HÓA HƯỚNG ĐỘNG của VI KHUẨN PHÂN hủy 2,4 d được PHÂN lập ở TIỀN GIANG và sóc TRĂNG

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

HÓA HƯỚNG ĐỘNG CỦA VI KHUẨN PHÂN HỦY
2,4-D ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở TIỀN GIANG VÀ SÓC
TRĂNG

Cán bộ hướng dẫn:
hiện:
Ths. Nguyễn Thị Phi Oanh
Bộ Môn Sinh Học

Sinh viên thực
Lý Thị Thùy Linh
MSSV:3082435
Lớp: Sinh học, khóa 34

Cần Thơ, tháng 5/2012

i

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp đóng một phần quan trọng trong hành trang học tập
của sinh viên nói chung, sinh viên ngành Sinh Học nói riêng. Nó giúp tôi có thể
tiếp cận được với thực tế, có thêm nhiều kiến thức về ngành học và định hướng
cho lựa chọn nghiên cứu khoa học sau này; từ đó trang bị những kiến thức thực
tế tổng quan giúp tôi có khả năng định hướng tốt công việc và có những chuẩn bị
tốt sau khi kết thúc học tập ở trường.
Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến TH.S Nguyễn Thị Phi Oanh đã tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến thầy Trần Thanh Mến và quí thầy
cô bộ môn Sinh Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã cho tôi nền tảng kiến thức, cho
tôi niềm tin và cả vật chất để tôi có thể học hỏi, trao dồi thêm kỹ năng của mình.
Tôi xin cám ơn bạn Võ Thị Ngọc Diễm, chị Nguyễn Thị Mai Phương, Cao
Học Sinh Thái Học K16 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu và anh Quách Quang Huy,các bạn lớp Sinh Học K34, các anh chị trong phòng
thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã tận tình động viên giúp đỡ tôi trong thời gian
qua.
Có thể trong quá trình học tập, nghiên cứu, với vốn kiến thức và kinh
nghiệm còn non nớt, chắc chắn tôi không thể không có những thiếu sót nhất định.
Rất mong được sự hướng dẫn, chỉ bảo từ phía quí thầy cô, các anh chị đi trước để
tôi có thể hoàn thiện hơn, tiếp tục con đường nghiên cứu vì khoa học, vì xã hội.
Xin chân thành cảm ơn!

Lý Thị Thùy Linh

LỜI CAM KẾT
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi,
các số liệu nêu trong luận văn là trung thực. Nếu sai, tôi xin chịu hoàn toàn trách
nhiệm và chịu mọi kỷ luật của khoa và nhà trường đề ra.


MỤC LỤC
Mục lục................................................................................................................

.....i

Danh mục các từ viết tắt.................
..................................................
.............
...iii

Danh mục bảng............. ....................................................................................
...

iv

Danh mục hình.......... .........................................................................................
...

v

Tóm lược........... ..................................................................................................
..

vi

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU......................................................................................
..

1

1.1
Đặt vấn đề.............................................................................................
.............

1

1.2
Mục tiêu đề tài......................................................................................
.............

1

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................
..

3

2.1 Tổng quan về tình hình sử dụng
thuốc

bảo

vệ

vật………………………………………………….…..………...

thực
3

2.1.1 Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới……………………....3

2.1.2 Tình hình sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam………………………………....3
2.2 Ảnh hưởng của thuốc BVTV với môi trường và tiềm năng sử dụng
chế phẩm sinh học…………………..........................................................................
4
2.3 Tác hại thuốc diệt cỏ 2,4-D…………………..…………………………….......

5

2.5 Sự phân hủy sinh học 2,4-D……………………………………………………
.7
2.6 Hóa hướng động ở vi khuẩn………….………………………………………...
.8
2.6.1 Hóa hướng động............................................................................................
2.6.2 Cơ chế hóa hướng động……………………………………………….…….
9

8


2.6.3 Hóa hướng động đến các hợp chất nhân thơm có gốc Clo………………...11
2.6 Các

phương

pháp

kiểm

tra

hóa

hướng

động

khuẩn…………………….…12
2.6.1 Thí nghiệm trên môi trường agar………………………………………….1
2
2.6.2 Thử nghiệm trên agarose plug………………………………….…………12
2.6.3 Bộ nhỏ giọt…………………………………………………………….…..12
ii

ở

vi


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

2.6.4 Đo tỉ trọng của chất hấp dẫn……………………………………………...13
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………...14
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề
tài…………………………….……........

14

3.2 Phương tiện thí
nghiệm………………………………………………….........
3.2.1 Thiết

14

bị

thí

nghiệm……..…………………………………………...…......

14

3.2.2 Hóa
chất………………………………………………………………......

14

3.2.3 Các dòng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm……………….………..…..
….15
3.3 Phương

pháp

nghiên

cứu……………………………………………….........

