Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

Header Page 1 of 120.

Viiện khoa học

Bộ khoa học

và công nghệ việt nam

và công nghệ

Viện Công nghệ Sinh học
V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
V.KHCNVN
V.CNSH

Báo cáo tổng kết Đề tài
Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc ngoài

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Trần Bình

6288
25/01/2007

Hà Nội, 2006
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 1 of 120.


Header Page 2 of 120.

Viiện khoa học
và công nghệ việt nam

Bộ khoa học
và công nghệ

Viện Công nghệ Sinh học
V.KHCNVN
V.CNSH

V.KHCNVN
V.CNSH

---------------------------------V.KHCNVN
V.CNSH

Báo cáo tổng kết Đề tài
Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc ngoài

Tăng cờng tính chống chịu
và cải tiến chất lợng giống lúa bằng
công nghệ sinh học thực vật

Chủ nhiệm Đề tài:

PGS. TS. Lê Trần Bình

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ sinh học

Cơ quan chủ quản:

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian thực hiện:

2002 - 2005

Hà Nội, 2006

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 2 of 120.


Header Page 3 of 120.

LLờ
ờii ccảảm
mơ
ơnn

Trong khuôn khổ hợp tác song phương về khoa học và công nghệ giữa
CHLB Đức và Việt Nam thì lĩnh vực công nghệ sinh học được chú trọng
như một lĩnh vực ưu tiên. Tuy nhiên, hầu hết các nội dung hợp tác giữa

các đối tác Việt Nam và đối tác Đức nổi bật vẫn là những nội dung nặng về
chuyển giao công nghệ và đào tạo nguồn nhân lực.
Lần đầu tiên trong lĩnh vực công nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên
đối tác đều muốn tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế
giới về Giải mã genom cây lúa nước. Đó cũng là lý do vì sao một quốc gia
như Đức, không trồng một cây lúa nước nào ở ngoài đồng ruộng tự nhiên
mà lại quan tâm đến những nghiên cứu rất cơ bản về cây lúa nước.
Vì thế việc xây dựng một đề tài đối ứng với một Viện đầu ngành về sinh
học phân tử thực vật như Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử,
Golm là một cơ hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách
thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến.
Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang về Đào tạo và nghiên
cứu, CHLB Đức đã hỗ trợ sự hợp tác này.

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÓ VIỆN TRƯỜNG

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS. Trương Nam Hải

PGS. TS. Lê Trần Bình

Đề tài hợp tác Việt - Đức
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 3 of 120.

i

Header Page 4 of 120.

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic axít

ADC

Arginindecarboxylase

APS

Ammonium persulfate

RNAse

RNA polymerase

ATP

Adenosine triphosphate

BSA

Bovine serum albumin

Bc

Bacillus cereus

bp

base pair

Bt

Bacillus thuringiensis

CaMV35S- P

Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor

cDNA

Complementary DNA

CHLB

Cộng Hoà Liên Bang

CGS

Cystathionin gamma-Synthase

cry

Crystal gene = Gen mã hoá protein tinh thể độc tố diệt côn trùng của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis

DNA

Deoxyribonucleic axít

DAO

Diaminoxidase

DNAse

DNA polymerase

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br

Ethidium Bromide

FRET

Fluorescence Resonance Energy Transfer

GC-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry

GC-TOF-MS

Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers

GCN

Guanidium thiocyanate

GUS

β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase

HSK

Homoserine kinase

HPLC

High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp

IRRI

International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

IPTG

Isopropylthio-o-D-galacuan an -kinh te -Footer Page 133 of 120.

11

Header Page 134 of 120.

Hình 3.10: Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi dùng trong phản ứng RT-PCR khi nhân những đoạn gen điều
khiển bằng RNA tách chiết từ lúa

Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR được kiểm tra bằng phép pha loãng nồng độ dung dịch RNA
khuôn mẫu. Với các loại mẫu RNA thu được từ các loại mô khác nhau đều cho thấy có mối tương
quan tỷ lệ thuận tịnh tiến trong tốc độ phản ứng (Hình 3.11).

Hình 3.11: Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái) và rễ (phải) cây mạ

Trong những nghiên cứu tiếp theo, mức độ biểu hiện của 6 gen cảm ứng rất mạnh dưới tác động
của khô hạn và muối được đánh giá. Số liệu được tính toán và xử lý bảo đảm nguyên tắc thống kê.
Sau khi xử lý mặn và áp suất thẩm thấu cao thấy có 4 trong số 6 gen chọn lựa đã tăng mức độ biểu
hiện, đồng thời phát hiện được sự xuất hiện của nhiều nhóm ABRE-Cis trong các đoạn điều khiển
(promotor) của các gen TF (Hình 3.12).

Hình 3.12: Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn trong cây lúa bằng kỹ
thuật RT-RT-PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo số liệu thu được từ ngân hàng gen cây lúa

Trên cơ sở những kết quả bước đầu, nguồn mồi được đặt ở công ty MWG sản xuất nhằm sàng
lọc một cách có hệ thống các yếu tố điều khiển.
3.2.2. Xây dựng phương pháp: Áp dụng kỹ thuật trồng lúa và xử lý hạn đối với các giống lúa Việt
Nam thuộc loài phụ Indica. Qui trình phân lập RNA từ mẫu mô cây mạ đã xử lý.
3.2.3. Xử lý hạn: Hai giống CR203 và DR2 được chọn để tiến hành xử lý hạn thông qua rút dịch nuôi
trong bình nuôi thủy canh. Bộ phận rễ, thân được thu hoạch để tách chiết RNA. Đáng lưu ý là RNA đã
bắt đầu bị phân hủy sau khi xử lý 12 giờ. Vì vậy thời gian xử lý được chọn tối ưu nhất cho nghiên cứu
này là 0 phút, 60 phút và 360 phút với điều kiện có và không có xử lý hạn. RNA sau khi phân lập được
tổng hợp thành cDNA để tiến hành đo đạc bằng RT-RT-PCR.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 134 of 120.

12


Header Page 135 of 120.

3.2.4. Xử lý muối

Hình 3.13: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi
dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu và hiệu quả nhân
các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ RNA cây mạ.
Biểu đồ phản ứng theo thời gian

Hình 3.14: Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi
dùng cho phản ứng mức độ đặc hiệu và hiệu quả nhân
các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ RNA cây mạ.
Biểu đồ tốc độ phản ứng

Hai giống Chăm và DR2 được chọn để xử lý trong hai điều kiện 0mM NaCl và 100mM NaCl theo
3 thời điểm 0 phút, 30 phút và 180 phút. Nhằm giảm thiểu sai số thí nghiệm, 30 000 hỗn hợp phản
ứng PCR được chuẩn bị một lần bằng thiết bị “Evolution P3 Pipeting Platform” (Perkin ElmerTM). Kết
quả RT-RT-PCR dưới dạng “đồ thị nhân bản” và dạng đồ thị tốc độ phản ứng được trình bày trên
Hình 3.13.
Kết quả tổng thể của thí nghiệm đánh giá hiệu quả các cặp mồi được thể hiện trên biểu đồ Hình
3.14, những cặp mồi không cho sản phẩm nhân bản gen không được tính đến, và những cặp mồi này
bị loại khỏi tập hợp các mồi dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.15: Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi
chuyên dụng dùng trong phản ứng RT-RT-PCR khi

đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển
bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn

Hình 3.16. Tần suất lặp lại của kết quả đánh giá mức
độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA tách
chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn bằng phản ứng RTRT-PCR khi đánh giá

Công thức tính toán sự biến động của mức độ biểu hiện gen được trình bày như sau:
∆Ct = Ct gen quan tâm – Ct gen house-keeping

∆∆Ct = ∆Ct condition1 − ∆Ct condition 2

(1 + E) ∆∆Ct = Lần biến đổi (Tăng/giảm)
Mức độ biến động của các thí nghiệm lặp lại giá trị biểu hiện gen của thời điểm t=0min, đối với
nồng độ NaCl là 0mM và 100mM được biểu thị dưới dạng log 2 ( FoldChange ) (Hình 3.16).
Mặt khác, để tránh tác động cơ học đối với quá trình biểu hiện gen có thể xuất hiện thông qua
thiết kế thí nghiệm, số liệu mức độ biểu hiện gen đối chứng ở nồng độ muối 0mM sau thời gian 30
phút và 180 phút được tính toán đối với cả hai giống lúa tham gia thí nghiệm. Giá trị này được ký hiệu
là: “gen cảm ứng do tiếp xúc”. Tất cả các gen có giá trị lặp lại log2(FoldChange)>1.5 đều được xếp
vào nhóm “cảm ứng do tiếp xúc”. Tổng số 788 gen được đánh giá theo cách thức này và kết quả trình

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 135 of 120.

