Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm

Header Page 1 of 128.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
*************************

PHAN LÊ SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ
BÀO TRỨNG BÒ ĐỂ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI- 2013

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 1 of 128.


Header Page 2 of 128.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
*************************

PHAN LÊ SƠN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG
ĐẾN HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT SIÊU ÂM HÚT TẾ

BÀO TRỨNG BÒ ĐỂ TẠO PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM
Chuyên ngành: Sinh sản và bệnh sinh sản gia súc
Mã số: 62 64 01 06

LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TSKH. CÙ XUÂN DẦN
2. PGS.TS. HOÀNG KIM GIAO

HÀ NỘI- 2013

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 2 of 128.


Header Page 3 of 128.

LỜI CAM ĐOAN
- Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã
được ghi nhận và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ
nguồn gốc.

Nghiên cứu sinh

Phan Lê Sơn

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 3 of 128.

Header Page 4 of 128.

Lêi c¶m ¬n
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo Trường Đại
học Nông nghiệp Hà Nội, không những đã giảng dạy và dìu dắt tôi trong suốt
gần 5 năm học đại học mà còn tạo điều kiện để tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban lãnh
đạo cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Viện Chăn nuôi, cơ quan chủ quản,
nơi tôi công tác, trưởng thành, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành
nhiệm vụ, được học tập và hoàn thành công trình nghiên cứu của mình.
Tôi xin cảm ơn chân thành các đơn vị sau đây đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi
có thể hoàn thành luận án này.
- Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
- Bộ môn Hóa sinh, Sinh lý động vật, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
- Bộ môn Sinh lý, Sinh hóa và Tập tính vật nuôi, Viện Chăn nuôi
- Trạm kiểm nghiệm và Bảo tồn vật nuôi, Viện Chăn nuôi
Để hoàn thành bản luận án này tôi cũng xin gửi tới thầy giáo người hướng
dẫn khoa học GS.TSKH. Cù Xuân Dần và PGS.TS. Hoàng Kim Giao lòng biết
ơn sâu sắc về sự tận tình giúp đỡ, động viên, dìu dắt tôi trong cuộc sống cũng
như trong suốt quá trình hoàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết
ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Đặng Thái Hải luôn động viên, dạy bảo,
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành được luận án này.
Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ths. Lưu Công Khánh, TS. Nguyễn
Văn Lý, Ths. Nguyễn Thị Thoa, TS. Phan Văn Kiểm, TS. Đào Đức Thà, TS.
Nguyễn Thạc Hòa và các bạn đồng nghiệp.
Xin cảm ơn gia đình và người thân đã động viên, tạo điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình công tác cũng như hoàn thành bản luận án này.
Hà Nội, năm 2013
Nghiên cứu sinh

Phan Lê Sơn

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 4 of 128.


Header Page 5 of 128.

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan…………………………………………………………..

I

Lời cảm ơn……………………………………………………………..

II

Mục lục………………………………………………………………...

III

Danh mục các từ viết tắt……………………………………………….

VI

Danh mục các bảng…………………………………………………….

VII

Danh mục các hình…………………………………………………….

IX

MỞ ĐẦU………………………………………………………………

1

1. Đặt vấn đề…………………………………………………………..

1

2. Mục đích nghiên cứu……………………………………………….

2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài……………………………

2

4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận………….

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

5

1.1. Buồng trứng……………………………………………………….

5

1.2. Tế bào trứng……………………………………………………….

7

1.2.1. Sự hình thành tế bào mầm nguyên thủy………………………

7

1.2.2. Sự phát triển của tế bào mầm nguyên thủy thành túi noãn……

8

1.2.3. Sự phát triển của túi noãn thành tế bào trứng…………………

9

1.3. Nang trứng………………………………………………………...

10

1.3.1. Sự hình thành nang trứng nguyên thủy……………………….

10

1.3.2. Sự phát triển của nang trứng…………………………………..

11

1.3.3. Chức năng của nang trứng…………………………………….

14

1.3.4. Sự hình thành sóng nang………………………………………

15

1.4. Hormone…………………………………………………………..

16

1.4.1. Cơ chế điều khiển của hormone đến sự phát triển nang trứng

16

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 5 of 128.


Header Page 6 of 128.

1.4.2. Vai trò của FSH ………………………………………………

17

1.5. Thu tế bào trứng…………………………………………………..

19

1.5.1. Thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ……………………….

19

1.5.2. Thu tế bào trứng từ bò sống…………………………………..

20

1.5.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng số lượng, chất lượng tế
bào trứng và kết quả tạo phôi in vitro khi siêu âm hút tế bào trứng…..

23

1.6. Nuôi tế bào trứng in vitro…………………………………………

32

1.6.1. Nuôi thành thục tế bào trứng in vitro…………………………

32

1.6.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến kết quả nuôi thành thục tế bào
trứng……………………………………………………………………

35

1.7. Tạo phôi in vitro…………………………………………………..

43

1.7.1. Thụ tinh in vitro………………………………………………

43

1.7.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thụ tinh của tế bào

46

trứng……………………………………………………………………
1.8. Nuôi phôi in vitro………………………………………………….

48

1.8.1. Môi trường nuôi phôi………………………………………

48

1.8.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của phôi………..

