Thiết kế, biểu hiện đoạn gen VP1 của virus lở mồm long móng type o trong e coli và tinh sạch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
-----------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS
LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI
VÀ TINH SẠCH

NGUYỄN MINH THÀNH

HÀ NỘI - 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
-----------------

LUẬN VĂN THẠC SỸ
THIẾT KẾ, BIỂU HIỆN ĐOẠN GEN VP1 CỦA VIRUS
LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O TRONG E.COLI
VÀ TINH SẠCH
NGUYỄN MINH THÀNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60420201

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HOÀNG DƢƠNG
NCS. NGUYỄN PHƢƠNG HOA

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Hoàng
Dƣơng, NCS. Nguyễn Phƣơng Hoa - Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô –
Viện Nghiên cứu Khoa học Miền Trung – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam - ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian qua
để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn chân thành tới các cô chú, anh chị Trung tâm Công nghệ
sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung đã giúp
đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu và các thầy cô khoa Sau Đại học,
Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho chúng
tôi trong suốt hai năm qua.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân và toàn thể bạn bè,
đã luôn quan tâm, ủng hộ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và tiến hành
luận văn.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016
Học viên

Nguyễn Minh Thành


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn
của thầy, cô hƣớng dẫn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai

công bố trong bất kỳ công trình nào.

Tác giả luận văn
( ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Minh Thành


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG ......................................3
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh ...............................................................................3
1.1.2. Phân bố bệnh trên thế giới và Việt Nam ....................................................5
1.1.3. Đặc điểm dịch tễ học. .................................................................................8
1.2. VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG. .................................................................12
1.2.1. Tổng quan về virus Lở mồm long móng. .................................................12
1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus Lở mồm long móng ........................................16
1.2.3. Cấu trúc gen virus LMLM........................................................................19
1.3. HỆ BIỂU HIỆN E. COLI................................................................................20
1.3.1. Đại cƣơng về E.coli ..................................................................................20
1.3.2. Chủng biểu hiện E. coli BL21(DE3) ........................................................21
1.3.3. Vector biểu hiện pET-SUMO ..................................................................22
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............23
2.1. VẬT LIỆU ......................................................................................................23
2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................23
2.1.2 Thiết bị và hóa chất. ..................................................................................24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................25

2.2.1 Phƣơng pháp điện di trên gel agarose .......................................................25
2.2.2 Phƣơng pháp khuếch đại gen bằng PCR (Polymerase Chain Reaction) ..25
2.2.3. Phƣơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCRTM4-TOPO 26
2.2.4. Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.coli ............27
2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid .....................................................28
2.2.6. Phƣơng pháp cắt DNA plasmid bằng enzym giới hạn .............................28


2.2.7. Phƣơng pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ............................................29
2.2.8. Xác định trình tự gene bằng máy tự động ................................................30
2.2.9. Cắt vector pET-SUMO bằng enzym giới hạn ..........................................30
2.2.10. Phƣơng pháp thôi gel (Cắt và thu nhận băng AND từ gel agarose ) ......31
2.2.11. Phƣơng pháp tạo vector tái tổ hợp..........................................................31
2.2.12. Biểu hiện protein VP1 tái tổ hợp trong chủng E. Coli BL21(DE3) .......32
2.2.13. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide ...........................33
2.2.14 Phƣơng pháp Western Blot .....................................................................35
2.2.15 Phƣơng pháp tinh sạch protein tái tổ hợp. ...............................................37
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ ......................................................................................39
3.1. TÁCH DÕNG ĐOẠN GEN VP1 VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ...............................39
3.2. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET- SUMO MANG GEN VP1. ..........43
3.3. BIỂU HIỆN VECTOR PET-SUMO-VP1 TRONG TẾ BÀO E.COLI BL21
(DE3) .....................................................................................................................47
3.4 TINH SẠCH PROTEIN VP1 BẰNG ĐUÔI HIS-TAG ..................................49
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................52


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp

: Ampicillin

BP( bp)

: Cặp Bazơ

DNA maker

: Thang DNA chuẩn

DNA

: Axit Deoxyribonucleic

E.Coli

: Escherichia Coli

EDTA

: Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

EtBt

: Ethidium Bromide

EtBt

: Ethidium Bromide

LB

: Môi trƣờng Lauria Betani

LMLM

: Bệnh lở mồm long móng

OD

: Optical Density (mật độ quang học)