15

3.3.1 Cơ sở tiến hành thí nghiệm khảo sát hóa hướng
động……………………..15
3.3.2

Thí

nghiệm

chứng

minh

hiện

tượng

hóa

hướng

động………………………16

3.3.3 So sánh khả năng di chuyển theo 2,4-D giữa các dòng vi
khuẩn...………..17
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO
LUẬN…………………………...………….18
4. 1 Khả năng hóa hướng động của các dòng vi khuẩn phân hủy 2,4D…………18
4. 2 So sánh khả năng hóa hướng động đến 2,4-D giữa các dòng vi
khuẩn………21
4.2.1 Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn
được

phân

lập

Giang.....................................................................................
4.2.2 Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn

iii

ở
21

Tiền


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
được

2012

phân

lập

ở

Sóc

và

Sóc

Trăng………………………………………………………..23
4.2.3 Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D giữa dòng vi khuẩn
ở

Tiền

Giang

Trăng……………………………………………………….25
4.2.4 Mối quan hệ giữa khả năng hóa hướng động và phân hủy 2,4-D
của

các

dòng

vi

……………………………………………………............

khuẩn

27

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………...….
..30
5.1 Kết
luận……......................................................................................................

30

5.2 Kiến
nghị……....................................................................................................

30

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………...…………..………. …….
31

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4- Dichlorophenoxyacetic acid

2,4-DCP

2,4- dichlorophenol

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BVTV

Bảo vệ thực vật

ctv.

Cộng tác viên

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

iv


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

EPA

Environment Protection Agency

FAO

Food and Agriculture Organization

HPK

Histidine protein kinase

MCP

Methyl-accepting chemotaxis protein

OD

Optical density

RR

Response regulator

TSA

Trypticase Soy Broth with agar

TSB

Trypticase Soy Broth

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 1. Các dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D được phân lập trong đất lúa
tỉnh Sóc Trăng và Tiền Giang…………………………...……...
………………….15

Bảng 2. Khoảng cách hóa hướng động theo 2,4-D và
sự tạo sinh khối của năm dòng vi khuẩn được phân lập ở Tiền
Giang…………...... 21

v


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Bảng 3. Khoảng cách hóa hướng động theo 2,4-D và
sự tạo sinh khối của năm dòng vi khuẩn được phân lập ở Sóc
Trăng...……………..24

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1. Công thức cấu tạo 2,4D……………………………………………………6
Hình 2. Cấu tạo chiên mao Escherichia
coli..............................................................

9

Hình 3. Hệ thống dẫn truyền tín hiệu hóa hướng động Escherichia
coli................. 11

vi


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Hình 4. Thí nghiệm khảo sát hóa hướng động
.......................................... ………..16
Hình 5. Hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn được phân lập
Tiền
Giang................................................................................................................

19

Hình 6. Hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn được phân lập Sóc Trăng
..................................................................................................................................

20

Hình 7. Hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn được phân lập
ở Tiền Giang sau một ngày thí nghiệm.................................................................

..22

Hình 8. Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D của năm dòng vi khuẩn
được phân lập ở Tiền Giang ...................................................................................

23

Hình 9. Hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn được phân lập
ở Sóc Trăng sau một ngày thí nghiệm ....................................................................

24

Hình 10. Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D của năm dòng vi khuẩn
được phân lập ở Sóc Trăng......................................................................................

25

Hình 11. Khả năng hóa hướng động theo 2,4-D của các dòng vi khuẩn
được phân lập ở Tiền Giang và Sóc Trăng............................................................

26

Hình 12. Khả năng hóa hướng động và phân hủy 2,4-D
của các dòng vi khuẩn……......

…………………………….......................…….…27

TÓM LƯỢC

Thí nghiệm chứng minh khả năng hóa hướng động của các dòng vi khuẩn
phân hủy 2,4-D được phân lập ở Tiền Giang và Sóc Trăng trên môi trường
khoáng tối thiểu (0.45 % agar) có bổ sung 2,4-D như nguồn cacbon duy nhất cho
thấy: tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng hóa hướng động theo 2,4-D. Điều

vii


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

này khẳng định khả năng hóa hướng động và phân hủy 2,4-D của các dòng vi
khuẩn là phụ thuộc nhau. Sự khác biệt về tốc độ di chuyển theo 2,4-D của mười
dòng vi khuẩn được ghi nhận sau một ngày thí nghiệm.
Kết quả so sánh khả năng hóa hướng động của các dòng vi khuẩn này cho
thấy: bốn dòng ST1, TG3, ST4, TG16 hóa hướng động theo 2,4-D nhanh nhất,
khả năng hóa hướng động giảm dần theo theo thứ tự TG2, ST7, ST14, ba dòng
TG26, TG27 và ST10 có khả năng hóa hướng động chậm nhất.
So sánh khả năng phân hủy và hóa hướng động theo 2,4-D cho thấy ba
dòng vi khuẩn ST1, TG3 và ST4 có khả năng phân huỷ mạnh và hoá hướng động
nhanh do đó có thể sử dụng các dòng vi khuẩn này để nghiên cứu ứng dụng trong
việc làm sạch 2,4-D trong môi trường bằng con đường sinh học

Từ khóa: hóa hướng động của vi khuẩn, 2,4-D, Cupriavidus, Burkholderia,

Ralstonia.

