Nghiên cứu thu nhận enzyme a-amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------------------------------------




NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI





NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM
α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC





Thành phố Hồ Chí Minh – 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------------------------------------



NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM
α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM


Thành phố Hồ Chí Minh – 2009




MỞ ĐẦU

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Chúng có mặt khắp
nơi: trong đất, trong nước, trong không khí,… kể cả trong cơ thể con người. Ngoài
tác hại do vi sinh vật gây ra như: gây bệnh cho thực vật, động vật và con người;
thì nguồn lợi mà chúng mang lại cho chúng ta vô cùng to lớn nếu ta hiểu, biết và
sử dụng chúng hợp lý. Các chủng vi sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói
riêng đã và đang được sử dụng rất phổ biến trong các chế phẩm sinh học để
phục vụ cho các ngành sản xuất như: rượu, bia, công nghiệp dệt, thuộc da, bổ
sung vào thức ăn cho gia súc để dễ tiêu hoá, thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản,

trong y học và nghiên cứu,… là nhờ khả năng sinh các loại enzym thuỷ phân của
các chủng vi sinh vật này.
Enzym là những chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất
xúc tác nó còn có những tính chất ưu việt hơn như: có hiệu suất xúc tác rất cao ở
điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này
vẫn được bảo tồn khi tách enzym ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện
invitro. Vì vậy, enzym ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với quy mô
ngày càng lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất
enzym. Việc sử dụng enzym trong thực tế không chỉ có ý nghóa về kinh tế mà còn
giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vấn đề bức xúc về môi trường.
Trước kia, enzym thường được thu nhận từ tế bào thực vật hoặc động vật
(chẳng hạn amylase được lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dạ
dày,…). Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzym ở động vật và thực vật gắn liền
với sự trao đổi chất và nhu cầu của tế bào. Ngoài ra, người ta còn phải phá bỏ
các tổ chức tế bào để tách chiết và thu nhận enzym. Như vậy, việc dùng tế bào
động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym là khá hạn chế,




thiếu tính kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu về số lượng enzym cần thiết
cho sản xuất.
Trong khi đó, ở vi sinh vật hầu như chứa đầy đủ các loại enzym và việc sử
dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể như nguồn
nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền hơn vì chúng thường là
phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) hoặc
nguồn nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy
dễ dàng, và enzym có hoạt tính cao hơn. Vì thế, khoảng 50 năm gần đây các chế
phẩm enzym từ vi sinh vật đã dần thay thế các enzym có nguồn gốc thực vật,
động vật.

Trong hàng loạt các loại enzym khác nhau thì amylase là enzym phân giải
tinh bột tạo đường cho các sinh vật. Từ những năm đầu thế kỷ 18 các nhà khoa
học đã bắt đầu nghiên cứu về amylase và đến nay đã biết khá rõ về loại enzym
này. Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lónh vực sản xuất như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,…Sản xuất amylase công nghiệp đã được chú
ý từ rất lâu và ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Việt Nam chúng
ta là một trong nhiều nước đã và đang có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng
enzym amylase, nhưng nền công nghiệp sản xuất enzym ở nước ta chưa thật sự
phát triển.
Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi chọn đề tài cho luận văn: “Nghiên cứu
thu nhận enzym α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô”.
Nội dung của đề tài gồm một số vấn đề sau:
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và
sinh enzim amylase có hoạt tính mạnh từ đất vườn qua trung gian cỏ khô.
2. Nghiên cứu hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc, và các đặc điểm sinh
học của chủng tuyển chọn.




3. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu được dòch enzym amylase
có hoạt độ cao.
4. Đònh danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật di truyền phân tử.
5. Nuôi cấy chủng đã tuyển chọn trong thiết bò bình lên men tam giác 1 lít
với các điều kiện nuôi cấy tối ưu. Nghiên cứu động học quá trình sinh
tổng hợp amylase với 3 thông số là pH, sinh trưởng và hoạt độ enzym.
6. Tách chiết enzym amylase từ dòch lên men nhờ các tác nhân tủa.
7. So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt độ chế phẩm enzym (CPE) amylase
thu được từ các tác nhân tủa khác nhau.
8. Nghiên cứu độ bền nhiệt và độ bền pH của CPE amylase.

