Nghiên cứu thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT
TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2017


Công trình được hoàn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trương Thị Minh Hạnh

Phản biện 1:
TS. Lê Lý Thùy Trâm
Phản biện 2:
PGS. TS. Lê Thị Liên Thanh

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công
nghệ sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào ngày 29 tháng 12 năm
2017

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng tại Trường Đại học Bách khoa
 Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN


1

MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Theo các nghiên cứu, nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý tim mạch là do
sự hình thành các cục máu đông hay còn gọi là huyết khối. Các cục máu đông
gây tắc nghẽn các mạch máu, gây tổn hại đến các cơ quan trong cơ thể và là
nguyên nhân trực tiếp gây ra các bệnh nguy hiểm như: tai biến do tăng huyết áp,
nhồi máu cơ tim, nhồi máu não, suy tim, thuyên tắc phổi,… Việc phát hiện
nattokinase mở ra một triển vọng mới cho việc điều trị và phòng ngừa chứng
huyết khối. So với các loại thuốc tan huyết khối sẵn có hiện nay, nattokinase có
nhiều ưu thế như an toàn, giá thành thấp hơn, hiệu quả, tác dụng kéo dài, sử
dụng phòng ngừa và các sử dụng qua đường ăn uống dễ dàng.
Hiện nay, Enzyme nattokinase chủ yếu được thu nhận từ quá trình lên men
với cơ chất là hạt đậu nành. Một số nghiên cứu đã đề cập đến các nguồn nguyên
liệu khác thay thế như: gạo lức, cao ngô, bã đậu nành,…Trong đó, bã đậu nành
từ các nhà máy sản xuất đậu phụ là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cần được quan tâm
nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất.
Trong sản xuất công nghiệp, bên cạnh việc sản xuất ra các chính phẩm,
việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm là rất cần thiết. Ngoài ý nghĩa về mặt
tăng cường hiệu quả kinh tế, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm còn có
nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường.
Từ yêu cầu thực tiễn đó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận
enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu
nành”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis
natto thu nhận enzyme nattokinase trên bã đậu nành.
- Xác định tỷ lệ thích hợp ethanol 96% trên dịch chiết enzyme thô trong
quá trình thu nhận enzyme nattokinase.
- Thu nhận chế phẩm enzyme thô.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
* Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc


2

trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp.
- Bã đậu nành lấy từ 03 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố
Quảng Ngãi.
* Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là bã đậu nành ở quy mô phòng thí
nghiệm.
4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Nghiên cứu lý thuyết
* Nghiên cứu thực nghiệm
5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
* Ý nghĩa khoa học
- Đóng góp thông tin khoa học về bã đậu nành và làm phong phú thêm
những nghiên cứu về ứng dụng của bã đậu nành, cung cấp thêm giải pháp xử lý
và tận dụng nguồn phế liệu bã đậu nành.
- Đóng góp thông tin khoa học về điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus
subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt
với cơ chất là bã đậu nành.

* Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp thông tin công nghệ của quá trình lên men bề mặt vi khuẩn
Bacillus subtilis natto trên bã đậu nành thu enzyme nattokinase nhằm ứng dụng
vào quy mô sản xuất công nghiệp. Góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi
trường do tận dụng phế thải bã đậu nành.
6. BỐ CỤC ĐỀ TÀI
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và bàn luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
Danh mục tài liệu tham khảo
Phụ lục


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH
1.1.1. Giới thiệu về bã đậu nành (okara)
Bã đậu nành (okara) là phần phế phẩm dạng rắn thu được sau quá trình lọc
thu dịch sữa đậu nành trong quá trình sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ (đậu
khuôn) và các sản phẩm khác từ đậu nành.
1.1.2. Một số ứng dụng của bã đậu nành
Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cho ngành chăn nuôi và công nghệ sinh
học.
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE
1.2.1. Giới thiệu về nattokinase
Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một