viii


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa nước là cây nông nghiệp chính ở Việt Nam, với diện tích canh tác bảy
triệu ha tương đương với hơn 60% tổng diện tích đất nông nghiệp của cả nước.
Quá trình cải tiến sản xuất, áp dụng khoa học kỹ thuật và mở rộng diện tích đất
canh tác đã đưa Việt Nam từ một nước nhập khẩu lúa gạo những năm1989 trở
thành một trong những quốc gia có sản lượng lúa gạo xuất khẩu hàng đầu thế
giới năm 1997 (Anonymous, 1996-1997). Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)
là vựa lúa trung tâm cung cấp hơn 75% tổng sản lượng lúa gạo cho cả nước
(). Để gia tăng sản lượng, ngoài việc thâm canh tăng
vụ, sử dụng các giống lúa cao sản, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV)
để phòng trừ sâu, bệnh, cỏ dại là điều cần thiết. Tuy nhiên do việc sử dụng thuốc
BVTV không đúng cách, không đúng liều lượng và việc lạm dụng nông dược
gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và hệ sinh thái. Một trong số những nông
dược đã và đang được sử dụng phổ biến nhất ở ĐBSCL là thuốc diệt cỏ 2,4-D
(Fernando và ctv., 2008).
2,4-D (2,4-Diclophenoxyacetic acid) là thuốc trừ cỏ nội hấp, chọn lọc dùng
để tiêu diệt cỏ lá rộng hậu nẩy mầm được sử dụng phổ biến ở nhiều quốc gia trên
thế giới. Thời gian bán hủy của 2,4-D tương đối dài (59,3 ngày trong đất, 66
ngày trong không khí và 39 ngày trong nước (EPA, 1988)). 2,4-D có khả năng
hòa tan cao nên chúng dễ thấm qua các mạch nước và khuyết tán xa gây ảnh
hưởng đến sinh vật trong hệ sinh thái (Rodrigues và ctv., 2005).
Trong đất, các vi sinh vật có khả năng phân hủy 2,4-D đã được phân lập và
định danh như Acinetobacter sp, Serratia marcescens, Stenothrophomonas
maltophilia, Flavobacterium sp và Penicillium sp được phân lập từ vùng đất bị ô
nhiễm 2,4-D ở Brazil (Silva và ctv., 2007). Ở Việt Nam, trong các mẫu đất đã
từng nhiễm 2,4-D, Huong và ctv. (2007; 2008) đã phân lập được 353 dòng vi
khuẩn (isolates) thuộc các nhóm như Achromobacter, Burkholderia, Delftia,
Halomonas, Pseudomonas và Sphingomonas chungbukensis.

1


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Ngoài khả năng phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường, hóa
hướng động là một đặc tính quan trọng giúp vi khuẩn di chuyển đến những nơi
có chất ô nhiễm để phân hủy chúng. Thật vậy, Helicobacter pylori (gây ung thư
dạ dày) tìm đến dịch chất nhày của dạ dày (Pittman và ctv., 2001), vi khuẩn đất
Agrobacterium tumefaciens tìm đến vết thương tổn trên rễ cây để chuyển plasmid
vào cây (Kim và ctv., 1998). R. eutropha JMP123 (pJP4) hóa hướng động đến
2,4-D để sử dụng chúng như cơ chất cho quá trình biến dưỡng (Hawkins và
Harwood, 2002).
Ở ĐBSCL, mười dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D được phân lập trong đất
lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng thuộc nhóm β-Proteobacteria, bộ Burkholderiales,
họ Burkholderiaceae (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv, 2011), tuy nhiên khả năng
hóa hướng động của các dòng vi khuẩn này thì chưa được khảo sát.

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Đề tài “Hóa hướng động của vi khuẩn phân hủy 2,4-D được phân lập ở
Tiền Giang và Sóc Trăng” được thực hiện với các mục tiêu như sau:
-

Khảo sát khả năng di chuyển về phía 2,4-D của các dòng vi khuẩn
được phân lập trong đất lúa nhiễm thuốc trừ cỏ 2,4-D ở Tiền Giang và
Sóc Trăng trong điều kiện phòng thí nghiệm.

-

So sánh khả năng di chuyển theo 2,4-D giữa các dòng vi khuẩn.

-

Tìm mối quan hệ giữa khả năng hóa hướng động và phân hủy 2,4-D
của các dòng vi khuẩn này.

2


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.2 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BẢO VỆ THỰC
VẬT
2.2.1

Tình hình sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới

Thuốc bảo vệ thực vật là hóa chất cần thiết trong hoạt động sản xuất nông
nghiệp. Sự gia tăng sản lượng nông sản kéo theo sự gia tăng chi phí và phụ thuộc
ngày càng nhiều vào thuốc BVTV. Theo số liệu thống kê năm 2001, chi phí sử
dụng thuốc BVTV trên thế giới được dùng tổng cộng hơn 32 tỉ đô la. Riêng tại
Mỹ, chi phí sử dụng thuốc trừ sâu là hơn 11 tỉ đô la trong cả năm 2000 và 2001
(Fishel, 2007). Trong đó chi phí sử dụng cho thuốc diệt cỏ ở Mỹ cao hơn các

nhóm thuốc BVTV khác. Mỹ đã sử dụng một lượng thuốc BVTV chiếm hơn
33% trong tổng số chi phí cho thuốc BVTV của thế giới (hơn 40% chi phí thuốc
diệt cỏ, hơn 33% cho thuốc trừ sâu và hơn 10% và 25 % cho thuốc diệt nấm và
thuốc BVTV khác tương ứng trong số tổng chi phí của từng nhóm thuốc BVTV
của thế giới) (Fishel, 2007). Ở châu Âu, hơn 64 ngàn tấn thuốc diệt cỏ mỗi năm
được sử dụng trong canh tác nông nghiệp, chủ yếu ở Pháp và Đức
( Ngoài ra, do hiểu biết của người sử
dụng còn hạn chế về cách sử dụng và tác hại của việc sử dụng nông dược không
hợp lý là một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng ô nhiễm gây ảnh
hưởng đến sức khỏe con người ( Trước tình hình sử
dụng nông dược tràn lan, nhiều nước trên thế giới cũng đã và đang đưa ra những
biện pháp xử lý, những chỉ tiêu về lượng nông dược lưu tồn trong môi trường và
những chỉ tiêu sử dụng nông dược hợp lý.

