Nghiên cứu tạo chủng đột biến STREPTOMYCES CLAVULIGERUS bằng hóa chất MNNG tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit CLAVULANIC

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----------

-----------

BÁO CÁO KHOA HỌC
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN BẰNG HÓA CHẤT MNNG TĂNG
HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢPAXIT CLAVULANIC TỪ XẠ KHUẨN
STREPTOMYCES CLAVULIGERUS

Giáo viên hướng dẫn:
Sinh viên:

TS. Tạ Thị Thu Thủy
Trần Hồng Hạnh

Lớp:

1302-K20

Hà Nội-2017


LỜI CẢM ƠN
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS.Tạ Thị Thu Thủy người
đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ chúng em trong quá trình thực hiện đề
tài.
Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Nguyễn Thị Phương Thảo cùng toàn
thể các thầy cô giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa Công Nghệ Sinh

Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tìnhgiúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để
chúng em hoàn thành đề tài này.
Qua đây, chúng em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người
thân, cùng toàn thể các bạn Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên và
giúp đỡ chúng em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này.
Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng,
nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên chúng em rất mong nhận
được những sự góp ý của quý thầy – cô cũng như các bạn trong lĩnh vực nghiên
cứu.

Chúng em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 17 tháng5 năm 2017
Sinh viên


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CKS

Chất kháng sinh

S. clavuligerus

Streptomyces clavuligerus

CLA

Axit clavulanic

D

Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo
milimet

Gram (-)

Gram dương

Gram (+)

Gram âm

h

Giờ

LB

Luria Bertani

TLC

Thin Layer Chromatography

Amox

amoxicillin

Amp

ampicilin

E.coli JM109

Escherichia coli JM109

B.su

Bacillus

MNNG

N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin

VSV

Vi sinh vật

XK

Xạ khuẩn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
PHẦN 1-TỔNG QUAN .......................................................................................... 2
1.1 Đại cương về kháng sinh................................................................................ 2
1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh ........................................................... 2
1.1.2 Khái niệm về kháng sinh ......................................................................... 5
1.1.3Phân loại kháng sinh ................................................................................ 6
1.1.4.Cơ chế tác dụng của kháng sinh .............................................................. 7

1.1.5 Kháng sinh nhóm β – Lactam ................................................................. 8
1.2. Đại cương về xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus ...................................... 12
1.2.1. Các đặc điểm chung ,cấu trúc của xạ khuẩn trong tự nhiên................... 12
1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus ..................................................... 13
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn ...... 14
1.2.4 Các nghiên cứu trong nước và quốc tế về chủng Streptomyces
clavuligerus ................................................................................................... 15
1.3 Axit clavulanic............................................................................................. 15
1.4. Các phương pháp đột biến ở vi sinh vật ...................................................... 18
1.4.1 Mục đích ............................................................................................... 18
1.4.2 Đột biến tạo bằng các tác nhân vật lý ................................................... 18
1.4.3Đột biến nhân tạo bằng tác nhân hóa học .............................................. 19
1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài ................................................ 19
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 22
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 22
2.1.1. Các chủng vi sinh vật ........................................................................... 22
a. Chủng xạ khuẩn ......................................................................................... 22
2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ................................................................. 22
2.1.3 Môi trường nghiên cứu.......................................................................... 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật ........................................ 25
2.2.2. Phương pháp bảo quản giống ............................................................... 27
2.2.3. Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn bằng hóa chất MNNG.................. 28
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính axit .................................................... 30


2.2.5 Xác định tỷ lệ sống sót .......................................................................... 30
2.2.6 Sàng lọc sau đột biến ............................................................................ 31
2.2.7 Phương pháp tách chiết axit clavulanic thô............................................ 31
Nguyên tắc: ................................................................................................... 31