50

1.9. Ảnh hưởng của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng đến kết quả
nuôi thành thục, thụ tinh và tạo phôi in vitro………………………….

53

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…

56

2.1.Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu……………………

56

2.1.1.Vật liệu………………………………………………………..

56

2.1.2. Nội dung nghiên cứu…………………………………………

56

2.1.3.Phương pháp nghiên cứu……………………………………..

56

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu………………………………..

64

CHƯƠNG 3. KÊT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………..

66

3.1. Ảnh hưởng của áp lực hút …………………………………...........

66

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 6 of 128.

Header Page 7 of 128.

3.2. Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng ………………..

76

3.3. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng …………………………..

84

3.4. Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội..

91

3.5. Ảnh hưởng của liều lượng FSH …………………………………..

96

3.6. Ảnh hưởng của giống bò………………………………………….

104

3.7. Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng………………………….

109

3.8. Ảnh hưởng của mùa vụ……………………………………………

113

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………………….

120

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
ÁN……………………………………………………………………..

122

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………

123

TIẾNG VIỆT…………………………………………………………

123

TIẾNG ANH………………………………………………………….

124

PHỤ LỤC……………………………………………………………..

148

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 7 of 128.


Header Page 8 of 128.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BSA

: Bovine Serum Albumin

F3

: Holstein Friesian x Lai Sind

FCS

: Foetal Calf serum

FSH

: Follicle Stimulating Hormone

GnRH

: Gonadotropin Releasing Hormone

HEPES

: N-(2 Hydroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethanesulforic acid)

HF

: Holstein Friesian

LH

: Luteinizing Hormone

MEM

: Minimum Essential Medium

PGF2α

: Prostaglandin F2α

SOF

: Synthetic oviduct fluid

TCM-199

: Tisue culture medium 199

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 8 of 128.


Header Page 9 of 128.

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

1.1

Đặc điểm phát triển của nang trứng bò ở giai đoạn đầu

1.2

Số lượng tế bào trứng và tỉ lệ phôi nang thu được ở các
giống bò khác nhau

1.3

Trang
14
29

Số lượng tế bào trứng và phôi nang thu được của bò ở các
độ tuổi khác nhau

31

1.4

Đánh giá chất lượng tế bào trứng ở 6 mức độ khác nhau

37

1.5

Mối quan hệ giữa đặc điểm tế bào chất và chất lượng tế bào
trứng

3.1

40

Số lượng nang trứng được hút và ảnh hưởng của áp lực hút
đến số lượng tế bào trứng thu được

66

3.2

Ảnh hưởng của áp lực hút đến chất lượng tế bào trứng

69

3.3

Ảnh hưởng của áp lực hút đến sự phân chia của hợp tử,
phôi dâu và phôi nang

3.4

72

Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến số
lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu
được

3.5

Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến chất
lượng tế bào trứng

3.6

3.9

80

Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến số lượng nang
trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

3.8

79

Ảnh hưởng của tần suất siêu âm hút tế bào trứng đến sự
phân chia của hợp tử, phôi dâu và phôi nang

3.7

76

85

Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng tế
bào trứng

86

Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến sự phân chia của

88

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 9 of 128.


Header Page 10 of 128.

hợp tử, phôi dâu và phôi nang
3.10

Ảnh hưởng của pha nang trứng phát triển và pha nang trứng
trội đến số lượng nang trứng được hút và số lượng tế bào
trứng thu được

3.11

Ảnh hưởng pha nang trứng phát triển và pha nang trứng trội
đến chất lượng tế bào trứng

3.12

91
93

Ảnh hưởng của các liều lượng FSH đến số lượng nang
trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

96

3.13

Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến chất lượng tế bào trứng

98

3.14

Ảnh hưởng của liều lượng FSH đến sự phân chia của hợp
tử, phôi dâu và phôi nang

3.15

Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến số lượng
nang trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

3.16

110

Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến sự phân chia
của hợp tử, phôi dâu và phôi nang

3.21

109

Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế
bào trứng

3.20

106

Ảnh hưởng của tuổi bò cho tế bào trứng đến số lượng nang
trứng được hút và số lượng tế bào trứng thu được

3.19

105

Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến sự phân chia
của hợp tử, phôi dâu và phôi nang

3.18

105

Ảnh hưởng của giống bò cho tế bào trứng đến chất lượng tế
bào trứng

3.17

100

111

Ảnh hưởng của mùa vụ đến số lượng nang trứng được hút
và số lượng tế bào trứng thu được

114

3.22

Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng tế bào trứng

115

3.23

Ảnh hưởng của mùa vụ đến sự phân chia của hợp tử, phôi
dâu và phôi nang

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128.

115


Header Page 11 of 128.

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cấu tạo của buồng trứng

7

1.2

Sơ đồ tóm tắt quá trình phát triển nang trứng

11

1.3

Phương pháp thu tế bào trứng từ buồng trứng lò mổ

20

1.4

Hệ thống siêu âm hút tế bào trứng

21

1.5

Các hình ảnh thu được khi đầu dò siêu âm ở các vị trí khác
nhau trên buồng trứng

22

1.6

Khả năng thao tác và quan sát buồng trứng của 2 loại đầu dò

24

1.7

Phân chia chất lượng hợp tử

51

1.8

Hợp tử

52

3.1

Tế bào trứng có chất lượng A, B, C và D

70

3.2

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 4 mức
độ áp suất khác nhau

73

3.3

Phương pháp cố định buồng trứng bằng bốn ngón tay

75

3.4

Phương pháp cố định buồng trứng bằng ngón tay trỏ và ngón
tay cái

3.5

Nang trứng quan sát được ở tần suất 2 tuần, 1 tuần và ½
tuần/lần

3.6

75

77

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở ba tần
suất khác nhau

83

3.7

Đếm và đo kích thước của các nang trứng

85

3.8

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 11 of 128.