OIE

: Office International Epidemiology (Tổ chức dịch tễ thế giới)

PCR

: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RT-PCR

: Reverse transcriptase-PCR (Kỹ thuật phối hợp khuyếch
đại trình tự các RNA)

SAT

: South Africa Territories

SDS

: Sodium dodecyl sulphate

TAE

: Tris – Acetate – EDTA

Taq polymerase : Polymerase Thermus aquaticus
v/ph

: vòng / phút

WHO

: Who Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

IRES

: International Ribosome Entry Site


DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH

Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004 .....................8

Hình 1.1: Friedrich Loeffler ........................................................................................4
Hình 1.2: Các đợt dịch LMLM năm 2003 ..................................................................5
Hình 1.3: Bản đồ phân bố các type LMLM trên thế giới ............................................6
Hình 1.4 : Triệu chứng bệnh LMLM ........................................................................12

Hình 1.5:Hình ảnh virus Lở mồm long móng ...........................................................13
Hình 1.6: Hình thái virus LMLM ..............................................................................17
Hình 1.7: Cấu trúc vỏ ngoài cuả virus LMLM .........................................................18
Hình 1.8: Hệ gen mã hóa VP1 ..................................................................................19
Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR gen VP1 bằng cặp mồi VP1-F/R ....................40
Hình 3.2: Đĩa cấy tế bào E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp chứa gen VP1 ........41
Hình 3.3: Điện di đồ kiểm tra plasmid mang gen VP1 .............................................41
Hình 3.4: Cắt kiểm tra ADN plasmid tái tổ hợp mang gen VP1 bằng EcoRI ..........42
Hình 3.5:Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa VP1 của virus gây bệnh LMLM ở
Việt Nam và trên thế giới bằng chƣơng trình Blast ..................................................43
Hình 3.6: Sản phẩm cắt và thôi gel vector pET- SUMO ..........................................43
Hình 3.7:Kết quả PCR đoạn gen VP1 tạo ra đầu so le..............................................44
Hình 3.8: Kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng phản ứng PCR ...................................45
Hình 3.9: Sản phẩm tách và tinh sạch plasmid của khuẩn lạc số 1,2,3 .....................46
Hình 3.10 : Biểu hiện gen VP1 ở 18oC và thu mẫu sau 3h,6h, 9h cảm ứng .............47
Hình 3.11 : Kết quả kiểm tra lƣợng protein VP1 tạo ra khi biểu hiện ở ..................48
18 oC, 20 oC và 25 oC ................................................................................................48
Hình 3.12: Điện di đồ protein VP1 sau khi tinh sạch ...............................................49


MỞ ĐẦU
Những năm gần đây, chăn nuôi luôn đóng vai trò quan trọng duy trì tốc độ
tăng trƣởng trong lĩnh vực nông nghiệp với tốc độ 5-7%/năm so với 2-2,5% /năm
của ngành trồng trọt. Chăn nuôi, một trong những ngành quan trọng để chuyển đổi
cơ cấu và thúc đẩy tăng trƣởng nông nghiệp, riêng ngành chăn nuôi chiếm khoảng
¼ GDP trong sản xuất nông nghiệp. Theo Tổng Cục Thống Kê tính đến 7/2013 giá
trị sản xuất ngành chăn nuôi (theo giá so sánh 2010) tăng 4,1% so với cùng kỳ năm
2012, tuy nhiên tổng số đàn trâu của cả nƣớc lại giảm 2,5%, đàn bò giảm 3%, đàn
lợn giảm 1,5%, gia cầm giảm 2% so với cùng kỳ năm 2012 mà nguyên nhân chính
là do sự đe dọa của dịch bệnh ngày càng tăng, đặc biệt là bệnh lở mồm long móng

