LUẬN văn CÔNG NGHỆ hóa áp DỤNG một số PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH hóa học đối với cây RAU má lá SEN CHỦ yếu là LOÀI “hydrocotyle vulgaris”

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ
BỘ MÔN HÓA
-------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
KHÓA HỌC 2003-2007
Tên ñề tài:

ÁP DỤNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA
HỌC ðỐI VỚI CÂY RAU MÁ LÁ SEN CHỦ YẾU LÀ LOÀI
“Hydrocotyle vulgaris”

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Giáo Viên Hướng Dẫn:
Ths Tôn Nữ Liên Hương

Sinh Viên Thực Hiện:
Ng. T. Kim Phụng 2033065
Lớp công nghệ Hóa Khoá29

Cần Thơ 12/2007


Lời cảm ơn

LỜI CẢM ƠN!
Qua hơn ba tháng thực hiện ñề tài tốt nghiệp ” Áp dụng một số phương pháp
phân tích hóa học ñối với cây rau má lá sen chủ yếu là loài “Hydrocotyte
vulgaris”.Kết quả ñạt ñược như ngày hôm nay. Em xin gửi lời chân thành cảm ơn

ñến:
Quý thầy cô khoa công nghệ trường ðại Học Cần Thơ ñã tạo cho em những
kiến thức và kinh nghiệm bổ ích.
Quý thầy cô bộ môn hóa Khoa Khoa Học ñã giúp ñỡ những ñiều kiện cần
thiết cho em làm luận văn.
ðặc biệt là cô Tôn Nữ Liên Hương ñã nhiệt tình hướng dẫn em tận tình trong
suốt thời gian thực hiện ñề tài.
Xin cảm ơn ñến các bạn ñồng lứa ñã giúp ñỡ ủng hộ nhiệt tình ñể tôi hoàn
thành tốt luận văn này.
Có ñược ngày hôm nay là sự dạy dỗ của gia ñình, thầy cô và giúp ñỡ của các
bạn . Xin bày tỏ lòng cảm ơn ñến tất cả.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

i


Danh mục các bảng

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết pha rắn ..........................................25
Bảng 2: Thu suất các cao bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng ......................................25
Bảng 3: Kết quả sắc ký cột phân ñoạn I của cao etyl acetat .........................................29
Bảng 4: Tóm tắt kết quả ñịnh tính các hợp chất trong cây ...........................................34

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

ii


Danh Mục Các Sơ ðồ Và Hình Ảnh Minh Họa

DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ VÀ HÌNH ẢNH MINH HỌA
Sơ ñồ 1: Qui trình ñiều chế các loại mẫu cao ............................................................... 20
Hình 1: Cây rau má lá sen Hydrocotyle vulgaris L. ...................................................... 2
Hình 2: Cây “Hydrocotyle vulgaris” ............................................................................ 3
Hình 3: Cây “Hydrocotyle bonariensis” ....................................................................... 4
Hình 4: Cây “Centella asiatica” .................................................................................. 5
Hình 5: Rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” ñã phơi gió và xay nhuyễn .................. 18
Hình 6: Ngâm dầm bột cây với metanol ....................................................................... 18
Hình 7: Cao MeOH tổng .............................................................................................. 18
Hình 8: Máy soxhlet dùng chiết pha rắn ....................................................................... 19
Hình 9: Bình lóng dùng trích lỏng-lỏng ....................................................................... 21
Hình 10: Cột sắc ký cao Ea phân ñoạn I ....................................................................... 23
Hình 11: Cao PE .......................................................................................................... 26
Hình 12: Cao cloroform .............................................................................................. 26
Hình 13: Cao Ea phân ñoạn I ....................................................................................... 27

Trung tâm
Học
ĐH
Cần
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hình 14:
Caoliệu
Ea phân

ñoạn
II ......................................................................................
27
Hình 15: Cao Ea ................................................................................................................... 28
Hình 16: Các cao alcol giai ñoạn sau ........................................................................... 28
Hình 17: Phân ñoạn 1-4 ............................................................................................... 30
Hình 18: Lọ 41 ............................................................................................................ 30
Hình 19: Phân ñoạn 43-53 ........................................................................................... 30
Hình 20: Thuốc thử Bouchardat, Cao PE sau và trước khi thêm thuốc thử ................... 31
Hình 21: Cao Ea trước và sau khi thêm thuốc thử, thuốc thử Shibata ........................... 31
Hình 22: Cao PE trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử ............................................... 32
Hình 23: Cao metanol .................................................................................................. 32
Hình 24: Cao metanol trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử gelatin mặn .................... 32
Hình 25: Cao cloroform trước và sau cho thuốc thử, thuốc thử Molish ........................ 33

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

iii


Chương 1: Mở ðầu

CHƯƠNG 1
MỞ ðẦU
Chúng ta cũng như bạn bè trên thế giới ñều ñánh giá cao sự phong phú, ý nghĩa
thực tiễn, giá trị khoa học cũng như kinh tế của nguồn tài nguyên cây thuốc Việt Nam.
Cây thuốc dân tộc và ñặc biệt tri thức y học dân tộc cổ truyền Việt Nam ñã góp phần
không nhỏ trong việc duy trì sự tồn tại và phát triển của dân tộc chúng ta từ xa xưa ñến
nay. Nó ñang và chắc chắn sẽ còn ñóng vai trò quan trọng trong việc chǎm sóc sức khỏe
cho con người và sự tồn tại một cách bền vững của y học cổ truyền Việt Nam.