Header Page 12 of 128.

hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 3 mức
độ kích thước khác nhau

90

3.9

Buồng trứng ở pha nang trội

92

3.10

Tế bào trứng trước và sau khi nuôi

93

3.11

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai pha
sóng nang

3.12

Một số phôi dâu và phôi nang thu được có chất lượng khác
nhau

3.13

95

101

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở 6 liều
lượng FSH khác nhau

3.14

104

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở hai
giống bò cho tế bào trứng khác nhau

3.15

108

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở bò 3 tuổi
và bò 6 tuổi

3.16

112

Biểu đồ đánh giá số lượng nang trứng, số lượng tế bào trứng,
hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang thu được ở vụ đông

3.17

– xuân và vụ hè - thu

117

Ảnh hưởng của stress nhiệt lên chất lượng tế bào trứng

119

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 12 of 128.


Header Page 13 of 128.

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Tạo ra đàn bò sữa có năng suất cao, chất lượng sữa tốt, thích nghi với
điều kiện khí hậu nước ta, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ sữa trong nước và giảm
lượng sữa nhập khẩu đang là nhu cầu cấp thiết. Do vậy, công nghệ cấy truyền
phôi đang được các nhà khoa học nước ta quan tâm nghiên cứu để nâng cao
được cường độ chọn lọc, đẩy nhanh được tiến độ di truyền, khai thác được tối
đa tiềm năng sinh sản của bò cái có giá trị di truyền cao (theo Erickson,
1966a) buồng trứng bò trưởng thành có khoảng 70.000 nang trứng nguyên
thủy có thể phát triển, thụ tinh và tạo phôi trong ống nghiệm), rút ngắn được
khoảng cách thế hệ, tăng khả năng thích nghi của đời con sinh ra. Năm 1986,
con bê đầu tiên ở nước ta đã ra đời từ công nghệ cấy truyền phôi. Tiếp theo sự
thành công đó, bê thụ tinh trong ống nghiệm, cắt phôi, xác định giới tính cũng
lần lượt được sinh ra. Song khả năng ứng dụng rộng rãi vào thực tế sản xuất
vẫn còn nhiều hạn chế. Có rất nhiều nguyên nhân, nhưng một trong những
nguyên nhân chính là do giá thành phôi in vivo còn cao, do sử dụng hormone
ngoại nhập để gây rụng trứng nhiều. Phôi in vitro có giá thành thấp, song chất
lượng chưa cao, do sử dụng tế bào trứng được thu từ buồng trứng lò mổ để
tạo phôi trong ống nghiệm. Vì vậy muốn giải quyết được điều đó chúng ta cần
làm chủ được nguồn cung cấp tế bào trứng có chất lượng tốt để tạo phôi trong
ống nghiệm. Năm 2005, kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống để tạo
phôi trong ống nghiệm bắt đầu được nghiên cứu tại Viện Chăn nuôi, mở ra
một bước ngoặt và triển vọng mới trong việc ứng dụng công nghệ cấy truyền
phôi vào thực tế sản xuất. Kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống cho
phép thu được rất nhiều tế bào trứng từ bê, bò có độ tuổi khác nhau, bò cạn
sữa, bò đang vắt sữa, bò chậm sinh và thậm chí bò đang mang thai tháng thứ 3

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 13 of 128.

Header Page 14 of 128.

thứ 4, với tần suất lên đến 2 lần/tuần và thậm chí 2 - 3 ngày một lần (Galli và
cs., 2003). Do vậy số phôi thu được lên đến 200 phôi/bò/năm và 100 bê sinh
được sinh ra khi số phôi này được cấy chuyển cho bò nhận phôi (Merton và
cs., 2003), cao hơn nhiều so với kỹ thuật gây rụng trứng nhiều (50
phôi/bò/năm, số bê sinh ra khi cấy là 30 bê). Ngoài các tiềm năng đó kỹ thuật
siêu âm hút tế bào trứng thành công cũng góp phần nâng cao hiệu quả và khả
năng ứng dụng của các công nghệ như: cloning, chuyển gen, vi tiêm, bảo tồn
nguồn gen dưới dạng tế bào trứng,…
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến số lượng nang trứng được hút, số
lượng, chất lượng tế bào trứng, phôi dâu và phôi nang thu được khi tiến hành
siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm như: Giống, tuổi,
mùa vụ, tần suất hút, các giai đoạn phát triển của đợt sóng nang, áp lực hút,
kích thước nang trứng và rất nhiều yếu tố khác. Chính vì lẽ đó chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài "Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả
của kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm"
2. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá được sự ảnh hưởng các yếu tố đến hiệu quả của kỹ thuật
siêu âm hút tế bào trứng bò để tạo phôi trong ống nghiệm.
- Xác định được các yếu tố phù hợp, tăng số lượng nang trứng được
hút, số lượng tế bào trứng thu được, hợp tử phân chia, phôi dâu và phôi nang
thu được.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Đây là một kỹ thuật mới, lần đầu tiên được nghiên cứu và ứng dụng ở
nước ta vào năm 2005. Là kỹ thuật có giá trị kinh tế cao, mở ra một triển vọng
mới trong việc sản xuất và thương mại hóa phôi trong ống nghiệm.
- Nâng cao được chất lượng, số lượng tế bào trứng, từ đó tăng số lượng,
chất lượng phôi dâu và phôi nang. Hạ được giá thành của phôi, tăng khả năng

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 14 of 128.