2.2.8 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC). .... 32
PHẦN 3: KẾT QUẢ ............................................................................................. 33
3.1 Khả năng ức chế β-lactamase của chủng S. clavuligerus tự nhiên ................ 33
3.2 Kết quả nghiên cứu đột biến hóa chất MNNG ............................................. 35
3.2.1. Kết quả nồng độ hóa chất MNNG tạo đột biến ..................................... 35
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian gây đột biến MNNG ....... 36
3.2.3 Phương pháp xác định pH gây đột biến ................................................. 37
3.3 Kết quả sàng lọc sau đột biến ....................................................................... 38
3.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp acid của chủng đột biến. ...................................................................... 39
3.4.1.Ảnh hưởng của hàm lượng cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng và
sinh kháng sinh. ............................................................................................. 39
3.4.2.Ảnh hưởng của hàm lượng nito đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng
sinh ................................................................................................................ 42
3.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4. ..................................................... 43
3.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy .............................................................. 44
3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ........................................................ 44
3.5.2 Ảnh hưởng của pH. ............................................................................... 45
3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ ....................................................................... 46
3.6 Quy trình tách và thu nhận axit quy mô thí nghiệm ..................................... 47
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 48
4.1 Kết luận ....................................................................................................... 48
4.2 Khả năng ứng dụng kết quả nghiên cứu của đề tài ....................................... 48
4.3 Kiến nghị ..................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 49
A. TÀI LIỆU TIẾNG ANH ............................................................................... 49
B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ............................................................................... 51


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin ................................................... 10
Bảng 1.2. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu .......................................... 11
Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài .......................................................... 23
Bảng 2.2 Thành phần trong 1000ml ( 1 lít) môi trường chuẩn gồm: ....................... 24
Bảng 2.3 Môi trường LB đặc có thành phần như sau: ............................................ 24
Bảng 2.4 Thành phần trong 1000 ml (1lít) môi trường NDYE gồm: ...................... 25
Bảng 3.1 Thử các nồng độ kháng sinh. .................................................................. 33
Bảng 3.2 Khả năng ức chế β-lactamase của CLA................................................... 34
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ MNNG đến khả năng sinh axit của chủng xạ
khuẩnS. clavuligerus.............................................................................................. 36
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian gây đột ............................................................ 37
Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đếnsinhaxit của chủng xạ khuẩnS.clavuligerus. .............. 37
Bảng 3.6 thử hoạt tính axit của các chủng sau đột biến .......................................... 38
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đếnkhả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp kháng sinh của chủng S.clavuligerusđột biến .......................................... 40
Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của hàm lượng Glycerol đến khả năng sinh trưởng và sinh
tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus .................................................................. 41
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit
của chủng S.clavuligerus ....................................................................................... 42
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng
sinh........................................................................................................................ 43


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng ......................... 3
Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh. ............................................................... 7
Hình 1.3 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin. ............................................ 9
Hình 1.4 Công thức hóa học: ................................................................................. 10
Hình 1.5 Công thức hóa học ampicilin ................................................................... 11
Hình 1.6 Xạ khuẩn S.clavuligerus trên đĩa thạch................................................... 14

S.clavuligerus soi trên kính hiền vi 100X .............................................................. 14
Hình 1.7 Công thức phân tử axit clavulanic. .......................................................... 16
Hình 1.8 Các chất trung gian của quá trình tổng hợp axit clavulanic. ..................... 18
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của MNNG,[36] ........................................................ 28
Hình 3.1 Thử hoạt tính kháng sinh Amox .............................................................. 34
Hình 3.2 Kết quả thử hoạt tính Amox khi bổ sung thêm axit clavulanic................. 35
Hình 3.5 Chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến cấy trang .................................. 38
Hình3.6 Đĩa thử hoạt tính AC của chủng S.clavuligerus đột biến và chủng tự nhiên
.............................................................................................................................. 39
Hình 3.7 Ảnh hưởng của các nguồn glycerol đến khả năng sinh trưởng S.clvuligerus
.............................................................................................................................. 41
Hình 3.8 Ảnh hưởng của các nguồn pepton đến khả năng sinh trưởng S.clvuligerus
.............................................................................................................................. 43
Hình 3.10 Ảnh hưởng của các nguồn

K2HPO4 đến khả năng sinh trưởng

S.clvuligerus .......................................................................................................... 44
Hình 3.11.Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
axit của chủng S.clavuligerus đột biến. .................................................................. 45
Hình 3.12 Biểu đồ ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp axit của
chủng S.clavuligerus đột biến. ............................................................................... 46
Hình 3.13 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
axit của chủng S.clavuligerus đột biến. .................................................................. 46


