ẢNH HƯỞNG của ph đến KHẢ NĂNG hóa HƯỚNG ĐỘNG của VI KHUẨN novosphingobium sp KN65 2 đối với CARBOFURAN, 2,4 d và CYPERMETHRIN

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN KHẢ NĂNG HÓA
HƯỚNG ĐỘNG CỦA VI KHUẨN
Novosphingobium sp. KN65.2 ĐỐI VỚI
CARBOFURAN, 2,4-D VÀ CYPERMETHRIN
Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. NGUYỄN THỊ PHI OANH

PHAN KHÁNH LINH
MSSV 3082434
Lớp Sinh học K34

Cần Thơ, 2012

1

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được
những sự giúp đỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin chân thành gửi lời
cảm ơn đến:
-

Cô Nguyễn Thi Phi Oanh đã hướng dẫn và chỉ bảo ân cần trong suốt quá trình

tiến hành thí nghiệm cũng như hoàn chỉnh bài viết.
-

Các thầy cô quản lí phòng thí nghiệm Sinh học 3, bộ môn Sinh học; các thầy cô

phòng thí nghiệm Hóa, bộ môn Hóa học, khoa KHTN cùng các thầy cô Viện CNSH
đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành thí nghiệm.
-

Các bạn sinh viên lớp Sinh học K34, các anh chị làm luận văn cùng thời điểm đã

hướng dẫn và giúp đỡ.
-

Tôi xin cảm ơn gia đình đã động viên tinh thần và hỗ trợ kinh phí cho tôi để tôi

hoàn thành luận văn này.

2


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

LỜI BẢN QUYỀN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của
Ths. Nguyễn Thị Phi Oanh. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu hay luận văn nào trước
đây.

Cán bộ hướng dẫn

Tác giả luận văn

Ths. Nguyễn Thị Phi Oanh

Phan Khánh Linh

3


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1. Công thức cấu tạo của carbofuran ........................................................... 3
Hình 2. Công thức cấu tạo của 2,4-D .................................................................... 6
Hình 3. Công thức cấu tạo của cypermethrin ........................................................ 9
Hình 4 Mô hình thí nghiệm khảo sát hóa hướng động ở vi khuẩn ......................... 18
Hình 5. Hóa hướng động của KN65.2 theo carbofuran ở pH 7.............................. 19
Hình 6. Hóa hướng động của KN65.2 theo 2,4-D ở pH 7..................................... 20
Hình 7. Hóa hướng động của KN65.2 theo cypermethrin ở pH 7 .......................... 20
Hình 8. Hóa hướng động của KN65.2 đối với ba loại nông dược ở pH 7 .............. 21
Hình 9. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 đối với carbofuran, 2,4-D và
cypermethrin ở pH 7 ............................................................................................. .22
Hình 10. Hóa hướng động của KN65.2 theo carbofuran ở pH 5.5 ......................... 23
Hình 11. Hóa hướng động của KN65.2 đối với cypermethrin ở pH 5.5 ................. 24
Hình 12. Hóa hướng động của KN65.2 đối với carbofuran và cypermethrin ở pH
5.5 ........................................................................................................................ 24
Hình 13. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 đối với carbofuran và
cypermethrin trong môi trường pH 5.5 ................................................................. 25
Hình 14. Hóa hướng động của KN65.2 đối với carbofuran ở hai môi trường pH
khác nhau ............................................................................................................. 26
Hình 15. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 đối với carbofuran trong môi
trường pH 7 và pH 5.5 .......................................................................................... 27
Hình 16. Hóa hướng động của KN65.2 đối với cypermethrin ở môi trường pH
khác nhau ............................................................................................................. 28
Hình 17. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 đối với cypermethrin ở môi
trường pH 7 và pH 5.5 .......................................................................................... 29

4


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1. Khoảng cách vi khuẩn di chuyển theo carbofuran, 2,4-D và
cypermethrin ở pH 7 sau 3 ngày quan sát ............................................................. 20
Bảng 2. Khoảng cách vi khuẩn di chuyển theo carbofuran, cypermethrin ở pH
5.5 sau 3 ngày....................................................................................................... 24
Bảng 3. Khả năng hóa hướng động của dòng KN65.2 khi nuôi cấy trên môi
trường khoáng tối thiểu ở các độ pH 7, pH 5.5 và có bổ sung carbofuran sau 3
ngày ..................................................................................................................... 25
Bảng 4. Khả năng hóa hướng động của dòng KN65.2 khi nuôi cấy trên môi
trường khoáng tối thiểu ở các độ pH 7, pH 5.5 và có bổ sung cypermethrin sau 3
ngày ..................................................................................................................... 27

5


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

ADN

Acid deoxyribonucleic

ADP

Adenosine diphosphate

ATP

Adenosine triphosphate

BVTV

Bảo vệ thực vật

CF

carbofuran

Cm

cypermethrin

Ctv.