13


Header Page 136 of 120.

bày ở Hình 3.17.

Hình 3.17: Sự phân bố tần suất gen “cảm ứng do tiếp
xúc” ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện
đối chứng không có muối vào thời điểm 30 và 180 phút

Hình 3.18: Sự phân bố tần suất gen chịu tác động cảm ứng
và ức chế bởi tác động của mặn ở các giống lúa tham gia
thí nghiệm tại điều kiện có muối (100mM) vào thời điểm 30
và 180 phút. Có những gen cảm ứng ở cả hai giống Chăm
và DR2, có những gen chỉ cảm ứng riêng đối với từng giống

Hình 3.19: Tác động của mặn (NaCl) lên độ dẫn điện của dịch bào ở cây mạ hai giống DR2 và Chàm khi bị xử lý
các thời gian khác nhau từ 0 đến 24 h

Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển (Hình 3.18) khi cây mạ bị xử lý mặn
tại hai thời điểm cho thấy với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần hoặc
kích thích hoặc ức chế thì có đến 12%, tức là 313 gen trong số 2512 gen được coi là cảm ức hoặc ức chế
do mặn .
Việc lựa chọn những gen để phân tích tiếp theo được thực hiện nhờ có các dòng “loại-gen =
knout-out = KO”. Hiện nay, trên thế giới có tất cả 4 ngân hàng các dòng KO. Đó là: (1) NIAS Tos17
đột biến ghép - insertion mutants, Nhật Bản; (2) Genoplante oryza tag lines, Pháp; (3) POSTECH
RISD, Hàn Quốc; và (4) RIFGP T-DNA, Trung Quốc. Trong 52 gen kết luận được có thể tìm thấy một
vài dòng KO trong các ngân hàng đó.
Mặt khác, việc lựa chọn những gene này nhằm tìm ra cơ chế liên quan đến những gen chịu tác động
chọn lọc riêng đối với từng gen đặc hiệu của giống có biểu hiện cảm ứng hoặc ức chế do mặn được chọn
lọc cho các nghiên cứu tiếp theo. Ngưỡng gia tăng hoạt động biểu hiện được chọn là
abs(log2(FoldChange))>3.32 và trong những trường hợp abs(log2(FoldChange))<1.5 thì được coi là
“không thay đổi”. Với tiêu chuẩn như vậy chỉ có 24 gen được xác định.
Nguyên nhân của sự sai khác giữa các giống có thể nằm trong vùng khởi động promotor nên 19
gen được chọn để thiết kế mồi cho việc nhân đoạn gen ngược đầu 5’ từ codon khởi đầu trở lên. Kết quả
đã nhân được đoạn DNA của 16 gen, trong đó có 3 mồi không cho kết quả. Hiện nay, các đoạn gen

được nhân đang được đọc trình tự.
Mức độ chịu mặn của các giống lúa được phân biệt thông qua cường độ quang hợp ngoài ra còn
được phân biệt thông qua độ dẫn điện của dịch bào. Khi đo độ dẫn điện ngay sau 24 giờ đã có thể
phân biệt được sự sai khác các giống. Tuy nhiên, số đo vào thời điểm 6 giờ lại thấp hơn điểm xuất
phát và các thời điểm trước đó (Hình 3.20), vì thế cần nghiên cứu thêm thì mới đưa ra kết luận chính
xác.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 136 of 120.

14


Header Page 137 of 120.

3.2.5. Xây dựng ngân hàng dữ liệu về tác nhân phiên mã ở lúa
Một Ngân hàng dữ liệu về các đoạn gen Tác nhân phiên mã ở cây lúa đã chính thức được xây
dựng và đưa vào hoạt động từ 01.09.2004 với địa chỉ . Trong Ngân
hàng có 2512 mô hình protein do 2261 loci mã hóa và sắp xếp thành 44 họ gen khác nhau. Tiếp theo
có thể sử dụng cùng một thuật toán để khai thác số liệu từ Ngân hàng gen của Arabidopsis và
Chlamydomonas. Từ 01.01.2005 phiên bản 3 của Genom Lúa với số gen nhiều hơn 1,2 % so với
phiên bản trước đã được mở cho sử dụng. Với phiên bản này, số lượng các gen TF của lúa sẽ được
cập nhật.
3.3. Các chất trao đổi trong rễ ở trạng thái ổn định và biến đổi khi bị xử lý stress
3.3.1. Xây dựng phương pháp nuôi trồng và chuyển gen lúa ở các giống thuộc loài phụ Indica
Bên cạnh những giống lúa nhóm Indica có 3 giống đối chứng thuộc nhóm Japonica được chọn là
Nipponbare (# 50), Taipei (# 51) và Songhua (# 53). Ngoài ra, trong mỗi lô thí nghiệm, đối chứng âm
được sử dụng là các cây mạ không bị xử lý mặn hay xử lý khô hạn.
3.3.2. Xử lý hạn:
Bốn giống lúa Việt Nam được chọn để phân tích các chất trao đổi khi bị hạn là Lốc, CR203, DR2
và C71.

3.3.3. Xử lý muối
Đối với xử lý muối, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và mỗi lần có 4 mẫu song song. Nồng độ muối
được sử dụng là 0, 50 và 100mM. Nguyên liệu sau khi thu hoạch được bảo quản ở -80°C cho đến khi
phân tích.
3.3.4. Thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ GC-TOF-MS
Ngân hàng dữ liệu về khối phổ các chất đã biết và chất chưa biết MSTs đó được lưu giữ trong
Ngân hàng có thể khai thác, trao đổi thông tin và trích dẫn khi công bố qua GMD Web-Site (Kopka et
al., 2005: />
Hình 3.20: Kho dữ liệu các phổ nhân tạo của các chất trao đổi từ cây mạ (lúa nước) xác định bằng phương pháp
GC-TOF-MS làm nguồn so sánh (bên trái) và phổ GC-TOF-MS của một mẫu đại diện (bên phải). A (xanh
dương) chất đã biết, B (đỏ chất chuẩn, C (xanh) chất thường hay xuất hiện nhưng chưa xác định, D (xám)
các chất đã biết từ các phổ GC-TOF-MS của mẫu thực vật khác

Đến nay, đối với cây mạ đã có 132 MSTs được xác định, trong đó có 109 chất thuộc các chất
trao đổi sơ cấp. Có một số chất bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học do hóa chất cần thiết
dùng cho kỹ thuật GC-MS. Tuy vậy, vẫn còn 148 MSTs của cây mạ chưa được biết đến. Chúng cũng
xuất hiện thường xuyên ở Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum, Lotus japonicus, hoặc
Lycopersicon spec. Việc tìm kiếm các chất đặc hiệu ở rễ và lá lúa được chú ý, nhưng ưu tiên hơn vẫn
là việc tìm kiếm các chất trao đổi trong rễ và lá có ý nghĩa chỉ thị đối với tính chịu mặn và chịu hạn.
Hình 3.21 trình bày thực trạng kho dữ liệu phổ các chất trao đổi được mô tả ở dạng phổ nhân tạo.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 137 of 120.

15


Header Page 138 of 120.

3.3.5. Xác định bằng khối phổ các chất chưa biết
Việc tìm kiếm các chất chỉ thị đã biết hoặc mới cần có phương pháp xác định nhanh thành phần

chất trao đổi phát hiện được trên phổ GC-TOF-MS. Phương pháp thông dụng là mua các chất chuẩn
rồi trộn vào hỗn hợp cần phân tích. Mặc dù “Kho dữ liệu phổ các chất” đã được công bố trên mạng
giúp cho việc xác định các chất thuận lợi hơn, nhưng việc tìm mua các chất trao đổi dạng tinh chế vẫn
là vấn đề khó khăn. Vì vậy, việc thiết lập phương pháp mới thông qua cách Đánh-dấu-đồng-vị-bền in
vitro có thể là giải pháp định tính có hiệu quả (Hình 3.21). Khi đó khối lượng của chất trao đổi đánh
dấu cho phép nhận biết dễ dàng hơn.

