩn cổ, lần lượt
chiếm khoảng 79% và 21% bộ dữ liệu trình tự phân tích [17]. Đáng chú ý là

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

8

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

nghiên cứu này chỉ ra rằng chỉ có 6,5% trình tự vi khuẩn và 1,7% trình tự vi
khuẩn cổ thuộc về nhóm có thể nuôi cấy được cho thấy những hạn chế của
các phương pháp truyền thống dựa trên nuôi cấy khi đánh giá độ đa dạng sinh
vật. Ngoài ra, tiềm năng sinh vật trong hệ sinh thái dạ cỏ động vật nhai lại là
rất lớn do trong tổng số các loài vi khuẩn và vi khuẩn cổ được phân tích mới
chỉ có 88 loài vi khuẩn và sáu chi vi khuẩn cổ đã được biết đến.
Trong khi đó, phân tích thành phần vi khuẩn ở pha rắn và pha lỏng
trong dạ cỏ dê (Capra hircus), nhóm nghiên cứu của Cunha chỉ ra nhóm vi
khuẩn ưu thế ở cả hai pha là Firmicutes và Bacteroidetes [7]. Tuy nhiên, khi
phân tích gần 1500 trình tự từ dữ liệu DNA metagenome hệ vi sinh vật cũng
từ dạ cỏ dê, Lim và cộng sự lại đưa ra kết quả nhóm vi khuẩn Prevotella
ruminicola 23, Butyrivibrio proteoclasticu B316 và Butyrivibrio fibrisolvens
chiếm số lượng nhiều nhất [23]. Dù thành phần vi khuẩn ưu thế khác nhau
nhưng nhìn chung đây đều là những vi khuẩn có khả năng sản sinh ra các
enzyme phân giải lignocellulose, thành phần chính trong thức ăn của động vật

nhai lại.
1.1.3.2 Động vật nguyên sinh
Protozoa xuất hiện trong dạ cỏ khi gia súc bắt đầu ăn thức ăn thực vật
thô. Sau khi đẻ và trong thời gian bú sữa dạ dày trước không có protozoa.
Protozoa không thích ứng với môi trường bên ngoài và bị chết nhanh.
Trong dạ cỏ protozoa có số lượng khoảng 105-106 tế bào/g chất chứa dạ
cỏ, có ít hơn vi khuẩn nhưng do có kích thước lớn hơn nên có thể tương
đương về tổng sinh khối. Có khoảng 120 loài protozoa trong dạ cỏ. Mỗi loài
gia súc có số loài protozoa khác nhau.

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

9

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.1.3.3 Nấm
Trong dạ cỏ và phân động vật nhai lại cũng tìm thấy nhiều loài nấm kỵ
khí. Nấm trong dạ cỏ chiếm khoảng 10% tổng số sinh khối, độ đa dạng phụ
thuộc vào thành phần dinh dưỡng và cơ thể vật chủ [21]. Chúng được xếp vào
ngành nấm mới riêng biệt Neocallimastigomycota. Nghiên cứu trên 267 287
trình tự, Liggenstoffer và cộng sự đã phân loại được một phần nhóm nấm này
vào các chi Neocallimastix, Piromyces, Anaeromyces, Caecomyces,
Orpinomyces và Cyllamyces [22]. Trong đó, chi Piromyces chiếm ưu thế với
36% số trình tự. Chi Orpinomyces và Cyllamyces có số lượng ít nhất với
1,1% và 0,7% số trình tự. Tuy nhiên, vẫn còn khoảng 38,3% trình tự chưa
được phân loại, không tương ứng các chi đã có.

Nấm tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ trong thành phần sinh vật của hệ sinh thái
dạ cỏ nhưng cũng có vai trò nhất định trong quá trình phân giải thức ăn [15].
Hoạt động phối hợp nhịp nhàng giữa các loài vi sinh vật trong dạ cỏ đem đến
hiệu quả phân giải thức ăn cho động vật ăn cỏ. Không có một thành viên nào
trong quần xã sinh vật có thể độc lập chuyển hóa được hoàn toàn
lignocellulose, tinh bột hay protein mà chúng cần hợp tác tham gia vào một
chuỗi quá trình phân giải cơ chất theo từng nấc để đưa đến sản phẩm cuối
cùng.
1.2 Tổng quan về DNA metagenome
1.2.1 Các khái niệm về DNA metagenome
1.2.1.1 Khái niệm về metagenome
Khái niệm "metagenome" lần đầu tiên được đưa ra bởi Jon Clardy,
Robert M. Goodman vào năm 1998 [11]. Gần đây Kevin Chen and Lior
Pachter đã đưa ra định nghĩa rộng hơn về "metagenome" là sự ứng dụng kỹ
thuật hệ gen hiện đại để nghiên cứu quần thể vi sinh vật trực tiếp từ môi
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