Cộng tác viên

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu long

KN65.2

Novosphingobium sp. KN65.2

OD

Optical density

PTNT

Phát triển nông thôn

QĐ/BNN

Quy định/Bộ Nông nghiệp

TSA

Tryptone Soy Agar

TSB

Tryptone Soy Broth

US EPA

United State Environmental Protection Agency

WHO

World Health Organization

6


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

TÓM LƯỢC
Kết quả thí nghiệm cho thấy: ở pH 7, dòng KN65.2 có khả năng hóa hướng động đối
với cả ba loại nông dược là carbofuran, 2,4-D và cypermethrin. Trong đó, vi khuẩn
di chuyển theo carbofuran nhanh nhất. Sự di chuyển theo 2,4-D và cypermethrin
chậm hơn và không có khác biệt ý nghĩa. Ở pH 5.5, hóa hướng động của KN65.2
chỉ thể hiện với carbofuran và cypermethrin, vi khuẩn không thể hiện khả năng hóa
hướng động đối với 2,4-D. Khả năng hóa hướng động của vi khuẩn KN65.2 đối với
cả ba loại nông dược được khảo sát không xảy ra ở môi trường pH 4.5.
Từ khóa: 2,4-D, carbofuran, cypermethrin,, Novosphingobium sp. KN65.2, hóa
hướng động, pH…

7


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

MỤC LỤC
Lời cảm tạ ........................................................................................................... i
Lời bản quyền....................................................................................................... ii

Danh sách hình ..................................................................................................... iii
Danh sách bảng .................................................................................................... iv
Danh sách từ viết tắt ............................................................................................. v
Tóm lược .............................................................................................................. vi
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU .................................................................................... 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................ 3
I. Các loại nông dược đã và đang được sử dụng phổ biến ở ĐBSCL ................... 3
1. Carbofuran ................................................................................................. 3
1.1. Giới thiệu............................................................................................... 3
1.2. Ảnh hưởng của carbofuran đến con người và môi trường....................... 4
1.3. Khả năng phân hủy carbofuran ở một số vi sinh vật ............................... 4
2. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) ..................................................... 5
1.4. Giới thiệu............................................................................................... 5
1.5. Ảnh hưởng của 2,4-D đến con người và môi trường .............................. 6
1.6. Khả năng phân hủy 2,4-D ở một số vi sinh vật ....................................... 7
2. Cypermethrin ........... .................................................................................. 8
1.7. Giới thiệu............................................................................................... 8
1.8. Ảnh hưởng của cypermethrin đến con người và môi trường................... 9
1.9. Khả năng phân hủy cypermethrin ở một số vi sinh vật ........................... 10
II. Hóa hướng động ở vi khuẩn ........................................................................... 10
1. Đặt tính hóa hướng động ở vi khuẩn………………………………………..10
2. Những yếu tố ảnh hưởng đến hóa hướng động ở vi khuẩn…………………11
III. Vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2

.................................................. 12

1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 12
2. Đặc điểm của Novosphingobium sp. KN65.2 ............................................. 13
8

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

IV. Những đặc điểm thổ nhưỡng ở ĐBSCL ..................................................... 13
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................ 15
I.

Thời gian và địa điểm .................................................................................... 15
1. Thời gian..................................................................................................... 15
2. Địa điểm ..................................................................................................... 15

II. Phương tiện ................................................................................................... 15
1. Hóa chất ...................................................................................................... 15
2. Thiết bị ....................................................................................................... 16
3. Dòng vi khuẩn dùng cho thí nghiệm ............................................................ 16
III. Phương pháp .................................................................................................. 16
1. Cơ sở tiến hành thí nghiệm hóa hướng động ............................................... 16
2. Thí nghiêm chứng minh pH ảnh hưởng đến khả năng hóa hướng động của vi
khuẩn................................................................................................................ 17
2.1. Nuôi cấy và đo mật độ quang (Optical density) ...................................... 17
2.2. Chuẩn bị môi trường khảo sát hóa hướng động của vi khuẩn ................. 17
2.3. Bố trí thí nghiệm .................................................................................... 18
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................ 19
1. Khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 theo
nông dược ở pH=7 ............................................................................................ 19
1.1. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo carbofuran ........................ 19
1.2. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo 2,4-D ................................ 19
1.3. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo cypermethrin .................... 20

1.4. So sánh khả năng hóa hướng động của Novosphingobium sp. KN65.2 đối
với carbofuran, 2,4-D và cypermethrin ở pH=7 ............................................ 21
2. Khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 theo
nông dược ở pH 5.5 .......................................................................................... 22
2.1. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo carbofuran ........................ 22
2.2. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo 2,4-D ................................ 23
2.3. Khả năng hóa hướng động của KN65.2 theo cypermethrin .................... 23
9


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

2.4. So sánh khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp.
KN65.2 ở pH=5.5 đối với carbofuran và cypermethrin ................................ 24
3. Khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 theo
nông dược ở pH=4.5 ....................................................................................... 25
4. So sánh khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp.
KN65.2 theo carbofuran ở môi trường pH=7 và pH=5.5 ................................ 26
5. So sánh khả năng hóa hướng động của vi khuẩn Novosphingobium sp.
KN65.2 theo cypermethrin ở môi trường pH=7 và pH=5.5.............................. 27
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 31
I.