(LMLM ).
Việc phòng chống bệnh LMLM ở nhiều nƣớc đã trở thành vấn đề trọng điểm
quốc gia, nhất là trong nền kinh tế thị trƣờng, việc có hay không có bệnh LMLM
trong sản xuất, chăn nuôi là một tiêu chí trong quan hệ buôn bán quốc tế và mọi
quốc gia sử dụng nó nhƣ là một vũ khí trong thƣơng mại. Thời gian gần đây, tình
hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở các nƣớc trên thế giới nói chung và
Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm soát. Ở Việt Nam,
những mục tiêu quan trọng nhất mà ngành thú y phấn đấu thực hiện là: khống chế
một số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở gia súc, mà đặc biệt là bệnh LMLM. Thế kỷ
XXI là thế kỷ của công nghệ sinh học cùng với sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật
sinh học phân tử đã mở ra những triển vọng nghiên cứu vô cùng to lớn và đã có
những thành tựu đáng kể trong việc phát hiện cấu trúc phân tử của virus LMLM. Do
đó việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của virus LMLM hiện nay là
thực sự cần thiết không những cho nghiên cứu chẩn đoán chính xác bệnh cũng nhƣ
nghiên cứu sản xuất các loại vắc-xin thế hệ mới phù hợp với virus LMLM đang lƣu
hành tại Việt Nam mà còn cho phép xác định mức độ tiến hóa của virus đƣơng
nhiễm với các chủng trƣớc đó tại Việt Nam và trên thế giới.
Có 7 type virus gây bệnh LMLM: O, A, C, Asia1, SAT1,SAT2 và SAT3 với

1


trên 70 subtype. Ở Việt Nam, đã phát hiện type O; type A và Asia 1 nhƣng thƣờng
gặp là type O. Các type lở mồm long móng này lại chia thành nhiều biến chủng
(subtype) khác nhau; ví dụ type A có A1, A2, A3,... type O có O1, O2, O3... Do có
nhiều type và các type không gây miễn dịch chéo cho nhau nên trong một vụ dịch
trâu bò có thể mắc bệnh nhiều lần với các subtype khác nhau..Vỏ capsid có 60 đơn
vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó
VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng nhƣ là loại kháng nguyên
chính tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM.

Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Thiết kế, biểu hiện
đoạn gen VP1 của virus Lở mồm long móng Type O trong E.coli và tinh sạch.”
với hi vọng kết quả thu đƣợc sẽ bƣớc đầu cung cấp những cơ sở khoa học cho đề
tài“Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng giả virus (VLP) để sản xuất vắc
xin lở mồm long móng (LMLM) type O”
Quá trình và mục đích đề tài nghiên cứu của chúng tôi nhƣ sau:
+/ Tách dòng gen mã hóa protein vỏ VP1 của virus LMLM type O ở Việt
Nam.
+/ Biểu hiện và tinh sạch gen VP1 mã hóa protein vỏ virus LMLM type O ở
Việt Nam để phục vụ cho quá trình nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp dạng
giả virus để sản xuất vắc xin lở mồm long móng type O ở Việt Nam
Đề tài này đƣợc thực hiện tại Trung tâm Công nghệ sinh học phân tử
Nghĩa Đô, Viện Nghiên Cứu Khoa học Miền Trung

2


CHƢƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh
Bệnh LMLM còn có tên khác là Foot and Mouth Disease ( viết tắt FMD) –
tiếng Anh,Apthaeepizooticae – tiếng La Tinh, Khẩu đề dịch – tiếng Trung Quốc,
đƣợc Tổ chức Thú y Thế giới OIE (Organization of International Epizootics) coi là
bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trong tất cả những bệnh truyền nhiễm ở động vật
móng guốc chẵn nhƣ: trâu, bò, lợn, dê, hƣơi, nai…. Sự nguy hiểm của bệnh là do
khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh. Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa động vật
khỏe với động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đƣờng kể cả qua đƣờng không khí.
Vì vậy bệnh thƣờng phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hƣởng lâu

dài lên năng suất vật nuôi và đến kinh tế xã hội nhiều nƣớc thuộc nhiều châu lục
trên thế giới. Do bệnh không lây lan sang ngƣời nên đôi khi công tác phòng chống
dịch bệnh không nhận đƣợc sự hƣởng ứng và tham gia tích cực của cộng đồng.
Bệnh thƣờng gây thiệt hại lớn cho các loài gia súc chăn nuôi cao sản nhƣ bò sữa, bò
thịt, lợn hƣớng nạc. Gia súc mắc bệnh thƣờng giảm tăng trọng, giảm sản lƣợng sữa
và là động vật mang trùng, vì vậy các nƣớc có nền chăn nuôi, kinh tế phát triển rất
quan tâm. Mặc dù xuất hiện nhƣ một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ tử vong thấp ngoại trừ
những con vật non, từ 2-5% đối với gia súc trƣởng thành và 20-50% ở đàn gia súc
nhƣ bê, nghé, lợn con. Ở gia súc sinh sản, bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25%
động vật có chửa, sản lƣợng sữa giảm 50% do viêm vú và lƣợng sữa thu đƣợc phải
trải qua nhiều khâu khử trùng phức tạp mới sử dụng đƣợc. Điều này cho thấy sự
thiệt hại về kinh tế do bệnh LMLM gây ra là rất trầm trọng. Khi dịch bệnh xảy ra
gây hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế - xã hội cũng nhƣ các vấn đề về môi
trƣờng ở khu vực có dịch vì thế bệnh LMLM đƣợc đặt ở vị trí số 2 bảng A trong
danh mục các bệnh truyền nhiễm của gia súc.