MỞ ĐẦU
Hiện nay kháng kháng sinh đang là vấn đề mang tính toàn cầu và đặt biệt nổi
trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và mất
nhiều chi phí cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới.Các

bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, đường hô hấp và bệnh nhiễm khuẩn là nguyên
nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước phát triển.Theo khảo sát
của BV Bạch Mai tại các tỉnh phía Nam, tỉ lệ E. coli (vi khuẩn đường ruột) kháng
kháng sinh lên tới 74,6%; tỉ lệ kháng của vi khuẩn gây nhiễm trùng K. pneumoniae
lên tới gần 60%; vi khuẩnA.baumannii có tỉ lệ kháng với hầu hết các loại kháng
sinh ở mức trên 90% [1]...
Với nhóm kháng sinh penicillin và cephalosporin là nhóm kháng sinh mạnh
nhất hiện nay cũng bị một số vi khuẩn kháng lại ,đặc biệt là các vi khuẩn gram âm
mang gene kháng thuốc như β-lactamase. Các β-lactamase là enzyme được sinh ra
bởi các vi khuẩn gram âm và gram dương, chúng xúc tác sự mở vòng của cầu nối
β-lactam làm cho các kháng sinh β-lactam mất hiệu lực. Hiện nay sử dụng các chất
ức chế β-lactamase kết hợp với kháng sinh β-lactam được coi là biện pháp hiệu quả
chống lại cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn. Các chế phẩm phối hợp kháng sinh
β-lactam và chất ức chế β-lactamase được sử dụng rộng rãi bao gồm
amoxicillin/axit clavulanic, ticarcilin/axit clavulanic, ampicilin/sulbbactam.
Axit clavulanic là một chất có chứa vòng β-lactam trong cấu trúc có khả
năng ức chế β-lactamase. Mặc dù không tác dụng như một kháng sinh nhưng khi kết
hợp với kháng sinh nhóm penicillin nó có khả năng tiêu diệt được các vi khuẩn tiết
enzyme β-lactamase làm tăng phổ kháng khuẩn của kháng sinh. Axit clavulanic
được sinh tổng hợp từ chủng Streptomyces clavuligerusđang được quan tâm và
nghiên cứu của rất nhiều nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam. Tuy vậy
chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus tự nhiên này sinh tổng hợp axit
clavulanic chưa cao, rất cần có biện pháp cải thiện năng suất nhằm thu được hàm
lượng axit cao hơn. Vì vậy em thực hiện đề tài : “ Nghiên cứu tạo chủng đột biến
bằng hóa chất MNNG nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp và thu nhận axit
clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.”

Page 1

PHẦN 1-TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về kháng sinh
1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh
Nghiên cứu kháng sinh trên Thế giới
Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi
sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn
ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng
trong quá trình phát triển của vi khuẩn.
Trước đầu thế kỷ 20, các cách trị nhiễm trùng chủ yếu dựa trên các phương
pháp y học dân gian.Các hỗn hợp với các đặc tính kháng khuẩn đã được sử dụng
trong điều trị nhiễm khuẩn đã được phát hiện cách đây hơn 2000 năm.Nhiều nền
văn hóa cổ, bao gồm Hy Lạp cổ đại và Ai Cập cổ đại sử dụng nấm mốc được chọn
lọc đặc biệt và nguyên liệu thực vật và chiết xuất để trị nhiễm khuẩn. Các quan sát
gần đây hơn được thực hiện trong phòng thí nghiệm về kháng sinh giữa các vi sinh
vật đã đưa đến những phát hiện về các khánh sinh tự nhiên được tạo ra từ vi sinh
vật. Louis Pasteurnhận xét, "nếu chúng ta có thể can thiệp vào sự đối lập giữa các vi
khuẩn được quan sát, có thể sẽ có nhiều hi vọng lớn trong các phương pháp điều
trị".
Năm 1895, Vincenzo Tiberio, nhà vật lý học ở đại học Naples đã phát hiện
rằng một loại nấm mốc (Penicillium) trong nước có hoạt động kháng khuẩn tốt. Sau
khi hợp chất hóa trị ban đầu tỏ ra có hiệu quả, những hợp chất khác cũng được theo
đuổi cùng dòng điều trị, nhưng nó không được thực hiện cho đến năm 1928,
khi Alexander Fleming quan sát kháng sinh chống lại vi khuẩn từ một loài nấm
trong chi Penicillium. Fleming công nhận ảnh hưởng gián tiếp từ một hợp chất
kháng sinh có tên là penicillin, và các tính chất kháng sinh của nó có thể được khai
thác cho phương pháp hóa trị. Ban đầu ông ta miêu tả một số đặc tính sinh học
của nó,và cố gắng sử dụng các điều chế thô để trị một số trường hợp nhiễm khuẩn.