Kết luận ......................................................................................................... 31

II. Kiến nghị ....................................................................................................... 31

10

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vựa lúa lớn của cả nước. Để đáp ứng nhu
cầu lương thực cho sự tăng dân số và xuất khẩu, ngoài việc sử dụng những giống lúa
có năng suất cao thì thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) và phân bón là yếu tố cần thiết
để tăng sản lượng lúa. Cùng với hoạt động thâm canh tăng vụ, thuốc BVTV ngày
càng bị lạm dụng, dẫn tới dư lượng thuốc tồn đọng trong môi trường gây ô nhiễm và
ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người (www.thiennhien.net, 11/5/2012).
Hiện nay, phương pháp xử lý chất ô nhiễm bằng con đường sinh học đang được
nghiên cứu và ứng dụng. Xử lý chất ô nhiễm bằng phương pháp sinh học không
những không gây hại môi trường mà còn ít tốn chi phí. Có rất nhiều vi khuẩn đã và
đang được nghiên cứu cho xử lý sinh học (Scheunert, 1993; Liu, 1990…), trong đó
nhóm sphingomonads được xem là những vi khuẩn tiềm năng vì chúng có khả năng
phân hủy được nhiều hợp chất hữu cơ ô nhiễm như: biphenyl, naphthalene(s),
flourene(s),

phenanthrene(s),

(chlorinated)dibenzo-p-dioxin(s),

pyrene,

diphenyl

carbazole,

ether,

estradiol,

(chlorinated)furan(s),
polyethlene,

glycols,

chlorinated phenols, các loại thuốc diệt cỏ và nông dược khác nhau (Stolz, 2009).
Do đó, nhóm vi khuẩn sphingomonads được xem là vi khuẩn tiềm năng để nghiên
cứu khả năng làm sạch môi trường theo hướng sinh học.
Novosphingobium sp. KN65.2 là một trong những vi khuẩn nhóm sphingomonads
có khả năng phân hủy carbofuran đã được phân lập trên đất rẫy ở ĐBSCL (Nguyễn
Thị Ngọc Ánh, 2009). Các protein có khả năng tham gia vào sự phân hủy carbofuran
ở dòng vi khuẩn này cũng đã được khảo sát (Lê Huyền Trân, 2010). Ngoài ra dòng
Novosphingobium sp. KN65.2 còn khả năng phân hủy 2,4-D, cypermethrin và
endosulfan (Nguyễn Thiện Trung, 2012). Khả năng hóa hướng động của dòng vi
khuẩn KN65.2 theo 2,4-D và cypermethrin cũng đã được khảo sát (Nguyễn Anh
Thư, 2012). Tuy nhiên, ảnh hưởng của yếu tố pH đến khả năng hóa hướng động của
11


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

dòng vi khuẩn KN65.2 vẫn chưa được nghiên cứu. Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là
khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng hóa hướng động của vi khuẩn

Novosphingobium sp. KN65.2 đối với carbofuran, 2,4-D và cypermethrin.

12


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
V. CÁC LOẠI NÔNG DƯỢC ĐÃ VÀ ĐANG ĐƯỢC SỬ DỤNG PHỔ BIẾN Ở
ĐBSCL
2. Carbofuran
2.1.

Giới thiệu

Carbofuran (C12H15NO3) (Hình 1) là một loại nông dược thuộc nhóm carbamate
dùng để diệt côn trùng, rệp và giun tròn, có tên khoa học là 2,3-dihydro-2,2dimethyl-7-benzofuranylmethylcarbate với trọng lượng phân tử 221.26g/M.

Hình 1. Công thức cấu tạo của carbofuran

Carbofuran lưu tồn tương đối lâu trong đất có thể gây ô nhiễm nước mặt và nước
ngầm. Carbofuran là hoạt chất có độc tính cao đối với đường hô hấp và da (Evans,
2009).
Theo quyết định số 15/2004/QĐ-BNN ngày 14/04/2004 của Bộ trưởng Bộ Nông
nghiệp và PTNT từ năm 2004, carbonfuran đã chính thức được đưa vào danh mục
các loại thuốc BVTV hạn chế sử dụng ở Việt Nam (Cục Y tế dự phòng và môi
trường, 2010).

13


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2.2.