10

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

trường tự nhiên mà không cần phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm
[5].
Thông thường trình tự hệ gen của một vi sinh vật chỉ được xác định khi
vi sinh vật đó được phân lập và nuôi cấy. Tuy nhiên phần lớn các vi sinh vật
trong mẫu môi trường đều không nuôi cấy được, do vậy việc xác định sự đa
dạng vi sinh vật chỉ dựa vào phương pháp nuôi cấy thông thường chỉ bộc lộ

được 1% số loài vi sinh vật trong mẫu phân tích [28].
Các nghiên cứu trước kia chủ yếu dựa vào trình tự 16S rRNA, đây là
trình tự bảo thủ ở tất cả các loài và có thể phân biệt sự khác biệt giữa các loài
dựa vào 16S rRNA. Gần đây các nghiên cứu về metagenome với nhiều dấu
chuẩn di truyền khác ngoài 16S rRNA đã bộc lộ sự đa dạng của nhiều loài vi
sinh vật mà trước kia chưa bao giờ được khám phá.
Metagenome cung cấp thông tin về các gen chức năng và có thể dự
đoán được các enzyme hoặc các chất xúc tác mới tiềm năng, các thông tin liên
quan giữa chức năng và hệ gen của các vi sinh vật. Metagenome được sử
dụng giống như phương pháp fingerprinting để phân tích toàn bộ hệ gen của
một quần thể vi sinh vật. Vì vậy phương pháp này trở thành một trong
phương pháp được sử dụng phổ biến trong nhiều phòng thí nghiệm và với các
nhà nghiên cứu về hệ sinh thái vi sinh vật. Metagenome góp phần thúc đẩy sự
phát triển của các kỹ thuật đọc trình tự nhanh và tiện dụng, làm giảm giá
thành đọc trình tự toàn bộ hệ gen [4].
1.2.1.2 Khái niệm về metagenomic
Metagenomic là phương pháp nghiên cứu về metagenome – vật liệu di
truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genome của nhiều cá
thể sống trong môi trường đó [11]. Phương pháp này cho phép chúng ta
nghiên cứu vi sinh vật bằng cách giải mã thông tin di truyền từ DNA được
Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

11

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

chiết xuất từ hệ vi sinh vật sống trong một mẫu môi trường mà không thông

qua nuôi cấy trong phòng thí nghiệm cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh
lý và di truyền của các vi sinh vật trong môi trường tự nhiên [13]. Kỹ thuật
này được xây dựng dựa trên những thành công của việc khảo sát độc lập các
rARN 16s của mẫu môi trường [6]. Một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật
metagenomic xây dựng thư viện DNA và tách chiết thành công một số dòng
cellulase mới bằng phương pháp metagenomic từ các môi trường khác nhau
như mẫu đất, dạ cỏ trâu bò dê hay phân thỏ. Sàng lọc enzyme từ metagenome
dựa trên cơ chất đặc hiệu về cơ bản gồm việc tách chiết DNA từ mẫu môi
trường, tách dòng DNA trong một vector thích hợp, biểu hiện trong cơ thể vật
chủ và sàng lọc các chủng biến nạp thu được [11].
1.2.2 Khái niệm về thư viện DNA metagenome
Trong sinh học phân tử, một thư viện DNA là tập hợp tất cả các đoạn
DNA được bảo quản riêng rẽ trong các tế bào vi sinh vật. Có nhiều loại thư
viện DNA khác nhau, ví dụ: thư viện cDNA, thư viện genome… [6].
Thư viện DNA metagenome là một tập hợp các đoạn DNA cùng đại diện
cho một hệ gen nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) của cá thể mà DNA được
bắt nguồn từ đó. Các đoạn này nằm trong các vectơ tự sao chép cho phép
chúng được duy trì và sinh sản cùng với tế bào của cơ thể vi sinh vật, như vi
khuẩn Escherichia coli hoặc nấm men Saccharomyces cerevisiae. Những thư
viện như thế có thể bảo quản như là một nguồn cố định của các đoạn DNA đại
diện cho một cơ thể đặc biệt. Một phòng thí nghiệm này có thể thu thập thư
viện hệ gen từ một phòng thí nghiệm khác hoặc từ một nguồn thương mại như
là một cách lựa chọn để xây dựng thư viện riêng của mình. Một khi thu được,
các thư viện được dùng chủ yếu hoặc để sàng lọc theo các phương pháp khác
nhau nhằm phân lập một (các) trình tự nucleotide quan tâm đặc biệt, hoặc để