Hình 3.21: Glycine N,N-di(trimethylsilyl) -, trimethylsilyl ester được đánh dấu tại vị trí C1 và C2 với đồng vị nặng
13
C, cũng như tại vị trí C2 với hai nguyên tử Deuteri (D). Kết quả là trọng lượng phân tử của đỉnh phổ M+
+
15 , m/z 276, tăng thêm 2 amu. Ion của phân tử glycin đánh dấu M , m/z 291, theo cách đã chọn trên
không hiện rõ trong phổ vị thế chỉ cần đánh dấu sao chi phân đoạn khối phổ của phân tử đánh dấu chỉ cần
tăng 1 amu (đỏ) hoặc 2 amu (xanh), ví dụ phân đoạn m/z 174, –CH2-N(Si(CH3)2

3.3.6. Xác định và phân tích chất chỉ thị khi xử lý mặn
Hình 3.22 cho thấy polyamin trong rễ, nồng độ các polyamin đều tăng lên rõ ràng khi nồng độ
muối ở mức 50mM. Cả ba giống được xếp vào nhóm mẫn cảm với mặn gồm Nipponbare, Taipei và
Songhua, có biểu hiện khá giống nhau, trong khi đó giống IR57311 lại thể hiện sự gia tăng hàm lượng
polyamin trong rễ. Qua đó có thể chọn Nipponbare là đối chứng cho giống mẫn cảm với mặn. Các
nghiên cứu với các giống Indica có nguồn gốc từ Việt Nam đang được thực hiện.

Hình 3.22: Biến động của hàm lượng Putrescine và Spermidine trong 4 giống lúa đối chứng. Cả hai loại
Polyamin đều có biểu hiện tăng hàm lượng khi cây bị xử lý ở 50mM NaCl

Theo ( thì:
Putrescine (226002-101),
H2N

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 138 of 120.

NH2

(4 lần silyl)

16


Header Page 139 of 120.

Spermidine (226002-101).
NH

NH2

(5 lần silyl)

H2N

3.3.7. Phân tích tương quan trong xác định chất chỉ thị
Ngoài các chỉ tiêu như cường độ quang hợp, nồng độ polyamin, muốn xác định chất chỉ thị cho
tính chịu hạn hay chịu mặn rõ ràng cần có thêm các chỉ tiêu định lượng sinh lý như trọng lượng tươi,
trọng lượng khô, chiều cao cây, chiều dài rễ, khả năng đẻ nhánh.
Hoạt tính enzym, mức độ phiên mã gen chưa được sử dụng vào mục tiêu này. Hệ số mẫn cảm
được tính theo công thức sau:

⎛ X ⎞ ⎛ R
SI = ⎜⎜1 − k ⎟⎟ × ⎜⎜1 − k
Xt ⎠ ⎝
Rt

⎝

⎞
⎟⎟
⎠

−1

Trong đó:
-

Xk số đo của giống nghiên cứu ở điều kiện đối chứng;

-

Xt số đo của giống nghiên cứu ở điều kiện xử lý thí nghiệm;

-

R giá trị trung bình của tất cả các giống tham gia thí nghiệm (SIa) hoặc R giá trị của giống đối
chứng, trong trường hợp cụ thể này là Nipponbare (SIb).

Với cách tính trên số liệu đo đạc về trọng lượng có thể được đưa vào tính hệ số mẫn cảm. Kết
quả đo đạc và tính toán được kiểm chứng quan phép đo PAM.
Đo năng suất quang hợp của hệ thống quang hoá II đo bằng máy PAM-2000 flurometer, WALZ,
CHLB Đức cho thấy không có sự sai khác giữa các giống xử lý hạn trong khoảng thời gian từ 2-7
ngày tưới phục hồi. Sau 14 ngày tưới nước phục hồi, năng suất quang hợp ở giống số 20, 53 giảm
trong khi đối với các giống khác không có sự thay đổi rõ rệt (Hình 3.23).

Hình 3.23. Sự thay đổi về năng suất quang hợp của hệ thống quang hoá II. Giống 1-19: Chống chịu; 13-31:

Chống chịu trung bình; 2-50: Mẫn cảm

Mặc dù sự phát triển của các giống bị xử lý hạn bị giảm biểu hiện trong giai đoạn đầu xử lý và
cuối xử lý nhưng ở kết quả thí nghiệm này không thấy có sự liên quan giữa tính chống chịu hạn và
hiệu suất quang hợp hệ thống quang hoá II. Do vậy, thí nghiệm xử lý hạn khắc nghiệt được thiết kế
để khẳng định mức độ chống chịu của các giống và mối tương quan giữa khả năng chống chịu với
hàm lượng huỳnh quang diệp lục. Xử lý hạn khắc nghiệt được thực hiện bằng cách rút nước để hạn
trong 9 ngày cho tới khi tất cả các cây chết. Kết quả cho thấy, một số giống có cùng mức chống chịu
(màu đen), một số giống có mức độ biểu hiện chống chịu khác nhau (màu đỏ) (Bảng 3.3).
Trong điều kiện xử lý hạn khắc nghiệt, hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II giảm
đáng kể. Ở ngày thứ 6 trong quá trình rút nước để hạn, hiệu suất quang hợp ở giống mẫn cảm giảm
trung bình 2 lần trong khi đối với các giống chống chịu và giống chống chịu trung bình giảm trung bình
1,2 lần so với đối chứng. Ở ngày thứ 7 trong quá trình xử lý hạn, các giống mẫn cảm bị chết, các
giống kháng sống cho đến ngày thứ 8 với hiệu suất quang hợp giảm mạnh từ 0,35 (ngày xử lý thứ 7)

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 139 of 120.

17


Header Page 140 of 120.

xuống 0,11 (ngày xử lý thứ 8). Trong điều kiện xử lý hạn khắc nghiệt, hiệu suất quang hợp của hệ
thống quang hoá II giảm mạnh ở các giống mẫn cảm so với các giống kháng (Hình 3.24).
Bảng 3.3. Kết quả xử lý hạn nhẹ kéo dài và xử lý hạn khắc nghiệt
Kháng
Trung bình
Mẫn cảm
Giống Chỉ số
Giống Chỉ số

Giống Chỉ số
1
265
31
343
2
408
15
265
14
344
30
414
18
285
5
348
3
428
52
296
51
380
17
430
4
298
22
383
16

459
29
324
20
387
53
465
19
339
13
388
50
507
Xử lý nhẹ thời gian 14 ngày

Kháng
Giống Chỉ số
29
12,6
1
13,2
18
13,2
20
22,6
50
24,4
52
29,2
4

30

Trung bình
Mẫn cảm
Giống Chỉ số
Giống Chỉ số
53
31,6
13
49,2
51
34
31
49,2
15
36
19
58,4
16
41,2
2
60
30
41,6
3
62
22
43,6
14
62

5
46,8
17
70
Xử lý khắc nhiệt

Để định lượng mối tương quan giữa mức độ chịu hạn và hiệu suất quang hợp của hệ thống
quang hoá II, 9 giống có mức độ chịu hạn khác nhau được chọn nghiên cứu so sánh ( giống số 18,
50, 52: Chống chịu; 15, 16, 22: Chống chịu trung bình; 13, 2, 14: Mẫn cảm) (Hình 3.25).

Hình 3.24: Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ
thống quang hoá II ở các giống tại các ngày 0, 4, 5, 6,
7, 8 rút nước để hạn

Hình 3.25: Kết quả đo hiệu suất quang hợp (PAM) đối với
mảnh lá của các giống lúa có mức độ chịu muối khác nhau
theo thời gian xử lý tăng dần nồng độ NaCl

3.3.8. Đề xuất bổ sung
Xây dựng hệ thống chuẩn bị – phân tích mẫu tự động để xử lý hàng loạt số lượng lớn mẫu rễ và
lá mạ theo nguyên lý “in-line”- GC-TOF-MS.
3.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
3.4.1. Chuyển gen tăng cường khả năng chịu hạn và mặn
Nhằm tăng cường khả năng chịu hạn và mặn, các gen nhaA được dùng để chuyển vào giống lúa
C71 và gen OAT được chuyển vào giống lúa DR2 theo qui trình đã trình bày ở phần trên.
Bảng 3.4: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa chuyển gen nhaA
Số mô sẹo
Số mô sẹo sống sau
Số mô sẹo
xử lý

chọn lọc / số mô sẹo
TN
tái sinh
nhiễm
chọn lọc
khuẩn
1
500
115/ 500 (23%)
55 cụm cây
2
500
162/ 500 (32%)
tái sinh
3
500
142/ 500 (28%)

Số cây
con

Số cây sống sau thử trên
môi trường Hygromycin
[50mg/l]/ Tổng số cây

1934

100/ 1934 (5%)

Phản ứng PCR được dùng để sàng lọc các dòng cây chuyển gen. Đối với các dòng cây chuyển

gen nhaA ở giống lúa C71 kết quả thu được 11 dòng cây dương tính 32.3, 1.12, 1.2, 19.1, 33.3, 1.10,
40.1, 6.6, 33.2, 6.16, 32.4. Đối với gen OAT đã thu được 3 dòng cây dương tính trên giống lúa DR2:
16.3, 35.1, 12.1. Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA được trình bày ở Bảng
3.4.
Các kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của giống lúa đã được chuyển gen OAT, nhaA, đã cho
thấy: các dòng nhaA19.1, OAT12.1 là các dòng có khả năng chịu hạn tốt. Sau khi trồng, đã thu được
hạt chuyển gen OAT, nhaA ở thế hệ T1 của các dòng cây dương tính.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 140 of 120.