2012

Ảnh hưởng của carbofuran đến con người và môi trường

Carbofuran là một trong các thuốc trừ sâu thuộc nhóm carbamat độc hại nhất. Nó
được bán trên thị trường dưới tên thương mại Furadan. Carbofuran rất độc hại đối
với động vật có xương sống với liều gây chết trung bình là 8-14 mg/kg ở chuột và
19 mg/kg ở chó (WHO).
Carbofuran đặc biệt độc hại với các loài chim do chim ăn nhầm các hạt carbofuran
vì chúng tương tự các hạt ngũ cốc. Trước khi bị cấm bởi Cơ quan Bảo vệ Môi
trường Mỹ vào năm 1991, carbofuran là nguyên nhân làm hàng triệu gia cầm tử
vong mỗi năm. Dạng lỏng của carbofuran ít độc hại với chim nếu chúng không ăn
trực tiếp. Ngày 25/7/2008, EPA (Environmental Protection Agency) công bố cấm
lưu hành carbofuran dưới mọi hình thức ở Mỹ.
Carbofuran đã được sử dụng trái phép để đầu độc động vật hoang dã ở Mỹ, Canada
và Anh. Động vật hoang dã bao gồm chó sói Bắc Mỹ, diều, đại bàng... Carbofuran
gây ngộ độc thứ cấp dẫn đến tử vong cho động vật, đặc biệt là chim ăn thịt, chó nhà,
chó sói, gấu trúc, kền kền (Wobeser và ctv, 2004)... Tại Kenya, nông dân sử dụng
carbofuran để giết sư tử và một số thú săn mồi khác (Mynott và Adam, 2008).
Carbofuran là một trong các chất có độc tính cao nhất đối với con người so với bất
kỳ loại thuốc trừ sâu khác được sử dụng rộng rãi trên lĩnh vực cây trồng (trừ aldicarb
và parathion). Hầu hết carbofuran được áp dụng bằng cách phun thương mại sử
dụng các hệ thống khép kín nhằm tránh tiếp xúc trực tiếp. Carbofuran có độc tính

cao đối với thú có vú do carbofuran là chất ức chế enzyme cholinesterase tham gia
vào chức năng dẫn truyền của hệ thần kinh (Dasgupta và ctv., 2007).
2.3.

Khả năng phân hủy carbofuran ở một số vi sinh vật

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy carbofuran đã được phân lập và nghiên cứu
thuộc giống Pseudomonas, Aspergillus, Fussarium, Flavobacterium,
Achromobacterium, Sphingomonas, Arthrobacter và Rhodococus (Chaudhry và Ali,
14


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

1988; Feng và ctv., 1997; Park và ctv., 2006). Dòng Sphingomonas sp. CF06 có khả
năng phân hủy carbofuran ở nhóm carbonyl và vòng thơm được phân lập từ mẫu đất
phía Tây Washington (Mỹ) nơi đã từng sử dụng carbofuran 3 năm và hiện nay
không còn sử dụng (Chaudhry and Ali, 1988). Năm 2000, Ogram và ctv. đã phân lập
được 2 dòng vi khuẩn phân hủy carbofuran là Sphingomonas sp. TA và
Sphingomonas sp. CD. Sphingomonas sp. SB5 có khả năng thủy phân carbofuran ở
vòng furanyl tạo thành carbofuran-7-phenol và hợp chất biến dưỡng màu đỏ được
Park và ctv. phân lập ở Hàn Quốc năm 2006. Tại hệ thống xử lý nước thải của nhà
máy nông dược ở Trung Quốc, Liu và ctv. (2006) đã phân lập được Sphingomonas
sp. CDS-1. Yan và ctv. (2007) đã phân lập được Novosphingobium FND-3 ở một hệ
thống xử lý nước thải của nhà máy sản xuất nông dược khác ở Trung Quốc.
Ở ĐBSCL, dòng vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 có khả năng phân hủy
carbofuran đã được phân lập trong đất rẫy ở Sóc Trăng. Dòng vi khuẩn khuẩn này
có thể phân hủy 520g/ml carbofuran trong 60 giờ (Nguyễn Thị Ngọc Ánh, 2009).

3. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)
3.1. Giới thiệu
2,4-D (C8H6Cl2O3) (Hình 2) là thuốc trừ cỏ nội hấp, có chọn lọc, trừ cỏ hậu nảy
mầm, có tên thương mại: OK, Vi 2,4-D, Anco, Zico,…
Tên hóa học: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
Đặc tính lý hóa học: 2,4-D có dạng bột, không màu, ít tan trong nước, tan nhiều
trong dung môi hữu cơ, không tan trong benzene và dầu hỏa. Ở 250C và pH 7, độ tan
của 2,4-D trong nước là 3,39x104 ppm. Thời gian bán hủy của 2,4-D trong nước là
39 ngày (Lê Trường, 1978; Trần Quang Hùng, 1999).

15


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Hình 2. Công thức cấu tạo của 2,4-D
Phân tử lượng: 221,04 g/M.
Các dạng chế phẩm: nhũ dầu (EC), dạng lỏng đậm đặc hòa tan trong nước (CS,
CSW), bột (D), bột thấm nước (WP), hạt (G).
Tính độc: muối 2,4-D amin độc cấp I, các nhóm còn lại độc cấp III, độc tính qua
miệng LD50: 666-805 mg/kg (Trần Quang Hùng, 1999; Hồ Huỳnh Thùy Dương,
2002).
3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến con người và môi trường
Một trong những loài thuốc diệt cỏ được sử dụng phổ biến hiện nay ở Việt Nam nói
chung và ĐBSCL nói riêng là 2,4-D. Kết quả điều tra 155 người bị ngộ độc 2,4-D
cho thấy tỉ lệ người có triệu chứng chóng mặt chiếm tỉ lệ 85,5%, mệt mỏi 78,7% và
nhức đầu 66,4% (Đỗ Lê Thăng và Đinh Đoàn Long, 2007). Ngoài ra, 2,4-D còn ảnh
hưởng đến hệ thần kinh và hệ tiêu hóa. Khi tiếp xúc với 2,4-D trong thời gian dài