Header Page 15 of 128.

ứng dụng vào thực tế sản xuất ở nước ta.
- Cho phép thu tế bào trứng liên tục 2 lần/tuần ở bê, bò trưởng thành,
bò chậm sinh và thậm chí bò mang thai trong 3 tháng đầu mà không cần sử
dụng hormone để kích thích.
- Siêu âm hút tế bào trứng không làm ảnh hưởng đến quá trình tiết sữa.
Bò cho tế bào trứng sẽ động dục và sinh sản bình thường sau khi ngừng siêu
âm hút tế bào trứng 7 – 10 ngày.
- Cho phép tạo ra nhiều phôi và bê trên một cá thể bò mẹ có giá trị di
truyền cao.
- Cung cấp tế bào trứng có chất lượng cho các nghiên cứu cơ bản như:
Đông lạnh tế bào trứng, xác định giới tính, cloning, chuyển gen, bảo tồn quỹ
gen dưới dạng tế bào trứng.
- Chủ động được thời gian và số lượng tế bào trứng.
4. Những đóng góp mới của luận án về học thuật và lý luận
- Cơ sở khoa học, phương pháp và kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng là
tài liệu tham khảo cho các nhà nghiên cứu, giảng dạy và học tập.
- Ứng dụng kỹ thuật siêu âm cho phép mở ra một hướng mới trong việc
nghiên cứu quá trình sinh sản, tình trạng sinh sản của bò thông qua việc đánh
giá cấu trúc và hoạt động của buồng trứng. Chẩn đoán bệnh của cơ quan sinh
dục, giới tính thai, điều khiển chu kỳ động dục, đánh giá tình trạng sinh sản
của đàn, điều trị bênh u nang buồng trứng, kiểm tra năng suất bò đực giống từ
những con bê được sinh ra/cùng một cặp bố mẹ.
- Siêu âm hút tế bào trứng có thể thực hiện 2 tuần/lần mà không làm
ảnh hưởng đến chức năng của buồng trứng, sự phát triển của các nang trứng,

số lượng, chất lượng, khả năng thành thục, khả năng thụ tinh, hợp tử phân
chia, khả năng phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang ở bò HF và bò
lai HF được chăm sóc và nuôi dưỡng ở điều kiện nước ta.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 15 of 128.


Header Page 16 of 128.

- Các tế bào trứng thu được từ nang trứng kích thước 2 mm trở lên có
chất lượng tốt đều có thể thành thục, thụ tinh và phát triển đến giai đoạn phôi
dâu và phôi nang.
- Bò cho tế bào trứng sẽ động dục sau khi ngừng siêu âm hút tế bào
trứng từ 8 - 10 ngày.
- Sau khi siêu âm hút tất cả các nang trứng có kích thước từ 2 mm trở
lên, trong khoảng thời gian 2 ngày một đợt nang trứng có kích thước từ 2 mm
trở lên lại xuất hiện.
- Sử dụng FSH để kích thích trước khi siêu âm hút tế bào trứng làm
tăng số lượng các nang trứng có kích thước từ 2 mm trở lên, làm tăng chất
lượng tế bào trứng do FSH tăng cường sự phát triển các tế bào hạt và tăng
cường sự chuyển hóa của các nang trứng ở các giai đoạn khác nhau.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 16 of 128.


Header Page 17 of 128.

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Buồng trứng

Buồng trứng bò được hình thành khi các gò tuyến sinh dục phát triển
do có sự dày lên của khoang biểu mô ở mặt giữa của trung thận (Dyce và cs.,
1966) và tạo sự liên kết với các mô trung thận bởi rất nhiều tế bào được gọi là
màng sợi giới tính nguyên thủy (Byskov và Hoyer, 1994). Ở gò tuyến sinh
dục, túi noãn hoàng được bao quanh bởi các sợi tế bào mầm (ovigerous) và
được hình thành do có sự bao bọc xung quanh bởi các sợi tế bào mầm, tạo nên
một tổ hợp bao gồm tế bào biểu mô, túi noãn. Các tế bào biểu mô hay các tế
bào soma là các tế bào có nguồn gốc từ khoang biểu mô, có hình lập phương
hay nhân tế bào hình cầu và là tiền thân của các tế bào nang trứng (Hirshfield
và Desanti, 1995). Trung mô hay tế bào cơ chất là tế bào có nguồn gốc từ sự
phân tầng phần mặt ngoài trung thận, nhân kéo dài ra và có sự xuất hiện của
các nguyên bào sợi và làm cho các tế bào mô vỏ (theca cells) tăng lên. Ở phần
cơ sở, các sợi tế bào mầm được liên kết với nhau bởi mô trung thận và ở bề
mặt chúng được liên kết với biểu mô sinh dục. Ở bò gò tuyến sinh dục được
biến đổi thành buồng trứng ở ngày thứ 40 của bào thai. Với sự phân rã của
các sợi tế bào nguyên thủy, buồng trứng phân ra thành phần vỏ và phần tủy
(Erickson, 1966a).
Buồng trứng bò là cơ quan sinh sản của gia súc cái, sản sinh ra tế bào
trứng và các hormone sinh sản của gia súc cái (oestrogen và progestins).
Trong tự nhiên, số lượng tế bào trứng rụng, thụ thai và số con được sinh ra
khác nhau giữa các loài, như: trâu, bò, ngựa,…mỗi chu kỳ động dục chỉ rụng
một tế bào trứng, cá biệt có hai tế bào. Song dê, lợn,…mỗi chu kỳ động dục
lại rụng nhiều tế bào trứng, số lượng tế bào trứng rụng ở lợn lên tới 25 tế bào.