Từ những năm 1940, y học hiện ñại bắt ñầu nghiên cứu tác dụng của rau má.
Hiện nay rau má ñã ñược sử dụng rất ña dạng dưới hình thức thuốc tiêm, thuốc
mở ñể ñiều trị tất cả các chứng bệnh về da như vết bỏng, vết thương do chấn thương, do
giải phẩu, cấy ghép da, những vết lở lâu lành, vết lở do ung thư, bệnh phong, vẩy nến.
Rau má ñược dùng trong thực phẩm như một loại rau gia vị (ăn sống), rau ăn
(luộc, nấu canh) hoặc nước giải khát (cả cây giã nhuyễn với nước và ñường). ðặc biệt ở
miền nam, nhân dân rất ưu chuộng rau má.
Có nhiều loại rau má có ñặc ñiểm lá tròn, cuống lá ở giữa cùng ñược gọi là rau má
lá sen. Nhưng thực chất chúng là những loài khác nhau và có tên khoa học riêng biệt, như
Hydrocotyle bonariensis, Hydrocotyle vulgaris,…ñặc biệt có vị ñắng hơn loài rau má
thường.
Gần ñây,
loàiĐH
“Hydrocotyle
bonariensis”
ñã liệu
ñược nghiên
cứu cùng
những ứng cứu
Trung tâm
Học
liệu
Cần Thơ
@ Tài
học tập
và nghiên
dụng trong y học, sinh học… Tuy nhiên “Hydrocotyle vulgaris “chưa từng qua khảo sát
và nghiên cứu ñể xác ñịnh thành phần hóa học, tìm hiểu công dụng của nó. Nên chúng tôi
tiến hành nghiên cứu ñề tài “Áp dụng một số phương pháp phân tích hóa học ñối với cây
rau má lá sen chủ yếu là loài “Hydrocotyle vulgaris”.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

1


Chương 1: Mở ðầu

Hình 1: Cây rau má lá sen Hydrocotyle vulgaris L.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

2


Chương 2: Tổng Quan

CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN
2.1. GIỚI THIỆU VỀ MỘT SỐ LOÀI RAU MÁ THƯỜNG GẶP
2.1.1. Rau má lá sen (Hydrocotyle vulgaris) [6,7,8,12,13,14,15,16,17,18,19,20,20,21,22]

Hình 2: Cây “Hydrocotyle vulgaris”
2.1.1.1. Danh pháp và phân loại
Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris (L)
MarshThơ
pennywort,pennywort.water
pennywort

, Fairy cứu
Tên nước
Trung tâm Học
liệungoài:
ĐH Cần
@ Tài liệu học tập
và nghiên
tables, water! white rot, (Ches). Penny rot, (Shrop). Farthing rot, flowkwort,
(Norf). Rotgrass, (N'thum). Shilling rot, (Ayr). Sheep rot, War, Cumb, N'thum,…
Tên thường gọi: Rau má lá sen
Phân loại:

Giới: Plantae
Phân giới: Viridaeplantae
Ngành: Tracheophyta
Phân ngành: Spermatophytina
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Araliales
Họ: Apiaceae (Hoa tán)
Phân họ: Hydrangeoideae
Tông: Hydrangeae
Chi: Hydrocotyle
Loài: vulgaris L.

2.1.1.2. ðặc ñiểm thực vật
Cỏ lưu niên, nhẵn nhụi, cây mảnh khảnh, khai căn tại các ñốt, cây cao từ 0,1
m ñến 0,5 m, cành non ngăn nhất 4-5 in (1 in=2,54 cm), lá tròn ngang 8-35 mm,
SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