dẫn tới yếu cơ, mất phản xạ, hạ huyết áp tức thời, hư gan, thận và thậm chí gây ung
thư (Nguyễn Văn Sức, 1993).
2,4-D được xác định trong một nghiên cứu gây độc cấp tính ở chuột với liều là 639
mg / kg (US EPA, 2006). Ở người, liều uống 5 và 30 mg/kg trọng lượng cơ thể
không gây ra bất kỳ tác dụng độc hại cấp tính nào. Ngoài ra, 2,4-D là 1 trong những
nguyên nhân gây teo cơ (Burns và ctv., 2001).

16


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Các nghiên cứu mới cho thấy, 2,4-D làm giảm khả năng sinh sản, tiếp xúc với 2,4-D
có thể dẫn đến giảm số lượng tinh trùng ở người (Garry và ctv., 2001). Theo số liệu
gần đây nhất của US EPA, 2,4-D làm thành pHần của dioxin, làm ô nhiễm môi
trường. Cục khảo sát địa chất Hoa kì cho biết, 2,4-D được tìm thấy thường xuyên ở
các con sông và suối. Ngoài ra, 2,4-D cũng hiện diện khi lấy mẫu đo trong không
khí. 2,4-D được sử dụng ở những bãi cỏ trong nhà là nguyên nhân làm tăng ung thư
ở chó (Glickman, 2004).
2,4-D còn gây nên những tổn thương về di truyền đối với thực vật (Filkowski và ctv.,
2003), gây độc đối với chim và động vật không xương sống khi chúng ăn phải
(Walker, 2004).
2,4-D còn là nguyên nhân dẫn tới ung thư, đột biến và gây ra các vấn đề về sinh sản
(Masunaga và ctv., 2001).
3.3.

Khả năng phân hủy 2,4-D của một số vi sinh vật

Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy 2,4-D đã được phân lập từ nhiều loại đất ô
nhiễm khác nhau như đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải,… Các vi
khuẩn phân hủy 2,4-D được phân làm 3 nhóm dựa vào enzim phân hủy và các đặc
tính lý hóa của chúng. Nhóm thứ nhất thuộc lớp β và γ–Proteobacteria như
Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas. Những vi khuẩn
này có chứa gen tfd thường nằm trên plasmid. Các plasmid này có thể chuyển từ vi
khuẩn này sang vi khuẩn khác nhờ sự tiếp hợp. Nhóm thứ hai thuộc lớp α–
Proteobacteria như Sphingomonas, chúng được phân lập từ môi trường có chứa Clo.
Nhóm thứ ba gồm những vi khuẩn lớp α–Proteobacteria nhưng thuộc giống
Bradyhizobium (Top và ctv., 1995; Itoh và ctv., 2004). Năm 1989, Roy và ctv. đã
phân lập được hai dòng vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18086
và Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18087 có khả năng phát triển trong
môi trường có 2,4-D và sử dụng hợp chất này như năng lượng và nguồn cacbon duy
nhất (Roy và Rouge, 1989). 5 giống vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D bao gồm
Acinetobacter, Serratiamarcescens, Stenothrophomonas, Flavobacterium và
17


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Penicilium được phân lập từ đất ô nhiễm 2,4-D ở Brazin (Maltseva và ctv., 1996).
Pseudomonas N.C.B.I 9340 được phân lập từ các mẫu đất biến dưỡng 2,4-D ở Anh
(Evans và ctv., 1971); Pseudomonas cepacia CSV 90 được phân lập từ các mẫu đất
công nghiệp bị nhiễm 2,4-D ở Ấn Độ (Bhat và ctv., 1994); Alcaligenes eutrophus
JMP228 được phân từ các mẫu đất nhiễm 2,4-D ở Michigan, Mỹ (Top và ctv., 1996);
Alcaligenes eutrophus JMP134 được phân lập ở Mexico (Dunbar và ctv., 1997);
Burkholderia phenoliruptrix AC1100 được phân lập ở Bỉ (Coenyel và ctv., 2004).
Ở Việt Nam, ba dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D đã được phân lập đều thuộc giống