protease serine, có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid
amin, khối lượng phân tử là 27,728 kDa và pI=8,6. Là một protease không chứa
cysteine, nattokinase không có cầu nối disulfua trong phân tử.
1.2.2. Cơ chế tác dụng của nattokinase
Nattokinase không chỉ làm tan huyết khối mà còn có tác dụng phòng ngừa
sự hình thành huyết khối. Ngoài ra, enzyme nattokinase không ảnh hưởng đến
sự hình thành fibrin từ fibrinogen nên không làm suy giảm khả năng đông máu
tự nhiên của cơ thể.
1.3. TỔNG QUAN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO
1.3.1. Giới thiệu về Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto được phân lập lần đầu tiên vào năm 1906 từ natto bởi
tiến sỹ Shin Sawamura, thuộc trường Đại học Tokyo, Nhật Bản. Bacillus subtilis
natto được biết đến là loại vi khuẩn lên men hạt đậu nành tạo mùi hương đặc
biệt cho natto.
1.3.2. Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Bacillus subtilis
natto có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 300C – 500C, pH hơi kiềm hoặc
trung tính. Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,2 - 7,6.


4

1.3.3. Khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto
1.3.3.1. Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto
Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis natto: các enzyme thủy phân như
protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase,
catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các
enzyme tham gia các quá trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase,
cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế
bào.

1.3.3.2. Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis natto
Bacillus subtilis natto có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme: amylase (αamylase), -glucanase, xylanase, protease… Trong đó, enzyme nattokinase là
một loại protease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhiều.
1.3.4. Các phương pháp lên men
Trong nghiên cứu này, tôi chọn phương pháp lên men bề mặt để lên men vi
khuẩn Bacillus subtilis natto thu enzyme nattokinase vì nhiều lý do như: phương
pháp lên men dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, việc xử lý thu chế phẩm
sau lên men đơn giản, ít tổn hao về hoạt tính enzyme, dễ bảo quản, kỹ thuật lên
men đơn giản.
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme
của vi khuẩn Bacillus subtilis natto
1.3.5.1. Nhiệt độ: Nhiệt độ không những tác động trực tiếp đến sự sự phát
triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto mà còn ảnh
hưởng đến tính chất của enzyme.
1.3.5.2. pH: Theo El-Safey E. M.và Abdul-Raouf U. M, ở pH= 7 vi khuẩn
Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp thu enzyme nattokinase có hoạt độ cao
nhất.
1.3.5.3. Thời gian nuôi cấy: Thời gian nuôi cấy thích hợp là thời gian cho
phép tích tụ lượng enzyme tối đa và chủ yếu phụ thuộc vào chủng vi sinh vật.
1.3.5.4. Thành phần môi trường
Thành phần môi trường đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển và
sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật.
Ngoài các yếu tố trên, các yếu tố môi trường khác như độ ẩm, độ thông
khí,... cũng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme


5

nattokinase của vi khuẩn Bacillus subtilis natto.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1998, Hidehiro Miyamura và các cộng sự đã nghiên cứu lên men
Bacillus subtilis trên bã đậu nành ở điều kiện thích hợp là nhiệt độ 370C, độ ẩm
80%, thời gian 24 giờ. Năm 2010, Xiaoyan Zu và các cộng sự đã khảo sát cho
thấy: sản lượng enzyme sản xuất từ bã thãi đậu nành cao hơn và có hoạt tính
không thấp hơn so với lên men natto hạt đậu nành. Năm 2013, Rohit Kapoor và
Bibhu Prasad Panda đã nghiên cứu lên men B. subtilis với cơ chất là hạt đậu
nành bổ sung 1% khối lượng sữa bột, 30% nước (v/w) thu được enzyme
protease có hoạt độ cao nhất khi thu nhận enzyme bằng đệm Tris pH 9.
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu được thực hiện theo hướng tận dụng
những nguồn cơ chất rẻ tiền, sẵn có khác.
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập thành công hai
chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên
môi trường đậu nành hấp chín nuôi cấy trên đĩa Petri và khay. Năm 2013, Bùi
Thị Nhung và cộng sự đã nghiên cứu thu được kết quả điều kiện lên men bề mặt
Bacillus subtilis với cơ chất là bột đậu nành và cám mì thu enzyme nattokinase
có hoạt lực cao nhất ở pH 9, độ ẩm từ 50-60% và thời gian lên men 48h. Năm
2016, Nguyen Nhut Huy và Nguyen Thuy Huong đã thực hiện lên men bề mặt
vi khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là hạt đậu nành ở điều kiện nhiệt độ
370C; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu nhận được enzyme nattokinase có hoạt
lực cao nhất. Năm 2016, Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã phân lập và định danh
được 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ natto thương phẩm của Nhật
Bản. Tại Việt Nam, chưa ghi nhận được nghiên cứu nào về lên men vi khuẩn
Bacillus subtilis natto trên cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase. Do
đó, tôi chọn nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thời gian lên
men, tỷ lệ giống, bề dày lớp cơ chất đối với quá trình lên men Bacillus subtilis
natto trên cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase

6

CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
2.1.1. Nguyên liệu
- Bã đậu nành lấy từ 3 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố Quảng
Ngãi.
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa
Hóa thuộc trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp.
- Bột đậu nành được tạo thành bằng cách sử dụng hạt đậu nành rang chín,
xay mịn.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ: được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn
công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, trường Đại học Bách
khoa Đà Nẵng
2.1.3. Hóa chất: được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn công nghệ
sinh học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà
Nẵng
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.1. Phương pháp xác định một số thành phần hóa học của bã đậu
nành
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy mẫu đến khối lượng không đổi,


7

lipid bằng phương pháp Soxhlet, protein, tinh bột bằng cách gửi mẫu kiểm
nghiệm.

2.2.2. Phương pháp hoạt hóa và giữ giống
Cấy chuyền và bảo quản các ống giống trong môi trường thạch nghiêng ở
nhiệt độ 4-50C. Thực hiện lặp lại việc cấy truyền 1-2 tháng/lần.
2.2.3. Phương pháp nhân giống:
Sử dụng sữa đậu nành làm môi trường nhân giống, nuôi trên máy lắc ở tốc
độ 180 vòng/phút, trong điều kiện 370C.
2.2.4. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Pha loãng dung dịch sau nhân giống bằng dung dịch NaCl 0,9% ở các
nồng độ thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,... Chuẩn bị môi trường đĩa thạch vô
trùng. Cho 0,1ml dung dịch sau nhân giống đã pha loãng vào mỗi đĩa Petri.
Dùng que gạt vô trùng trải đều mẫu trên mặt thạch. Đặt đĩa Petri vào tủ ấm ở
370C. Sau 24h, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 0,1ml
mẫu.
Mật độ tế bào là: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/ V
Trong đó: Ai: số lượng tế bào.
Di: là độ pha loãng
V: là dung dịch huyền phù tế bào (ml)
2.2.5. Phương pháp lên men

Bã đậu nành

Bổ sung nước
Bacillus subtilis natto
Hấp chín
(1210C, 1atm, 30 phút)

Nhân giống

Để nguội
(36-390C)

Lên men bề mặt

Bã đậu nành lên men

Hình 2.2. Quy trình lên men bã đậu nành bằng phương pháp lên men bề mặt


8

2.2.5.1. Khảo sát thời gian lên men
Để xác định thời gian lên men thích hợp thu enzyme có hoạt lực cao nhất,
tiến hành lên men 05 mẫu, mỗi mẫu gồm 02 thí nghiệm thực hiện với tỷ lệ giống
10% (v/w). Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm,
xác định thời gian lên men thích hợp.
2.2.5.2. Khảo sát tỷ lệ giống
Vi khuẩn Bacillus subtilis natto được nuôi cấy trong 5 mẫu, mỗi mẫu gồm
02 thí nghiệm. Các tỷ lệ giống được khảo sát gồm: 10%, 12%, 14%, 16%, 18%
(v/w). Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm, xác
định tỷ lệ giống thích hợp.
2.2.5.3. Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung
Bã đậu nành sau khi được hấp tiệt trùng, tiến hành bổ sung bột đậu nành
theo các tỷ lệ: 10%, 20%, 30%, 40%, trộn đều, đánh cho tơi xốp và phân phối
vào các khay lên men. Giống vi khuẩn được cấy vào môi trường lên men với tỷ
lệ thích hợp đã được xác định thí nghịệm và lên men trong thời gian thích hợp
đã được xác định. Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí
nghiệm, xác định tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung thích hợp.
2.2.5. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô
Hỗn hợp sau lên men được giữ ở nhiệt độ 40C trong 10 phút. Thêm dần dần
dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 40C vào hỗn hợp sau lên men đồng thời khuấy