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 17 of 128.


Header Page 18 of 128.

Buồng trứng bò được cấu tạo bao gồm miền tủy bên trong và miền vỏ

bên ngoài, hai miền đó được cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp. Miền tủy
có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các
lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng, xảy ra quá trình trứng chín, rụng
trứng và tạo ra các hormone (Hình 1.1). Trong cơ thể, buồng trứng được treo
ở cạnh trước dây chằng rộng, nằm trong xoang chậu. Ở bò chúng ta có thể xác
định được bằng tay khi khám qua trực tràng. Buồng trứng thường có hình
ovan dẹt, song hình dáng và kích thước của buồng trứng sẽ bị thay đổi và biến
dạng do sự phát triển của nang trứng và sự tồn tại của thể vàng . Kích thước
của buồng trứng to hay nhỏ phụ thuộc rất nhiều vào giống, tuổi của bò. Kích
thước bình quân của buồng trứng ở bò Lai Sind là 23,45 x 16,50 x 11,55 mm
và ở bò sữa 35 x 25 x 15 mm (Bearden và Fuquay, 2000) và 4 x 2 x 1,5 cm
(Dyce và cs., 1987). Buồng trứng được xem như một tuyến nội tiết của con
cái, làm nhiệm vụ nuôi dưỡng cho trứng chín, tiết ra các hormone sinh dục,
tác động đến chức năng của tử cung và làm thay đổi tính biệt giữa con đực và
con cái.
Khi buồng trứng có các nang trứng thành thục, các tế bào hạt trong biểu
mô nang trứng tiết ra nhiều oestrogen, oestrogen có chức năng tới đặc tính
sinh dục thứ cấp của gia súc cái làm âm đạo tiết ra nhiều dịch nhầy, âm hộ
xung huyết đỏ, sừng tử cung và ống dẫn trứng dinh dưỡng được tăng cường,
tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn con vật xuất hiện động dục. Đồng thời
tiết ra hormone progesterone từ thể vàng đi vào máu sau khi rụng trứng, có
tác dụng kích thích niêm mạc tử cung, tăng cường dinh dưỡng, màng nhầy
phát triển để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ, đồng thời còn tác dụng tới tế
bào biểu mô màng nhầy tử cung tiết ra nhiều glycogen và các chất dinh dưỡng
nuôi phôi, giúp phôi bám chặt vào thành tử cung và phát triển. Progesterone
còn ức chế nang trứng chín trên buồng trứng, thông qua sự ức chế của FSH ức

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 18 of 128.

Header Page 19 of 128.

chế cơ trơn tử cung làm giảm co bóp, giảm hormone thùy sau tuyến yên làm
cho tử cung yên tĩnh trong thời gian mang thai. Ngoài ra progesterone còn
kích thích tuyến vú phát triển. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là
biểu mô bề mặt. Ngay bên dưới biểu mổ bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các
mô liên kết, phía dưới lớp mô dày đặc là nhu mô có chứa nang trứng và các tế
bào phân tiết hormone buồng trứng. Sự hình thành của chức năng buồng trứng
phụ thuộc vào: Giai đoạn đầu của phân bào giảm nhiễm, quá trình hình thành
nang trứng và sự khác nhau của các tế bào sản sinh steroid.

Nang trứng nguyên thủy

Nang trứng
sắp rụng

Nang trứng
Đang phát triển
(Tertiary)

Nang trứng thứ cấp
Nang trứng thoái
hóa
Thể bạch

Nang trứng rụng
Tế bào
trứng

Thể huyết

Thể vàng

Hình 1.1. Cấu tạo của buồng trứng (Nguồn: Bearden và Fuquay, 2000)
1.2. Tế bào trứng
1.2.1. Sự hình thành tế bào mầm nguyên thủy
Nguồn gốc của tế bào trứng là tế bào mầm nguyên thủy. Tế bào mầm
nguyên thủy được hình thành từ nội bì của túi noãn hoàng ở thời kỳ phôi thai
(Byskov và Hoyer, 1994; Senger, 1997). Tế bào mầm nguyên thủy di chuyển
theo kiểu amip từ biểu mô của túi noãn hoàng theo đường mặt lưng màng treo
ruột của đoạn cuối ruột phôi và di chuyển đến các gò tuyến sinh dục (Senger,
1997) khi bào thai được 35 - 36 ngày tuổi ở bò (Erickson, 1966b). Các gò

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 19 of 128.