Athrobacter lần lượt là Athrobacter sp. DNB19, Athrobacter sp. DNB20,
Athrobacter sp. DNB21 trên các mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay
Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu, 2002; Ngô Tự Thành và ctv., 2003). Năm 2008, Hương
và cộng tác viên đã phân lập được các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D
như: Sphingomonas chungbukensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchri
trên các mẫu đất ở Quảng Trị, Huế và Biên Hòa (Nguyen L. Huong và ctv., 2008).
Ở ĐBSCL, mười dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D đã được phân lập trong
đất lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng bao gồm các dòng vi khuẩn thuộc các giống
Cupriavidus, Burkholderia và Ralstonia (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv., 2011).
4. Cypermethrin
4.1. Giới thiệu
Cypermethrin (C22H19O3NCl2) (Hình 3) là thuốc trừ sâu tổng hợp, dạng pyrethroid
nhân tạo được sử dụng để tiêu diệt côn trùng trên bông, rau diếp, diệt gián, bọ chét
và mối trong nhà (WHO, 1989), ít độc đối với gia cầm và động vật có vú, rất bền
trong không khí và ánh sang (Tomlin, 1994), lần đầu tiên được tổng hợp vào năm
1974 (Gammon, 1981), được thương mại hóa lần đầu tiên năm 1977. Tất cả các loại
thuốc trừ sâu thuộc nhóm này đều được tổng hợp dựa trên hợp chất pyrethrins-được
các cây họ Cúc tổng hợp để chống lại côn trùng (Lawrence, 1982).

18


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Tên thông dụng: cypermethrin.
Tên thương mại: Sherpa, Ambush C, Cymbush, Peran, Cyperan, Barricade, Ripcord,
Ammo, Cypermethrine, Asymmethrin, Cymperator, Cypercopal, Hilcyperin,
Neramethrin (US EPA, 1989).

Tên

hóa

học:

(RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)-3-(2,2-

dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate. Có các đồng phân: alphacypermethrin, beta-cypermethrin, theta-cypermethrin và zeta-cypermethrin.

Hình 3. Công thức cấu tạo của cypermethrin
Khối lượng phân tử: 416.3 g/mol.
Thuốc dạng đặc sệt (ở 60°C chuyển thành dạng dung dịch lỏng), hầu như không tan
trong nước, tan trong nhiều dung môi hữu cơ, tương đối bền trong môi trường trung
tính và acid nhẹ, thủy phân trong môi trường kiềm, quang giải yếu, không ăn mòn
kim loại (Cantalamessa, 1993).
3.2.

Ảnh hưởng của cypermethrin đến con người và môi trường

Cypermethrin độc đối với ong, côn trùng có lợi khác, giun đất, cá, tôm, chim (US
EPA, 1989). Cá nước ngọt khi tiếp xúc với cypermethrin làm giảm số lượng hồng
cầu và nồng độ protein trong máu (Saxena và ctv., 2002).
Đối với động vật có xương sống và động vật không xương sống, cypermethrin tác
động chủ yếu vào hệ thống thần kinh (Klaassen, 1996). Cypermethrin cũng ảnh

19


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

hưởng đến tế bào thực vật, ức chế sự phân chia tế bào và làm tăng số lượng nhiễm
sắc thể bất thường (Atale và ctv., 1993; Kara và ctv., 1994).
Cypermethrin ảnh hưởng đến kênh Natri và enzim ATPase trên màng của tế bào
thần kinh (Patel và ctv., 2006). Vì vậy, cypermethrin độc đối với hệ thần kinh. Các
triệu chứng phơi nhiễm bao gồm chóng mặt, buồn nôn, đau đầu, và co giật. Nó cũng
ức chế hệ thống miễn dịch, ức chế sự hình thành kháng thể để chống lại sự xâm
nhập của vi khuẩn. Cypermethrin được xếp vào nhóm những chất có thể gây ung thư
ở người (WHO, 1989).
3.3.

Khả năng phân hủy cypermethrin của một số vi sinh vật

Năm giống vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp., Escherichia coli,
Bacillus

sp.,

và Corynebacterium

sp. có khả năng phân hủy cypermethrin

(Murugesan và ctv., 2009). Dòng vi khuẩn Ochrobactrum lupine được phân lập từ
bùn hoạt tính có khả năng sử dụng beta-cypermethrin và chất chuyển hóa chính của
nó là axit 3-phenoxybenzoic như nguồn cacbon và nguồn năng lượng duy nhất
(Chen và ctv., 2011).
VI. HÓA HƯỚNG ĐỘNG Ở VI KHUẨN
3. Đặt tính hóa hướng động ở vi khuẩn

Hóa hướng động là hiện tượng tế bào vi khuẩn phản ứng và di chuyển theo một số
hóa chất trong môi trường sống của chúng. Đặt tính này rất quan trọng đối với vi
khuẩn trong việc tìm thức ăn, giúp chúng bơi về phía có nồng độ thức ăn cao hơn,
hoặc chạy trốn khỏi các chất độc. Hóa hướng động dương khi vi khuẩn di chuyển
đến nơi có nồng đọ hóa chất cao hơn, và âm nếu chúng di chuyển theo hướng ngược
lại ( 11/5/2012)