3

Chương 2: Tổng Quan
hình khiên, khía tay bèo, không bị rạch ở giữa lá, 6-9 gân lá ñường trục nổi rõ mặt
dưới lá, gân lá tỏa ra từ cuống lá, lá kèm có khía khô xác, lá mầm co lại vào cuốn
lá, cuốn lá thẳng dài 25 cm ở chính giữa lá, có lông lơ thơ, ra hoa từ tháng 6-8, nhỏ
màu trắng nhẹ ñược nhuốm màu với màu hồng và màu xanh lục, 2-5 cánh hoa, thể
lưỡng tính, 1mm, ñài hoa tồn tại một thời gian ngắn hoặc không có, bao phấn màu
vàng, tự thụ phấn, ra quả từ tháng 7-10 dài 2 mm, rộng 2,5 mm, dày 0,8 mm,
không có cuốn lá bào tử.
2.1.1.3. Sinh thái
Lớn lên tùy thích trong những chỗ vũng ñầm lầy, trên những mép của
những hồ và những sông…Cây thích ánh sáng, cát, ñất sét phì nhiêu và nặng môi
trường dễ bẩn. Cây thích axít, trung tính, kiềm. Nó yêu cầu ñất ẩm ướt.
2.1.1.4. Phân bố
Châu á, bắc mỹ, phía tây vùng Caspian, châu âu, gần ñây phát hiện có mọc
ở Việt Nam.
2.1.1.5. Công dụng
Thường dùng ñể trị ung thư, trị ho gà-phương thuốc y học cổ truyền ở ðan
Mạch.
2.1.2. Rau má lá sen (Hydrocotyle bonariensis) [4,10]
2.1.2.1. Danh pháp và phân loại

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 3: Cây Hydrocotyle bonariensis L.
Tên khoa học: Hydrocotyte bonariensis L.
Tên khác: Hydrocotyte polystachya, Penywort, Large leaf penywort paraguita, rau
má lá sen.
Phân loại:

Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

4


Chương 2: Tổng Quan
Thứ: Apiales
Họ: Apiaceae
Chi: Hydrocotyle
Loài: Bonariensis
2.1.2.2. ðặc ñiểm thực vật
Là loại cỏ lưu niên, nhẵn, dạng thân rễ, mọc bò, tại mỗi ñốt có nhiều rễ và
cho ra 1-2 lá vươn thẳng lên, cọng lá dài 15-20 cm. Lá hình lọng, phiến tròn,
mỏng, rộng 3-12 cm, có thùy cạn, mép lá khía tai bèo, cuốn lá ñính ở giữa chứ
không phải ở mép như các cây khác; lá kèm khô xác, dài 0,2-0,4 cm.Tán hoa
ñường kính 1-6 cm gồm nhiều tua tụ tạo thành vòng tròn, cọng cuốn chính có thể
dài tới 40 cm, cuống nhỏ dài 0,2-2 cm. Hoa nhỏ, 5 cánh màu trắng hoặc vàng
kem, lá ñài nhọn màu lục. Quả hình bầu dục, dày 0,5-2 mm, rộng 2,5-3 mm, ñáy
và ñỉnh có khía sống lưng và phần gân nổi rõ.
Sống dễ trong nước nhưng cũng chịu ñược môi trường khô, xuất xứ ở nam
Mỹ, gần ñây phát hiện mọc ở Việt Nam.
2.1.2.3. Công dụng
ðang nghiên cứu tại Khoa Khoa học.
2.1.3. Rau má [9,11]

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 4: Cây “Centella asiatica”
2.1.3.1. Phân loại khoa học
Danh pháp khoa học: Centella asiatica
Tên khoa học ñồng nghĩa: Hydrocotyle asiatica L.
Tên khác: Rau má, tích tuyết thảo, lôi công thảo.
Phân loại:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Apiales
SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

5


Chương 2: Tổng Quan
Họ: Apiaceae (Umbelliferae)
Chi: Centella
Loài: C.asiatica
2.1.3.2. Mô tả
Rau má là một loài cây một năm thân thảo trong họ Hoa tán (Umbelliferae).
Thân cây rau má gầy và nhẵn, là loại thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh ñỏ, có
rễ ở các mấu. Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài và phần ñỉnh lá tròn,
kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt. Các lá mọc ra từ cuống
dài khoảng 5-20 cm. Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng ñứng. Chúng có màu
trắng kem và ñược che phủ bằng các lông tơ ở rễ.
Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới ñỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gần mặt
ñất. Mỗi hoa ñược bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh. Các hoa lưỡng tính
này khá nhỏ (nhỏ hơn 3 mm), với 5-6 thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị và 2 vòi nhụy.

Quả có hình mắt lưới dày dặc, ñây là ñiểm phân biệt nó với các loài trong chi.
Hydrocotyle có quả với bề mặt trơn, sọc hay giống như mụn cơm. Quả của
nó chín sau 3 tháng và toàn bộ cây, bao gồm cả rễ, ñược thu hái thủ công.
2.1.3.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Có nguồn gốc Australia, các ñảo Thái Bình Dương, New Guinea,
Melanesia, Malesia và châu Á.
Mọc hoang
khắp
nơi ởThơ
Việt Nam
và các
nước
vùngtập
nhiệtvà
ñớinghiên
như Lào, cứu
Trung tâm Học
liệu tại
ĐH
Cần
@ Tài
liệu
học
Campuchia, Indonesia, Ấn ðộ...

Toàn cây khi tươi có vị ñắng, hơi hăng khó chịu; khi khô chỉ còn mùi cỏ
khô. Thu hái quanh năm. Dùng tươi hay sao vàng.
2.1.3.4. Thành phần
Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các các hoạt chất có thể
sai biệt.

