Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobater BHN2

Header Page 1 of 128.

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu
lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2”,
em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và
các bạn tại phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng
kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung – Người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp
đỡ trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và
làm việc tại Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt
tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, nhưng người thân, bạn bè đã
quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn !
Hà nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị An

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 1 of 128.

Header Page 2 of 128.

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
số liệu, kết quả nêu trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực nếu sai tôi xin
chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Tác giả

Nguyễn Thị An

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 2 of 128.


Header Page 3 of 128.

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BC

: Bacterial cellulose

Cs

: Cộng sự

g

: gam

MT

: Môi trường

S

: Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2)

S/V

: Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thể tích dịch
lên men tạo màng (cm )

V

: Thể tích dịch lên men tạo màng (cm3)

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 3 of 128.


Header Page 4 of 128.

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài .................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................. 2
3. Nội dung của đề tài ................................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................ 2
4.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 2
4.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................. 2
5. Điểm mới của đề tài................................................................................ 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 3
1.1. Đại cương về vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC ..................... 3
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter .............. 3
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter ....................... 4
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter ................................... 4
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ
vi khuẩn Gluconacetobacter ................................................................. 6
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose ...................................................... 6

1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 .......................................... 6
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O ..................................... 6
1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4.............................................. 7
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn Gluconacetobacter ..................................................................... 7
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống ................. 7
1.3.2. Độ thông khí ................................................................................. 7
1.3.3. Nhiệt độ ........................................................................................ 8
1.3.4. Độ pH ........................................................................................... 8
1.4. Ứng dụng của màng BC ...................................................................... 8
1.4.1. Ứng dụng của BC ......................................................................... 8
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng.................................. 9
1.5. Tổng quan về thiết bị lên men.............................................................. 9
Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 4 of 128.


Header Page 5 of 128.

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.5.1. Đặc điểm và tính chất của một số vật liệu dùng làm bình lên men
................................................................................................... 10
1.5.2. Phân loại theo hiệu ứng của polyme với nhiệt độ ........................ 12
1.5.3. Phân loại theo ứng dụng ............................................................. 13

1.6. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới......... 13
1.6.1. Trên thế giới ............................................................................... 13
1.6.2. Ở Việt Nam ................................................................................ 14
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 16
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu....................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 16
2.1.2. Hoá chất và thiết bị ..................................................................... 16
2.1.2.1. Hoá chất ............................................................................... 16
2.1.2.2. Thiết bị ................................................................................ 16
2.1.3. Môi trường.................................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 17
2.2.1. Phương pháp vi sinh ................................................................... 17
2.2.1.1. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram ............ 17
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống ................................................ 18
2.2.1.3. Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn
Gluconacetobacter................................................................ 18
2.2.1.4. Phương pháp bảo quản chủng giống Gluconacetobacter trên
môi trường thạch nghiêng ..................................................... 18
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men tạo màng BC từ
chủng Gluconacetobacter ........................................................... 19
2.2.2.1. Nghiên cứu lựa chọn vật liệu của thiết bị lên men tạo màng
BC ........................................................................................ 19
2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo
màng của vi khuẩn Gluconacetobacter ................................. 19
2.2.3. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả ...................................... 21
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 22
3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
........................................................................................................... 22
3.1.1. Hình thái tế bào học .................................................................... 22
Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 5 of 128.


Header Page 6 of 128.

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

3.1.2. Đặc điểm của khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường MT1 ........ 23
3.1.3. Khả năng tạo màng BC ............................................................... 23
3.2. Nghiên cứu lựa chọn vật liệu của thiết bị lên men tạo màng BC ........ 24
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi
khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ......................................................... 27
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 38
1. Kết luận ................................................................................................ 38
2. Đề nghị ................................................................................................. 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 39

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 6 of 128.


Header Page 7 of 128.

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu trên cốc đong 250ml ..... 20
Bảng 2.2. Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu trên hộp nhựa 500ml .... 20
Bảng 3.1. Một số đặc điểm so sánh khi lên men tạo màng BC ở các dụng cụ
làm bằng các vật liệu inox, thủy tinh, nhựa ................................... 26
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC ..... 29
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC ..... 32
Bảng 3.4. Khảo sát khả năng tạo màng BC ở các khay có dung tích ............. 36
khác nhau...................................................................................... 36

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 7 of 128.


Header Page 8 of 128.