đều, để yên trong 40 phút. Tiến hành lọc và ly tâm 4000 vòng/phút, 20 phút để
thu dịch chiết enzyme thô.
2.2.6. Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol
96%
Dịch chiết enzyme được giữ ở nhiệt độ 40C và ethanol ở nhiệt độ -40C
trong 1 giờ. Thêm dần dần ethanol vào dịch chiết enzyme với tỷ lệ nghiên cứu
và dùng đũa khuấy nhẹ để dịch enzyme hòa đều với ethanol, xuất hiện kết tủa để
yên trong 15-24 giờ để dung dịch phân lớp. Tiến hành li tâm với tốc độ 15000
vòng/20 phút để thu tủa enzyme.
2.2.7. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease
Sử dụng phương pháp Amano xác định hoạt độ enzyme protease. Đơn vị
hoạt độ protease là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương tương với


9

100µg tyrosin trong 1µl dịch lọc ở điều kiện thí nghiệm.
3.2.8. Phương pháp sấy thăng hoa
Lạnh đông kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (-150C đến -100C); sau đó cho
mẫu vào thiết bị sấy thăng hoa. Quá trình sấy thực hiện ở nhiệt độ < 50 0C trong
thời gian 10-14 giờ. Sản phẩm sau khi sấy được nghiền mịn, cho vào lọ kín và
bảo quản.
3.2.9. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại thí nghiệm. Xử lý
số liệu thí nghiệm bằng phần mềm Anova trên Excel 2016.
CHƯƠNG 3
KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÃ ĐẬU
NÀNH
Bảng 3.1. Một số thành phần hóa học của bã đậu nành

Thành phần hóa học
Protein
Tinh bột
Lipid
Tỷ lệ (% khối lượng)
21,84
20,74
0,18
Kết quả trên phù hợp với số liệu của tác giả Suhong Li và cộng sự (2013)
đã công bố về thành phần của bã đậu nành. So với nguồn nguyên liệu truyền
thống thu nhận enzyme nattokinase - đậu nành thì thành phần dinh dưỡng của bã
đậu nành thấp hơn về hàm lượng protein và tinh bột.
3.2. XÂY DỰNG DƯỜNG CHUẨN TYROSIN
Căn cứ vào đường chuẩn tyrosin, xác định hoạt độ enzyme protease theo
lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên.
Với hệ số tương quan R2 = 0,9912, đường chuẩn tyrosin đã xây dựng có
độ tin cậy lớn, phù hợp sử dụng để xác định hoạt lực enzyme. Số liệu tại Phụ lục
1.

Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn tyrosine


10

3.3. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG
Để chọn thời gian nhân giống, tôi xây dựng đường cong sinh trưởng của
Bacillus subtilis natto. Số liệu tại Phụ lục 2.
Qua phân tích, cho thấy đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus
subtilis natto trải qua các giai đoạn sau:
- Pha tiềm phát: Giai đoạn này xảy ra trong 4 giờ, đây là thời gian tương

đối ngắn, chứng tỏ tế bào vi khuẩn trong ống giống ở trạng thái tốt.
- Pha logarit: Đây chính là pha quan trọng nhất đối với quá trình nhân
giống, vì thế nên chọn thời điểm kết thúc quá trình nhân giống nằm trong pha
logarit.
- Pha cân bằng: tốc độ sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật giảm
dần. Do đó, cần kết thúc quá trình nhân giống trước khi vi sinh vật bước vào pha
cân bằng.
- Pha suy vong: sau 36 giờ số lượng tế bào giảm do bị phân huỷ ngày càng
nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt, chất độc hại tăng ức chế vi khuẩn sinh trưởng,
phát triển.
Kết luận: Tôi quyết định chọn thời gian kết thúc quá trình nhân giống là 24
giờ với mật độ tế bào là 8,86 x 108 CFU/ml nhằm thu được số lượng tế bào vi
khuẩn cao đồng thời thuận lợi cho thời gian lên men và thu nhận enzyme sau đó.

Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis natto
3.4. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Kết quả cho thấy hoạt độ enzyme cao nhất ở thời điểm 24h là 3,26


11

đvht/ml, lớn hơn nhiều so với hoạt độ enzyme đo được tại thời điểm 22h. Sau
24h, hoạt độ enzyme giảm dần. Sự giảm hoạt độ enzyme sau thời điểm 24h có
thể được lý giải bởi các lý do sau: lượng dinh dưỡng giảm không đủ cung cấp
cho vi khuẩn sử dụng, vi khuẩn tổng hợp các chất kìm hãm trong môi trường
như các acid hữu cơ làm giảm hoạt lực của enzyme. Kết quả này phù hợp với
một số nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước và thế giới như Po Ting
Chen (2007), E. M. El- Safey và U.M. Abbul- Raouf . Kết luận: Thời gian lên
men 24h được chọn là thời gian thích hợp để lên men vi khuẩn Bacillus subtilis

natto cho các nghiên cứu khảo sát tiếp theo. Số liệu tại Phụ lục 3.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian lên men đối với quá trình lên men bã đậu
nành thu nhận enzyme nattokinase
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Từ kết quả hoạt độ enzyme thu được ở các tỷ lệ giống khảo sát, cho thấy:
hoạt độ enzyme tăng dần từ tỷ lệ giống 10% đến 14%. Hoạt độ enzyme đạt giá
trị lớn nhất 5,27 đvht /ml ở tỷ lệ giống 14%. Điều này có thể được hiểu khi số
lượng tế bào vi khuẩn tăng lên thì lượng enzyme do vi khuẩn sinh tổng hợp và
tích lũy nhiều hơn, cho hoạt lực cao hơn. Tuy nhiên, sau đó hoạt lực enzyme lại
giảm ở tỷ lệ giống 16%, có thể do 02 nguyên nhân. Thứ nhất, vi khuẩn Bacillus
subtilis natto là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, lượng oxy cung cấp cho quá trình
lên men ảnh hưởng lớn đến khả năng trao đổi chất, sinh trưởng, phát triển và
tích lũy các enzyme ngoại bào. Khi tăng tỷ lệ dịch tăng sinh lên 16% và 18% đã
làm tăng độ ẩm của bã đậu nành làm hạn chế khả năng lưu thông không khí,
giảm lượng oxy cung cấp cho vi khuẩn. Điều này dẫn đến làm giảm hoạt tính
của enzyme do vi khuẩn sinh tổng hợp ra. Nguyên nhân thứ hai có thể kể đến là
lượng vi khuẩn ban đầu nhiều trong khi hàm lượng các chất dinh dưỡng của cơ


12

chất không đủ cung cấp dẫn đến hiện tượng cạnh tranh giữa các vi khuẩn. vi
khuẩn tiết ra các chất kìm hãm lẫn nhau làm giảm hoạt lực của enzyme. Kết
luận: Chọn 14% (v/w) là tỷ lệ giống thích hợp để lên men vi khuẩn Bacillus
subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase. Kết quả này cũng phù hợp với kết
quả nghiên cứu của Bùi Thị Nhung (2013). Số liệu tại Phụ lục 3.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đối với quá trình lên men bã đậu nành thu
nhận enzyme nattokinase

3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung vào môi
trường lên men
Kết quả thí nghiệm cho thấy hoạt độ enzyme cao nhất ở tỷ lệ bột đậu nành
là 20% (w/w), lớn hơn nhiều so với hoạt độ enzyme đo được khi bổ sung 10%
bột đậu nành. Tuy nhiên, khi tăng lượng bột đậu nành bổ sung lên mức 30% và
40% thì hoạt độ enzyme thu được lại giảm. Sự giảm hoạt độ enzyme khi tăng tỷ
lệ bột đậu nành bổ sung có thể được lý giải bởi lý do sau: bột đậu nành có kích
thước hạt nhỏ nên lấp đầy các khe hở trong bã đậu nành, làm giảm sự thông
thoáng của môi trường lên men, hạn chế sự cung cấp oxy cho vi khuẩn phát
triển. Mặt khác, bột đậu nành có độ ẩm thấp nên khi bổ sung sẽ làm giảm độ ẩm
của môi trường lên men, ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme sinh tông hợp. Kết
luận: Tỷ lệ 20% bột đậu nành bổ sung vào môi trường lên men được chọn là tỷ
lệ thích hợp để thực hiện lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu nhận
enzyme. Số liệu tại Phụ lục 3.