Thành phần của rau má bao gồm những chất sau: beta caroten, sterol,
saponin, alkaloid, flavonol, saccharid, Ca, Fe, Mg, Mn, P, K, Zn, các loại vitamins
B1, B2, B3, C và K.
2.1.3.5. Sử dụng
Nó ñược sử dụng như một loại rau cũng như trong y học Ayurveda và y học
cổ truyền Trung Hoa.
Rau má hiện nay còn là một vị thuốc dùng trong phạm vi nhân dân, ñồng
thời còn là loại rau ăn.
Nhân dân ta coi vị rau má là một loại thuốc mát, vị ngọt, hơi ñắng, tính
bình, không ñộc, có tính chất giải nhiệt, giải ñộc, thông tiểu, dùng chữa thổ huyết,
tả lỵ, khí hư, bạch ñới, lợi sữa.
Theo Trung y, rau má có tính hàn (lạnh), tân (cay), khổ (ñắng). Khi ăn ở
dạng tươi như một loại rau, người ta cho rằng nó giúp cho việc duy trì sự trẻ trung.
SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

6


Chương 2: Tổng Quan
Nước sắc từ lá rau má ñược coi là có tác dụng hạ huyết áp. Loại nước sắc này cũng
ñược coi là một loại thuốc bổ dưỡng ñể có sức khỏe tốt (tăng trí nhớ, thị lực). Loại
thuốc ñắp từ lá cũng ñược dùng ñể ñiều trị những chỗ ñau, hạ sốt. Nó còn ñược
dùng trong ñiều trị các chứng phù; viêm thanh quản, tĩnh mạch, phế quản; các
bệnh trĩ, phong, eczema hay vẩy nến; giải ngộ ñộc sắn và lợi tiểu .
Một vài báo cáo khoa học cho thấy khả năng của rau má trong việc hỗ trợ
làm lành vết thương. Khi ñiều trị bằng rau má, sự liền sẹo ñược kích thích bằng
việc sản xuất ra các chất keo loại I. Việc ñiều trị này cũng cho thấy sự giảm sút
ñáng kể của các tác ñộng viêm nhiễm và việc tạo ra các nguyên bào sợi.
Các nhà thảo mộc học còn cho rằng nó có chứa nhân tố trường thọ gọi là
Vitamin X trẻ trung có tác dụng bổ dưỡng cho não và các tuyến nội tiết và xác

nhận rằng nước chiết từ rau má giúp cải thiện các vấn ñề về hệ tuần hoàn và da.
Tại một số nước, người ta còn nghiên cứu rau má ñể tìm tác dụng chữa
bệnh hủi và bệnh lao.
2.2. MỘT SỐ KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY [5]
Có nhiều cách ñể chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Các kỹ thuật
ñều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng
(ngâm dầm, chiết ngấm kiệt, chiết pha rắn....). Trong thực nghiệm, việc chiết rắn –
lỏng ñược áp dụng nhiều hơn.
2.2.1. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration)
Ngâm liệu
bột cây
trong
một bình
tinhhọc
hoặctập
bằng và
thépnghiên
không gỉ, cứu
Trung tâm Học
ĐH
Cần
Thơchứa
@bằng
Tàithủy
liệu
bình có ñậy nắp. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi có thể hòa tan một ít
nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất ñó có chứa trong cây.
Rót dung môi tinh khiết vào bình cho ñến xấp xấp bề mặt lớp bột cây. Giữ
yên ở nhiệt ñộ phòng trong một ñêm hoặc một ngày, ñể cho dung môi xuyên thấm
vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau ñó, dung dịch

chiết ñược lọc qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ ñược cao chiết. Tiếp theo
rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết một số lần nữa
cho ñến khi chiết kiệt mẫu cây.
Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ một giọt
dung dịch chiết lên tấm kiếng sạch, ñể bốc hơi và xem có còn ñể lại vết gì trên mặt
kiếng hay không, nếu không còn vết gì là ñã chiết kiệt.
Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng ñảo trộn, xốc ñều
lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc ñể lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra
làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài).
Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là ñủ, vì với một lượng dung môi cố
ñịnh trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi ñến ñạt mức bão hòa, không
thể hòa tan thêm ñược nhiều hơn; có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết
là chiết nhiều lần, mỗi lần một ít lượng dung môi.
ðây là quá trình chiết gián ñoạn, không ñòi hỏi thiết bị phức tạp, có thể dễ
dàng thao tác với một lượng lớn mẫu.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