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39]
Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 –
2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước,
không khí.
Là vi khuẩn dò dưỡng hoá năng, thu năng lượng nhờ sự oxi hoá các hợp chất
hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc
hiếu khí tuỳ tiện.
Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào đã trải
qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào

sinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng tự
phân giải giải phóng bào tử. Các tế bào Bacillus đặc trưng là sinh bào tử màø vẫn
giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào tử, trong một số trường hợp tế bào vi
khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử. Tuỳ loài mà bào tử có thể nằm chính
tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào.
Bào tử có khả năng chòu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì
vậy chúng có khả năng giữ ở trạng thái bào tử nhiều năm. Bào tử không phải cơ
quan sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống, nó được tạo ra để giúp tế
bào chòu được các điều kiện bất lợi của môi trường. Đó là dạng nghỉ của tế bào.
Bào tử ở dạng tự do không có quá trình trao đổi chất, khi gặp điều kiện thuận lợi
mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng.
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như
Bacillus alcalophillus, hoặc với pH = 2 – 6 như Bacillus- acidocaldrius.
Về nhiệt độ, có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45
0
C – 75
0
C), hoặc ưa lạnh
(5
0
C –25
0
C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ tối ưu là 34
0
C – 37
0
C.
Hầu hết Bacillus không gây bệnh cho người và động vật. Một số loại gây

bệnh cho côn trùng như Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B.
cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus và B. anthracis có thể gây bệnh cho
người)…đa số còn lại trong tự nhiên là có ích.
Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm,
cellulase… và các enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ
môi trường, nông nghiệp…
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên
1.1.1 Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ
biến trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô nên Bacillus subtilis được gọi là trực
khuẩn cỏ khô.
Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều
khi tế bào nối lại với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng
riêng rẽ.
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mòn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch.
Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 30
0
C – 50
0
C, thường
nuôi cấy ở 37
0
C.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm
nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có
những chứng cứ về việc duy trì sức sống bào tử B. subtilis trong 200-300 năm.
Vi khuẩn B. subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng

chòu được điều kiện khắc nghiệt vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo vệ vi
khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm
tiêu bản, qua kính hiển vi chúng ta có thể nhìn thấy màng nhày của B. subtilis là
không màu, trong suốt, còn tế bào vi khuẩn bắt màu nâu đỏ trên nền tiêu bản
xanh hoặc đen.




B. subtilis có khả năng sinh ra một số enzym như: α-amylase, protease
kiềm có giá trò cao, đặc biệt có khả năng tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B
2
).
Vì vậy, B. subtilis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp.
1.1.2. Bacillus mesentericus
Bacillus mesentericus còn được gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có
mặt chủ yếu trên khoai tây. Chúng gần giống Bacillus subtilis khuẩn lạc ăn sâu
và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan ra
môi trường, màu xám nhạt-trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như Bacillus
mensentericus ruber hoặc đen như Bacillus mensentericus niger .
Bacillus mensentericus sinh trưởng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 36 –
45
0
C, tối đa 50 – 55
0
C, pH = 4,5 – 5 thì ngừng phát triển.
Bacillus mensentericus có hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn
Bacillus subtilis, nhưng lên men đường lại kém hơn.
Bacillus mensentericus và Bacillus subtilis rất phổ biến trong tự nhiên,
chúng lây nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm có chứa

nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả). Ngoài ra, chúng còn sinh
ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin,
ở Bacillus subtilis gọi là subtilin.
1.1.3. Bacillus cereus
Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B. mycoides,
B. thuringiensis. Bào tử của chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm,
nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong không khí…Chúng thường sinh
sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm
hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm.
Tế bào của B. cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có khi dài hơn,
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.




Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, bề mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc
dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm.
1.1.4. Bacillus megaterium
Megaterium có nghóa là “con thú lớn”, tế bào của nó khá lớn khoảng gấp
hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. Ở các
ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế
bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen).
Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng
nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào.
Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc
hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn đều hay
lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ
yếu tố dinh dưỡng nào khác.
1.1.5. Bacillus pumilus