18


Header Page 141 of 120.

Hình 3.26: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA (A. Tạo mô sẹo ở giống lúa C71; B. Mô
sẹo trên môi trường chọn lọc; C. Chọn lọc mô sẹo; D. Cây chuyển gen nhaA tái sinh trên môi trường chọn
lọc)

Hình 3.27: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen OAT bằng PCR (M: Thang DNA chuẩn, 1 đối chứng dương, 6 dòng
cây mang gen OAT dương tính)

3.4.2. Chuyển gen cải thiện thành phần axít amin trong lúa gạo
* Chuyển gen: Các gen chuyển: SAT - Serine acetyltransferase, HSK - Homoserine kinase biểu
hiện trong tế bào chất và plastid (transide peptide), CGS - Cystathionine gamma synthase,
pCAMBIA1390 - Empty vector. Sơ đồ vector mang gen cần chuyển được mô tả ở Hình 3.28.

Hình 3.28: Sơ đồ vector chuyển gen pCAMBIA1390/Ubiquitin/SAT/HSK/CGS

Việc thiết lập hệ thống chuyển gen thực hiện và hoàn thiện dựa trên những qui trình đã được

nghiên cứu trước. Điều khác biệt của hệ thống này là sử dụng hạt lúa khô, trong khi đó các qui trình
khác đều dùng phôi non, rất khó chủ động vì cần rất nhiều diện tích trồng cây.
Bốn gen được chuyển vào lúa để thay đổi thành phần và hàm lượng axít amin trong gạo là:
Cystathionin gamma-Synthase, Serinacetyltransferase, Homoserinkinase (plastids), Homoserinkinase
(cytosolisch).
Tất cả các gen chịu sự điều khiển của promotor Gene Ubiquitin. Đối chứng âm là vector không
mang gen nghiên cứu và cấu trúc chứa GUS:
-

pCAMBIA1390 rỗng

-

Ubiquitin-GUS (GUS = Glucoronidase).

Hiện đã thu được 15 dòng cây chuyển gen Cystathionin gamma-Synthase: 4.6, 7.5, 14.6, 6.6,
5.1, 28.2, 6.10, 6.21, 30.1, 13.7, 13.6, 1.11, 32.3, 31.3, 16.1. Các dòng cây đang được trồng, theo dõi
sự hoạt động của gen này trong phytotron. Hạt giống thế hệ T1 sẽ được thu từ những cây trồng trong
phytotron và những dòng cây T0 vẫn được duy trì trong ống nghiệm.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 141 of 120.

19


Header Page 142 of 120.

Hình 3.29: Qui trình chuyển gen vào lúa giống Tapei: (Trên) Sơ đồ chuyển gen trên cơ sở sử dụng hạt lúa chín.
(Dưới) Hình ảnh một số bước chuyển gen A) Tạo mô sẹo (15 ngày); B) Nhiễm khuẩn vào mô sẹo; C) Biểu
hiện gen GUS sau chuyển gen; D) Chọn dòng trên môi trường có Hygromycin; E) Tái sinh cây trên môi

trường chứa 50mg/l Hygromycin

Các cấu trúc mang gen SAT và SSUHSK (Serinacetyltransferase; Homoserinkinase, plastid) đang
trong giai đoạn tái sinh cây. Các dòng chuyển gen Homoserinkinase (cytosolisch) cũng chuẩn bị được
chuyển sang môi trường tái sinh. Bảng 3.5. trình bày tiến độ các thí nghiệm chuyển gen.
Bảng 3.5: Tiến độ chuyển các gen cải thiện chất lượng axít amin gồm Cystathionin gamma-Synthase (CGS),
Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase (plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) và
Glucoronidase (GUS) vào cây lúa
Số mô sẹo
Số Mô sẹo chọn
Số chồi tái
Số dòng cây PCR
TN
Gen
được chọn
được
sinh
dương tính
1
CGS
350
140
42
15
2
SAT
232
198
3
SSUHSK

217
170
4
HSK
191
151
5
Vector rỗng
195
144
6
GUS
Trong số 453 nhuộm X-Glux có 367 mô sẹo dương tính GUS

Phản ứng PCR được thực hiện để sàng lọc cây chuyển gen với các cặp mồi đặc hiệu. Kết quả
thu được các dòng chuyển gen CGS (dương tính bằng PCR) (Hình 3.32).

Hình 3.30: Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen CGS được chuyển. 1: Marker;
2 và 5: đối chứng dương plasmid chứa CGS; 3 và 4: các dòng chuyển gen

Phân tích các dòng cây chuyển gen:
Phân tích hoạt tính enzyme Cystathionine γ synthase
Hoạt tính của enzyme cystathionine γ synthase được xác định dựa trên sự tạo thành cystathionine
từ hai cơ chất là O-phospho-L-homoserine và L-cysteine ở điều kiện 30oC trong vòng 1 giờ.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 142 of 120.

20

Header Page 143 of 120.

L-cystathionine tạo ra sau phản ứng sẽ được xác định bằng sắc kí lỏng cao áp (Reverse Phase
HPLC)
Phân tích hoạt tính enzyme Serine acetyltransferase
Hoạt tính của Serine acetyltransferase được xác định dựa trên sự tiêu thụ acetyl Coenzyme A ở
bước sóng 232nm. Theo phản ứng sau:

Hoặc cũng có thể xác định bằng việc đo sự tạo thành của thionitrobenzoic qua phản ứng trao đổi
cầu sulfur giữa Coenzyme A tạo ra sau phản ứng được xúc tác bởi serine acetyltransferase và 5,5´dithio-bis-(2-nitro-benzoic axit).

Phân tích thành phần axit amin tự do trong lá lúa: Thành phần axit amin tự do trong lá lúa được
xác định dựa trên sự phản ứng của axit amin với O-Phthaldialdehyd ở nhiệt độ thường. Sản phẩm của
phản ứng được xác định bằng sắc kí lỏng cao áp (RP HPLC).
O

S R1
H
H

+

H2N R1

+

HS R2

1 min; RT

+

N R2

2 H2O

O

mV
25

Emission:450
nm

2

20

3
1

15

14

10

16

13

5

6

5

78 9

17
18
20
19 21

15
10

4

11

22
23

12

0
0,

5,

10,

15,

20,

25,

30,

35,

Hình 3.31: Phổ các 23 axit amin chuẩn xác định bằng RP HPLC

40,

45,

50,

55,

60,

min

Phân tích thành phần các chất mang nhóm thiols trong lá lúa
Việc phân tích các hợp chất chứa nhóm thiols như cysteine, glutahione (GSH), homocysteine và γGlutamylcysteine dựa trên phản ứng của các hợp chất này với Monobrombiman (mBrB; 3-Bromomethyl-5ethyl-2,6-dimethyl-pyrazolo[1,2-ỏ]pyrazol-1,7-dion). Sản phẩm tạo thành được xác định bằng sắc kí lỏng
cao áp (RP HPLC).

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 143 of 120.

21


Header Page 144 of 120.

O

O

O

O
N

+

N

HS R

15 min; RT

N

Dunkelheit

N

+
S

Br

HBr

R

Hình 3.32: Phổ các hợp chất thiols chuẩn xác định bằng RP HPLC (1=Cystein, 2=γ-Glutamylcystein (γ-EC),
3=Glutathion, 4=Homocystein)

Phân tích sự biểu hiện của các gen trong chu trình trao đổi chất methionine ở các dòng cây
chuyển gen: Sự biểu hiện của các gen (endogenous genes) trong chu trình trao đổi chất methionine ở
các dòng cây chuyển gen ở mức độ sao mã (transcript level) được xác định bằng phản ứng RT-RTPCR (Real Time Reverse Transcriptase PCR). Chu trình trao đổi chất methionine và các gen tham gia
được minh hoạ ở Hình 3.33.