3


Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius
mô tả một căn bệnh tƣơng tự trên gia súc tại Italy. Gần 400 năm sau, vào năm 1897
Friedrich Loeffler và Frosch đã chứng minh đƣợc tác nhân gây nên bệnh lở mồm
long móng có thể qua lọc.

Hình 1.1: Friedrich Loeffler
Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua
lọc gọi là virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology).
1929: Những trƣờng hợp cuối cùng ở Mỹ
1953: Những trƣờng hợp cuối cùng ở Canada và Mexico
1993: Italy

1997: Đài Loan (Taiwan)
2001: Anh (United Kingdom)
Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 và 1981. Dịch bệnh lở mồm
long móng đã xảy ra ở nhiều châu lục nhƣ châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ.

4


Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu
gia súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế
các quốc gia này nói chung. Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tại Hàn Quốc, Nhật
Bản và Đài Loan. Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan,
Lào, Campuchia, Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam). Một năm sau, dịch
lan tới Trung Quốc, Nga, Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma.

Hình 1.2: Các đợt dịch LMLM năm 2003
Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia nhƣ Brasil,
Argentina và Paraquay cũng nhƣ ở châu Phi (Nam Phi).
1.1.2. Phân bố bệnh trên thế giới và Việt Nam
1.1.2.1 Phân bố bệnh trên thế giới
Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Type huyết
thanh O, A đƣợc nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các type
huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 đƣợc giới hạn ở một số nƣớc thuộc châu Phi.
Type huyết thanh Asia 1 đƣợc tìm thấy ở nhiều nƣớc thuộc châu Á. Riêng type
huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nƣớc nhƣ Philippines. Theo tài liệu của
Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc type O,
gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh
miền núi phía bắc.
5

Hình 1.3: Bản đồ phân bố các type LMLM trên thế giới
1.1.2.2 Phân bố bệnh tại Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc ghi nhận lần đầu tiên tại Nha Trang (1898). Trƣớc
đây, bệnh thƣờng thấy ở các tỉnh miền Trung và miền Nam, giáp biên giới
Campuchia và Lào. Ở miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong thời gian dài từ những
năm 1921-1963. Bệnh không xảy ra ở khu vực các tỉnh phía Bắc từ 1963-1992.
Năm 1993, dịch bệnh xuất hiện ở các tỉnh Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa
Thiên- Huế. Năm 1995, bệnh xảy ra ở 107 huyện thuộc 26 tỉnh làm nhiều trâu, bò,
lợn bị chết. Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nên phức tạp, hàng năm bệnh xảy
ra ở diện rộng với số lƣợng lớn gia súc mắc bệnh.
Theo số liệu của Cục thú y: Năm 1999, trong khi vẫn chƣa chấm dứt các đợt
dịch từ các tỉnh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc đợt dịch mới từ Trung
Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các tỉnh giáp biên. Cao Bằng là điểm đầu tiên, từ
đó dịch lan sang các tỉnh khác.

6


Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 tỉnh, thành với 3.976 trâu bò mắc bệnh.
Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 tỉnh, thành, gây bệnh cho 10.287 trâu, bò.
Năm 2003, 38 tỉnh, thành có dịch, trong đó, 28 tỉnh có dịch ở trâu, bò và 28
tỉnh có dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trâu, bò; 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ
yếu ở các tỉnh: Quảng Trị, Phú Yên, Đăk Lăk, Khánh Hòa, Gia Lai, Hà Giang.
Theo Tô Long Thành và cộng sự thì tình hình dịch bệnh LMLM trong mấy
năm gần đây diễn biến hết sức phức tạp và có chiều hƣớng gia tăng:
Năm 2004: Số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh, trong đó có 9 tỉnh do virus
LMLM serotype A (phát hiện lần đầu tiên tại Ninh Thuận và Bình Định vào tháng
8/2004), 12 tỉnh do virus LMLM serotype O và 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM
serotype O và A. Nguyên nhân của việc xuất hiện virus LMLM type A có thể là do