Bào tử phát tán rộng, có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis. Khuẩn
lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế
bào B. subtilis.
1.1.6. Bacillus polymyxa
Kích thước tế bào là (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành
đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình quả chanh. Bào
tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 μm), trên bề mặt cắt ngang như hình
sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng.
Khuẩn lạc của B. polymyxa vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần ra xung
quanh, mép đôi khi có thuỳ.
Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bò hỏng. Vì vậy,




người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Chúng là nguồn để sản xuất
kháng sinh polymyxin.
1.1.7. Bacillus simplex
Tế bào B. simplex nhỏ bé, có kích thước (2 – 5) × 0,6 μm, thường đứng
riêng rẽ không gắn thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 × 0,9 μm,
nằm lệch tâm.
Khuẩn lạc của B. simplex giống khuẩn lạc B. cereus, chỉ khác là khuẩn lạc
của B. simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường.
1.1.8. Bacillus brevis
B. brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, đứng riêng
rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi. Bào tử có hình bầu dục nằm cuối tế bào làm cho tế
bào có một đầu hơi phồng to.
Khuẩn lạc của B. brevis màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng,
lấp lánh, mép răng cưa giống như dạng mỡ đặc.
1.1.9. Bacillus aslersporus

Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào
tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm giữa tế bào. Khi
hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút trông giống như dạng Clostridium.
Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng,
mềm, nhày, đồng chất.
1.2. Khái quát chung về enzym [1], [4], [15], [23], [49].
Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá
trình trao đổi chất trong tế bào của cơ thể, và giữa cơ thể với môi trường ngoài.
Quá trình trao đổi chất của sinh vật là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Khi
cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Quá trình trao đổi
chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục




của vật chất trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh học xảy ra thường xuyên
không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà ở cả ngoài môi trường bao quanh tế bào.
Các phản ứng sinh học này được xúc tác bởi một loại protein đặc biệt được gọi
là enzym. Các enzym tham gia phản ứng trong tế bào gọi là enzym nội bào, còn
các enzym thuỷ phân có chức năng phân huỷ chất hữu cơ ngoài tế bào thành
chất dinh dưỡng có thể hấp thụ vào tế bào gọi là enzym ngoại bào. Cả hai loại
enzym này đều được tổng hợp trong tế bào.
1.2.1. Enzym cảm ứng.
Những enzym được tạo thành từ VSV không phải chỉ phụ thuộc vào loại
VSV mà còn phụ thuộc thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy.
Hiện tượng trên là do trong môi trường có chất khó đồng hoá, VSV tiết vào môi
trường một hoặc các enzym tương ứng để tạo thành chất có thể đồng hoá được.
Các enzym được tiết ra như thế được gọi là enzym cảm ứng và các cơ chất
kích thích quá trình tổng hợp enzym cảm ứng gọi là chất cảm ứng.
1.2.2. Bản chất sinh học của enzym.

Các loại enzym đều có các đặc tính sinh học chung như sau:
+ Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật.
+ Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzym được
tách khỏi tế bào sống.
+ Enzym tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà, vì enzym
được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ của
cơ thể. Phần lớn nhiệt độ của cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30-40
o
C.
+ Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể.
+ Phản ứng enzym là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong
khi đó, các phản ứng hoá học được xúc tác bởi các chất xúc tác hoá học đòi hỏi
năng lượng rất lớn.




+ Enzym chòu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Điều này
có ý nghóa rất lớn trong việc điều khiển sự tổng hợp enzym trong tế bào sinh vật.
1.2.3. Bản chất hoá học của enzym.
Phân tích thành phần hoá học của enzym người ta chia thành hai nhóm:
+ Nhóm enzym đơn cấu tử: là các enzym được cấu tạo chỉ có protein. Các
hydrolase thuộc loại này.
+ Nhóm enzym đa cấu tử: bao gồm những enzym có hai thành phần:
• Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzym. Ngày nay
mới tìm thấy một số ARN có hoạt tính enzym chuyển hoá tiền chất thành các
ARN. Các enzym ARN được gọi là Ribozim. Hiện nay đã biết có 3500 enzym có
bản chất protein và 100 ribozim.
• Phần thứ hai là thành phần không phải protein mà là những chất hữu
cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Thiếu thành phần thứ hai này

thì các enzym không hoạt động, nên gọi chúng là chất cộng tác (cofactor). Các
chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein bằng liên kết đồng
hoá trò được gọi là nhóm phụ (prosthetic), hoặc cũng có thể gắn lỏng lẻo và dễ
dàng tách chúng khỏi protein được gọi là coenzym.
Apoenzym quyết đònh tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt độ xúc tác của
enzym. Còn những chất hữu cơ đặc hiệu quyết đònh kiểu phản ứng, trực tiếp
tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây
biến tính.
Ngoài ra, trong thành phần của enzym còn có sự hiện diện một số kim
loại, các kim loại này thường rất dễ tách ra khỏi enzym. Trong trường hợp
enzym mất kim loại chúng sẽ mất hoạt tính. Khi đưa trở lại các kim loại tương
ứng vào enzym thì hoạt tính của enzym lại được khôi phục, tính chất này mang
tính thuận nghòch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzym vẫn chưa thực