Page 2

Hình 1.1. Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng
Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa là cái bút lông) có tên như vậy là
do bộ phận sinh sản của loài nấm mốc đó có hình dạng giống cái bút lông .
Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford
là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông
để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicillin và họ đã thử nghiệm thành
công Penicillin trên chuột vào năm 1940.
Năm 1944,nhóm đã chọn được loại nấm sinhPenicillin ưu việt nhất là chủng
Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần
Penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928.
Năm 1945,Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng Ernst Boris Chain và
Howard Walter Florey.
Cùng với việc phát hiện ra Penicilin,thập kỉ 40,50 của thế kỉ XX cũng ghi
nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh
(CKS) mới có giá trị trong y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932),
Streptomycin(Selman

Waksman

và

Albert

Schat,1944),

Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),…
Tốc độ tìm kiếm các CKS ngày càng được đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên
cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn

liên tục phát hiện hàng loạt CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.Năm 1945
phát hiệnđược 30 CKS, năm 1949 con số này là 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450
CKS, năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số lượng CKS được phát hiện lên tới

Page 3


17.000 chất và khoảng 30.000 CKS bán tổng hợp,[2],[7].Tuy nhiên, trong số đó chi
có 1÷2% CKS là có đủ tiêu chuẩn để được sử dụng trong y học.
Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces CDRLL – 312, cótác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng
đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm
gây bệnh mạnh.
Tại Nhật Bản, năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces
sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự
phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này còn có khả năng
chống lại các tế bào ung thư, có giá trị MIC là 0,01÷ 0,3 mg/ml.
Tại Hàn Quốc, năm 2007, phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh
CKS Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và
các cầu khuẩn kháng Vancomycin.
Năm 2002, tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng
sinh CKS mới là 2 - methylheptyl isonicotinate, CKS này có khả năng kháng được
nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F. Solina,.
Nghiên cứu kháng sinh tại Việt Nam
Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu CKS là giáo sư Đặng Văn Ngữ. Ông
đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum và xạ khuẩn Streptomycesgrieus
để điều trị vết thương cho thương binh trong chiến dịch Đông Xuân 1951-1952,
kháng chiến chống Pháp.
Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được
thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp

kháng sinh. Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS.
Trương Công Quyền phụ trách.Tại đâyđã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn
từ các mẫu đất khác nhau.Đáng chú ý là đã tuyển chọn được một chủng có khả năng
chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu quả tốt đối với vi khuẩn gây bệnh mủ xanh
(Pseudomonas aeruginosa). Kháng sinh này lấy tên là Dekamycin và sau này được
xác định là Neomycin.
Từ năm 1974,tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và Công
Nghệ Việt Nam) đã có một nhóm nghiên cứu về CKS.Nhiều chủng VSV sinh CKS

Page 4


có hoạt tính mạnh đã được ứng dụng trong bảo vệ thực vật.Một số chế phẩm kháng
sinh như: Tetravit, Biovit, Baxitraxin…đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong
chăn nuôi.Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung
Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh song
cũng không thành công do nhiều nguyên nhân.
Từ năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu cấp Nhà nước vềsản xuất
thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng kết quả đạt được không cao về
công nghệ lẫn hiệu suất.
Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham gia
nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu tối ưu điều
kiện lên men và môi trường sản xuất kháng sinhVancomycin từ chủngStreptomyces
orientalis (2004); nghiên cứu quy trình công nghệ lên men sản xuất Vancomycin
(2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn
làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung thư và hệ bạch huyết.
Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật
nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ
khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum
gâybệnh thối rễ ở thực vật. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực

vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa
chất bảo vệ thực vật nhất định.
1.1.2 Khái niệm về kháng sinh
Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các
hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng
đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng
thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng
con đường cung cấp chung”[2].
Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung
dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh.
Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi
trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời

Page 5


gian xác định[3]. Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg,
còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007).
1.1.3Phân loại kháng sinh
Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS do
việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều. Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các
CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác
chữa bệnh.
Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng,
cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học. Tuy
nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái
nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh.
Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:
- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate
- Nhóm 2: Các lactone macrolide

- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất
- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid
- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ
- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy
- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no
- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm
- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng

Page 6


1.1.4.Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh.
Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn
-

Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá trình

nhân lên của vi khuẩn. Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục nhân lên
với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi
thực bào, nhân tố lý hóa học.
-

Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide do

ức chế enzym tổng hợp D-alanin.
-

Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của vi

khuẩn.
Ức chế chức năng của màng tế bào
-

Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin,

sideromycin.
-

Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của

màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống
nấm nistatin.
Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
-

Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome,

ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm
cho quá trình dịch mã không chính xác.

Page 7


-

Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme

peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới

thành lập.
-

Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm

ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide.
Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid
-

Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã

tạo thành mRNA (RNA thông tin).
-

Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai

mạchđơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA.
-

Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác

dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid.
-

Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân

purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid.
Ức chế quá trình trao đổi chất folate
Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó
tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn. Sulfamid và trimethoprim có

cấu trúc hoá học tương tự p-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid. Khi sử dụng,
sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất để tổng hợp folic acid, sẽ
gây thiếu purine, nucleic acid. Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn
quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic
acid), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn.
1.1.5Kháng sinh nhóm β – Lactam
Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm:
penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ
biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin .

a. Cấu trúc và phân loại
Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng βLactam

Page 8


Hình 1.3 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin.
Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: ( 2S, 5R,
6R, 3,3-dinethyl-7-7oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid) khi
thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có caassu hình 2S, 5R, 6R
ta có các penicilin có dộ bền, được động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M
là gốc cation thường là K,Na,H.

Nhóm penicillin Nhóm penicillin kháng penicilliiase
phổ rộng

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau.
Oxacillin
(OXA)

Cloxacillin
(CLO)

Ampicillin
(AMP)

Là các
Penicillin bán
tổng hợp. Phổ
hẹp như nhóm
I. Kháng
penicelliiase,
không tác
động vào vòng
β-lactam được.

Phổ rộng, tác
dụng cả khuẩn
gram (+) và (). Không
kháng βlactamase và

Page 9


Amoxcillin
(AMO)

penicilliiase.

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin
Amoxycillin
Amoxycillin hoặc moxicillin hay được gọi tắt là amox, là thuốc kháng sinh
cùng họ với penicilin thuộc nhóm kháng sinh β- lactam , nó ngăn chặn và diệt các
loại vi khuẩn gram dương như viêm họng, da tấy mũ hay nhiễm trùng da, nhiễm
trùng đường tiết niệu, viêm phổi…
Hình 1.4Công thức hóa học:

Công thức phân tử:C16H19N3O5S
Ampicillin
Ampicillin là kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm β- lactam , tức là nhóm kháng sinh
có cấu trúc phân tử gồm khung β- lactam.
Ampicillin thực chất là một penicillin bán tổng hợp nhóm A có phổ tác dụng
rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Ampicillin có tác
dụng chống lại những vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp,
dẫn mật, tiêu hoá, tiết niệu, một số bệnh ngoài da như viêm bì có mủ, áp -xe, đầu
đinh... viêm tai giữa, bàng quang và thận...

Page 10


Ampicilin là một kháng sinh tương tự penicilin tác động vào quá trình nhân
lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptid của thành tế bào vi khuẩn nhưng
không có khả năng kháng β- lactamase.
Hình 1.5 Công thức hóa học ampicilin

Công thức phân tử:C16H19N3O4S
b. Tính chất vật lý và hoá học của β-lactam
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong
nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi

hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa
đồng thời nhóm – COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy
vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước
sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc
phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân
tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
Tên kháng

pKa1

Tên kháng sinh

pKa1

Tên kháng sinh pKa1

sinh
PEN

2,74

AMO

2,8

CLO

2,7

AMP

2,7

CEP

2,6

CEF

2,75

OXA

2,72

Bảng 1.2. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu
c. Tác dụng:
Cơ chế của kháng sinh có vòng β-lactam

Page 11


Các penicilin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm chi quá
trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện.Sinh tổng hợp vách tế bào bị
ngưng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin có hoạt hóa
enzyme tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là
vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn
nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam
có hoạt động phổ rộng.

Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn sinh β-lactamase
Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzyme có tác dụng mở vòng β-lactam,
theo phản ứng ái nhân vào các nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả
các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gian tiếp ( được
gọi là methicilllin)
Vi khuẩn thường phát triển kháng thuốc kháng sinh β-lactam bằng cách tổng
hợp β-lactamase , một enzyme tấn công vòng β-lactam. Để khắc phục sự đề kháng
này, thuốc kháng sinh β-lactam thường được dùng với các chất ức chế βlactamase như axit clavulanic .

1.2. Đại cương về xạ khuẩnStreptomyces clavuligerus
1.2.1. Các đặc điểm chung ,cấu trúc của xạ khuẩn trong tự nhiên.
Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa sốsinh trưởng hiếu khí
và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tựnhưnấm. Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là:
Actinobacteria, tên tiếng Anh là: Actinomycetes - bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp
“actys” (tia) và “mykes” (nấm). Ban đầu xạkhuẩn được coi là nấm nhỏvì chúng sinh
trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thểsợi thường phát triển ở
cảbềmặt cơchất rắn (tạo thành hệsợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất
(HSCC).
Đa sốxạkhuẩn sinh bào tử, bào tửrất khác nhau vềhình dạng và kích thước.
Phần lớn xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nướcvà xác
thực vật. Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự
nhiên. Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axithumic
trong đất. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp

Page 12


chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các enzym thủy phân xenlulozơ và
hemixenlulozơ và các peroxidaza ngoại bào,[28], [25].
Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các

loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6 B12), một số axit hữu cơ như axit lactic,
axitaxetic,axit amin như axit glutamic, metionin, tryptophan, lizin.
Vềmặt phân loại, lớp xạkhuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong đó bộ được nhắc
đến nhiều nhất (có giá trịtrong y học và kinh tế) là bộActinomycetales.
BộActinomycetalescó13 dưới bộ, 42 họvà khoảng 200 chi, [34].
Xạkhuẩn thường được chia thành hai loại:Streptomycesvà không phải
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạkhuẩn được biết nhiều nhất là
Streptomyces, với khoảng 500 loài, tất cảđều có G-C cao (69 ÷ 73 %) trong ADN.
Streptomyces đặc biệt nhiều trong đất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức
các chất hữu cơbằng các enzym ngoại bào.
Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình
thành CKS, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS. Cho
tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn
sinh ra[14]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như
Micromonospora,Actinomadura,Actinoplanes,Streptoverticillium….
1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus
Streptomyces Clavuligerus (S. clavuligerus)là một loài vi khuẩn sinh tổng
hợpaxit clavulanic. S. clavuligerus ATCC 27064 (NRRL 3585, DSM 738) đã được
phát hiện lần đầu tiên bởi Higgens và Kastner, nó được phân lập từ một mẫu đất
Nam Mỹ. Streptomyces clavuligeruslà một loài vi khuẩn Gram dương.
S.clavuligerus sản xuất hơn 20 chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó có nhiều βlactam kháng sinh như axit clavulanic, cephamycin C, deacetoxycephalosporin C,
penicillin N ( chất trung gian trong cephamycin C đường) và ít nhất bốn clavams
khác. Kháng sinh Non-β-lactam bao gồm holomycin và một khu liên hợp kháng
sinh.Một điều quan trọng của S. clavuligerus là nó không có khả năng sử dụng
glucose như một nguồn carbon vì nó thiếu một hệ thống vận chuyển glucose.

Page 13


Hình 1.6 Xạ khuẩn S.clavuligerustrên đĩa thạch

S.clavuligerus soi trên kính hiền vi 100X .