2.1.2 Tình hình sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam
Mặc dù là nước xuất khẩu lúa gạo hàng đầu thế giới nhưng dân số ở Việt
Nam ngày một gia tăng kéo theo nhu cầu lượng thực-thực phẩm ngày một tăng
cao trong khi diện tích đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp theo mức độ đô thị
hóa thì việc đảm bảo nguồn cung lượng thực vẫn là vấn đề khó khăn và thách
thức lớn. Để tăng sản lượng, ngoài việc tạo ra những giống lúa có năng suất cao,
3


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

nông dân đã tăng năng suất bằng cách thâm canh tăng vụ, nông dân phụ thuộc
ngày càng nhiều vào nông dược và phân bón hóa học. Việt Nam đặc biệt là
ĐBSCL là nước sử dụng thuốc BVTV và phân bón hóa học thuộc nhóm cao của

Đông Nam Á (Dung và Dung, 1997).
Số liệu thống kê năm 1994, ĐBSCL có diện tích đất nông nghiệp khoảng
2,6 triệu ha, chủ yếu là trồng lúa ( Thuốc trừ sâu
được sử dụng trong canh tác lúa là 65% tổng giá trị của nông dược trên thị
trường năm 1994 (Heong và ctv., 1996). Trong những năm 1990-1999, chi phí sử
dụng cho thuốc BVTV ở ĐBSCL cao nhất nước, cao hơn cả các nước có nền
nông nghiêp phát triển như: Phillippnes, Trung Quốc, Ấn Độ…(Dung và Dung,
1997). Số liệu thống kê năm 1996 cho thấy hàng năm Việt Nam đã sử dụng hơn
30.000 tấn thuốc BVTV (FAO, 2004). Ở ĐBSCL, trung bình có khoảng 1017 g
hoạt chất thuốc BVTV mỗi mùa (Dung và Dung, 1997). Do kiến thức về tác hại
của thuốc BVTV còn hạn chế nên nông dân thường bảo quản nông dược không
đúng nơi, không đủ độ cách li an toàn và sử dụng không đúng liều qui định.
Nông dân thường có có thói quen dùng nhiều thuốc BVTV sẽ có tác dụng nhanh
và đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc và nhiễm độc thường xuyên
(vethucvat).

2.4 ẢNH HƯỞNG CỦA THUỐC BVTV VỚI MÔI TRƯỜNG VÀ TIỀM
NĂNG ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC
Thuốc BVTV được sử dụng để trừ sâu, bệnh hại, cỏ dại… cho nhiều loại
cây trồng. Tuy nhiên, nếu lạm dụng thuốc BVTV hóa học sẽ ảnh hưởng đến sự
đa dạng sinh học. Thuốc BVTV làm tăng tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt
thiên địch, phá vỡ cân bằng sinh thái làm bộc phát dịch hại cây trồng. Sử dụng
thuốc BVTV tác động xấu đến môi trường gây ô nhiễm đất và nước. Khi sử dụng
thuốc BVTV, một tỷ lệ đáng kể thuốc bị rửa trôi và một phần lưu tồn trong đất,
dẫn đến nguồn nước làm ô nhiễm ảnh hưởng sức khỏe cộng đồng
(). Mặt khác, sử dụng thuốc hoá học không đúng
biện pháp đã gây ô nhiễm môi trường, đồng thời dư lượng thuốc trừ sâu trên
nông sản vượt quá giới hạn cho phép. Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền

4

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón
hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng
và thế giới nói chung. Các chế phẩm sinh học, trong đó có vi sinh vật trong sản
xuất nông nghiệp có các ưu điểm sau: không gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức
khỏe con người vật nuôi, cây trồng…, và không gây ô nhiễm môi trường sinh
thái. Ứng dụng các chế phẩm sinh học không làm hại kết cấu đất, không làm chai
đất, thoái hóa đất. Ngược lại, chế phẩm sinh học còn góp phần tăng độ phì nhiêu
của đất, chúng có tác dụng đồng hóa các chất dinh dưỡng, góp phần tăng năng
suất và chất lượng nông sản. Chế phẩm sinh học tiêu diệt côn trùng gây hại, giảm
thiểu bệnh hại, tăng khả năng đề kháng bệnh của cây trồng mà không làm ảnh
hưởng đến môi trường như các lọai thuốc BVTV có nguồn gốc hóa học. Ngoài
ra, chế phẩm sinh học còn có khả năng phân hủy, chuyển hóa các chất hữu cơ
bền, các phế thải sinh học, phế thải nông công nghiệp góp phần làm bảo vệ môi
trường ().
Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay được chia làm 3
nhóm

sản

phẩm

với

các

tính

năng

khác

():
- Chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng.
- Chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân
hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng.
- Chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp.
Đây là chế phẩm sinh học đang được đặc biệt quan tâm và nghiên cứu để
giải quyết tình hình ô nhiễm đang gia tăng. Vì vậy, nhóm chế phẩm sinh học đặc
biệt dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp mở ra những hướng đi đầy
tiềm năng để phát triển một nên nông nghiệp hiện đại và bền vững
()