Khóa luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter .......................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc cellulose ........................................................................... 5
Hình 3.1. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 khi ............... 22
nhuộm Gram................................................................................. 22
Hình 3.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên môi trường
MT1 ............................................................................................. 23
Hình 3.3. Lên men tạo màng BC trong cốc inox ........................................... 25
Hình 3.4. Lên men tạo màng BC trong cốc thủy tinh 250ml ......................... 25
Hình 3.5. Lên men tạo màng BC trong hộp nhựa 500ml ............................... 25
Hình 3.6. Các dạng hình khối ....................................................................... 27
Hình 3.7. Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng ................... 29
Hình 3.8. Một số mẫu màng BC ở cốc đong 250ml với ................................ 30
Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V khối lượng màng BC ............................. 31
Hình 3.10. Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng ................. 32
Hình 3.11. Một số mẫu màng BC ở hộp nhựa 500ml với.............................. 33
Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ S/V đến khối lượng màng BC ................... 34

Nguyễn Thị An

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 8 of 128.


Header Page 9Khóa
of 128.
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin,
hemicellulose, peptin và sáp nến…Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội
với độ dẻo dai, bề chắc [13].
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều
trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho
quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,
dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi
trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt
trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các
bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [9].
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ
khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí
nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter có
khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ
chủng Gluconacetobacter có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở
để tạo ra màng trị bỏng cho người. Nhằm tìm kiếm được thiết bị tốt nhất lên

Nguyễn Thị An

1

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 9 of 128.


Header Page 10
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

men thu màng BC từ chủng Gluconacetobacter để tạo cơ sở cho sản xuất
màng trị bỏng và nhiều ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài:
“Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng
Gluconacetobacter BHN2”
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng
Gluconacetobacter BHN2 với giá thành rẻ có chất lượng tốt.
3. Nội dung của đề tài
3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2.
3.2. Nghiên cứu lựa chọn vật liệu của thiết bị lên men tạo màng BC.
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi
khuẩn Gluconacetobacter BHN2.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2
với giá thành rẻ có chất lượng tốt.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo được màng BC với giá thành rẻ trên thiết bị đã chọn.
5. Điểm mới của đề tài

Tìm ra thiết bị phù hợp để tạo màng BC với hiệu quả cao nhất.

Nguyễn Thị An

2

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128.


Header Page 11
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì
Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn
nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Gluconacetobacter như một loài phụ của
A. aceti [14].
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di
động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn
Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy

trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất.

Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter
Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn
lạc đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên,
dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [15].
Nguyễn Thị An

3

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 11 of 128.


Header Page 12
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-350C, pH : 4-6.
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 370C, tế bào sẽ suy thoái hoàn
toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.Gluconacetobacter có khả năng chịu
được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi
cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [10].
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm:
Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương tính;

Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid;
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp
cellulose [10].
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn
Gluconacetobacter hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose,
được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng
Bacterial cellulose hay màng BC.
* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch
thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính lại khác xa nhau.

Nguyễn Thị An

4

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 12 of 128.


Header Page 13
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Sợi cellulose của màng BC

Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.2. Cấu trúc cellulose
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi
lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó
và cuối cùng tạo dải ribbon. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm.
Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon
của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc
mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [16].
Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết
tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học
cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn Gluconacetobacter được nghiên
cứu đầu tiên bởi Brown. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX,
những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và
đặc tính của cellulose [16].

Nguyễn Thị An

5

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 13 of 128.


Header Page 14
of 128.

Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn Gluconacetobacter
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng
hợp cellulose của Gluconacetobacter. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ
Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng A. xylinum HN5 thì nguồn cacbon có ảnh
hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Gluconacetobacter là glucose.
Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như Quỳnh đã
quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu trên chủng
Gluconacetobacter [9], [5].
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để
xây dựng tế bào. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố có ảnh
hưởng lớn đến sự phát triển của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng
cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi
trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng
đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng
BC cao nhất [8], [6].
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O
MgSO4 ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS. TS Đinh Thị
Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những
enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình
thành màng BC [3].

Nguyễn Thị An

6

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 14 of 128.


Header Page 15
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có
vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter.
Sử dụng nồng độ 2g/l KH2PO4 sẽ cho sản lượng BC cao [7].
1.3. Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn Gluconacetobacter
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống
Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng
trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn. Độ dai của màng phụ thuộc rất
nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng
lớn về thời gian lên men thu nhận màng. Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và
kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính chất cơ học của màng BC. Ngược lại
nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ
tiến hành phân huỷ thu năng lượng cung cấp cho hoạt động sống của tế bào.
Đối với loài Gluconacetobacter, trong quá trình lên men, phần lớn các

tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt
nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dịch
thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho
phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất.
Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ
giống và thời gian lên men [8].
1.3.2. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện
tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của
quá trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ
Nguyễn Thị An

7

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 15 of 128.