SO42- Serine Aspartate

SO42-

SAT

S2-

OAS Homoserine

OPHS

Cysteine

CγS

Cystathionine

Lysine
Chloroplast

TS

Threonine

CBL

Homocysteine

SAM
SAMS

Methionine

MS

Homocysteine

Isoleucine

Cytosol

Hình 3.33: Chu trình trao đổi chất methionine và các
gen tham gia

Hình 3.34: Các mẫu RNA tổng số sau khi xử lý
DNAse, không nhận được sự khuếch đại nào sau 35
chu kì phản ứng

RNA tổng số từ lá lúa, sau khi xử lý DNAse để loại bỏ genomic DNA (Hình 3.34) và các mẫu này
tiếp theo sẽ được kiểm tra sự nhiễm genomic DNA bằng phản ứng RT-RT-PCR với các đoạn mồi
được thiết kế để khuếch đại các đoạn intron, dùng 1 mẫu genomic DNA làm đối chứng dương. Nếu
không có sự nhiễm genomic DNA, các mẫu này được dùng cho phản ứng tổng hợp cDNA bằng việc
dùng SuperScript III Reverse Transcriptase của hãng Invitrogen.
Sự biểu hiện của các gen ở mức độ sao mã (transcriptional level) sẽ được xác định bằng giá trị
2∆Ct trong đó ∆Ct = Ct gen quan tâm – Ct gen house-keeping. Gen house-keeping được dùng trong trường hợp
này Actin-1 (LOC_Os01g73310).
Xây dựng phương pháp phân tích hàm lượng axit amin tổng số từ hạt của một số giống lúa Việt
Nam: Hạt lúa chín từ 9 giống lúa P1, P4, P6, IR64, TAB1, TAB2, TDH1, TDH2, C71 được bóc vỏ, sau
đó nghiền trong thành dạng bột mịn. Cân ~0,5mg bột vào các ống thuỷ tinh phân tích. Sau đó tiến
hành phản ứng thuỷ phân bằng lò hệ thống lò vi sóng. Thành phần axit amin từ các mẫu thủy phân sẽ
được phân tích trên hệ thống sắc kí.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 144 of 120.

22


Header Page 145 of 120.

Bảng 3.6: Điều kiện thuỷ phân protein bằng lò vi sóng MAR5
Điện thế
Thời gian

Nhiệt độ

Duy trì

Bước 1

600W

100%

5´

150

0´

Bước 2

600W

100%

0

150

30´

Xử lý số liệu: Phổ sắc kí axit amin, các hợp chất mang nhóm thiols được phân tích thông qua
chương trình Chromeleon version 6.60 (www.dionex.com). Các số liệu phân tích được xử lý bằng

chương trình Microsoft Excel 2003 (www.microsoft.com). Các đoạn mồi dùng cho các phản ứng PCR
và Real Time RT-PCR được thiết kế bằng chương trình Primer Express version 2.0
(www.AppliedBiosystems.com).
Xác định thành phần axít amin của lúa gạo: Để xác định thành phần axít amin của lúa gạo,
phương pháp thủy phân protein gạo bằng vi sóng được sử dụng. Trước tiên, mẫu chuẩn là BSA được
dùng thử. Kết quả thủy phân BSA được trình bày ở Hình 3.38.

Hình 3.35: Thành phần axít amin của protein chuẩn BSA và của protein gạo toàn phần A) So sánh thành phần
axít amin của BSA xác định được bằng phương pháp thủy phân vi sóng và số liệu công bố trong tài liệu
(biểu đồ màu xanh), B) Protein tổng số của gạo so sánh với số liệu công bố có trước

Nội dung tối ưu hóa gồm hiệu quả thủy phân, phản ứng tạo dẫn xuất của các axít amin bằng
OPA và cuối cùng là xác định bằng HPLC. BSA là protein biết trước thành phần axít amin nên dùng
làm chuẩn rất thích hợp cho việc xây dựng kỹ thuật cải tiến. Phần B trên Hình 3.35 trình bày thành
phần axít amin của protein tổng số của gạo sau khi thủy phân bằng vi sóng. Kết quả tách chiết protein
gạo được trình bày ở Hình 3.36.

Hình 3.36: Kết quả chiết rút protein gạo bằng các dịch đệm khác nhau và phân tích trên điện di PAGE (trái) và
định lượng bằng Bradford (phải). Lượng protein tính bằng µg/ 1mg gạo

Để đảm bảo độ tin cậy của phương pháp mới, kết quả được so sánh với số liệu đã được các tác
giả khác công bố. Có hai vấn đề còn cần hoàn thiện:

-

Protein lúa gạo có tỷ lệ tái xác định được thấp hơn so với protein tinh khiết.

-

Các axít amin như Cystein và Tryptophan không thể định lượng được một cách ổn định bằng

phương pháp đã có.

Vấn đề thứ nhất có thể được lý giải: Do hạt gạo chứa nhiều tinh bột có tác động không tốt lên
hiệu quả thủy phân và làm cho kết quả xấu hơn. Hình 3.36 cho thấy kết quả tách chiết protein của gạo

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 145 of 120.

23


Header Page 146 of 120.

với các dịch đệm khác nhau (trái: SDS Gel, phải: định lượng bằng Bradford). Mục đích tách chiết là
loại bớt tác động xấu của protein trong khi thủy phân.
Vấn đề thứ hai là cần cải tiến qui trình để có thể định lượng Methionin, Cystein và Tryptophan.
Trong đó, cần lưu ý ôxy hóa các axít amin.
3.4.3. Đề xuất bổ sung
Để có thể cân chính xác được một lượng protein ở phạm vi µg cần phải có thiết bị cân siêu-vilượng đặt trên một chiếc bàn-giảm-rung, giá thiết bị cân này là 16.000 €. Ngoài ra, để tăng cường tốc
độ phân tích mẫu một thiết bị HPLC với giá 60.000 € cần được mua thêm.
* Chuyển gen vào cây lúa nhằm gia tăng hàm lượng polyamin
Một số dòng phân tử cDNA của RIKEN Resource Center, Nhật Bản mã hóa cho các enzym chính
trong chu trình sinh tổng hợp và phân giải polyamin bao gồm:
(1) Arginindecarboxylase – ADC,
(2) S-Adenosylmethionin-decarboxylase - SAMDC,
(3) Spermidinsynthase – SPD)
(4) Diaminoxidase – DAO,
(5) Polyaminoxidase – PAO) có nguồn gốc Arabidopsis thaliana.
Những gen này sẽ được chuyển vào vector pCAMBIA1390-UbiII (Ubiquitin-Promotor) để chuyển
vào cây lúa.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 146 of 120.

24


Header Page 147 of 120.

CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC
Trong thời gian từ năm 2002 đến 2005, đề tài Hợp tác nghiên cứu khoa học với CHLB Đức đã
thu được kết quả sau:
4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC

1.

Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân và lưu giữ tại Viện
Công nghệ sinh học.

2.

Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa phù hợp
với điều kiện ở Việt Nam. Kết quả xử lý mặn thu được 5 giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển,
IR57311, Cườm và Nước mặn), 7 giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp
mặn, Đốc phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei và
Nipponbare). Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh,
IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa
mặn, Lốc dâu, K.lua nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom,
Songhua, Nipponbare).

3.

Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm lượng polyamin, (ii) Các
giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả
năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần. Hoạt động
của enzym Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt. Thí nghiệm
chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được tiến hành.

4.

Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp thủy phân protein
tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp với việc tách chiết bằng các hệ dịch
đệm khác nhau cho phép hình thành một hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân
bằng vi sóng, tạo dẫn xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít
amin trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo.

5.

Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa. Thông qua việc tra cứu và thu thập
thông tin về gen hiện nay một Ngân hàng dữ liệu về các đoạn gen Tác nhân phiên mã ở cây lúa
đã chính thức được thành lập và đưa vào hoạt động từ 01.09.2004 với địa chỉ
. với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa và xắp xếp thành 44 họ
gen khác nhau.

6.

Thông qua việc thiết kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh
giá được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn tại hai thời điểm.
Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần
hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313
gen trong số 2512 gen được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn.

7.

Trong số đó có 19 gen được chọn để thiết kế mồi cho việc nhân đoạn gen ngược đầu 5’ từ bộ ba
khởi đầu trở lên. Kết quả đã nhân được đoạn DNA của 16 gen, trong đó có 3 mồi không cho kết
quả. Hiện nay, các đoạn gen được nhân đang được đọc trình tự. Bước đầu đã xác định 6 gen
cảm ứng mạnh dưới tác động của khô hạn và muối (Alfin-like-5, Alfin-like-28, AP2-EREBP-43,
ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11).