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

12

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

xác định vị trí và thứ tự của các trình tự trong hệ gen mà từ đó thư viện được
xây dựng.
Các bước cơ bản để xây dựng thư viện metagenome bao gồm: (1) Phân
lập DNA metagenome của hệ vi sinh vật từ mẫu môi trường; (2) Cắt DNA
metagenome thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau (tủy thuộc vào mục
đích nghiên cứu) bằng enzyme hạn chế; (3) ghép nối các đoạn DNA vào hệ
vector thích hợp và (4) biến nạp vector tái tổ hợp vào vật chủ thích hơp (vật
chủ được sử dụng phổ biến nhất là vi khuẩn Escherichia coli) [11].
1.3 Tổng quan về tách chiết và tinh sạch DNA metagenome
1.3.1 Tổng quan về một số phương pháp tách chiết DNA metagenome
1.3.1.1 Phương pháp Repeated bead beating plus column (RBBC)
Phương pháp này được thực hiện theo mô tả của Yu, Morrison 2004
[31].
Nguyên tắc:
Sự phân giải tế bào được thực hiện bằng cách nghiền mẫu trong dung
dịch chứa 4% (trọng lượng/thể tích – w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS), 500
mM NaCl, và 50 mM EDTA. Dung dịch này còn có tác dụng bảo vệ DNA
khỏi tác động của DNases, là những enzyme tồn tại nhiều trong các mẫu dạ
dầy và đường ruột [10]. Sau khi nghiền, muối ammonium acetate được bổ
sung vào để tủa protein, loại các chất không phải DNA và SDS, sau đó DNA
được tủa bằng isopropanol và thu lại bằng li tâm. DNA hệ gen được tinh sạch
bằng sử dụng enzyme RNase, proteinase K; sau đó là sử dụng cột tinh sạch
QIAamp.

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

13

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

1.3.1.2 Phương pháp Repeated bead beating (RBB)
Nguyên tắc:
Tương tự phương pháp RBBC.
1.3.1.3 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 1 (PSP1)
Phương pháp này được thực hiện theo mô hướng dẫn quy trình 1
(protocol 1) của nhà sản xuất Invitek GmbH, Berlin, Đức.
Nguyên tắc:
Quy trình PSP gồm các bước phân giải mẫu, loại bỏ các chất ức chế
PCR, phân hủy protein, hấp phụ DNA vào màng của cột ly tâm, rửa cột và
loại bỏ các chất bẩn bằng cồn, thu DNA. Sau khi mẫu đã được phân giải trong
đệm phân giải P thì DNase bị bất hoạt. Dịch này được chuyển lên cột, DNA
được hấp phụ vào màng trên cột và hầu hết các chất ức chế PCR, các chất bẩn
sẽ bị loại khỏi cột bằng các bước rửa cột và DNA được đẩy khỏi cột bằng
dung dịch đẩy DNA.
1.3.1.4 Phương pháp PSP®Spin Stool DNA Kit, protocol 2 (PSP2)
Thực hiện theo hướng dẫn protocol 2 của nhà sản xuất Invitek GmbH,
Berlin, Đức.
Nguyên tắc:
Tương tự phương pháp PSP1.
1.3.1.5 Phương pháp QIAamp® DNA Stool Mini Kit (QIA)
Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất QIAgen, Hilden, Đức.
Nguyên tắc:

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

14

Khóa luận tốt nghiệp

Khoa Công nghệ sinh học

QIAamp DNA Mini Kit đơn giản hóa quá trình tách chiết DNA từ các
mẫu mô, mẫu vi sinh bằng các cột ly tâm nhanh hoặc hút chân không mà
không cần chiết bằng phenol – chloroform. DNA bám đặc hiệu lên màng
silica-gel trong khi các chất tạp nhiễm bị rửa trôi. Các chất ức chế phản ứng
PCR như cation hóa trị hai và protein được loại bỏ hoàn toàn qua hai bước rửa
đệm. DNA sạch được thôi khỏi cột bằng nước hoặc đệm của hãng đi cùng bộ
kít. Bộ kít cho phép tinh sạch DNA hệ gen, ty thể, vi khuẩn, động thực vật ký
sinh hoặc vi rút phân lập từ các mẫu mô người để dùng cho các phản ứng
PCR và lai DNA.
1.3.2 Tổng quan về một số phương pháp tinh sạch DNA metagenome
1.3.2.1 Tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel
Phương pháp điện di trong gel thường được sử dụng để phân
tách DNA, RNA, oligonucleotide, protein... sau đó có thể dùng
để tinh sạch các chất đó. Dưới tác dụng của điện trường, do tích điện âm nên
các phân tử DNA dịch chuyển về phía cực dương, tốc độ dịch chuyển của
chúng phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Vì thế các đoạn DNA càng lớn thì
dịch chuyển càng chậm nên gần cực âm hơn, còn các phân tử có kích thước
nhử hơn thì sẽ gần cực dương hơn. Các đoạn DNA có kích thước khác nhau
sẽ phân bố ở các vị trí tương ứng với độ lớn của chúng trên gel.
Sau khi xác định được vị trí băng DNA mục tiêu, thì chúng được thu

nhận và tách khỏi gel bằng một số phương pháp như thẩm tích, dùng cột tinh
sạch, kit tinh sạch. Gel agarose chứa nhiều tạp chất có thể ức chế các phản
ứng tiếp theo nếu không loại hoàn toàn ra khỏi.
1.3.2.2 Tinh sạch bằng cột ly tâm (cột tinh sạch DNA)
Hiện nay trên thị trường có bán nhiều loại cột dùng để tinh sạch axit

Nguyễn Bảo Hân – K20.1302

15

Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về