Header Page 16
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và
sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,
thoáng và lớp môi trường mỏng [5].

Wan phát hiện áp suất oxy cũng ảnh hưởng đến khả năng hình thành
cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới áp suất oxy thấp có sự phân
nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxy cao do đó ảnh hưởng trực
tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC [17].
1.3.3. Nhiệt độ
0

Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Gluconacetobacter từ 25-35 C. Ở nhiệt độ
thấp quá trình lên men chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức
nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men giảm [17].
1.3.4. Độ pH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH
thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm
acid hoá môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp
ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [19].
1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả
năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề
dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh
học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các
Nguyễn Thị An

8

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 16 of 128.

Header Page 17
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo
vệ môi trường, công nghiệp [6], [8], [9].
1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại
di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc Gia mỗi năm tiếp nhận khoảng hơn
400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi. Ngoài ra các
tác nhân khác gây bỏng là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại
chỗ có tác dụng lớn trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm
khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và
dịch trong cơ thể (là nguy cơ dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức
hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình
thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật [5], [6].
1.5. Tổng quan về thiết bị lên men
Thiết bị lên men thường có cấu tạo phù hợp với từng quá trình lên men:
sản phẩm tạo ra, độ pH, yêu cầu kị khí hay thoáng khí… Đối với lên men bề
mặt, nhất là đối với lên men tĩnh thiết bị lên men rất đơn giản, thường chỉ có

các bình lên men có bề mặt thoáng, rộng, có thiết bị thông khí. Lên men tạo
màng BC là lên men tĩnh.

Nguyễn Thị An

9

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 17 of 128.


Header Page 18
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Vật liệu cấu tạo nên dụng cụ dùng để lên men có vai trò rất quan trọng
quyết định chất lượng của sản phẩm lên men như: Thùng lên men rượu vang
bằng gỗ sồi có tác dụng làm cho vị của rượu thêm mềm mại hơn và một số
trường hợp trở nên thơm ngon hơn… Lên men màng BC thường tạo ra acid
acetic. Vì vậy, bình lên men phải chịu được pH thấp, tránh bị ăn mòn. Trong
đời sống sản xuất, lên men giấm rất phổ biến có thể thực hiện tại gia đình, lên
men trong các bình thủy tinh hoặc nhựa. Sản xuất acetic trên quy mô lớn, nuôi
cấy chìm, thường dùng bình lên men bằng inox.
1.5.1. Đặc điểm và tính chất của một số vật liệu dùng làm bình lên men
Vật liệu inox
Inox (hay còn được gọi là Thép không gỉ) là một dạng hợp kim sắt

chứa tối thiểu 10,5% crôm. Nó ít bị biến màu hay bị ăn mòn như thép thông
thường khác. Inox được phát minh bởi Harry Brearley một chuyên gia ngành
thép người Anh. Năm 1913, Harry Brearley đã sáng chế ra một loại thép đặc
biệt có khả năng chịu mài mòn cao, bằng việc giảm hàm lượng cacbon xuống
và cho crôm vào trong thành phần thép (0.24% C và 12.8% Cr) [21].
Trong ngành luyện kim, inox được dùng để chỉ một dạng hợp kim sắt
chứa tối thiểu 10,5% crôm, không bị biến màu hay bị ăn mòn dễ dàng như là
các loại thép thông thường khác. Inox có khả năng chống sự ôxy hoá và ăn
mòn rất cao. Khả năng chống lại sự oxy hoá từ không khí xung quanh ở nhiệt
độ thông thường của Inox có được nhờ vào tỷ lệ crôm có trong hợp kim (nhỏ
nhất là 13% và có thể lên đến 26% trong môi trường khắc nghiệt). Bên cạnh
crôm, niken, mô-lip-đen và ni tơ cũng có tính năng oxi hoá chống gỉ tương tự.
Niken (Ni) là thành phần thông dụng để tăng cường độ dẻo, dễ uốn, tính tạo
hình của thép không gỉ. Mô-lip-đen (Mo) làm cho thép không gỉ có khả năng
chịu ăn mòn cao trong môi trường acid. Nitơ (N) tạo ra sự ổn định cho thép
Nguyễn Thị An

10

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 18 of 128.