7


Chương 2: Tổng Quan
2.2.2. Kỹ thụật chiết ngấm kiệt
Dụng cụ: Gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh hình trụ ñứng dưới ñáy
bình là một van khóa ñể ñiều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa
ñặt bên dưới ñể hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình
lóng ñể chứa dung môi chiết.
Thực hành: Bột cây ñược xay thô, lọt ñược qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không
nên to hơn vì sẽ chiết không kiệt, mẫu ñược xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy
nhựa…sẽ cản trở dòng chảy. ðáy của bình ngấm kiệt ñược lót bằng bông thủy tinh

và một tờ giấy lọc. Bột cây ñược ñặt vào bình bên trên lớp bông thủy tinh, lên gần
ñầy bình. ðậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những
viên bi thủy tinh ñể cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót
dung môi cần thiết vào bình cho ñến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt.
Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội.
ðể yên sau một thời gian, thường là 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho
dung dịch chiết chảy ra từng giọt nhanh và ñồng thời mở khóa bình lóng ñể dung
môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt. ðiều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh
khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình
ngấm kiệt.

Trung

Phương pháp ñược sử dụng phổ biến. So với phương pháp ngâm dầm,
phương pháp này ñòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao
hơn và ít mất công hơn, vì ñây là quá trình chiết liên tục dung môi trong bình
ngấm kiệt
ñã liệu
bão hòa
mẫuCần
chất sẽ
ñược@
liênTài
tục thay
bằngtập
dungvà
môinghiên
tinh khiết
tâm
Học

ĐH
Thơ
liệuthếhọc
nhưng thao tác với một lượng nhỏ mẫu.
2.2.3. Kỹ thuật chiết pha rắn
Nguyên tắc chiết pha rắn là tương tác giữa các chất tan trong một dung dịch
lên trên chất hấp thu (như trong sắc ký cột).
Dụng cụ:
Gồm một cột là phễu lọc xốp bằng thủy tinh, bình tam giác, hệ thống tạo áp
suất bằng vòi nước. Hệ thống chỉ hoạt ñộng với một áp suất vừa phải, khoảng 2070 mmHg, sử dụng áp suất mạnh sẽ làm gãy cột hấp thu.
Thực hành:
Nạp chất hấp thu vào cột: gắn phễu lọc xốp vào bình tam giác và cho hệ
thống tạo áp suất kém hoạt ñộng. Múc từng lượng nhỏ chất hấp thu khô cho vào
phễu, dùng nút thủy tinh có ñáy bằng ñể nén nhẹ và ñều. Vừa nạp chất hấp thu vào
phễu, vừa gõ nhẹ vào thành phễu ñể chất hấp thu tạo thành một khối ñồng nhất,
chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nạp cột chỉ
ñược cao khoảng 5cm. Nếu cần chiết tách một lượng nguyên liệu ñầu nhiều hơn thì
sử dụng phễu có ñường kính lớn hơn.
Sau khi nạp cột xong, ñặt một lớp bông gòn dầy lên trên bề mặt chất hấp
thu ñể tránh cho dung môi sau này làm hư hại bề mặt chất hấp thu.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

8

cứu


Chương 2: Tổng Quan
Rửa và cân bằng cột: sau khi nạp cột, cột này cần ñược rửa với dung môi.

Thao tác bằng cách rót dung môi lên trên ñầu cột rồi hút hoặc nén cho dung môi
chảy ngang qua cột.
Nạp mẫu lên cột: ñặt mẫu lên trên bề mặt cột sao cho tạo thành một lớp
mỏng trên bề mặt cột. Lượng mẫu nạp lên ñầu cột phải ít hơn khả năng của chất
hấp thu.
Giải ly mẫu ra khỏi cột:
Lựa chọn ñộ phân cực của dung môi giải ly hợp chất ra khỏi cột tùy vào
mục ñích cần cô lập hợp chất như thế nào.
Nếu muốn thu ñược tất cả sản phẩm có trong nguyên liệu thành một dung
dịch ñậm ñặc với lượng thể tích nhỏ sử dụng ngay lập tức một loại dung môi
mạnh.
Muốn chia nguyên liệu ban ñầu thành nhiều phân ñoạn có tính phân cực
khác nhau giải ly với dung môi có ñộ phân cực tăng theo kiểu bậc thang
Công dụng:
ðể xác ñịnh mức ñộ phân cực của một hợp chất chưa biết
Làm ñậm ñặc một hợp chất
ðể phân chia cao thô ban ñầu thành các phân ñoạn có tính phân cực
khác nhau

Trung tâm Học
ĐHmộtCần
Thơ
Tàinhiên
liệu
ðể liệu
phân lập
mẫu hợp
chất@
thiên
cầnhọc

khảo tập
sát và nghiên cứu
2.2.4. Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Việc chiết lỏng –lỏng ñược thực hiện bằng bình lóng, trong ñó cao alcol thô
ban ñầu ñược hòa tan vào pha nước. Sử dụng các dung môi hữu cơ loại không hòa
tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp ñược với nước, ñể chiết ra khỏi pha nước
các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào ñộ phân cực của dung môi). Tùy
vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở
dưới so với pha nước.
Việc chiết ñược thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực ñến
dung môi phân cực. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết ñược thực hiện
nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết ñến khi không còn chất
hòa tan vào dung môi (chiết kiệt) thì ñổi sang chiết với dung môi có tính phân cực
hơn. Dung dịch các lần chiết ñược gom chung lại, làm khan nước, ñuổi dung môi
thu ñược cao chiết.
Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng có nhược ñiểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần,
dễ tạo nhũ tương gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp.
2.2.5. Lựa chọn dung môi ñể chiết tách:
Chọn dung môi phải có tính trung tính, không quá dễ cháy, hòa tan ñược
hợp chất cần khảo sát; sau khi chiết tách xong, dung môi ñó có thể ñược loại bỏ dễ