việc nhập lậu bò từ Campuchia.
Năm 2005: Số tỉnh có dịch LMLM là 37 tỉnh với 28.241 trâu bò, 3.976 lợn
và 81 dê mắc bệnh, trong đó có 3 tỉnh do virus LMLM serotype A, 13 tỉnh do virus
LMLM serotype O, 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A, 2 tỉnh do virus
LMLM serotype Asia1 (phát hiện tại Lào Cai và Khánh Hoà vào tháng 10/2005).
Từ đầu năm 2006 đến nay, số tỉnh có dịch LMLM là 27, trong đó 26 tỉnh là
type O và Hà Giang là type Asia 1 (phát hiện tháng 5 năm 2006 bằng kit 3ABC và
giám định) với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh.
Trong gần trọn một thế kỷ, bệnh này đó tồn tại và phát triển trên địa bàn 107
trong tổng số 229 huyện thuộc 26 tỉnh, gây nên hàng trăm ổ dịch, làm cho hàng
chục vạn trâu, bò và lợn bị bệnh.
Từ năm 1996-2011, bệnh LMLM đó xảy ra tại 2.873 (26% trong tổng số
11.020) xã, làm tổng số là 5.630 lƣợt xã có dịch thuộc 463 (66,7% trong tổng số
694) huyện thị, thành phố của tất cả 63 tỉnh, thành phố. Tổng số có 238.669 trâu, bò
và lợn bị bệnh trong giai đoạn này.

7


Bảng 1.1: Tình hình bệnh lở mồm long móng giai đoạn 1999-10/2004

1.1.3. Đặc điểm dịch tễ học.
1.1.3.1. Động vật cảm nhiễm.
Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu,
các loài dã thú nhƣ hƣơu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và ngƣời ít nhạy cảm với
bệnh, loài một móng nhƣ ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh. Ở ngƣời, theo tài
liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông Đài Loan,
thì ngƣời ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh lở
mồm long móng đều không mắc bệnh. Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh
Phƣớc, ngƣời chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus

xâm nhập qua vết thƣơng ở da, đƣờng tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh
khoảng 4-8 ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nƣớc mọc ở đầu ngón
tay, bàn chân, cánh tay và các nơi khác. Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng
gãi nhiều, đôi khi mụn có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng. Bệnh có thể kéo dài
đến 10 ngày, sau đó sẽ hết bệnh.
Chất chứa virus: - Mụn nƣớc là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là
mụn nƣớc sơ phát mới hình thành. - Trên cơ thể thú ngoài mụn nƣớc, các chất bài

8


tiết nhƣ nƣớc bọt, nƣớc tiểu, phân, sữa, nƣớc mắt, nƣớc mũi cũng chƣá nhiều virus.
Số lƣợng virus trong chất thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh,
thƣờng rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2 tuần hầu nhƣ không còn thấy
virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ
virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò). - Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập
trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng.
1.1.3.2 Đường xâm nhập và cách truyền bệnh.
Đƣờng xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc
miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi
virus xâm nhập vào cơ thể. Đƣờng sinh dục và hô hấp đƣợc coi là đƣờng xâm nhập
phụ. Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
+ Lây trực tiếp qua nƣớc bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn
thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.
+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nƣớc uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay,
giầy dép của ngƣời chăn nuôi, ngƣời tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán
chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia
súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh.
+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km.
1.1.3.3 Cơ chế gây bệnh.

- Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày.
- Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống
tiêu hoá, qua thức ăn, nƣớc uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Virus sẽ
nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thƣợng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá,
da, tạo nên mụn nƣớc sơ cấp, thƣờng các mụn nƣớc này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn
sinh hoạt bình thƣờng, do đó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện đƣợc. Sau 1-2 ngày
virus từ mụn nƣớc sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt
cao. Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do
đó virus quay ngƣợc trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thƣợng bì non nhƣ môi,
nƣớu răng, lƣỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nƣớc thứ cấp. Đặc