2.5 THUỐC DIỆT CỎ 2,4-D (hình 1)
Tên thông dụng: 2,4-D
Tên khoa học: Dichlorophenoxyacetic acid
Công thức phân tử: C8H6Cl 2O3

5

nhau


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

Tên thương mại: Weedar 64, Low vol 4D, Crossbow, Envy 2,4-D, Vi 2,4-D
80WP, Anco 720 EC, OK 720 EC, …

Hình 1. Công thức cấu tạo 2,4-D ( />
Thuốc trừ cỏ 2,4-D được sử dụng đầu tiên tại Mỹ vào khoảng những năm
1940 (EPA, 1988), sau đó 2,4-D được sản xuất và sử dụng trên diện rộng vào
nửa đầu thế kỉ sau đó nhanh chống được lan rộng trở thành thuốc trừ cỏ phổ biến
hàng đầu trên thế giới. 2,4-D được sử dụng trên cạn và cả thủy vực. Các vùng
chính dùng thuốc trừ cỏ bao gồm đồng cỏ, thảm cỏ ở các con vòng và vùng đất
trồng trọt bao như các cánh đồng bắp, đậu nành, lúa mì, mía, lúa mạch... 2,4-D
được sử dụng cho các mục đích phi nông nghiệp như khai hoang, làm vườn, sân
golf, khu dân cư và các mục đích sử dụng đất khác (Silva và ctv., 2007).



Đặc tính hóa lý

2,4-D ở dạng rắn có màu từ trắng tới nâu, dễ hòa tan và tồn tại dưới nhiều
dạng như ester, acid, hoặc muối. 2,4-D dễ dàng chuyển vào mạch nước ngầm, do
khả năng hòa tan cao trong nước (600 mg/l ở 25ºC)( Rodrigues và ctv., 2005).
Thời gian bán hủy của 2,4-D tương đối dài (59,3 ngày trong đất, 66 ngày trong
không khí và 39 ngày trong nước (EPA, 1988)). Sau khi một thời gian dài sử
dụng thuốc diệt cỏ chứa 2,4-D một lượng đáng kể 2,4-D hoặc các sản phẩm
chính của quá trình phân hủy 2,4- dichlorophenol (2,4-DCP) vẫn được tìm thấy
trên bề mặt nước giếng hay nước sông hồ (Silva và ctv., 2007).

6

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học


2012

Đặc tính hóa sinh

2,4-D là một hợp chất có cấu tạo vòng thơm và gốc Clo. Công thức cấu tạo
này là một dạng đồng phân của họcmon kích thích tăng trưởng Auxin. 2,4-D
được sử dụng như một chất kích thích tăng trưởng và được dùng trong nuôi cây
mô thực vật (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Ở nồng độ thấp (<0.1 mg/l
2,4-D có thể kích thích phân chia tế bào, không là tác nhân gây đột biến, không
độc với hệ thần kinh, không là tác nhân gây ung thư (Chinalia và ctv., 2007;
Charles và ctv., 2001). Tuy nhiên, ở nồng độ cao (>0.1 mg/l) sẽ gây độc với tế
bào (Chinalia và ctv, 2007). 2,4-D gây rối loạn quá trình sinh trưởng và phát triển
như tăng lượng ADN, ARN, tăng quá nhanh quá trình sinh tổng hợp protein và
các chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật (Chinalia và ctv., 2007).
Cơ chế tác động của 2,4-D trên những đối tượng không phải là sinh vật đích
đã được nghiên cứu. Ở liều lượng trên ngưỡng an toàn, 2,4-D là chất độc đối với
sinh vật. 2,4-D được coi là một tác nhân gây ung thư, ảnh hưởng đến gan, tim và
trung tâm hệ thống thần kinh, dẫn đến co giật và cỏ có liên quan đến một số bệnh
của con người (Silva và ctv., 2007). 2,4-D có thể gây gây tử vong, cũng như tác
động

đến

sự

sinh

sản

và

hệ

thống

nội

tiết

(Silva và ctv., 2007). 2,4-D độc với động vật ở nồng độ 100-1200mg/kg tùy theo
từng loài (Hayse và ctv.,1991). Liều gây chết của 2,4-D ở chuột là 0,0022mg/kg,
ở người là 0,002 mg/kg (Mai Thanh Truyết, 2001). Ở người liều gây chết 50 %
của 2,4-D là 666-805 mg/kg (Hà Thị Hiến, 2003).