sự làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng có thể kim loại đóng vai
trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực
tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và
peroxydase.
1.2.4. Tính chất hoá học của enzym.
Enzym có thể hoà tan trong nước, trong dung dòch muối loãng tạo thành
các dung dòch keo ưa nước, nhưng enzym không tan trong dung môi không phân
cực. Khi enzym được hoà tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp
với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzym tạo
thành lớp vỏ hydrat. Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng làm
môi trường cho các phản ứng sinh hoá.
Enzym bò kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein như muối trung tính bão
hoà (NaCl, (NH

4
)
2
SO
4
…), dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp (etanol, aceton…) nên
các chất này được dùng để thu chế phẩm enzym hoạt động. Tuy nhiên, protein
sẽ bò biến tính làm cho enzym mất hoạt tính do sự tác động của các tác nhân
như: nhiệt độ cao, môi trường acid hay kiềm quá cao, các muối kim loại nặng. Vì
vậy, người ta đã dùng các yếu tố trên để kìm hãm hoạt tính enzym khi cần thiết.
1.2.5. Cấu trúc enzym.
Không phải toàn bộ các thành phần của enzym tham gia vào hoạt động
xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử
enzym mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung
tâm hoạt động của enzym. Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho
cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác. Mỗi enzym thường có một
trung tâm hoạt động. Tuy nhiên cũng có enzym có hai thậm chí có bốn trung tâm
hoạt động.
1.2.6. Cơ chế tác dụng của enzym




Bản chất của các phản ứng enzym là khi có sự tham gia xúc tác của các
enzym, các cơ chất sẽ được hoạt hoá mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hoá học
của cơ chất. Dưới tác dụng của enzym, cơ chất có thể có những thay đổi không
chỉ về cấu trúc hoá học, mà còn thay đổi tính chất hoá học. Quá trình xúc tác
của enzym xảy ra qua ba giai đoạn:
• Giai đoạn thứ nhất: enzym sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết
yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzym-cơ chất thường không bền, phản ứng xảy ra

rất nhanh, đòi hỏi một ít năng lượng.
• Giai đoạn thứ hai: cơ chất bò thay đổi cấu hình không gian và mức độ
bền vững của các liên kết. Kết qủa là các liên kết trong cơ chất bò phá vỡ.
• Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành
và tách khỏi enzym. Enzym được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được tóm tắt như sau:
E + S ↔ ES → E + P
Trong đó, E: enzym (enzyme); S: cơ chất (substrate); P: sản phẩm
(products).
1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym.
• Nồng độ cơ chất
Khi phân giải một loại cơ chất nào đó, phần cơ chế tác dụng của enzym
cho thấy phản ứng khi có enzym tham gia sẽ trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu nếu nồng độ cơ chất thấp thì vận tốc phản ứng (V) phụ
thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
Giai đoạn kế tiếp nếu V xấp xỉ giá trò cực đại thì V không phụ thuộc vào
cơ chất.
Giai đoạn tiếp theo nếu nồng độ cơ chất tiếp tục tăng cao thì hầu như V
không tăng nữa mà đạt giá trò gần với V
max
vì các enzym đã bão hoà cơ chất.




• Nồng độ enzym
Nếu thừa cơ chất, V phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym: V = k[E]
Trong đó: V: vận tốc phản ứng
[E]: nồng độ enzym
k: hằng số vận tốc phản ứng.

• Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzym. Tốc độ phản ứng chỉ
tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất đònh, vượt quá nhiệt độ đó vận tốc phản ứng
sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu do cấu trúc protein đã bò phá vỡ. Nhiệt độ tối
ưu của những enzym khác nhau là hoàn toàn khác nhau. Phần lớn enzym hoạt
động mạnh nhất ở nhiệt độ 40-50
o
C, có một số enzym khác là 60
0
C hoặc 70
0
C,
thậm chí một số enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 90
0
C.
Nếu tăng nhiệt độ cao hơn mức tối ưu thì hoạt tính của enzym sẽ bò giảm,
khi đó enzym không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngược lại, ở nhiệt độ
0
0
C thì hoạt tính của enzym bò hạn chế rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ
từ thì hoạt tính của enzym sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
Nhiệt độ tối ưu của một enzym phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ
chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ.
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q
10
để biểu thò ảnh hưởng của nhiệt
độ đến vận tốc phản ứng. Hệ số này càng lớn thì phản ứng càng khó xảy ra ở
nhiệt độ thường.
• pH môi trường
pH thường ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym, và đặc biệt ảnh

hưởng đến độ bền của enzym. Đa số enzym bền ở pH = 5-9, độ bền của enzym
tăng nếu có mặt cơ chất, coenzym, hoặc Ca
2+
. Mỗi enzym có một giá trò pH tối
ưu (pH
opt
) tại đó V đạt V
max
.




Nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, cũng có enzym hoạt
động ở pH acid hoặc pH kiềm.
• Các chất kìm hãm (I)
Các chất kìm hãm hoạt động của enzym làm giảm hoạt tính enzym nhưng
lại không bò enzym làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất
vật lý của chúng. Các chất này bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu
cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghóa rất lớn trong điều khiển các qúa
trình trao đổi chất ở tế bào sinh vật.
Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể thuận nghòch hoặc không
thuận nghòch, đặc hiệu hoặc không đặc hiệu. Sau đây chúng ta chỉ xét các chất
kìm hãm thuận nghòch. Tuỳ thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất
kìm hãm người ta chia thành các loại chất kìm hãm sau:
 Các chất kìm hãm cạnh tranh
Các chất này có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất vì thế chúng
có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym. Kết quả là trung tâm
hoạt động của enzym bò chất kìm hãm chiếm mất, do đó cơ chất mất một phần
khả năng tương tác làm tốc độ phản ứng giảm.

 Các chất kìm hãm không cạnh tranh
Các chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzym ở một vò trí không
phải trung tâm hoạt động, kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của
phân tử enzym theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất
kìm hãm làm giảm hoạt động của enzym.
Khi kết hợp với chất kìm hãm, enzym vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất
khi đó sẽ tạo thành phức hợp EIS.
Trong thực tế chất kìm hãm chỉ kết hợp với phức hợp ES mà không kết hợp
với E tự do. Các chất kìm hãm có thể là những chất sau:




 Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng
Các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm hãm không
cạnh tranh. Nếu enzym xúc tác cho phản ứng của cơ chất A và B tạo thành sản
phẩm P
1
và P
2
, enzym có ái lực với P
1
, P
2
và cả cơ chất A, B. Khi đó P
1
và P
2
trở
thành chất kìm hãm của enzym.

 Kìm hãm do thừa cơ chất
Khi ES được tạo thành có thể có một cơ chất gắn với ES làm chúng không
thể chuyển hoá tiếp được: ES + S ↔ ESS
• Chất hoạt hoá
Là những chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym. Chất hoạt hoá enzym
có thể là anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp có nhiệm
vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym
hoặc phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym.
Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một nồng độ nhất đònh, vượt
quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzym.
1.3. Hệ enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44]
Amylase thuộc hệ enzym thuỷ phân (hydrolase) chúng thuỷ phân các liên
kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của tinh bột. Từ xưa chủ yếu người ta thu nhận
amylase từ malt, nhưng ngày nay việc thu nhận chủ yếu từ nuôi cấy VSV.
Cũng như nhiều VSV khác, vi khuẩn Bacillus tạo ra rất nhiều enzym
ngoại bào như: amylase, protease, celullase,... Trong đó amylase rất quan trọng
vì chúng được sử dụng phổ biến và mang lại nhiều lợi ích cho nền sản xuất công
nghiệp. Các loại amylase thường gặp khi nuôi cấy VSV gồm: α – amylase, β-
amylase và γ-amylase.
1.3.1. Giới thiệu về enzym α – amylase.
• Cấu tạo:




α-amylase có cấu tạo gồm 3 tiểu đơn vò:
* A là tiểu đơn vò lõi có cấu trúc đặc trưng helix (α/β) 8 barel.
* Tiểu đơn vò C được nối với A có cấu trúc tám đoạn β-sheet song song.
* Tiểu đơn vò B gồm hai đoạn β-sheet được lồng vào giữa đoạn β-sheet thứ
ba và α-helix thứ ba của tiểu đơn vò A. Tiểu đơn vò B quyết đònh độ bền hoạt độ

của enzym và liên kết enzym-cơ chất. Ion canxi nối giữa tiểu đơn vò A và B, có
từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol.
Khi tách hoàn toàn canxi ra khỏi enzym thì α-amylase mất hết hoạt tính, vì
Ca duy trì cấu hình hoạt động của enzym. Mặt khác, Ca còn có tác dụng đảm
bảo độ bền rất lớn của enzym đối với các tác động gây biến tính và sự thuỷ phân
của các enzym phân giải protein.
Tuỳ thuộc vào dạng enzym mà có thể có thêm một số tiểu đơn vò khác được
gắn với đầu C-terminal hoặc đầu N-terminal của phân tử protein.
Tâm hoạt động của α-amylase có chứa các nhóm –COOH và NH
3
.










• Tính chất lý hóa
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử α-amylase [50]




giống nhau.
- pH

pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5-4,8 và của vi
khuẩn là 5,8-6,0. Nhìn chung pH tối ưu nằm trong khoảng acid yếu 4,8-6,9.
pH<4,0 α-amylase của vi khuẩn bò vô hoạt hoàn toàn, tuy nhiên một số α-
amylase chòu acid cao như của Bacillus acidocaldarious (pH tối thích là 3,5) và
chòu kiềm mạnh như B. licheniformis (pH tối thích là 9,0).
- Nhiệt độ
Nhìn chung α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác, đặc tính
này được cho rằng có liên quan đến hàm lượng ion canxi trong phân tử (α-
amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa canxi nhiều hơn α - amylase của nấm
mốc 3 - 4 lần). α - amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả.
Bảng 1.1. Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau
(theo Miller, Johson và Palmer)
Hoạt độ α-amylase, % so với hoạt độ ban đầu
Nhiệt độ (
o
C)
của nấm sợi của malt của vi khuẩn
65
70
75
80
85
90
95
100
52
3
-
-
-

-

100
100
58
25
1
-
-
100
100
100
92
58
52
8
Tính bền nhiệt cao của α-amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn. Vì trong
sản xuất α-amylase được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở công đoạn phải dùng
nhiệt độ cao.




• Cơ chế tác dụng
α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử
polysaccharid một cách ngẫu nhiên. Vì thế người ta gọi nó là enzym amylase nội
phân (endoamylase). Khi tác dụng lên tinh bột tạo ra sản phẩm chủ yếu là
dextrin phân tử lượng thấp (phản ứng không màu với iod), ngoài ra còn có
maltose, và một ít glucose. Vì vậy, người ta gọi α-amylase là amylase dextrin
hoá hay amylase dòch hoá.

1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase.
Enzym có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực
vật, vi sinh vật (VSV). Tuy nhiên việc khai thác enzym từ thực vật, động vật
thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên liệu hạn chế, hiệu suất thấp nên giá
thành cao. Hiện nay phần lớn enzym đều được thu nhận từ vi sinh vật, vì có
những điểm nổi bật sau:
- VSV có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản cực kỳ nhanh, từ đó
tổng hợp enzym với cường độ rất mạnh, nên trong một thời gian ngắn có thể thu
được một lượng enzym rất lớn.
- Hệ enzym của VSV rất phong phú, từ các chủng VSV khác nhau ta có
thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau, trong đó có những enzym
chuyên biệt chỉ có ở VSV mà hầu như không thấy ở động vật, thực vật.
- Môi trường nuôi cấy VSV đơn giản, rẻ tiền, thường là những phế phụ
liệu của ngành công nghiệp nên giá thành enzym rẻ hơn và dễ áp dụng cho các
cơ sở sản xuất.
- VSV chòu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các tác động
của môi trường, do đó người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng hoặc các
yếu tố tác động để điều khiển quá trình tổng hợp enzym theo yêu cầu.
- Việc cải tạo giống VSV để tạo ra các chủng VSV có khả năng tổng hợp




ra các loại enzym theo ý muốn có thể thực hiện được và chỉ trong thời gian ngắn,
vì khả năng thích ứng với môi trường của VSV là rất mạnh.
- Sản xuất enzym từ VSV có thể thực hiện trên qui mô công nghiệp, tự
động hóa và cơ giới hoá.
Người ta đã biết nhiều loại VSV có khả năng tổng hợp amylase, trong đó
được sử dụng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn
thì ít hơn.