9


điểm mụn nƣớc chỉ mọc ở phần thƣợng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì và hạ bì,
do đó sau khi mụn nƣớc vở sẽ rất mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng thành mụn mủ
nếu đƣợc chăm sóc tốt.
- Mụn mọc ở miệng, lƣỡi gây cảm giác đau nhức làm thú không nuốt đƣợc,
nƣớc bọt bị kích thích chảy ra đầy ở miệng. Heo con, bê nghé bỏ bú do đó sẽ chết
sau vài ngày mắc bệnh.
- Mụn nƣớc ở móng chân thƣờng bị nhiễm trùng do thú đi đứng trong phân,
đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dƣới gây hƣ hại nặng tổ.
- Virus có thể tạo các mụn nƣớc ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ
tim kéo theo sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ
tim, thoái hoá cơ tim làm gia súc chết ngộp.
1.1.3.4. Triệu chứng bệnh
Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình là 3-4 ngày, gồm 3 thể bệnh
+/ Thể thông thƣờng
- Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt
cao 40-41oC kéo dài 3 ngày. - Xuất hiện các mụn nƣớc ở da, vành móng kẻ chân,

lƣỡi, vú làm thú kém ăn, nhai khó khăn.
- Ở miệng: lƣỡi có mụn to ở đầu lƣỡi gốc lƣỡi ở hai bên lƣỡi, xoang trong
miệng trong má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp. Sau đó
mụn vỡ và tạo thành các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám. Nƣớc dãi chảy nhiều
nhƣ bọt xà phòng.
- Ở mũi: niêm mạc có mụn nƣớc, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nƣớc mũi
lúc đầu trong sau đục dần.
- Ở chân, kẽ móng có mụn nƣớc từ trƣớc ra sau, mụn vỡ làm long móng.
- Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng nhƣ bụng, bẹn, vú, ở đầu
núm vú…
- Sau khi hàng loạt mụn nƣớc vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm
trùng da, thú sốt cao, suy nhƣợc dần rồi chết

10


+/ Thể biến chứng
- Những biến chứng xảy ra khi điều kiện vệ sinh, chăm sóc kém làm mụn vỡ
dẫn đến nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xƣơng làm thú què. Vú thì
bị viêm tắc sữa. Các mụn khác vỡ sẽ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết rồi chết.
Bệnh lở mồm long móng ghép với các bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn
trong máu có thể làm con vật mau chóng chết.
+/ Thể ác tính
- Đối với heo con: sốt cao 40 - 41,5oC, trong những ngày đầu thấy toàn thân
đỏ ửng cả da và niêm mạc. Chảy nƣớc mắt và nƣớc dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn
nheo nứt thành từng vết từ trên xuống và có nƣớc chảy ra. Nhiều con miệng viêm
loét không bú đƣợc và nhiễm trùng máu rồi chết. Tốc độ lây nhiễm trong đàn heo
con là rất nhanh. Bệnh tích thƣờng gặp ở bốn chân, mụn loét ở miệng và gây hiện
tƣợng long móng, sau 7-10 ngày thì lây lan sang toàn đàn.
- Đối với heo nái: bệnh biểu hiện nhẹ hơn, thấy mụn nƣớc ở vú, kẽ móng

chân, có con nhiễm trùng thì sƣng móng viêm có mủ, đi cà nhắc, có con long móng.
1.1.3.5. Bệnh tích.
- Chủ yếu ở đƣờng tiêu hóa nhƣ miệng có các vết loét ở lƣỡi, lỗ chân răng,
hầu, thực quản, dạ dày…
- Ở đƣờng hô hấp gây viêm phế quản. Bên trong phủ tạng: tim bị viêm cấp,
van tim bị sùi hoặc loét (TIM CỌP), lách bị sƣng đen, niêm mạc ruột non ruột già
xuất huyết điểm, long móng, thối móng, rụng xƣơng bàn chân. Khi khỏi bệnh thì ở
các vết loét sẽ để lại sẹo ở miệng.

11


Chảy nƣớc dãi ở bò

Viêm loét miệng bò

Loét kẽ móng chân bò

Tụt móng chân ở lợn

Viêm loét lƣỡi ở lợn

Nổi mụn nƣớc trên mũi lợn

Hình 1.4 : Triệu chứng bệnh LMLM
1.2. VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG.
1.2.1. Tổng quan về virus Lở mồm long móng.
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo.
Virus gây bệnh LMLM là loại virus nhỏ nhất thuộc họ Picornavirideae
nhóm Aphthovirus, có kích thƣớc 20-30 nm, có cấu trúc đa diện 30 mặt đều, hạt

12


virus chứa 30% acid nucleic, là một đoạn RNA.Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là
capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 có
vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng nhƣ là loại kháng nguyên chính
tạo kháng thể chống lại virus gây bệnh LMLM.