Header Page 20 of 128.

tuyến sinh dục là túi sinh dục chưa được phân hóa và được hình thành ở ngày
thứ 32 của bào thai bò (Erickson, 1966b). Các yếu tố giúp cho tế bào mầm
nguyên thủy di chuyển được đến gò tuyến sinh dục vẫn chưa được hiểu rõ
ràng. Tuy nhiên khi nghiên cứu in vivo (French-Constant và cs., 1991) và
nghiên cứu in vitro (Alvarez và Merchan, 1986) đều thấy có sự tham gia của
fibronectin, fibronectin có mặt trên đường đi từ biểu mô của túi noãn hoàng
đến gò tuyến sinh để tạo nên sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy
(French-Constant và cs., 1991). Nghiên cứu in vitro trên chuột cho thấy rằng
yếu tố sinh trưởng biến đổi β1 (Transforming growth factor β1) được tạo ra
bởi tuyến sinh dục liên quan đến dãy hóa chất (Godin và Wylie, 1991), ảnh
hưởng đến tế bào mầm nguyên thủy làm cho chúng di chuyển theo một
phương hướng nhất định. Cũng nghiên cứu trên chuột (De Felici và Pesce,
1994) thấy rằng bộ giao tử (Kit Gland) cần thiết cho sự sống sót và sự phát

triển của tế bào mầm nguyên thủy khi di chuyển (Kit Ligand cũng được gọi là
yếu tố tế bào mầm hay yếu tố tế bào lớn). Kit Ligand kích thích lên mô xôma
của phôi chuột dọc theo đường di chuyển của tế bào mầm và ở các gò tuyến
sinh dục. Ảnh hưởng qua lại giữa tế bào mầm nguyên thủy và Kit Ligand thúc
đẩy sự di chuyển của tế bào mầm nguyên thủy và tăng nhanh sự phát triển của
tế bào mầm nguyên thủy thông qua quá trình ngăn chặn tế bào chết theo
chương trình (De Felici và Pesce, 1994).
1.2.2. Sự phát triển của tế bào mầm nguyên thủy thành túi noãn
Các tế bào mầm nguyên thủy trải qua một sự giới hạn về số lượng của
các quá trình phân chia nguyên nhiễm khi đang di chuyển cũng như khi đến
gò tuyến sinh dục (Russe, 1983; Smitz và Cortvrindt, 2002). Quá trình phân
chia nguyên nhiễm xảy ra ở gò tuyến sinh dục thường xuyên hơn so với khi
chúng đang trên đường di chuyển đến gò tuyến sinh dục. Ở bò có sự tăng lên
đột ngột về số lượng phân chia nguyên nhiễm ở mỗi buồng trứng bắt đầu ở

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 20 of 128.


Header Page 21 of 128.

ngày thứ 60 của bào thai (304 lần gián phân/ngày so với 13 lần/ngày ở ngày
thứ 50) (Erickson, 1966b). Ở thời kỳ này cường độ phân chia nguyên nhiễm
rất mạnh. Khi tế bào mầm nguyên thủy ngừng di chuyển và cố định vào gò
tuyến sinh dục để phân chia thì chúng được gọi là túi noãn (Russe, 1983;
Smitz và Cortvrindt, 2002). Có thể được phân biệt túi noãn với tế bào mầm
nguyên thủy dựa vào mức độ tế bào, do túi noãn có nhiều cơ quan tế bào, đặc
biệt là màng lưới nội chất và các ống có chứa các ty lạp thể. Các ty lạp thể có
chứa ATP và các enzim liên quan đến các hoạt động của tế bào (Russe, 1983).
Các tế bào mầm di chuyển đến gò tuyến sinh dục trong một khoảng
thời gian nhất định, do vậy chúng được tìm thấy ở các chu kỳ nguyên nhiễm

khác nhau trong các nhóm tế bào mầm phân chia. Trong quá trình buồng
trứng phát triển các tế bào mầm nguyên thủy di chuyển trước sẽ trưởng thành
sớm hơn, các tế bào mầm nguyên thủy di chuyển đến muộn và nằm ở phần
sâu của tuyến sinh dục phát triển. Phần ngoại vi của tế bào mầm nguyên thủy
hoạt động như các tế bào gốc để tạo ra các túi noãn mới (Russe, 1983).
1.2.3. Sự phát triển của túi noãn thành tế bào trứng
Quá trình phân chia nguyên phân của túi noãn dừng lại vào khoảng
ngày thứ 150 của bào thai, ấn định số lượng tế bào mầm của bò cái. Số lượng
tế bào mầm giữa 2 buồng trứng phải và trái chỉ có sự khác nhau khoảng 10 %.
(Erickson, 1966b).
Ở bò, sự phân bào giảm nhiễm của túi noãn bắt đầu sau khi bào thai
được 75 - 80 ngày tuổi, các tế bào mầm của túi noãn tăng lên sau khi bắt đầu
quá trình phân bào giảm nhiễm và được xem như tế bào trứng sơ cấp (Byskov
và Hoyer, 1994). Sự phân bào giảm nhiễm của tế bào trứng sơ cấp không tiếp
tục vượt quá giai đoạn sợi dày của tiền kỳ phân bào I (Erickson, 1965). Ở giai
đoạn sợi dày của tiền kỳ phân bào I, các nhiễm sắc thể tập hợp lại, được gói
vào trong nhân tế bào trứng và được gọi là túi mầm. Các tế bào trứng tương

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 21 of 128.