8.

Đã thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ GC-TOF-MS. Ngân
hàng dữ liệu về khối phổ các chất đã biết và chất chưa biết MSTs đó được lưu giữ trong Ngân
hàng có thể khai thác, trao đổi thông tin và trích dẫn khi công bố qua GMD Web-Site
Tiến hành phân tích phổ GC-TOF-MS trên cây mạ đã
có 132 MSTs được xác định, trong đó có 109 chất thuộc các chất trao đổi sơ cấp. Có một số chất
bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học do hóa chất cần thiết dùng cho kỹ thuật GC-MS.
Tuy vậy, vẫn còn 148 MSTs của cây mạ chưa được biết đến. Chúng cũng xuất hiện thường
xuyên ở Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum, Lotus japonicus, hoặc Lycopersicon spec. Việc
tìm kiếm các chất đặc hiệu ở rễ và lá lúa được chú ý, nhưng ưu tiên hơn vẫn là việc tìm kiếm các

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 147 of 120.

25


Header Page 148 of 120.

chất trao đổi trong rễ và lá có ý nghĩa chỉ thị đối với tính chịu mặn và chịu hạn.

9.

Đã xây dựng và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu
ban đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập.

10. Bước

đầu thu được 15 dòng cây chuyển gen CGS, các dòng cây này đang trồng, theo dõi sự
hoạt động của gen này trong phytotron. Hạt giống thế hệ T1 sẽ được thu từ những cây trồng trong
phytotron và tiếp tục các nghiên cứu khác. Các gen khác như Serinacetyltransferase,
Homoserinkinase (plastid) và Homoserinkinase (cytosolic) đang được hoàn thiện để chuyển gen
nhằm cải thiện thành phần axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam.

11. Đối với các dòng cây chuyển gen nhaA ở giống lúa C71 kết quả thu được 11 dòng cây dương
tính. Đối với gen OAT đã thu được 3 dòng cây dương tính trên giống lúa DR2.

4.2. KẾT QUẢ NỔI BẬT VÀ KHẢ NĂNG ÁP DỤNG
Bảng 4.1: Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 2002 - 2005
TT
1
2

3

Tên sản phẩm
Qui trình đánh giá tính chịu
mặn, hạn ở lúa
Qui trình chuyển gen vào mô
sẹo hạt lúa chín thông qua vi
khuẩn
Agrobacterium

tumefaciens
Qui trình qui phạm đánh giá,
phân tích cây chuyển gen
trong phòng thí nghiệm và nhà
lưới an toàn

Số
lượng
02

Chỉ tiêu kinh tế
- kỹ thuật
Đạt tiêu chuẩn
của IRRI

Kết quả đạt được
Áp dụng có hiệu quả cao đối với các
giống lúa và điều kiện ở Việt Nam

01

Hiệu
quả
chuyển gen đạt
5-10%

Trình độ tiên tiến có thể triển khai tại
các phòng thí nghiệm trong nước

01

Đảm bảo độ
chính xác và an
toàn sinh học

Trên cây lúa và các cây nông nghiệp
khác

Cấu trúc phù
hợp để chuyển
vào các giống
lúa ở Việt Nam
Sử dụng để
chuyển gen vào
lúa hiệu quả
Sử dụng để
chuyển gen vào
lúa
Có gen nhaA và
gen OAT trong
cây

Sử dụng được để thiết kế các gen chịu
hạn và mặn, tăng cường PA

5

Phân lập và thiết kế gen

03

6

Gen tăng cường tính chịu hạn
(OAT) và mặn (nhaA) ở lúa

02

7

Gen tăng cường hàm lượng
axít
amin
Cystathionine
gamma synthase (CGS)

01

8

Các dòng lúa chuyển gen
nhaA và OAT

14

9

Xác định các chất trong phổ
trao đổi chất bằng GC/MS

132

Đảm bảo độ
chính xác cao

01

Dữ liệu để cung
cấp cho các
nghiên cứu tiếp
theo

Sử dụng để sàng lọc các đoạn gen
quan tâm

2512

Có độ chính xác
cao

Trong 2512 vi bản gồm 44 họ gen, đã
xác định 6 gen cảm ứng rất mạnh dưới
tác động của khô hạn và muối

10

Thư viện cDNA ở lúa

11

Ngân hàng dữ liệu về các gen
điều khiển phiên mã (TF)

Đã được sử dụng chuyển gen thành
công vào mô sẹo hạt lúa chín
Đã được sử dụng chuyển gen thành
công vào mô sẹo hạt lúa chín
Thế hệ R0 và có biểu hiện PCR dương
tính thế hệ R1 (11 dòng mang gen
nhaA, 3 dòng mang gen OAT)
Sử dụng để tìm kiếm các chất trao đổi
làm chỉ thị đối với tính chịu mặn và chịu
hạn

Đề tài đã hoàn thành tốt các hạng mục công việc như đã ký trong thuyết minh đề tài như sau:
1. Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân và lưu giữa tại
Viện Công nghệ sinh học
2. Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa phù
hợp với điều kiện ở Việt Nam.
3. Đã xây dựng và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật
liệu ban đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập.
4. Đã xây dựng được qui trình qui phạm đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm và

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 148 of 120.

26


Header Page 149 of 120.

nhà kính an toàn sinh học.
5. Thiết kế được các gen nâng cao tính chịu hạn, mặn và gen nâng cao hàm lượng axít amin
CGS để chuyển vào cây lúa.
6. Đã thu được 11 dòng cây mang gen nhaA, 3 dòng cây mang gen OAT và 15 dòng cây mang
gen CGS.
7. Đã tạo được thư viện cDNA ở lúa từ các giống lúa xử lý mặn và hạn sử dụng để sàng lọc các
đoạn gen quan tâm.
8. Bước đầu đã xác định 6 gen cảm ứng mạnh dưới tác động của khô hạn và muối (Alfin-like-5,
Alfin-like-28, AP2-EREBP-43, ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11) trong Ngân hàng dữ liệu
về các gen điều khiển phiên mã (TF) bao gồm 2512 vi bản mang 44 họ gen.

4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ
-

Lần đầu tiên trong lĩnh vực công nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên đối tác đều muốn
tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế giới về Giải mã genom cây lúa nước.

-

Sử dụng các trang thiết bị hiện đại, các kỹ thuật tiên tiến có độ tin cây cao để đánh giá giá khả
năng chịu hạn và mặn ở cây lúa, các phương pháp hiện đại để xác định các chất trong phổ
trao đổi chất bằng GC/MS và xây dựng thư viện cDNA để phục vụ nghiên cứu, tìm kiếm các
chỉ thị liên quan đến tính chống chịu, sàng lọc các gen nâng cao hàm lượng axít amin. Đây là
cơ sở tốt để tạo tiền đề cho hướng nghiên cứu mới về nâng cao tính chống chịu và tăng
cường chất lượng ở giống cây trồng.

-

Trình độ công nghệ về thiết kế gen và chuyển gen vào cây lúa đạt trình độ tương đương quốc tế.

-

Các kết quả nghiên cứu mà đề tài thu được chứng tỏ trình độ của các cán bộ khoa học nước
ta trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại tương đương với các nước trong khu vực và thế
giới. Các kết quả thu được có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao trong việc nghiên cứu tính
chống chịu và cải tiến chất lượng giống cây trồng bằng công nghệ sinh học thực vật.

4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG
Bảng 4.2: Khả năng áp dụng của đề tài
Tên tiến bộ kỹ
Cơ quan tạo ra
TT
thuật
1

2

3

Qui trình đánh giá
tính chịu mặn, hạn ở
cây lúa
Qui trình chuyển
gen vào mô sẹo hạt
lúa chín thông qua vi
khuẩn
Agrobacterium
tumefaciens
Qui trình qui phạm
đánh giá, phân tích

cây chuyển gen
trong phòng thí
nghiệm và nhà lưới
an toàn

Nơi được chuyển
giao

Hiệu quả kinh tế

Viện Công nghệ
sinh học

Viện Max Planck –
CHLB Đức, Các
phòng thí nghiệm
quan tâm

Phân loại và
đánh giá nhanh
các dòng - giống
lúa có khả năng
chịu hạn và mặn

Viện Công nghệ
sinh học

Viện Max Planck –
CHLB Đức, Các
phòng thí nghiệm

quan tâm

Tạo giống cây
trồng chuyển gen

Viện Công nghệ
sinh học

Các phòng thí
nghiệm và cơ quan
tạo giống và thử
nghiệm cây trồng
chuyển gen

An toàn và có độ
chính xác cao

4

Sưu tập trình tự các
gen OAT, nhaA và
CGS

Viện Công nghệ
sinh học và Viện
Max Planck –
CHLB Đức

Các phòng thí
nghiệm quan tâm

5

Gen tăng cường
tính chịu hạn (OAT)
và mặn (nhaA) ở lúa

Viện Công nghệ
sinh học

Các phòng thí
nghiệm quan tâm

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 149 of 120.