2.6 SỰ PHÂN HỦY SINH HỌC 2,4-D
Vi sinh vật phân hủy 2,4-D đã và đang được quan tâm nghiên cứu rộng rãi.
Nhiều vi sinh vật phân hủy 2,4-D đã được phân lập và định danh từ nhiều vùng
đất bị nhiễm 2,4-D các vùng địa lý khác nhau. Nghiên cứu của Silva và ctv.
(2007) đã phân lập và định danh các vi khuẩn phân hủy 2,4-D ở Brazil như
Acinetobacter

sp,

Serratia

marcescens,

Stenothrophomonas

maltophilia,

Flavobacterium sp và Penicillium sp. Yoriko và ctv. (2007) đã phân lập và định
danh các vi khuẩn phân hủy 2,4-D ở Nhật như Burkhoderia RASC. Trong đất
nhiễm 2,4-D ở Việt Nam, Huong và ctv. (2007, 2008) đã phân lập được 353 dòng

7


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

vi khuẩn (isolates) thuộc các nhóm như Achromobacter, Burkholderia, Delftia,
Halomonas, Pseudomonas và Sphingomonas chungbukensis. Những vi khuẩn
này đã được phân lập từ những vùng đất bị nhiễm 2,4-D ở miền Bắc, Trung,
Đông Nam Bộ chủ yếu tồn dư do chiến tranh Việt Nam và sử dụng cho mục đích
nông nghiệp. Lộ trình phân hủy sinh học của 2,4-D cũng đã được nghiên cứu chi
tiết ở Ralstonia eutropha JMP134 (Danilo và ctv., 2008).
Ở ĐBSCL, các vi khuẩn phân hủy 2,4-D cũng đã được phân lập và định
danh. Các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D này được phân lập trong
đất lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng thuộc nhóm β-Proteobacteria, bộ
Burkholderiales, họ Burkholderiaceae và được đặt tên là Cupriavidus sp. ST1,
Burkholderia sp. ST4, Cupriavidus sp. ST7, Cupriavidus sp. ST10, Burkholderia
sp. ST14, Cupriavidus sp. TG2, Cupriavidus sp. TG3, Cupriavidus sp. TG16,
Ralstonia sp. TG26, and Burkholderia sp. TG27 (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv,
2011). Khả năng phân hủy 2,4-D của chúng cũng đã được xác định. Trong các

dòng vi khuẩn phân lập ở Sóc Trăng, dòng Burkholderia sp. ST4 đã phân hủy
gần như hoàn toàn 500 mg 2,4-D/l sau 16 giờ nuôi cấy. Thời gian phân hủy 2,4D của dòng Cupriavidus sp. ST1 và Burkholderia sp. ST14 tương ứng là 24 giờ
và 28 giờ. Dòng Cupriavidus sp. ST7 và Cupriavidus sp. ST10 phân hủy gần như
hoàn toàn 2,4-D sau 32 giờ nuôi cấy. Trong các dòng vi khuẩn phân lập ở Tiền
Giang, dòng Cupriavidus sp. TG2 phân hủy gần như hoàn toàn lượng 2,4-D sau 4
giờ nuôi cấy. Thời gian phân hủy 2,4-D của các dòng Cupriavidus sp. TG3,
Cupriavidus sp. TG27 và Ralstonia sp. TG26 lần lượt là 12 giờ, 24 giờ và 32 giờ.
Dòng Cupriavidus sp. TG16 chỉ phân hủy 91,6% 2,4-D sau 32 giờ nuôi cấy. Như
vậy, trong các dòng vi khuẩn đã phân lập trong đất lúa ở Sóc Trăng và Tiền
Giang, dòng Cupriavidus sp. TG2 phân hủy 2,4-D nhanh nhất. Khả năng phân
hủy 2,4-D của các dòng vi khuẩn còn lại giảm dần theo thứ tự Cupriavidus sp.
TG3, Burkholderia sp. ST4, Burkholderia sp. TG27,

Cupriavidus sp. ST1,

Burkholderia sp. ST14, Cupriavidus sp. ST7, Cupriavidus sp. ST10, Ralstonia
sp. TG26 và Cupriavidus sp. TG16 (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv, 2011).

8


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

2.7 HÓA HƯỚNG ĐỘNG Ở VI KHUẨN
2.7.1 Hóa hướng động
Khả năng di chuyển có ý nghĩa quan trọng trong đời sống của vi sinh vật
trong việc di chuyển đến môi trường thuận lợi như thức ăn, độ ẩm, nồng độ muối,
ánh sáng thích hợp… cũng như trốn tránh, chạy khỏi nơi bất lợi.

Hóa hướng động là hiện tượng mà vi khuẩn di chuyển tới hóa chất (hóa
hướng động dương) hoặc di chuyển đi khỏi những chất độc hại với chúng (hóa
hướng động âm). Trong nhiều trường hợp chất hấp dẫn là chất cung cấp cho vi
khuẩn như một nguồn cacbon hoặc năng lượng, trong khi chúng sẽ là những chất
xua đuổi khi là chất độc hại với vi khuẩn (Pandey.G và Jain R. K, 2002).
Khả năng cảm nhận nồng độ các chất tạo thành hóa hướng động ở vi khuẩn
có ý nghĩa đặc biệt cho từng loài, chẳng hạn như Helicobacter pylori (gây ung
thư dạ dày) tìm đến dịch chất nhày của dạ dày (Pittman và ctv., 2001), vi khuẩn
đất Agrobacterium tumefaciens tìm đến vết thương tổn trên rễ cây để chuyển
plasmid vào cây (Kim và ctv., 1998)… Đối với sự cộng sinh, hóa hướng động
dẫn các vi khuẩn rhizobia sống tự do môi trường xung quanh đến các lông hút
trên rễ cây họ đậu nơi có nồng độ các chất dinh dưỡng cao (Pandya và ctv.,
1999).