Hình 1.5:Hình ảnh virus Lở mồm long móng
Sức đề kháng của virus: Virus có sức đề kháng mạnh
+ Ở 60oC tồn tại 5-15 phút.
+ Ở 100oC virus chết ngay lập tức.
+ Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và
gây bệnh.
+ Trong thịt ƣớp lạnh virus tồn tại khá lâu.
+ Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày.
+ Nƣớc tiểu virus tồn tại 39 ngày.
+ Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các
dung môi hữu cơ ( cồn, ete…).

13


+ Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, …
+ Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7. Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ
pH cao hoặc thấp (pH <2 và pH>11). Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm.
1.2.1.2. Phân loại.
Virus LMLM đƣợc hai nhà khoa học Đức là Loefler và Frosch phân lập lầu
đầu tiên vào năm 1987. Cho đến năm 1902, hai nhà khoa học Pháp Vallée và Carée
lần đầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò đƣợc

gọi là type O (phân lập đƣợc tại vùng Oisée- Pháp) và type A (phân lập đƣợc tại
vùng Ardène- Pháp) có trong đàn bò nhập từ Đức. Năm 1926 hai nhà khoa học Đức
là Waldmann và Trautwein đã phân lập đƣợc 3 type virus LMLM và đặt tên là A, B,
C. Nhƣng sau đó các nhà khoa học thấy rằng hai type A và B có đặc tính giống với
2 type O và A mà hai nhà khoa học Pháp đã phân lập đƣợc trƣớc đó. Cho đến năm
1952, các nhà khoa học trên thế giới đã thống nhất gọi các type là O, A, C.
Type Asia 1 do Brooksby và Rogere (1957) tìm thấy ở Pakistan, đây là type
hay gây bệnh phổ biến ở lục địa Châu Á (cận Đông, Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan,
Trung Quốc, Lào, Hồng Kông…).
Type SAT1, SAT2, SAT3 (Southern African Teritoties) tìm thấy ở Nam Phi
và đƣợc giám định tại viện Pirbright (Anh) trên các bệnh phẩm bò ở miền Nam và
Bắc Rhodesia. Các type này chủ yếu có trên lục địa Châu Phi (Nam, Trung và Đông
Phi, Saudan, Ai cập…) phổ biến nhất là các type SAT1, mới đây cũng thấy type
SAT1 tại vùng Trung Cận Đông.
Nhƣ vậy virus LMLM có 7 type là type A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và
Asia 1các type khác nhau có độc lực khác nhau. Những virus này thƣờng biến hóa
không ngừng thành những chủng phụ mới có khác biệt về tính kháng nguyên, tồn
tại bền vững, đã có hơn 70 phân8 type đƣợc xác định vì vậy phải thƣờng xuyên
chuẩn đoán định chủng virus chính xác qua xét nghiệm tại phòng thí nghiệm thì mới
chọn đƣợc loại vaccine thích hợp để phòng cho từng vùng và từng thời kỳ.
Các type virus LMLM gây những triệu chứng lâm sàng giống nhau, nhƣng
không có miễn dịch bảo hộ chéo với nhau. Đây chính là một khó khăn về kỹ thuật

14


và gây tốn phí lớn về kinh tế trong việc sản xuất vaccine phòng bệnh thích hợp cho
từng khu vực dịch.
Phƣơng pháp phân loại virus chủ yếu dựa trên kháng nguyên. Cho đến nay
chƣa phát hiện thêm type nào mới nhƣng các chủng virus LMLM do có genome là