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành axit.
Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy
từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng
sử dụng tốt các loại đường đơn như glucozơ, mannozơ,glycerol, fructozơ...có chủng
sử dụng tốt loại đường đôi như saccarozơ, maltozơ...Ngoài ra một số chủng còn có
thể sử dụng các loại axit hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên
men sinh axit .
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh axit đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô
cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như: bột
đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng
phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp axit, [22]. Nguồn nitơ vô
cơ thường sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp
axit của nhiều chủng xạ khuẩn.

Page 14


Ảnh hưởng của pH
Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường, pH tác động
trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động
gián tiếp qua môi trường, pH thích hợp cho sinh tổng hợp axit thường là trung tính,
pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp axit,[17], [33].
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp axit của xạ
khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 ÷ 300C, nhiệt độ tối ưu cho

sinh trưởng và tổng hợp axit thường chỉ nằm trong khoảng 18 ÷ 280C, [1].
Ảnh hưởng của các yếu tố vi lượng
Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi trường lên
men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn.
Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng
kể khả năng tổng hợp axit của nhiều chủng xạ khuẩn.
1.2.4 Các nghiên cứu trong nước và quốc tế về chủng Streptomyces clavuligerus
- Tối ưu hóa các yêu cầu dinh dưỡng và kế hoạch cung cấp chất dinh dưỡng
sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng Streptomyces clavuligerus. Parag
S.Saudagar, Rekha S. Singhal Phòng Kỹ thuật và Kỹ thuật Thực phẩm, Viện Công
nghệ Hoá học, Đại học Mumbai, Matunga, Mumbai 400 019, Ấn Độ
- Nghiên cứu về sản suất axit clavulanic từ chủng Streptomyces
clavuligerusnuôi theo mẻ, quy trình bổ sung dinh dưỡng liên tục. A.B Neto, D.B.
Hirata, L.C.M. Casiano Filho, C. Bellao Đại học São Carlos, Phòng kỹ thuật hóa
chất.
- Axit clavulanic: β-lactamase ức chế β-lactam từ Streptomyces clavuligerus.
C.Reading và M.Cole Bộ phận Researeh Dược phẩm Beecham, Anh.

1.3 Axit clavulanic
Axit clavulanic được phát hiện khoảng năm 1974-1975 bởi nhà khoa học
người Anh làm việc tại các công ty dược Beecham . Sau nhiều nỗ lực, cuối cùng
Beecham đã đệ đơn xin cấp bằng sáng chế Mỹ bảo vệ cho thuốc vào năm 1981, và
Bằng sáng chế Mỹ 4.525.352, 4.529.720, 4.560.552 và đã được cấp trong năm

Page 15


1985.Axit
Axit clavulanic (CLA)
(CLA là một chất ức chế mạnh của β -lactamase

lactamase, các enzym
chịu trách nhiệm
m cho quá trình
tr
thủy phân của kháng sinh β-lactam.
lactam.Axit clavulanic
là một chất bán tổng hợp
ợp ức chế β-lactamase phân lập từ S.. clavuligeru
clavuligerus.
CLA có hoạtt tính kháng khuẩnyếu
khu
đối với hầu hết các loạii vi khu
khuẩn với các
giá trị nồng độ ức chế tốii thiểu
thi 25-125 mg ml -1 . Tuy nhiên ,CLA có ch
chứa một vòng
β-lactam và liên kết mạnh
nh mẽ
m với β-lactamase tại hoặc gần vị trí ho
hoạt động của nó,
do đó cản trở hoạt động
ng của
c enzyme. Điều này bảo vệ kháng sinh β--lactam khác từ
β-lactamase
lactamase xúc tác, qua đó
đ tăng cường tác dụng kháng khuẩn. Do đó được sử dụng
kết hợp với thuốcc kháng sinh dễ
d bị β-lactamase, như penicillin và cephalosporin, để
điều trị nhiễmtrùng
mtrùng do vi khuẩn

khu sản xuất β-lactamase. Các tiềm lựcc được gán cho
việc bảo tồn một nồng
ng độ
đ thích hợp của thuốc kháng sinh củaa vi khu
khuẩn bằng cách
ức chế β-lactamase ( Baggaley.1997 ).
a. Cấu trúc hóa học
Axit
xit clavulanic được
đư biosynthetically tạo ra từ các axit amin arginine và
đường glyceraldehyde 3--phosphate..
AC