13

Hình 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung đối với quá trình lên men
bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase
3.5. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÀM TAN HUYẾT KHỐI CỦA ENZYME
NATTOKINASE
Bảng 3.2. Kết quả thử khả năng làm tan huyết khối của dịch chiết enzyme
Mẫu

Khối lượng cục máu đông

Khối lượng cục máu đông

ban đầu (g)

sau 8 giờ (g)

Mẫu trắng

3,18

3, 15

Mẫu 1

3,55

1,63

Mẫu 2

3.30

1,19

Kết quả trên cho thấy, trong khi mẫu trắng không có khả năng làm tan cục máu
đông thì dịch chiết enzyme đã chứng tỏ khả năng làm tan cục máu đông ở cả 02 mẫu
thử. Do đó, có thể kết luận: dịch chiết enzyme thu được chứa enzyme nattokinase có
khả năng tiêu fibrin. Tuy nhiên, dịch chiết enzyme còn chứa nhiều thành phần tạp chất
nên hoạt tính không cao, do đó để nâng cao hoạt tính enzyme nattokinase, tôi tiến hành
kết tủa công đoạn kết tủa enzyme.
3.6. KHẢO SÁT TỶ LỆ ETHANOL 96% TRÊN DỊCH CHIẾT ENZYME THÔ
THU NHẬN KẾT TỦA ENZYME
Trong phạm vi nghiên cứu này, tôi chỉ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ

cồn 96% đối với sản lượng enzyme thu được. Các tỷ lệ ethanol: dịch chiết enzyme thô
được khảo sát là 1/1; 1,5/1; 2/1; 2,5/1.
Qua kết quả thí nghiệm chọn tỷ lệ cồn: dịch chiết enzyme là 1,5/1, khi đó lượng
enzyme thu được là nhiều nhất.


14

Hình 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol 96% đối với quá trình kết tủa
enzyme nattokinase
Kết tủa enzyme thu được có độ ẩm lớn nên khó bảo quản nên tôi tiến hành
sấy thăng hoa ở 500C trong thời gian 12h để thu chế phẩm enzyme có độ ẩm
thấp dễ bảo quản. Chế phẩm enzyme thu được sau khi sấy thăng hoa ở trạng thái
rắn, tơi, mịn, màu nâu, mùi đặc trưng của natto. Chế phẩm enzyme có hoạt độ
35,29đvht/g. Số liệu tại Phụ lục 4.
3.7. ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEASE GIÀU
ENZYME NATTOKINASE VÀ SINH KHỐI VI KHUẨN BACILLUS
SUBTILIS NATTO
Bã đậu nành
Bacillus subtilis
Natto

Nhân giống

Khử trùng
(1210C, 1atm, 30 phút)

Lên men

Bột đậu nành

Sản phẩm sau lên men

Sấy khô 400C

Nghiền nhỏ

Rây thu hạt mịn

Hình 3.7. Sơ đồ qui trình sản
Đóng bao

Chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh
khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto

xuất chế phẩm protease giàu
enzyme nattokinase và sinh khối vi
khuẩn Bacillus subtilis natto


15

3.8. ĐỀ XUẤT QUI TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME
NATTOKINASE THÔ QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
Bã đậu nành
Bacillus subtilis Natto
Khử trùng
(1210C, 1atm, 30 phút)

Nhân giống

Dung dịch NaCl 0,9%

Lên men

Bột đậu nành

Khuấy (40C, 30 phút)

Bã

Lọc

Bã

Ly tâm (4000 vòng/phút, 20
phút)

Dịch chiết enzyme thô
Ethanol 96%

Ly tâm thu tủa enzyme

Sấy thăng hoa

Chế phẩm enzyme

Hình 3.8. Sơ đồ qui trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase thô ở quy mô phòng
thí nghiệm