RNA nên liên tục có sự biến đổi tạo ra các subtype mới. Trƣớc đây các subtype
thƣờng đƣợc ký hiệu bằng số mũ nhƣ O1, A32…thì nay ngƣời ta thống nhất ký hiệu
là O1, A32…
1.2.1.3. Khả năng tồn tại của mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên
Theo Phan Đình Đỗ, Trịnh Văn Thịnh (1975), Nguyễn Vĩnh Phƣớc (1978),
Merchant I.A và BRNAer R.O, Swam H (1978) và nhiều tác giả khác thì sức đề
kháng của virus LMLM đối với ngoại cảnh là tƣơng đối mạnh. Tuy có sự biến đổi
giữa vài dạng virus về tính kháng nhiệt hay chịu đựng sốc do phản ứng gây ra.
Virus LMLM là loại virus không có vỏ bọc, lớp ngoài cùng của virus là một
lớp lipid do vậy virus có tính đề kháng cao với các dung môi hữu cơ (cồn, ete…).
Tuy nhiên virus LMLM lại khá mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, formol, acid, kiềm.
Nhƣ với dung dịch NaOH 0,5-1% tiêu diệt virus một cách nhanh chóng 5 phút.
Ở phân, nƣớc tiểu, máu, những chỗ loét hay với nƣớc bọt trâu, bò, virus có
thể tồn tại từ 5-10 ngày sau khi nhiễm ở 18ºC. Nhiệt độ lạnh là một nhân tố bảo
tồn virus LMLM một cách khá tốt. Trong tủ lạnh, virus cũng hoạt lực sau 425 ngày.
Thịt ƣớp đông lạnh xong sấy khô có thể giữ virus tồn tại trong 52 tháng.
Gia súc khỏi bệnh trở thành vật mang trùng lâu dài, đặc biệt là trâu, bò.
Chính những con mang trùng này là nguyên nhân tái phát ổ dịch cũ và phát sinh ổ
dịch mới ở nơi chúng đƣợc đƣa đến. Theo quy định của Tổ chức Thú y thế giới gia
súc tại các ổ dịch cũ, trong khi thực hiện công tác giám sát dịch tễ, nếu phát hiện có
dƣơng tính với bệnh LMLM phải giết hủy hoặc đánh dấu không cho vận chuyển.

15


1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus Lở mồm long móng
1.2.2.1. Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM
Cấu trúc của virus LMLM là cấu trúc đối xứng khối 20 mặt, gồm 1 sợi RNA
mạch đơn chứa 8500 nucleotide đƣợc đóng gói trong một vỏ protein đƣợc tạo thành
từ 60 capsome, không vỏ bọc. Mỗi capsomer gồm 4 loại polypeptide VP (virus

protein) ký hiệu VP1(1D), VP2 (1C), VP3 (1B), VP4 (1A). 4 loại VP này đều có
nguồn gốc từ VP0, VP1 ở lớp ngoài cùng, là yếu tố cấu trúc, tham gia quá trình cố
định virus trên màng tế bào, có tính sinh miễn dịch chủ yếu. Ngƣời ta đã ứng dụng
phát hiện này để điều chế vaccine cho hiệu quả cao với VP1 (dẫn liệu của Lê Anh
Phụng, 1996; Trần Thanh Phong, 1996). Do có đặc điểm của các virus sợi đơn (+)
RNA, virus có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh.
Bộ gene gồm vùng không giải mã (UTR: untranslated region) dài 1200 base
ở đầu 5’ (5’UTR) (có vai trò quan trọng trong việc giải mã, độc lực, hình thành
capsid), vùng này chứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary
structure), và đƣợc biết nhƣ là vị trí để tiến vào bên trong ribosome (IRES:
international ribosome entry site) và đầu 3’ (3’UTR). Phần giải mã protein cấu trúc
(1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD). Chỉ thị phần
tử sử dụng nhiều nhất trong định type và nghiên cứu phả hệ virus lở mồm long
móng là 5’UTR và VP1. Cả hai đầu của bộ gene có thể đƣợc thay đổi, đầu 5’ tận
cùng bởi VPg (genome-linked protein) (khoảng 23 acid amin), đầu 3’ bởi chuổi dài
adenyl (King, 2000).

16


Hình 1.6: Hình thái virus LMLM
Toàn bộ genome của virus LMLM mã hóa cho một protein đơn. Sau khi dịch
mã, protein này phân cắt thành 4 sản phẩm sơ cấp: Amino terminal L protease, phân
cắt ở đầu cuối carboxyl , P1-2A, tiền chất của protein vỏ, sẽ trải qua giai đoạn
polyprotein sau dịch mã với sự tham gia của các protease virus để tạo thành 1
protomer. Hạt virus hình thành từ từng đơn vị protomer (hay đơn vị capsid). Từ đơn
vị căn bản này, 5 protomer hợp thành 1pentamer, 12 pentamer liên kết nhau theo
cấu trúc khối đối xứng gồm 3 trục để hình thành 1 sợi RNA, đó là 1 virus.

17