Sử dụng thiết kế
gen cho phù hợp
để chuyển vào
cây trồng khác
ngoài cây lúa
Tăng cường tính
chịu hạn và mặn
ở giống cây trồng

Pháp lý cho
việc áp dụng
Sẽ đăng ký
quyền tác giả

Sẽ đăng ký

quyền tác giả

27


Header Page 150 of 120.

Các dòng lúa
chuyển gen nhaA và
OAT

Viện Công nghệ
sinh học

Các cơ quan tạo
giống cây trồng

Gen tăng cường
hàm lượng axít amin
Cystathionine
gamma synthase
(CGS)

Viện Max Planck –
CHLB Đức và Viện
Công nghệ sinh
học

Viện Công nghệ
Sinh học

Ngân hàng dữ liệu
về các gen điều
khiển phiên mã (TF)

Viện Max Planck –
CHLB Đức và Viện
Công nghệ sinh
học

Các phòng thí
nghiệm quan tâm

Tạo giống lúa
chịu mặn và hạn
Nâng cao hàm
lượng axít amin
Cystathionine
gamma synthase
(CGS) ở các
giống lúa Việt
Nam
Tìm kiếm nhanh
và sử dụng các
gen điều khiển
phiên mã

Sẽ đăng ký
quyền tác giả
Hợp tác nghị

định thư trong
khuôn khổ của
đề tài này
Hợp tác nghị
định thư trong
khuôn khổ của
đề tài này

4.5. ĐÀO TẠO
Bảng 4.3: Danh sách các học viên được đao tạo
TT

Năm

1

20032007

Nguyễn Hữu Cường

2

20042008

Đỗ Thị Phúc

3
4
5

20022006
20042007
20032004

Họ và tên

Lê Xuân Đắc

Nghiên cứu tăng cường hàm lượng axít amins
nhóm sulfur ở cây lúa Oryza sativa L.
Cải tiến chất lượng giống lúa liên quan đến kháng các
điều kiện stress của môi trường: Vai trò của polyamine
trong việc chịu mặn và hạn
Nghiên cứu chọn tạo giống giống lúa chất lượng
cao bằng công nghệ sinh học

Tiến sỹ
Tiến sỹ
Tiến sỹ

Nguyễn Phương Thảo

Nghiên cứu về proteomic ở cây lúa chuyển gen

Tiến sỹ

Nguyễn Hải Yến

Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen ở lúa

Cao học

Bảng 4.4: Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ
Thời gian
Họ và tên
Nội dung đào tạo
TT
đào tạo
Sử dụng phần mềm BLAST khai
thác Ngân hàng dữ liệu về các gen
4/20031
Lê Xuân Đắc
5/2003
điều khiển phiên mã (TF)

Cơ quan
Viện Max Planck –
CHLB Đức

Nguyễn Hồng Châu

Sử dụng các thiết bị để phân tích
phổ trao đổi chất bằng GC/MS và
xây dựng thư viện cDNA

Viện Max Planck –
CHLB Đức

2002, 2003,
2004

Lê Trần Bình

Trao đổi hợp tác nghiên cứu khoa
học và đào tạo

Viện Max Planck, Đại
học tổng hợp
Greifswald - CHLB
Đức

22/11/2005

Các cán bộ nghiên cứu
khoa học thuộc Viện
CNSH, Viện KHNN Việt
Nam, Viện DTNN... (35
người)

Bài giảng tập huấn về chuyển gen
nâng cao hàm lượng axít amin và
Quá trình đồng hóa sulfur ở thực
vật

TS. Reiner Hoefgen
và TS. Hesse Holger
Viện Max Planck –
CHLB Đức

2

4/20035/2003

3

4

Bậc đào
tạo

Tên Luận văn, luận án

4.6. SẢN PHẨM KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1. Bộ sưu tập các giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân và lưu giữa tại
Viện Công nghệ sinh học: 68 giống
2. Qui trình đánh giá tính chịu mặn, hạn ở cây lúa: 02 qui trình
3. Qui trình chuyển gen vào mô sẹo hạt lúa chín thông qua vi khuẩn A.tumefaciens: 01
4. Qui trình qui phạm đánh giá, phân tích cây chuyển gen trong PTN và nhà lưới an toàn: 01
5. Trình tự và các gen OAT, nhaA và CGS: 3 trình tự và 3 gen

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 150 of 120.

28


Header Page 151 of 120.

6. Các dòng lúa chuyển gen nhaA, OAT và CGS: 27 dòng (11 dòng mang gen nhaA, 3 dòng
mang gen OAT và 15 dòng mang gen CGS)
7. Thư viện cDNA ở lúa: 01 thư viện sử dụng để sàng lọc các đoạn gen quan tâm

8. Ngân hàng dữ liệu về các gen điều khiển phiên mã (TF): tại địa chỉ . với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa và xắp xếp thành 44 họ gen khác nhau
9. Ngân hàng dữ liệu về khối phổ các chất đã biết và chất chưa biết MSTs đó được lưu giữ
trong Ngân hàng có thể khai thác, trao đổi thông tin và trích dẫn khi công bố qua GMD WebSite />10. Đào tạo: 01 cao học, 4 nghiên cứu sinh
11. Đào tạo nâng cao: 2 cán bộ tại viện Max Planck - CHLB Đức
12. Lớp tập huấn: 01 lớp cho 35 cán bộ khoa học
13. 13. Bài báo khoa học: 7 bài đăng tạp chí trong nước, 4 bài đăng tạp chí nước ngoài và 2
Poster trình bày hội nghị Quốc tế.

4.7. HỢP TÁC QUỐC TẾ
Bảng 4.5: Nội dung hợp tác quốc tế
TT
1
2
3
4
5

Cơ quan phối hợp
Đại học Tổng hợp Greifswald
Viện Max Planck về Sinh lý thực vật
phân tử
EU (Bỉ, Tây Ban Nha, Pháp, Trung
Quốc)
Đại học tổng hợp Nagoya Nhật Bản
Viện Nông lâm nghiệp - Đại học Tổng
hợp Tshukuba - Nhật Bản

Nội dung phối hợp
Đào tạo nghiên cứu sinh
Đào tạo nghiên cứu sinh, đào tạo cán bộ khoa học Việt Nam

nâng cao trình độ và sử dụng các phần mềm, các thiết bị
hiện đại và tiên tiến, trao đổi phân tích mẫu nghiên cứu
Phối hợp cung cấp gen, vector pCAMBIA1300, pCAMBIA1390/Ubill, cung cấp giống lúa Songhua
Đào tạo nghiên cứu sinh
Cung cấp giống lúa Nipponbare

4.8. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ
Tổng kinh phí SNKH:
800 triệu
Tổng kinh phí đã quyết toán:

800 triệu

4.9. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

1.

Nguyễn Thị Hồng Châu, Trần Thanh Thu, Michel Jacobs, Ramon Serrano, Emmanuel Guiderdoni,
Lê Trần Bình (2004). Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lúa Zhongzua (Japonica) chuyển
gen. Tạp chí Công nghệ sinh học, tập 2, sô 1, tr: 93 - 100

2.

Nguyễn Thị Hồng Châu, Nguyễn Phương Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003). Chuyển gen
thông qua Agrobacterium tumefaciens tumefaciens vào giống lúa C71. Tạp chí Công nghệ sinh
học, tập 1, số 2, tr: 219 - 226.

3.

Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003).

Mối tường quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa, Tạp chí Công nghệ sinh
học, tập 1, số 1. tr. 85 - 94

4.

Nguyễn Minh Hùng, Đinh Thị Phòng, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (2003). Nghiên
cứu mức độ methyl hóa DNA genom một số giống lúa chọn tạo bằng công nghệ tế bào thực vật.
Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb. KH & KT Hà Nội, tr: 923 926

5.

Nguyễn Thị Tâm, Lê Trần Bình (2003). Ảnh hưởng của nhiệt độ cao lên hoạt độ α -amylase và
hàm lượng đường tan ở hạt nảy mầm của một số giống và dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo chịu
nóng, Tạp chí Công nghệ sinh học, tập 1, số 1. tr. 101 - 108.