16

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
1. Xác định một số thành phần hóa học của bã đậu nành gồm protein (21,84%),
tinh bột ( 20,74 %) và lipit (0,18%).
2. Xác định thời gian nhân giống thích hợp là 24 giờ với mật độ tế bào là 8,86 x
108 CFU/ml.
3. Quá trình lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu nhận dịch chiết enzyme
nattokinase thô có hoạt lực cao nhất 11,67 đv/ml ở điều kiện: tỷ lệ giống 14% (v/w),
thời gian lên men 24 giờ, với môi trường lên men là bã đậu nành bổ sung 20% bột đậu
nành.
4. Tỷ lệ cồn etanol 96% : dịch chiết enzyme thô thích hợp để thu nhận lượng kết
tủa enzyme nhiều nhất là 1,5:1.
5. Từ 100g môi trường lên men ban đầu qua quá trình thu nhận dịch chiết, kết tủa
enzyme và sấy thăng hoa thu được chế phẩm enzyme nattokinase có hoạt độ
35,29đv/g.
6. Đề xuất 02 quy trình sản xuất gồm: Quy trình sản xuất chế phẩm protease giàu
enzyme nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto ; Quy trình thu nhận
chế phẩm enzyme nattokinase thô ở quy mô phòng thí nghiệm
Kiến nghị:
1. Nghiên cứu khảo sát các điều kiện lên men với cơ chất bã đậu nành có bổ sung
các cơ chất giàu dinh dưỡng nhằm tăng hoạt lực enzyme thu nhận được.
2. Nghiên cứu quá trình tinh sạch enzyme nhằm thu nhận chế phẩm enzyme kỹ
thuật và chế phẩm tinh khiết.
3. Khảo sát quy trình sản xuất enzyme nattokinase ở quy mô công nghiệp.


17

PHỤ LỤC 1
Xây dựng đường chuẩn tyrosin
Nồng

Kết quả đo quang

Giá trị trung bình kết

độ tyrosin (µg/ml)

quả đo quang

0

0

0

0

0,0

10

0,196

0,195

0,195

0,2

20

0,293

0,298

0,297

0,3

30

0,398

0,402

0,402

0,4

40

0,587

0,557

0,586

0,6

50

0,697

0,699

0,699

0,7

60

0,815

0,82

0,82

0,8

70

0,913

0,927

0,918

0,9

80

1,032

1,127

1,029

1,1

90

1,172

1,131

1,132

1,1

100

1,202

1,281

1,295

1,3


18

PHỤ LỤC 2
Xây dựng đường cong sinh trưởng của
vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Thời gian (h)

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

23

31

73,

13

19

39

88

1.5

1.9

2.0

1.1

76

5

5

5

7

5,6

92

23

15

32

1

7,3 7,4 78, 8,1 8,2 8,6 8,9

9,2

9,2

9,3

9,1 8,8

0

8

0

Mật độ tế bào
x106
(CFU/ml)
Log
(CFU/ml)

6

9

6

3

4

0

0

3

8

19

PHỤ LỤC 3
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men
1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên

Kết quả đo

Hoạt độ

men (giờ)

quang

(đv/ml)

Mẫu 1

Mẫu 2

20

0,380

0,376

1,17c  0,021

22

0,383

0,395

1,27bc  0,085

24

0,564

0,524

3,26a  0,455

26

0,424

0,445

1,76b  0,170

28

0,467

0,393

1,74bc  0,601

2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống
Tỷ lệ giống

Kết quả đo

Hoạt độ

% (v/w)

quang

(đv/ml)

Mẫu 1

Mẫu 2

10

0,547

0,523

3,04c  0,255

12

0,627

0,614

4,48b  0,170

14

0,656

0,667

5,27a  0,156

16

0,553

0,571

3,47c  0,205

18

0,551

0,539

3,20c  0,134

3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bột dậu nành bổ sung vào môi trường lên men

Tỷ lệ bột đậu

Kết quả đo quang

nành

Hoạt độ
(đv/ml)

% (w/w)

Mẫu 1

Mẫu 2

10

0.779

0.766

7,86c  0,219

20

0.917

0.909

11,67a  0,170

30

0.951

0.841

9,76b  0,191

40

0.832

0.825

9,29b  0,141


20

PHỤ LỤC 4
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% trên dịch chiết enzyme thô thu nhận kết tủa
enzyme
Tỷ lệ ethanol:

Khối lượng kết

Giá trị trung bình

dịch chiết

tủa (g)

khối lượng kết tủa

enzyme thô

(g)

(v/v)

Mẫu 1

Mẫu 2

1/1

18.03

17.12

17.58b  0,643

1,5/1

19.98

19.76

19.87a  0,156

2/1

13.83

14.24

14.04c  0,290

2,5/1

13.83

14.03

13.93c  0,100