Header Page 19
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

không gỉ ở nhiệt độ âm (môi trường lạnh). Sự tham gia khác nhau của các
thành phần crôm, niken, mô-lip-đen, ni tơ dẫn đến các cấu trúc tinh thể khác
nhau tạo ra tính chất cơ lý khác nhau của Inox [22], [23].
Đặc tính của thép không gỉ: Các đặc tính của nhóm thép không gỉ có
thể được nhìn dưới góc độ so sánh với họ thép cacbon thấp, thép không gỉ có:
 Độ dẻo cao hơn
 Độ cứng và độ bền cao hơn
 Độ bền nóng cao hơn
 Chống chịu ăn mòn cao hơn
 Độ dẻo dai ở nhiệt độ thấp tốt hơn
 Phản ứng từ kém hơn (chỉ với thép austenit)
Các cơ tính đó thực ra đúng cho họ thép austenit và có thể thay đổi khá nhiều
đối với các mác thép và họ thép khác. Các cơ tính liên quan đến các lĩnh vực ứng
dụng thép không gỉ, nhưng cũng chịu ảnh hưởng của thiết bị và phương pháp
chế tạo. Nhờ khả năng chống ăn mòn, bảo trì thấp và màu sáng của thép không
gỉ làm cho nó trở thành một vật liệu lý tưởng cho nhiều ứng dụng. Có hơn 150
loại thép không gỉ, trong đó 15 loại được sử dụng phổ biến nhất. Inox được sử
dụng làm dụng cụ nhà bếp, dụng cụ phẫu thuật, thiết bị gia dụng, thiết bị công
nghiệp, ô tô và hàng không vũ trụ, và vật liệu xây dựng [23].
Vật liệu thủy tinh
Thủy tinh là một chất rắn vô định hình đồng nhất, có gốc silicát, thường
được pha trộn thêm các tạp chất để có tính chất theo ý muốn. Trong dạng
thuần khiết và ở điều kiện bình thường, thủy tinh là một chất trong suốt,
tương đối cứng, khó mài mòn, rất trơ về mặt hóa học và không hoạt động xét
về phương diện sinh học, có thể tạo thành với bề mặt rất nhẵn và trơn. Tuy
nhiên, thủy tinh rất dễ gãy hay vỡ thành các mảnh nhọn và sắc dưới tác dụng
của lực hay nhiệt một cách đột ngột. Tính chất này có thể giảm nhẹ hay thay
Nguyễn Thị An

11

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 19 of 128.


Header Page 20
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

đổi bằng cách thêm một số chất bổ sung vào thành phần khi nấu thủy tinh hay
xử lý nhiệt [23].
Vì thủy tinh là một vật liệu cứng và không hoạt hóa nên nó là một vật
liệu rất có ích. Trong phòng thí nghiệm để làm các thí nghiệm trong hóa học,
sinh học, vật lý và nhiều lĩnh vực khác, người ta sử dụng bình tam giác, ống
nghiệm, lăng kính và nhiều dụng cụ thiết bị khác được làm từ thủy tinh. Đối
với các ứng dụng này, thủy tinh Pyrex ( thủy tinh có thêm Bo) thường được
sử dụng vì sức bền và hệ số giãn nở nhiệt thấp, tạo cho thủy tinh chống lại tốt
hơn đối với các sốc nhiệt và cho phép đo đạc chính xác hơn khi làm nóng và
làm nguội các thiết bị. Đối với phần lớn các ứng dụng có yêu cầu cao, thủy
tinh thạch anh được sử dụng, mặc dù rất khó làm việc với nó. Phần lớn thủy
tinh như thế này được sản xuất hàng loạt bằng các công nghệ khác nhau,
nhưng đa phần các phòng thí nghiệm lớn cần rất nhiều các loại đồ thủy tinh
khác nhau vì thế họ vẫn giữ ống thổi thủy tinh trong văn phòng.
Vật liệu nhựa
Nhựa là các hợp chất cao phân tử, được dùng làm vật liệu để sản xuất

nhiều loại vật dụng trong đời sống hằng ngày như: áo mưa, ống dẫn điện...
cho đến những sản phẩm công nghiệp, gắn với đời sống hiện đại của con
người. Chúng là những vật liệu có khả năng bị biến dạng khi chịu tác dụng
của nhiệt, áp suất và vẫn giữ được sự biến dạng đó khi thôi tác dụng [23].
1.5.2. Phân loại theo hiệu ứng của polyme với nhiệt độ
Nhựa nhiệt dẻo : Là loại nhựa khi nung nóng đến nhiệt độ chảy mềm Tm thì
nó chảy mềm ra và khi hạ nhiệt độ thì nó đóng rắn lại. Thường tổng hợp bằng
phương pháp trùng hợp. Các mạch đại phân tử của nhựa nhiệt dẻo liên kết
bằng các liên kết yếu (liên kết hydro, vandecvan). Tính chất cơ học không cao
khi so sánh với nhựa nhiệt rắn. Nhựa nhiệt dẻo có khả năng tái sinh được
Nguyễn Thị An

12

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 20 of 128.