Header Page 22 of 128.

đối sáng và dễ nhận biết vì có sự tăng lên về kích thước tế bào do tăng lên của
tế bào chất và sự phồng lên của nhân (Russe, 1983).
1.3. Nang trứng
1.3.1. Sự hình thành nang trứng nguyên thủy
Sự hình thành nang trứng nguyên thủy được bắt đầu khi một lớp màng
bao gồm các tế bào biểu mô dẹt tập hợp lại xung quanh tế bào trứng và bao
bọc các tế bào trứng lại thành nang trứng nguyên thủy. Các tế bào trứng và

các tế bào nang trứng phụ thuộc lẫn nhau. Tế bào trứng cần phải có các tế bào
hạt để phát triển và sống sót (Picton, 2001). Ở giai đoạn này có sự xuất hiện
các tế bào theca, sự có mặt của tế bào theca có thể là sự bắt đầu cho quá trình
phát triển của nang trứng. Các tế bào theca có mặt trong nang trứng nguyên
thủy và nang trứng sơ cấp ở thỏ (Hirshfield, 1991). Do vậy có thể sự tương tác
giữa các tế bào hạt và tế bào theca có thể đóng vai trò điều chỉnh sự phát triển
và biệt hóa các nang trứng ở tất cả các giai đoạn hình thành nang.
Khi bào thai được khoảng 18 - 22 tuần, lớp vỏ của buồng trứng có số
lượng nang trứng nguyên thủy cao nhất, bình quân khoảng 300.000 nang
trứng nguyên thủy, song phụ thuộc vào từng cá thể khác nhau mà số lượng
nang trứng nguyên thủy biến động từ 25.000 đến 2,5 triệu. Nang trứng
nguyên thủy chứa tế bào trứng chưa trưởng thành và được bao quanh bởi tế
bào hạt dẹt. Nhưng số lượng nang trứng này giảm dần trước khi sinh và đến
tuổi thành thục về tính chỉ còn khoảng 180.000, biến động 25.000 đến 1,5
triệu nang trứng nguyên thủy do túi noãn trải qua giai đoạn tiền kỳ giảm
nhiễm làm túi noãn bị tổn thương dẫn đến thoái hóa và nhiều túi noãn bị mất
đi trong quá trình này (Russe, 1983). Các tế bào trứng không bị thoái hóa
được một lớp màng đơn của các tế bào biểu mô dẹt tập hợp lại xung quanh và
bao quanh chúng tạo thành nang trứng nguyên thủy. Ở bò cái sau khi sinh có
khoảng 133.000 nang trứng nguyên thủy và các nang trứng này từ từ phát

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 22 of 128.


Header Page 23 of 128.

triển thành thục (rụng trứng và thoái hóa cho đến hết khi bò khoảng 15 - 20
tuổi (Erickson, 1966b).
1.3.2. Sự phát triển của nang trứng
Từ nang trứng nguyên thủy, sự phát triển của nang rứng trải qua quá

trình hồi phục, phát triển sau một giai đoạn dài yên lặng. Bao gồm thay đổi
của các chuỗi tế bào, sự thay đổi các thành phần khác nhau của nang trứng,
đảm bảo cho sự phát triển của các nang trứng đến khi rụng trứng và giải
phóng một hay nhiều tế bào trứng trưởng thành ở khoảng cách được ấn định
từ đầu đến khi kết thúc vòng đời sinh sản của con cái. Từ nang trứng nguyên
thủy để đạt đến kích thước rụng trứng trải qua 3 giai đoạn: Sơ cấp, thứ cấp và
nang trứng ở giai đoạn phát triển (Hình 1.2).

Tế bào
trứng
Tách
nhau ra
Ổ trứng

Nang
trứng
nguyên
thủy

Vành
phóng xạ

Tế bào
trứng
Tế bào
trứng

Nang trứng đã
hình thành
Nang

xoang
trứng
Nang
thứ cấp
trứng
sơ cấp

Nang trứng
sắp rụng

Màng tế
bào Theca Xoang
Các tế bào
hạt hình trụ

Các tế bào
cumulus

Rụng trứng

Thể vàng

Các tế bào hạt dẹt
Tiền tế bào hạt

Các tế bào
thể vàng

Hình 1.2. Sơ đồ tóm tắt quá trình phát triển nang trứng
(Nguồn: Hernandez-Ochoa và cs., 2009)

Sự phát triển của nang trứng bắt đầu ngay sau khi nang trứng nguyên
thủy hoạt hóa và sự biệt hóa của tiền các tế bào hạt thành tế bào hạt. Sự phát
triển đầu tiên của tế bào trứng được thể hiện thông qua sự phát triển của vùng

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 23 of 128.


Header Page 24 of 128.