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

9


Chương 2: Tổng Quan
dàng. Cẩn tránh các dung môi ñộc như benzen hoặc dễ cháy do có nhiệt ñộ sôi
thấp như dietyl eter,…
Người ta thường sử dụng các dung môi không hòa tan trong nước như các

hydrocarbon (hexan, toluene), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetate
(etyl, butyl), cloroform, clorur metylen. Các loại dung môi này tương ñối rẻ tiền,
có bán sẵn, ñộ nhớt thấp, tỷ trọng tương ñối khác so với nước.
2.2.6. Làm khô mẫu chất:
Sau khi làm chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi có ñược
cao. Cao chiết này cần ñược sấy khô vì các lý do sau:
Các hợp chất trong cao sẽ ổn ñịnh bền nếu chúng hiện diện ở trạng thái khô
hơn là trạng thái lỏng.
ðể tính ñúng thu suất của cao chiết so với lượng cây khô ban ñầu (ghi trong
báo cáo, ñể khi cần có thể lặp lại thí nghiệm).
ðể tiếp tục tinh chế cao bằng sắc ký cột
Nếu mẫu là hợp chất tinh khiết muốn ño các số liệu phổ thì mẫu cần ñược
sấy khô, nếu còn lẫn vết nước, trên phổ ñồ xuất hiện tín hiệu của nước, gây khó
khăn cho việc giải ñoán cấu trúc.
Các phương pháp làm khô mẫu chất: sấy khô bằng khí trơ trong máy cô
quay chân không, sấy khô bằng bình hút ẩm,…

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC [1, 2,5]
2.3.1. Phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp phân tích, phân li, phân tích các chất dựa vào sự
phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha ñộng và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha ñộng
và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính tự hấp phụ v.v…). Trong các
hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha ñộng mới chuyển ñộng dọc theo hệ sắc kí.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha ñộng và pha tĩnh. Trong quá
trình pha ñộng chuyển ñộng dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này ñến lớp pha
tĩnh khác, sẽ lặp ñi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có
ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển ñộng chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các
chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ ñặc ñiểm này mà người ta có thể tách các

chất qua quá trình sắc kí.
2.3.1.1. Sắc ký cột
Cột dùng ñể sắc ký là ống buret ñường kính khoảng 8-12cm, dài khoảng 2530cm. ðể rửa sạch và sấy khô, kẹp buret ở vị trí thẳng ñứng trên giá sắt. Lót một
lớp bông thủy tinh ở ñáy buret. Chất hấp phụ ñể nhồi vào cột ñược chọn theo
nguyên tắc sau: chọn silicagel hay nhôm oxit hay than hoạt tính… Tỷ lệ khối
lượng giữa hỗn hợp các chất cần sắc ký và khối lượng chất hấp phụ thường 1/100.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

10


Chương 2: Tổng Quan
Sắc ký cột hở ñược tiến hành ở ñiều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường
là những hạt có kích thước 50-150 µ m ñược nạp trong một cột thủy tinh. Mẫu chất
cần phân tách ñược ñặt ở phần trên cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy
tinh che chở ñể lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly ñược ñặt
phía trên cao cột. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần dưới cột, ñược hứng vào
những lọ nhỏ ñặt ngay ống dẫn ra của cột.
Hệ thống này thường làm cho sự tách chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC). Sắc ký cột hở cũng có ưu ñiểm như pha tĩnh và các
dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất.
Có hai phương pháp nhồi chất hấp phụ vào cột:
Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột: gồm chất hấp thu và dung môi vào cột
cùng lúc.
Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dung môi ñược cho vào cột trước, sau
ñó cho chất hấp thu vào.
2.3.1.2. Sắc ký bản mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp
thu trong ñó pha ñộng là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển

ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ ví dụ như silicagel hoặc oxit
alumin... Pha tĩnh này tráng thành một lớp mỏng, ñều phủ lên một nền phẳng như
tấm kiếng, tấm nhôm, tấm plastic. Do chất hấp thu ñược tráng thành một lớp mỏng
nên phương pháp này ñược gọi là sắc ký lớp mỏng.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng
Chuẩn bị vi quản: vi quản là một ống thủy tinh có ñường kính trong của ống
phải nhỏ, 1-2mm, một ñầu ñược vót nhọt. Một ống vi quản có thể sử dụng ñể chấm
nhiều loại mẫu dung dịch khác nhau, chỉ cần sau mỗi lần sử dụng, rửa sạch vi quản
bằng dung môi hữu cơ, thí dụ như aceton.
Chuẩn bị tấm bản mỏng: với các bản ñể theo dõi sắc ký cột có chiều dài
5cm. Với bản dùng ñể ño Rf, ñể sau này công bố kết quả, nên có chiều dài 10cm.
Từ tấm bản mỏng thương mại 20x20cm, dùng kéo cắt bản với kích thước
cần thiết.
Chuẩn bị dung dịch: hòa tan hỗn hợp các chất trong dung môi thích hợp ñể
ñược dung dịch có nồng ñộ khoảng 2-5%
ðưa mẫu chất lên bản sắc ký: Dùng ống mao quản nhỏ ñể lấy dung dịch các
chất nhỏ lên tuyến xuất phát (cách mép dưới 1 cm) sao cho các vệt cách nhau
khoảng 1cm và cách mép bên khoảng 1,5cm. Trên mức tiền tuyến dung môi (cách
bờ cạnh trên 0,5-1 cm) dùng một ñầu viết chì vót nhọn vạch một ñường hằn xuống
lớp hấp thu. Làm như thế khi dung môi giải ly ñi lên ñến ñầu trên sẽ buộc ngừng
lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống nhau. ðiều chỉnh lượng dung dịch nhỏ
xuống sao cho vệt xuất phát có kích thước nhỏ (ñường kính vệt khoảng 2-5mm).
ðể ngoài không khí cho dung môi bay hết.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

11

Chương 2: Tổng Quan
Chạy sắc ký: quá trình chạy sắc ký ñược tiến hành trong bình ñậy kín chứa
dung môi làm pha ñộng. Bình ñược bão hòa bởi dung môi bằng cách dựng mấy
băng giấy lọc (tẩm dung môi) xung quanh thành bình rồi ñể yên khoảng 30 phút.
0
Sau ñó, ñặt bản sắc ký vào bình ở ñộ nghiêng khoảng 20-30 sao cho dung môi
tiếp xúc với bản mỏng ở dưới tuyến xuất phát rồi ñậy bình.
Hiện hình vết: khi dung môi dâng lên cách mép trên thì nhẹ nhàng nhấc bản
sắc ký ra khỏi bình. Cho bay hơi hết dung môi trong không khí.
Khi sắc ký những chất không có màu, ta cần chọn những phương pháp thích
hợp ñể nhận ra vệt chất. Trong nhiều trường hợp có thể hiện hình nhờ iot bằng
cách ñặt bản sắc ký trong bình kín chứa hơi iot. Lớp chất hấp phụ trên bản sắc ký
sẽ nhuốm màu Iot, vùng vệt chất khảo sát không có màu. Có thể xử lý bằng hơi
Brom hoặc phun những tác nhân thích hợp (axit Sunfuric ñậm ñặc, dung dịch
KMnO 4 ,…) hoặc quan sát bản sắc ký trong ánh sáng tử ngoại.
Tiến hành sắc ký nhanh, sử dụng ít chất, có khả năng làm hiện màu cho các
chất khảo sát.

2.4. ðỊNH TÍNH CÁC CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY [3]
2.4.1. Alcaloid
ðại cương
Trung tâm Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Alcaloid là nhóm hợp chất tự nhiên hiện diện khá nhiều trong các họ thực
vật với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất ña dạng.
Các ñặc tính hóa lý của alcaloid
ða số alcaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn với ñiểm nóng chảy xác
ñịnh hoặc có khoảng nhiệt ñộ phân hủy. Một vài alcaloid ở dạng nhựa vô ñịnh
hình, một vài alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, conilin) và một vài alcaloid có màu

(berberin màu vàng, betanidin màu ñỏ).
Alcaloid là những hợp chất base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Các
alcaloid ở dạng base tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt
trong dung môi hữu cơ như cloroform, dietyl eter, alcol bậc thấp. Các muối của
alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ
như cloroform, dietyl eter, benzen.
Các thuốc thử ñể ñịnh tính alcaloid
Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Bertrand…
a)Thuốc thử Mayer
HgCl 2

6.8g

Nước cất

500ml

KI

2.5g

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

12


Chương 2: Tổng Quan
b)Thuốc thử Dragendorff
Dung dịch A:
Bi(NO 3 ) 3

850mg

CHCOOH

10ml

Nước cất

40ml

Dung dịch B:
KI

8g

Nước cất

20ml

Khi sử dụng lấy 20 ml dung dịch hỗn hợp 2 dung dịch (A+B), thêm vào
CHCOOH (20ml) và nước cất (100 ml).