- Các giống nấm sợi thường được dùng để thu amylase là Aspergillus,
Rhizopus.
- Nhiều chủng vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn amylase như:
Bacillus polymyxa, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutylicum,… trong
đó các chủng vi khuẩn ưa nhiệt tạo nhiều amylase đáng chú ý là Bacillus
diastaticus, B. stearothermophilus, B. coagulans, B. circulans; vi khuẩn ưa ẩm tạo
amylase mạnh được nghiên cứu nhiều hơn cả và sử dụng rộng rãi nhất là B.
subtilis.
Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn
tự nhiên. Trong công nghiệp, các biến chủng tạo ra được bằng cách gây đột
biến, nhờ tác nhân lý học hoặc hoá học hoặc phối hợp cả hai loại tác nhân trên,
là những chủng hoạt động rất mạnh và có khả năng sinh tổng hợp nhiều
amylase.
1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV [18], [23]
 Giống vi sinh vật
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành amylase và lượng
amylase của VSV như: chủng VSV, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi
cấy,… Trong các yếu tố trên thì chủng giống VSV là điều kiện đầu tiên và cơ
bản nhất.




Không phải các chủng VSV đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau.
Ngay cả những chủng cùng chi, thậm chí là cùng loài cũng rất khác nhau về
lượng enzym do chúng sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng VSV có
khả năng tạo nhiều amylase là vô cùng quan trọng.
Ngoài việc tuyển giống có khả năng sinh amylase cao, thì việc bảo quản
giống, tiến hành nuôi cấy trong điều kiện tối ưu cũng vô cùng quan trọng nhằm
đảm bảo khả năng sinh tổng hợp enzym cao nhất và ổn đònh nhất. Vì tầm quan

trọng như vậy mà nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc
gia và đã thành lập các trung tâm, chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV.
 Nguồn dinh dưỡng
Trong môi trường nuôi cấy VSV cần phải đảm bảo đầy đủ, thích hợp các
thành phần và tỉ lệ các chất dinh dưỡng cho từng VSV cụ thể.
• Ảnh hưởng nguồn cacbon
Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzym. Theo số liệu của Grigorev về ảnh hưởng của nguồn cacbon tới cường độ
sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau:
Với α–amylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > lactozơ > glucozơ >
sacarozơ > galactozơ > manozơ > arabinozơ.
Với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > sacarozơ > glucozơ >
lactozơ > lactozơ > arabinozơ > galactozơ > manozơ.
Nồng độ nguồn cacbon cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym. Mỗi
loài VSV chỉ có thể thích hợp với một nồng độ hydratcacbon nhất đònh.
• Ảnh hưởng nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cho các phân tử của enzym. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy có
thể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ thường dùng là nitrat amon, sunfat




amon, urê,… Các hợp chất hữu cơ là những nguyên liệu giàu đạm như cao ngô,
bột đậu tương, khô lạc, khô đậu,… Ngoài ra một số axit amin, bazơ purin,
pyrimidin cũng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy VSV.
Ngoài hai nhân tố cơ bản trên, trong môi trường dinh dưỡng của VSV sinh
enzym nói chung cần phải có mặt nhiều nguyên tố khoáng ở dạng muối magiê,
photpho, kali,…và các nguyên tố vi lượng. Ví dụ ion Mg
2+

có tác dụng làm ổn
đònh amylase ở nhiệt độ cao, Ca
2+
có trong thành phần protein của α – amylase.
 Điều kiện nuôi cấy
Trong môi trường nuôi cấy VSV các yếu tố như, nhiệt độ, độ pH, độ ẩm,
thời gian nuôi cấy,… cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym của VSV.
• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ tối thích cho sinh tổng hợp enzym của các VSV là khác nhau. Ví
dụ ở đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28-32
o
C, của vi khuẩn 30-35
o
C.
• Ảnh hưởng của pH môi trường
pH ban đầu của môi trường ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển và tạo
thành enzym. Đa số nấm mốc phát triển và tạo amylase ở môi trường axit yếu,
trong khi đó vi khuẩn lại thích hợp trong môi trường trung tính. pH môi trường
không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà còn ảnh hưởng đến chủng
loại enzym được tổng hợp. Ví dụ ở Asperillus oryzae khi pH môi trường là 6,5 thì
ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đó ưu thế tổng hợp
glucoamylase khi pH môi trường là 4,5.
• Ảnh hưởng độ ẩm của môi trường nuôi cấy
Trong quá trình sản xuất cần phải duy trì độ ẩm của môi trường, vì độ ẩm
sẽ làm giảm độ thoáng khí của môi trường, còn độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh
trưởng và phát triển của VSV. Độ ẩm môi trường xốp thích hợp nuôi nấm mốc là
50 – 60%, còn đối với vi khuẩn là 50 – 70%.

• Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự hình thành enzym. Đối với đa số
nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp sự tạo thành amylase cực đại thường kết
thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo thành amylase
thường từ 30-42 giờ. Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất từ
khoảng 40-50 giờ. Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng của chủng giống đạt cực đại
tới pha ổn đònh trước, khoảng từ 5 đến 8 giờ sau thì hoạt độ enzym đạt cực đại.
1.3.4. Tách chiết enzym từ các nguồn nguyên liệu [4], [10], [12], [14]
- Đối với enzym ngoại bào: người ta tách sinh khối và các chất cặn bã khỏi
canh trường bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm. Sử dụng thêm các chất trợ lọc
(diatomite, than hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa để các chất này dễ dàng bò
lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc dễ dàng hơn.
- Đối với enzym nội bào: để thu nhận enzym cần phải phá vỡ tế bào bằng
các phương pháp sau:
▪ Phương pháp vật lý
Nghiền tế bào trong máy đồng hoá hoặc nghiền với bột thuỷ tinh hay cát
trắng sạch trong cối sứ. Thay đổi nhiệt độ đột ngột hoặc tạo áp suất thẩm thấu
cao để phá vỡ thành tế bào.
▪ Phương pháp hoá học
Sử dụng acid để thuỷ phân thành tế bào. Tuy nhiên cho acid quá nhiều có
thể làm biến tính enzym. Hoặc có thể dùng kiềm, nhưng nếu enzym có tính acid
thì không dùng được.
▪ Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều nhất là phương pháp enzym.
Dùng các enzym tương ứng với các cơ chất có trong thành tế bào để thuỷ phân,
như vậy thành tế bào sẽ bò phá vỡ.
Sau khi phá vỡ tế bào, các enzym được tách chiết bằng các dung môi

khác nhau như: nước, dung dòch đệm, muối trung tính. Phần lớn các enzym thuỷ
phân tan tốt trong nước, do đó nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzym, có
thêm một ít focmalin để sát trùng. Nhiệt độ nước để rút chiết enzym thường là
25-28
0
C. Cần làm lạnh nhanh dòch chiết xuống 10-12
0
C để ngăn cản VSV lạ phá
hỏng dòch enzym.
1.3.5 Ứng dụng của amylase trong thực tế sản xuất và đời sống [6], [15],
[28], [29], [46]
 Trong sản xuất bánh kẹo
Mục đích của việc sử dụng enzym vào sản xuất các loại bánh quy là làm
tăng mùi và vò của bánh. Thêm các enzym protease và amylase khi chế biến bột
làm tăng hàm lượng các acid amin tự do và lượng đường khử, từ đó chúng tham
gia vào các phản ứng oxi hoá khử và kết qủa tạo cho bánh quy có mùi, vò và
màu hấp dẫn.
 Trong công nghệ sản xuất bánh mì
Trong sản xuất bánh mì, enzym được xem như chất phụ gia để làm tăng
chất lượng bánh: làm tăng thể tích bánh, bánh có màu sắc đẹp hơn và mùi thơm
hơn. Trong quá trình sản xuất người ta sử dụng enzym protease, α-amylase, β-
amylase, trong đó:
o Enzym protease có tác dụng làm giảm độ nhớt của bột nhào do gluten
gây ra và làm tăng hệ số tiêu hoá protein.
o Enzym α-amylase, β-amylase tham gia thuỷ phân tinh bột tạo ra
đường, nhờ đó nấm men dễ dàng chuyển hoá đường thành cồn, CO
2
, từ đó làm

tăng thể tích của bánh và tạo màu sắc, hương vò của bánh.
Ngày nay, nguồn enzym amylase và protease được sử dụng chủ yếu từ
nấm mốc Aspergillus oryzae, và A. awamori.