(3-(2-hydroxyethylidene)
hydroxyethylidene)-7-oxo-4-oxa-l-azabi-

cyclo[3.2.0]heptane
cyclo[3.2.0]heptane-2-

carboxylic acid) là 1 phần
n tử
t có công thức cấu tạo :

Hình 1.7 Công thức phân tử axit clavulanic.
AC có hoạtt tính kháng khuẩn
khu yếu, mặc dù có vòng β-lactam
lactam đđó là đặc tính
của kháng sinh β-lactam
lactam . Tuy nhiên, sự giống nhau trong cấuu trúc hóa hhọc cho
phép các phân tử tương

ng tác vvới enzyme β-lactamase tiết ra bởii vi khuẩ
khuẩn nhất định để
tính kháng β-lactam
lactam kháng sinh.

Page 16


AC là một chất ức chế tự tử , đồng hóa trị việc kết hợp với một serine dư
lượng ở vị trí hoạt động của β-lactamase. Điều này tái cơ cấu các phân tử axit
clavulanic, tạo ra một loại nhiều phản ứng mạnh hơn tấn công một acid amin khác ở
vị trí hoạt động, vô hiệu hóa nó, và do đó bất hoạt các enzym. Sự ức chế này sẽ khôi
phục lại hoạt động kháng khuẩn của kháng sinh β-lactam chống lại các vi khuẩn
kháng lactamase .
b. Sinh tổng hợp
Với cấu trúc β-lactam , axit clavulanic có cấu trúc tương tự với penicillin
nhưng sự sinh tổng hợp các phân tử này liên quan đến một con đường khác nhau và
tập hợp các enzyme khác. Axit clavulanic được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
S. clavuligerus sử dụng lyceraldehyde-3-phosphate và L-arginine như là

vật liệu

bắt đầu của con đường. Mặc dù tất cả các chất trung gian của con đường được biết,
các cơ chế chính xác của mỗi phản ứng enzym được không hiểu đầy đủ. Các sinh
tổng hợp chủ yếu liên quan đến 3 enzyme: synthase clavaminate ,

β-lactam

synthetase và N 2 - (2-carboxyethyl) -L-arginine synthase (CEA). Clavaminate
synthase là sắt không heme α-keto-glutarate phụthuộc oxygenase được mã hóa bởi

orf5 của axit clavulanic cụm gen .
Các cơ chế cụ thể về cách enzyme này hoạt động không được hiểu đầy đủ,
nhưng enzyme này quy định 3 bước trong quá trình tổng hợp tổng thể của acid
clavulanic. Tất cả 3 bước xảy ra trong cùng một vùng của trung tâm sắt xúc tác,
nhưng không xảy ra trong trình tự và ảnh hưởng đến các khu vực khác nhau của các
cấu trúc AC.

Page 17


Hình 1.8 Các chất
ch trung gian của quá trình tổng hợpp axit clavulanic.

1.4. Các phương
ng pháp đột
đ biến ở vi sinh vật
1.4.1 Mục đích
Trong thực tế không thể
th phân lập được từ tự nhiên một chủng
ng VSV có kh
khả
năng tạo axit mong muốnn với
v hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu củaa ssản xuất công
nghiệp. Các chủng
ng nguyên thủy
th sau phân lập thường sinh axit có ho
hoạt tính thấp,
đồng thờii trong quá trình nuôi cấy
c hoạt tính của chúng thường giảảm dần do hiện
tượng thoái hóa giống.

ng. Vì vậy,
v
đột biếncải tạo giống VSV nhằm
m thu được những
chủng “siêu tổng hợp”, tạạo ra axit có hoạt tính cao, ổn định là mộtt trong nh
những điều
kiện quan trọng và cầnn thiết
thi ở quy mô phòng thí nghiệm trướcc khi đư
đưa ra sản xuất
công nghiệp.
1.4.2 Đột biến tạo bằng
ng các tác nhân vật lý
-

Các loạii tia phóng xạ
x (như tia X, tia gamma, tia β, chùm nơtron)
ơtron) đã kíchthích

và ion hóa các nguyên tử
ử khi chúng đi xuyên qua các mô sống.
ng. Các phân ttử ADN,

Page 18