2.7.2 Cơ chế hóa hướng động
Chiên mao là cơ quan di chuyển của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và ctv,
2009). Chúng được gắn vào trong tế bào vi khuẩn và sử dụng năng lượng điện để
xoay sợi roi dài đẩy vi khuẩn chuyển động.
Chiên mao là cấu trúc phức tạp của tế bào vi khuẩn, với các thành phần
protein bên trong tế bào chất, protein xuyên qua màng tế bào và protein ngoại
bào. Cấu trúc chiên mao điển hình đã được mô tả chi tiết ở vi khuẩn Escherichia
coli. Cấu tạo chiên mao bao gồm ba phần chính: thể gốc (basal body) là bộ phận
xuyên màng và trong tế bào chất, chúng tiếp nhận thông tin và sinh động lực cho
sự quay của roi; roi là phần ngoại vi màng được cấu tạo từ protein sợi tạo sự
chuyển động cho tế bào vi khuẩn; phần giữa roi và thể gốc là một móc (hook) giữ

9


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

cho roi cố định chiều quay nằm trên một trục dọc (Nguyễn Lân Dũng và ctv,
2009)(hình 2).
Roi

Móc
chiên
mao

Roi

Thể
gốc

Hình 2. Cấu tạo chiên mao Escherichia coli (Wadhams và Armitage, 2004)

Hệ thống tín hiệu hóa hướng động gồm các thành phần sau (hình 3): các hóa
thụ thể xuyên màng (chemoreceptors) tiếp nhận tín hiệu từ nồng độ hóa chất hay
còn được gọi là methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs). Ở E. coli có năm
loại hóa thụ thể Tsr, Tar, Tap, Trg và Aer. Protein CheW giúp cho sự liên kết
giữa MCP với protein CheA (của histidine protein kinese-HPK trong tế bào chất)
và cũng là nơi tích hợp thông tin cảm giác để kiểm soát CheA kinase hoạt động
gắn nhóm phosphat vào protein CheY. Hai protein kiểm soát đáp ứng với hóa
chất (response regulator-RR) là CheY và CheB. CheY sau khi được gắn nhóm
phosphat tạo thành CheY-P, CheY-P liên kết với protein quay FliM (thành phần
tạo chuyển động của chiên mao) gây ra sự nhào lộn và thay đổi trong hướng quay
của roi (Welch và ctv.,1993; Toker, 1997); protein CheB có 2 chức năng là
enzyme khử nhóm methyl của MCP và kiểm soát hoạt động của MCP. Ở E. Coli

the protein CheZ là một enzyme khử gốc phosphat của CheY-P dẫn đến kết thúc
sự quay cùng chiều kim đồng hồ và trả lại hướng quay trước kích thích hóa chất

10


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học
(McEvoy và ctv., 1999). CheR là enzyme gắn nhóm methyl của các hóa thụ thể
(Hess, 1988; Anand và ctv., 1998) (hình 3).
Khi giảm nồng độ của chất hấp dẫn giảm dẫn đến sự gắn kết của chất hấp
dẫn vào các hóa thụ thể giảm. Điều này kích thích protein CheA chuyển nhóm
phosphat vào Che-Y làm tăng nồng độ CheY-P đồng nghĩa với sự gia tăng nhào
lộn và đổi hướng quay của roi (quay cùng chiều kim đồng hồ-CW). Tín hiệu
CheY-P được kết thúc bởi CheZ (phosphotase-emzyme khử nhóm phosphate).
CheB cũng bị phosphoryl hóa bởi CheA là nguyên nhân gây ra sự gia tăng khử
gốc methyl tại các MCP. Khi MCP bị khử gốc methyl, chúng sẽ cảm ứng CheA
làm CheA làm giảm khả năng gắn gốc phostphat vào CheY, sự chuyển động của
vi khuẩn trở về mức trước khích thích (Wahams và Armitage, 2004).
Khi nồng độ chất hấp dẫn tăng, hóa chất sẽ gắn nhiều lên hóa thụ thể và làm
ức chế CheA gắn nhóm phosphat vào CheY, do đó giảm nồng độ CheY-P. CheBP giảm kéo theo CheR tăng chuyển nhóm methyl (CH3 +) vào các MCP. Ở trạng
thái hiện diện MCP có gắn nhóm methyl cao chúng sẽ kích thích cảm ứng sự
CheA (Wadhams và Armitage, 2004) gắn gốc nhóm phosphat vào CheY làm vi
khuẩn nhào lộn và chuyển hướng quay bơi về phía hóa chất.

Hình 3. Hệ thống dẫn truyền tín hiệu hóa hướng động Escherichia coli
(Wadhams và Armitage, 2004)

11

2012

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

2.7.3 Hóa hướng động đến các hợp chất nhân thơm có gốc Clo
Các hợp chất có gốc Clo rất phổ biến trong sinh quyển do các hoạt động
công nghiệp (Reinke và ctv., 1988). Một số trong số chất này được sử dụng trên
thế giới như thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu (Harayama và ctv., 1988). P. putida
PRS2000 được tìm thấy có khả năng hóa hướng động tới 3- 4 chlorobenzoate,
mặc dù những hợp chất không phải là hợp chất biến dưỡng của sinh vật này
(Harwood và ctv., 1990).
Theo nghiên cứu của Hawkins và Harwood (2002), R. eutropha JMP123
(pJP4) hóa hướng động theo hợp chất 2,4-D. Hóa hướng động thể hiện bởi sự
tăng trưởng và di chuyển theo 2,4-D. Khả năng này và phụ thuộc vào sự hiện
diện của plasmid pJP4 chứa gen tfd cần thiết cho sự phân hủy 2,4-D.