6.

Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Thị Tỵ, Lê Trần Bình (2003). Đánh giá một số đặc điểm hóa sinh của các
dòng lúa chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nhiệt độ cao. Báo cáo Khoa học Hội nghị Công

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 151 of 120.

29


Header Page 152 of 120.

nghệ sinh học toàn quốc 2003. Nxb. KH & KT Hà Nội, tr: 958 - 961

7.

Nguyễn Thị Tâm, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2003). Ứng dụng kỹ thuật phân tích sự đa hình các
đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) vào việc đánh giá các dòng lúa chọn lọc từ mô sẹo
chịu nhiệt độ cao. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb. KH & KT
Hà Nội, tr: 1003 - 1007.

8.

Frenzel T, Miller A, Engel KH (2002) Metabolite profiling - A Fractionation method for analysis of
major and minor compounds in rice grains. Cereal Chemistry 79 (2): 215-221

9.

Kopka J, Schauer N, Krueger S, Birkemeyer C, Usadel B, Bergmüller E, Dörmann P, Gibon Y,
Stitt M, Willmitzer L, Fernie AR, Steinhauser D (2005) GMD@CSBDB: The Golm Metabolome
Database. Bioinformatics 21: 1635-1638.

10. Sato S, Soga T, Nishioka T, Tomita M (2004) Simultaneous determination of the main metabolites

in rice leaves using capillary electrophoresis mass spectrometry and capillary electrophoresis
diode array detection. Plant Journal 40:151–163.

11. Schauer N, Steinhauser D, Strelkov S, Schomburg D, Allison G, Moritz T, Lundgren K, Roessner-

Tunali U, Forbes MG, Willmitzer L, Fernie AR, Kopka J (2005) GC-MS libraries for the rapid
identification of metabolites in complex biological samples. FEBS Letters 579:1332-1337

12. Do PT, Erban A, Scherling C, Drechsel O, Heyer AG, Kopka J, Zuther

E (2005). Investigation of

polyamine biosynthesis in Indica rice varieties with different levels of salt tolerance. 5th
International Rice Symposium, Manila, Philippines.

13. Zuther E, Drechsel O, Do PT, Erban A, Kopka J, Heyer AG (2004) Characterization of polyamine

biosynthesis in different indica varieties of Oryza sativa under salt stress conditions. 3rd Plant
Genomics European Meeting, Lyon, France

4.10. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI
Giữa hệ thống quản lý của Bộ BMBF, Đức và Bộ KH&CN, Việt Nam có sự khác nhau cơ bản về
thời gian thực hiện đề tài, trong khi MPIMP được BMBF cho thực hiện đề tài trong thời gian 5 năm từ
2002 đến 2007 thì đề tài đối ứng của Viện Công nghệ sinh học được Bộ KH&CN cho phép tiến hành
từ năm 2002 đến năm 2004 vì vậy không tránh khỏi những khâu lệch rất lớn vì rất nhiều nội dung
mang tính kế thừa. Vì vậy, đề tài phía đối tác Việt Nam đã phải gia hạn thời gian thực hiện đến năm
2005.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 152 of 120.

30


Header Page 153 of 120.

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN

1.

Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân và lưu giữ tại Viện
Công nghệ sinh học.

2.

Hoàn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa phù hợp
với điều kiện ở Việt Nam. Kết quả xử lý mặn thu được 5 giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển,
IR57311, Cườm và Nước mặn), 7 giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp
mặn, Đốc phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua, Taipei và
Nipponbare). Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt (CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh,
IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa
mặn, Lốc dâu, K.lua nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom,
Songhua, Nipponbare).

3.

Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm lượng polyamin, (ii) Các
giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn, (iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả
năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần. Hoạt động
của enzym Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt. Thí nghiệm
chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được tiến hành.

4.

Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp thủy phân protein
tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp với việc tách chiết bằng các hệ dịch
đệm khác nhau cho phép hình thành một hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân
bằng vi sóng, tạo dẫn xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít
amin trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo.

5.

Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa. Thông qua việc tra cứu và thu thập
thông tin về gen hiện nay một Ngân hàng dữ liệu về các đoạn gen Tác nhân phiên mã ở cây lúa
đã chính thức được thành lập và đưa vào hoạt động từ 01.09.2004 với địa chỉ
. với 2512 gen gồm 2261 loci mã hóa và xắp xếp thành 44 họ
gen khác nhau.

6.

Thông qua việc thiết kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh
giá được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn tại hai thời điểm.
Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần
hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313
gen trong số 2512 gen được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn.

7.

Trong số đó có 19 gen được chọn để thiết kế mồi cho việc nhân đoạn gen ngược đầu 5’ từ codon
khởi đầu trở lên. Kết quả đã nhân được đoạn DNA của 16 gen, trong đó có 3 mồi không cho kết
quả. Hiện nay, các đoạn gen được nhân đang được đọc trình tự. Bước đầu đã xác định 6 gen
cảm ứng mạnh dưới tác động của khô hạn và muối (Alfin-like-5, Alfin-like-28, AP2-EREBP-43,
ARR-B2, C2C2-Dof-5, C2C2-Dof-11).

8.

Đã thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ GC-TOF-MS. Ngân
hàng dữ liệu về khối phổ các chất đã biết và chất chưa biết MSTs đó được lưu giữ trong Ngân
hàng có thể khai thác, trao đổi thông tin và trích dẫn khi công bố qua GMD Web-Site
Tiến hành phân tích phổ GC-TOF-MS trên cây mạ đã
có 132 MSTs được xác định, trong đó có 109 chất thuộc các chất trao đổi sơ cấp. Có một số chất
bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học do hóa chất cần thiết dùng cho kỹ thuật GC-MS.

Tuy vậy, vẫn còn 148 MSTs của cây mạ chưa được biết đến. Chúng cũng xuất hiện thường
xuyên ở Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabaccum, Lotus japonicus, hoặc Lycopersicon spec. Việc
tìm kiếm các chất đặc hiệu ở rễ và lá lúa được chú ý, nhưng ưu tiên hơn vẫn là việc tìm kiếm các
chất trao đổi trong rễ và lá có ý nghĩa chỉ thị đối với tính chịu mặn và chịu hạn.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 153 of 120.

31


Header Page 154 of 120.

9.

Đã xây dựng và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu
ban đầu là hạt lúa chín (thay vì phôi non rất khó chủ động) đã được thiết lập.

10. Bước

đầu thu được 15 dòng cây chuyển gen CGS, các dòng cây này đang trồng, theo dõi sự
hoạt động của gen này trong phytotron. Hạt giống thế hệ T1 sẽ được thu từ những cây trồng trong
phytotron và tiếp tục các nghiên cứu khác. Các gen khác như Serinacetyltransferase,
Homoserinkinase (plastid) và Homoserinkinase (cytosolic) đang được hoàn thiện để chuyển gen
nhằm cải thiện thành phần axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam.

11. Đối với các dòng cây chuyển gen nhaA ở giống lúa C71 kết quả thu được 11 dòng cây dương
tính. Đối với gen OAT đã thu được 3 dòng cây dương tính trên giống lúa DR2.

5.2. ĐỀ NGHỊ
1. Giữa hệ thống quản lý của Bộ BMBF, Đức và Bộ KH&CN, Việt Nam có sự khác nhau cơ bản về

thời gian thực hiện đề tài, trong khi MPIMP được BMBF cho thực hiện đề tài trong thời gian 5 năm
từ 2002 đến 2007 thì đề tài đối ứng của Viện Công nghệ sinh học được Bộ KH&CN cho phép tiến
hành từ 2002 đến 2004, vì vậy không tránh khỏi những khâu lệch rất lớn vì rất nhiều nội dung
mang tính kế thừa. Mặc dù thế, thông qua việc khai thác các nguồn tài chính khác đề tài đã tận
dụng được lực lượng cán bộ Việt Nam được nhận học bổng 322 gửi đi làm NCS ở MPIMP để
tham gia thực hiện nhiều nội dung quan trọng của đề tài bằng những kinh nghiệm thu nhận được
trước đó tại Viện Công nghệ sinh học góp phần thúc đẩy tiến độ của đề tài.
2. Đề nghị có những điều chỉnh trong công tác quản lý để có sự phù hợp tốt hơn về thời gian và tiến
độ giữa các bên và tiếp tục thực hiện những nội dung còn chưa hoàn tất.

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 154 of 120.

32