20


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

4. Những yếu tố ảnh hưởng đến hóa hướng động ở vi khuẩn
Hóa hướng động ở vi khuẩn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như điều kiện môi
trường, nồng độ hóa chất, nhiệt độ, pH, tập tính hướng hóa của vi khuẩn,… Hóa
hướng động tích cực của Rhodospirillum rubrum được thể hiện đối với các hợp chất
sulfhydryl, ATP, ADP và nhiều chất hữu cơ oxy hóa như malat và chiết xuất từ nấm
men (Clayton, 1958).
Hóa hướng động của vi khuẩn Erwinia amylovora, vi khuẩn gây bệnh trên táo, phụ
thuộc vào nhiệt độ và pH. Vi khuẩn phát triển tối ưu ở nhiệt độ từ 28-280C và pH từ
6-8. Ở pH=4 và pH=10, khả năng hóa hướng động của vi khuẩn E. amylovora bị ức
chế gần như hoàn toàn. Ở nhiệt độ 4 và 330C, hóa hướng động của vi khuẩn thấp
nhất (Raymundo và Ries, 1980).
Ảnh hưởng của pH còn được nghiên cứu ở vi khuẩn đường ruột E. coli và vi khuẩn
gây ung thư dạ dày Helicobacter pylori. Ở vi khuẩn H. pylori, hóa hướng động
mạnh nhất ở pH 5.5-6.5, hóa hướng động không xảy ra ở pH 3. Hóa hướng động
tăng ở pH 3-5.5 và giảm dần ở pH 6-9. Ngoài giới hạn này thì hóa hướng động hầu
như không xảy ra (Tadjrobehkar và Abdollahi, 2004).

Ở vi khuẩn đường ruột E. coli, pH thấp làm gia tăng sự tiêu thụ acid và bơm proton
H+ ra khỏi màng tế bào, đồng thời làm tăng quá trình oxi hóa và gây sốc nhiệt. pH
cao làm tăng hoạt động bơm proton H+ vào bên trong màng tế bào, ức chế khả năng
hóa hướng động. Sự khác biệt về các độ pH ảnh hưởng đến các protein ngoại bào và
các protein trên màng tế bào (Maurer và ctv., 2004).

Sự thay đổi pH của môi trường bên ngoài làm ảnh hưởng đến lớp lipopolysaccharide
của màng ngoài tế bào vi khuẩn, đồng thời cũng làm bất hoạt những emzyme thiết
yếu ở bề mặt ngoài tế bào. Thông thường môi trường pH càng thấp thì hoạt động
kháng khuẩn càng mạnh. Khi pH giảm nhanh, tế bào phải liên tục sử dụng năng
21


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

lượng bơm ion H+ ra ngoài nhằm cân bằng pH. Protein bị biến tính ở môi trường pH
thấp dẫn đến hoạt động của các enzyme bị bất hoạt. Hơn nữa, anion acid sẽ phá hủy
và gây rối loại hoạt động của AND và sự tổng hợp protein, làm chết tế bào vi khuẩn
( />
Hóa hướng động có thể đi đôi với quá trình biến dưỡng chất hấp dẫn bằng cách vận
chuyển chất vào bên trong tế bào. Tuy nhiên, hóa hướng động cũng có thể độc lập
với quá trình biến dưỡng. Nghĩa là chất hấp dẫn cũng đồng thời là chất dinh dưỡng
cầ thiết cho sự sống của vi khuẩn, hóa hướng động giúp vi khuẩn tìm đến với nguồn
dinh dưỡng và phân hủy nó để tạo năng lượng. Khả năng này được tìm thấy ở E. coli,
Salmonella sp., Pseudomonas sp., Bacillus subtilis, P. putida PRS2000 (Armitage,
1999; Berg, 1975; Bren và Eisenbach, 2000; Falke và ctv., 2001). Tuy nhiên, với
những chất hấp dẫn không phải là chất dinh dưỡng hay do vi khuẩn không có nhu

cầu sử dụng những chất này thì khi đó, hóa hướng động vẫn hưỡng vi khuẩn đến
chất hấp dẫn nhưng không xảy ra quá trình biến dưỡng. Khả năng này được tìm thấy
ở vi khuẩn Rhodobacter sphaeroides, Campylobacter jejuni và Sinorhizobium
melotiti (Armitage và ctv., 1997; Hendrixson và ctv., 2001).

VII. VI KHUẨN Novosphingobium sp. KN65.2
1. Vị trí phân loại
Giới: Bacteria.
Ngành: Proteobacteria.
Lớp: Alphaproteobacteria.
Bộ: Sphingomonadales.
Họ: Sphingomonadaceae.
Chi: Novosphingobium ( 22/5/2012)
22