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA HÓA HƯỚNG ĐỘNG
Ở VI KHUẨN
2.7.1 Thí nghiệm trên môi trường agar
Vi khuẩn được chủng vào môi trường agar (0.2- 0.3%) có chứa chất hấp
dẫn. Vi khuẩn di chuyển trên agar về phía chất hấp dẫn (Parales và ctv., 2000).

2.7.2 Kiểm tra bằng lutrol
Lutrol F127 (là chất trùng hợp của polyethylene và polypropylene) ở trạng
thái lỏng ở nhiệt độ thấp, chúng chuyển thành dạng đặc ở nhiệt độ cao. Trong
môi trường lỏng vi khuẩn bơi tới chất hấp dẫn. Khi nhiêt độ tăng, môi trường
lỏng chuyển thành dạng đặc. Điều này làm cho sự chuyển động vi khuẩn bị cản
trở và chúng phát triển tạo khuẩn lạc. Sự chuyển động của vi khuẩn dưới sự ảnh

hưởng chất hấp dẫn được quan sát bằng sự phát triển của vi khuẩn (Thomson và
ctv., 2001).

2.7.3 Thử nghiệm trên agarose plug
Agarose được trộn với hóa chất để kiểm tra khả năng hóa hướng động khi
đổ lên kính mang vật. Kính đậy vật được cố định bằng hai thạnh nhựa phía trên.
Một vùng trống sẽ được hình thành khi agarose đã được hình thành. Dung dịch

12


Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

huyền phù có chứa vi khuẩn đang di chuyển được cho vào vùng này và các chất
hấp dẫn khuyếch tán vào dung dịch huyền phù. Hiện tượng hóa hướng động được
nhận biết bằng các dãy băng của vi khuẩn xung quanh agarose plug trong thời
gian chưa tới năm phút. Phương pháp này dùng để kiểm tra các cơ chất dễ bay
hơi và dễ hòa tan trong môi trường nước (Parales và Harwood, 2002).

2.7.4 Bộ nhỏ giọt
Vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng nhanh (giai đoạn log) được thu và
chuyển

thành

huyền

phù

trong

chất

đệm

hóa

hướng

động.

Hydroxypropylmethylcellulose 1% được thêm vào huyền phù. Lớp huyền phù có
vi khuẩn hơi nhớt sau đó tách lớp sâu khoảng 3mm trong dĩa Petri vòng kính
60mm. Một lượng nhỏ chất hấp dẫn dùng để kiểm tra hóa hướng động được thêm
vào ở giữa dĩa. Vi khuẩn hóa hướng động đáp ứng lại hóa hướng động tạo thành
một vòng đục ở gần trung tâm dĩa Petri (Grimm và Harwood, 1997).

2.7.5

Đo tỉ trọng của chất hấp dẫn

Đây là một phương pháp mới để định lượng hóa hướng động (Ortega-Calvo
và ctv., 2003). Cuvette thạch anh 5 ml được dùng để làm buồng đo tỉ trọng. Cho
vào cuvette 5ml dung dịch đệm gây hóa hướng động chứa 50 ml dung dịch gây
hóa hướng động. Sau đó bơm 200 ml vi khuẩn với nồng độ 109 tế bào m/l vào
đáy của cuvette. Mật số vi khuẩn được đo ở các thời điểm khác nhau.

13

Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Sinh học

2012

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.3 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài


Thời gian: tháng 12 năm 2012 tháng 5 năm 2012



Địa điểm thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự

Nhiên và phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển
Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Phương tiện thí nghiệm
3.3.1 Thiết bị thí nghiệm
 Túi nylon, bút lông dầu
 Dĩa pertri 20, 50 ml; que cấy, tăm tre, eppendorf , tuýp các loại (Đức)
 Ống nghiệm
 Kim mũi giáo
 Giấy lọc Whatman
 Màng lọc (Φ=0.22 µm) (Đức)
 Cân phân tích Mettler Toler (Switzerland)
 Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)

 Máy đo quang phổ Beckman Coulter DU 640B (Đức)
 Tủ ủ Memmert (Đức)
 Máy lắc Heidolph MR3001 (Đức)
 Micropipet P10, P20, P50, P50, P200, P1000 Gibson (Đức)
 Nồi khử trùng nhiệt ướt HVE-50
 Tủ lạnh trử mẫu (Hitachi, Nhật)
 Máy ảnh kỹ thuật số Panasonic DMC-S1

3.2.2 Hóa chất
Các hóa chất pha trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Na2HPO4(Merck) ,
KH2PO4 (Merck), (NH4)2PO4 (Merck), MgSO4.7H2O (Merck), Na2-EDTA
(Merck),

FeSO4.7H2O

(Merck),

MnSO4.H2O

14

(Merck),

H3BO3

(Merck),