Golgi, do các nang bao quanh tế bào và sự lan rộng dần của Golgi về phía
ngoại vi. Sự phát triển của nang trứng được tạo thành do số lượng lớp màng tế
bào hạt tăng lên xung quanh tế bào trứng cùng với sự tăng lên về kích thước
tế bào trứng và hình thành vòng trong suốt. Sự tích tụ của vùng Golgi trong tế
bào trứng cho thấy có sự tham gia của tế bào trứng cho sự hình thành vòng
trong suốt. Trong quá trình hình thành vòng trong suốt, sự bao quanh của các
tế bào hạt làm chúng liên kết lại với nhau bởi các tiểu thể nối gian bào. Các tế
bào hạt được gọi là tế bào vành phóng xạ. Cùng với độ dày của màng vòng
trong suốt tăng lên các tế bào vành phóng xạ cần phát triển để liên kết tế bào
trứng và vòng trong suốt lại với nhau (Russe, 1983; Adashi, 1996). Mạng lưới
mao mạch bên ngoài nang trứng là cơ sở để màng tăng lên trong quá trình
nang trứng phát triển. Các mao mạch xuất hiện trong giai đoạn nang trứng
nguyên thủy và một số tĩnh mạch xuất hiện khi nang trứng phát triển đến giai
đoạn thứ cấp (Tanaca và cs., 2001). Trong giai đoạn nang trứng nguyên thủy
các mao mạch được phát hiện xung quanh nang trứng cùng với sự liên kết
đồng tâm và sự biệt hóa của tế bào cơ chất thành tế bào mô vỏ (theca) bên
trong. Sự phát triển của nang trứng cho đến giai đoạn này thì được xem như
nang trứng nang trứng thứ cấp (preantral). Nang trứng tiếp tục phát triển, các
túi dịch của dịch nang trứng xuất hiện trong màng tế bào hạt. Khi 5 - 8 lớp
màng tế bào hạt được hình thành, các túi dịch vỡ ra hình thành một xoang và
sau đó nang trứng phát triển, được gọi là nang trứng phát triển (nang antral

hay nang Graff), bao gồm các nang trứng từ giai đoạn thứ cấp đến nang trứng
trước khi rụng trứng (Lundy và cs., 1999). Toàn bộ quá trình phát triển
của nang trứng từ giai đoạn tế bào trứng nguyên thủy (kích thước 50 60 µm) đến giai đoạn rụng trứng (kích thước 10 - 15 mm) mất khoảng 180
ngày (Lussier và cs., 1987). Thời gian từ khi nang trứng nguyên thủy hoạt hóa
để đạt được kích thước rụng trứng mất 80 đến 100 ngày, do vậy nang trứng

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 24 of 128.


Header Page 25 of 128.

thứ cấp cuối cùng sẽ mất hai chu kỳ động dục để đạt được kích thước rụng
trứng (Lussier và cs., 1987). Khoảng thời gian này cho phép hình thành vòng
trong suốt (vòng trong suốt là glycoprotein bao bọc xung quanh màng tế bào
trứng, bắt đầu xuất hiện ở thời kỳ tế bào trứng nguyên thủy, rất quan trọng
cho sự sống của tế bào trứng, sự tích lũy các sản phẩm cần thiết cho quá trình
thụ tinh, quá trình thụ tinh và phôi phát triển giai đoạn đầu).
Nang trứng ở giai đoạn nang trứng phát triển phát triển và hình thành
các xoang trong nang trứng. Các xoang chứa đầy dịch nang trứng. Các xoang
bắt đầu xuất hiện trong nang trứng bò có kích thước 0,12 và 0,28 mm (Lussier
và cs., 1987; Monniaux và cs., 1997). Các xoang bắt đầu xuất hiện trong bào
thai bê khoảng 230 ngày tuổi (Russe, 1983). Nang trứng ở giai đoạn phát triển
có mạng lưới lỗ hổng rộng rãi cho phép vận chuyển dinh dưỡng và điều chỉnh
thông tin giữa tế bào trứng và các tế bào hạt (Espey, 1994). Các tế bào hạt có
được cơ quan thụ cảm LH khi nang trứng có kích thước 8 - 9 mm (Ireland và
Roche, 1983). Một khoảng trống riêng biệt được tạo thành giữa tế bào trứng
và màng trong suốt ngay trước khi rụng trứng. Máu cung cấp của màng theca
thay đổi đột ngột trong giai đoạn cuối của nang trứng trưởng thành và phát
triển thành hệ thống mạch máu bên trong tế bào theca và một hệ thống mạch
máu bên ngoài có nguồn gốc từ mao mạch mô đệm (Yamada và cs., 1995).

Nang trứng tiếp tục được huy động cho đến khi kho dự trữ bị cạn kiệt.
Số lượng nang trứng ở bò được phân chia tương đối đều giữa hai buồng trứng.
Nang trứng bò phát triển gấp 300 - 400 về kích thước, từ giai đoạn tế bào
trứng sơ cấp (kích thước 50 µm) đến trước giai đoạn rụng trứng (kích thước
15- 20 mm) (Rajakoski, 1960).
Các nang trứng ở các giai đoạn khác nhau có cấu tạo, kích thước khác
nhau. Nghiên cứu về các giai đoạn phát triển của nang trứng (Braw-Tal và
Yossefi, 1997) ở bò cho thấy có sự khác nhau (Bảng 1.1).

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 25 of 128.