Header Page 21
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

nhiều lần, ví dụ như : polyetylen (PE), polypropylen (PP), polystyren (PS),
poly metyl metacrylat (PMMA), poly butadien (PB), poly etylen tere phtalat
(PET), ...
Nhựa nhiệt rắn: là hợp chất cao phân tử có khả năng chuyển sang trạng thái

không gian 3 chiều dưới tác dụng của nhiệt độ hoặc phản ứng hóa học và sau
đó không nóng chảy hay hòa tan trở lại được nữa, không có khả năng tái sinh.
Một số loại nhựa nhiệt rắn: ure focmadehyt (UF), nhựa epoxy, phenol
focmadehyt (PF), nhựa melamin, poly este không no, ...
Vật liệu đàn hồi (elastome): là loại nhựa có tính đàn hồi như cao su.
1.5.3. Phân loại theo ứng dụng
Nhựa thông dụng: là loại nhựa được sử dụng số lượng lớn, giá rẻ, dùng
nhiều trong những vật dụng thường ngày, như : PP, PE, PS, PVC, PET,
ABS,...
Nhựa kỹ thuật: là loại nhựa có tính chất cơ lý trội hơn so với các loại nhựa
thông dụng, thường dùng trong các mặt hàng công nghiệp, như : PC, PA, ...
Nhựa chuyên dụng: là các loại nhựa tổng hợp chỉ sử dụng riêng biệt cho
từng trường hợp)
1.6. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
1.6.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, dùng
màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown, Jonas và Farad,
dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền
Nguyễn Thị An

13

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 21 of 128.


Header Page 22

of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực
phẩm. Đặc biệt Brown đã dùng BC làm vải đặc biệt, Jonas và Farad dùng
màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protêin hay
sử dụng cho sắc kí [15], [19].
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả Wan và Millon sử
dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt.
Đặc biệt tác giả Wan đã đượng đăng kí bản quyền về làm màng BC từ A.
xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad, đã dùng màng BC làm da
nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [17], [20].
1.6.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải
tiến. Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số
màng trị bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử
dụng các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Từ
năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và Cs đã có một
số công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu nghiên cứu
về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng
trong trị bỏng ở Việt Nam [6].
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng
từ rất lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên
nhiên và có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết
thương, vết loét…
Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có

nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng [5], [6].
Nguyễn Thị An

14

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 22 of 128.


Header Page 23
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Một số công trình liên quan đến đề tài như: Luận văn thạc sĩ vi sinh
học 2012“Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xử lý, bảo quản màng Bacterial
cellulose từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 _ 21 và ứng dụng điều
trị bỏng” của Trần Linh Châm - ĐHSP Hà Nội đã nghiên cứu được thiết bị
lên men thu màng đó là bằng nhựa là tốt nhất và nghiên cứu được tỷ lệ diện
tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng Gluconacetobacter tạo màng tốt
nhất là S/V = 0,7.

Nguyễn Thị An

15

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 23 of 128.


Header Page 24
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ màng của các nguồn
nguyên liệu khác nhau nhờ quá trình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo
phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật, khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
- Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar.
- Nguồn Nitơ: Pepton, (NH4)2SO4
- Các muối khoáng: KH4PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Nước dừa.
2.1.2.2. Thiết bị
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
- Nồi hấp Tommy (Nhật).
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).

- Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
- Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml.
- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
- Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
Nguyễn Thị An

16

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 24 of 128.


Header Page 25
of 128.
Khóa
luận tốt nghiệp

Đại học Sư phạm Hà Nội 2

- Khay nhựa có kích thước 15x10x4 cm, cốc đong 200ml, cốc inox 150ml.
- Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…
2.1.3. Môi trường
STT

Thành phần

MT1

MT2

MT3

1

Glucose

20g

20g

20g

2

(NH4)2SO4

3g

3g

3g

3

KH2PO4

2g

2g

2g

4

MgSO4

2g

2g

2g

5

Pepton

5g

0

0

6

Agar

20g

0

0

7

Nước dừa già

0

0

1000ml

8

Nước máy

1000ml

1000ml

0

Trong đó: MT1: môi trường giữ giống
MT2: môi trường nhân giống
MT3: môi trường lên men tạo màng BC
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc

nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên
khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với
thuốc nhuộm kiềm và iot. Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn Gram âm,

Nguyễn Thị An

17

K35C Khoa Sinh- KTNN

luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 25 of 128.