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

2. Đặc điểm của Novosphingobium sp. KN65.2
Vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 được phân lập trên đất rẫy ở Sóc Trăng.
Trên môi trường TSA, khuẩn lạc của dòng Novosphingobium sp. KN65.2 có màu
vàng, tròn, mô, bìa nguyên và kích thước từ 1 đến 2 mm. Dòng KN65.2 có khả năng
phân hủy 520mg carbofuran.l-1 trong 60h và tạo ra hợp chất biến dưỡng màu đỏ, 5(2-hydroxy-2-methyl-propyl)-2, 2-dimethyl-2, 3-dihydro-naphthol [2,3-6] furan-4, 6,
7, 9-tetrone (Nguyễn Thị Ngọc Ánh, 2009).
Kết quả điện di SDS-PAGE của protein ở vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2
cho thấy có sự khác biệt về thành phần protein trong môi trường nuôi cấy có và
không bổ sung carbofuran. Hai băng protein khác biệt có trọng lượng phân tử lần
lượt là 38,3kDa và 28,5 kDa. Phân tích thành phần peptide của băng protein có trọng

lượng phân tử 38,3kDa bằng phương pháp LC-MS/MS cho thấy enzim dioxygenase
tham gia vào quá trình phân huỷ carbofuran. Các enzim hydroxybutyrate
dehydrogenase; dehydrogenase; thioredoxin reductase; ATPase, AAA family;
succinyl-CoA synthetase, alpha subunit, NAD(P)-binding và các protein elongation
factor Ts, outer membrane protein A cũng tham gia vào lộ trình phân huỷ carbofuran
ở dòng vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 (Lê Huyền Trân, 2010).
Ngoài carbofuran, Novosphingobium sp. KN65.2 còn có khả năng phân hủy
endosulfan, 2,4-D và cypermethrin (Nguyễn Thiện Trung, 2012). Nghiên cứu mới
đây cho thấy, Novosphingobium sp. KN65.2 cũng có khả năng hóa hướng động theo
carbofuran, cypermethrin và 2,4-D (Nguyễn Anh Thư, 2012).
VIII. NHỮNG ĐẶC ĐIỂM THỔ NHƯỠNG Ở ĐBSCL
Đồng bằng Nam bộ ( còn gọi là đồng bằng sông Cửu Long), là vùng mới được khai
thác khoảng 500 - 600 năm trở lại đây. Diện tích toàn châu thổ là 36.000 km2, trong
đó diện tích có thể trồng trọt được khỏang 2,1 triệu ha và đã trồng lúa 1,5 - 1,6 triệu
ha. Đất đai chủ yếu là phù sa sông Tiền, sông Hậu khoảng 1.800.000 ha, đất phèn
1.100.000 ha, đất mặn 320.000 ha, đất than bùn và đất thấp Glây- mùn
( 5/6/2012)
23


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Phần lớn đất phù sa ở ĐBSCL có pH khoảng 5.5, phân bố ở Cai Lậy, Cờ Đỏ, Thốt
Nốt, Phụng Hiệp. Ngoài ra, đất phù sa còn được chia thành các vùng khác nhau.
-

Vùng đất phù sa ven sông Tiền, sông Hậu có pH từ 5.5-6.5.
Đất phù sa ngập lụt tương đối nhiều có pH từ 5.5-6.5 phân bố ở Tiền Giang,

Hậu Giang, Cửu Long (cũ).
Đất phù sa bị ngập lụt quá nhiều có pH từ 4.0-4.5 phân bố ở Hậu Giang, Cần
Thơ.
Đất ven sông Hậu thuộc An Giang có pH từ 4.5-5.5.

Đất mặn phân bố ở Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh có pH từ 6.0-7.5.
Đất hữu cơ thuộc Năm Căn, U minh, Kiên Giang có pH từ 4.0-4.5.
pH đất có ảnh hưởng lớn đến khả năng cung cấp chất dinh dưỡng dưới dạng dễ tiêu
cho cây và điều kiện để cây hút dinh dưỡng thuận lợi. Đa số các cây trồng sinh
trưởng, phát triển và hút chất dinh dưỡng thuận lợi từ pH ít chua đến trung tính.
pH<3 sẽ rất hạn chế đối với nhiều loại cây trồng, pH từ 3-4 hạn chết vừa, pH>4 hạn
chế ít (Nguyễn Như Hà, 2006; Nguyễn Vy và Đỗ Đình Thuận, 1977).
Dựa vào những giá trị về pH đất cùng với khoảng pH thích hợp cho cây trồng, thí
nghiệm sẽ được tiến hành ở ba giá trị pH là 4.5, 5.5 và 7.0 để khảo sát hóa hướng
động của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 đối với ba loại nông dược là
carbofuran, 2,4-D và cypermethrin.

24


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
I. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. Thời gian: từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 5 năm 2012.
2. Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học 4, bộ môn Sinh Học, khoa Khoa Học Tự
Nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
II. PHƯƠNG TIỆN

1. Hóa chất
- Na2HPO4 (Na2HPO4.2H2O) (Merck)
- KH2PO4 (Merck)
- (NH4)2SO4 (Merck)
- MgSO4.7H2O (Merck)
- CaCl2.2H2O (Merck)
- FeSO4.7H2O (Merck)
- MnSO4.H2O (Merck)
- H3BO3 (Merck)
- ZnSO4.7H2O

(Merck)

- CuSO4 (Merck)
- Co(NO3)2.6H2O

(Merck)

- (NH4)6MO7O24.4H2O

(Merck)

- HCl 10%
- NaOH 10%
- Nước cất
- TSB (Tryptone Soy Broth, Merck)
- Agar (Prolabo)
- Carbofuran (Sigma Aldrich, 98%)
- Cypermethrin (Sigma Aldrich, 99%)
25