d)Thuốc thử Bertrand
Axit Silicotungstic 5g
Nước cất

100 ml

2.4.2. Flavonoid

ðại cương

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất
nhiều rau, quả, hoa,… Phần lớn các flavonoid có màu vàng. Tuy vậy, một số sắc tố
có màu xanh, tím, ñỏ, không màu cũng ñược xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học.
Các flavonoid thường dễ kết tinh.
Flavonoid nào mang nhiều nhóm metoxy -OCH 3 và ít nhóm hydroxyl –
OH, có tính phân cực yếu, tan tốt trong dung môi ít phân cực như: bezen,
cloroform, etyl acetat ñôi khi tan một phần trong hexan. Flavonoid mang nhiều
nhóm hydroxyl, có tính phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt trong dung môi có tính phân
cực như aceton, etanol, metanol, butanol, nước,…
Các thuốc thử ñể ñịnh tính sự hiện diện của flavonoid
Thuốc thử Shibata: HCl ñậm ñặc, bột Mg kim loại, alcol isoamil
2.4.3. Steroid
Hầu hết các steroid là hydrocarbon có mang một số nhóm chức như
hydroxyl (-OH), acetyl (-OAc), eter (-O-), carbonyl (C=O ester hoặc acid
carboxylic), nối ñôi (-C=C-)… nên nói chung là những hơp chất có tính ít phân
cực, có tính thân dầu nên tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter dietyl,
cloroform,… ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với các phân tử ñường
ñể tạo thành glycosid.
Thuốc thử ñịnh tính steroid
Phản ứng Liebermann – Burchard
SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

13


Chương 2: Tổng Quan
Anhidrid acetic 20ml

H 2 SO 4 ñậm ñặc(1 ml)
Phản ứng Salkowski: H 2 SO 4 ñậm ñặc

2.4.4. Saponin
ðại cương về saponin:
Là một glicosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất ñặc
trưng: khi hòa vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và
tạo nhiều bọt; saponin thường ở dạng vô ñịnh hình có vị ñắng.
ðể phát hiện sự hiện diện của saponin trong cao chiết cần phải thử tính tạo
bọt.
Thử ñịnh
Cân bột
(1g)
cho học
vào erlen
chứa sẵn cứu
Trung tâm Học
liệutính
ĐHsaponin:
Cần Thơ
@mẫu
Tài
liệu
tập500ml
và nghiên
100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ khoảng 30 phút. Lọc ñể nguội và thêm nước cất
ñến100 ml (nước sắc)
2.4.5. Tanin
Tanin là nhóm hợp chất polyphenol phân bố rộng rãi trong họ thực vật.
Người ta gặp tanin hằng ngày trong cuộc sống (trà, rượu vang ñỏ, nhiều loại trái

cây nhất là trong vỏ trái măng cụt,…). Các nhóm tanin có trọng lượng phân tử
khoảng 500-3000.
Các tanin do mang nhiều nhóm –OH nên ít nhiều (tùy theo trọng lượng
phân tử của chúng) hòa tan trong nước tạo nên dung dịch nhớt.
Trong kỹ nghệ làm giày da, người ta sử dụng tanin làm thuộc da vì tanin có
tính chất làm ñông tụ các protein của lớp da trong: tanin tạo các nối hydrogen liên
kết phân tử giữa các nhóm –OH và -NH 2 của protein với các nhóm –OH phenol
của tanin.
ðịnh tính tanin bằng thuốc thử sau ñây:
Thuốc thử Stiasny:
Formol 36%

20ml

HCl ñậm ñặc

10ml

Dung dịch gelatin mặn:

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

14


Chương 2: Tổng Quan
Gelatin

20gram

Dung dịch NaCl bão hòa

100ml

Dung dịch axetat chì bão hòa:
Pb(CH 3 COO) 2
Dung dịch FeCl 3 1% trong nước.

2.4.6. Glicosid
ðại cương về glicosid
Các glicosid hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận
cây: lá, vỏ, hạt,… Các glicosid thường là chất kết tinh và có vị ñắng.
Glicosid là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có 2 phần: phần ñường và
phần không ñường thường ñược gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzym thực vật
hoặc acid hoặc kiềm, glicosid bị thủy phân thành aglycon và phần ñường.

Trung

Cấu trúc hóa học của glicosid rất ña dạng nên tính phân cực của mỗi phân
tử thayHọc
ñổi tùyliệu
theo ĐH
cấu trúc
của Thơ
aglycon@
và Tài
số phân
tử ñường
tâm
Cần

liệu
học gắn
tậpvào
vàaglycon.
nghiên
Glicosid có tính phân cực khá mạnh, nên không tan trong eter dầu hỏa,
hexan, benzen, nhưng tan trong cloroform, dietyl eter, tan tốt trong alcol, nước.
Thuốc thử dùng ñịnh tính glicosid
Thuốc thử Molish
Dung dịch thymol 2% 1-2 giọt
H 2 SO 4 ñậm ñặc 1ml

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

15

cứu


Chương 3: Thực Nghiệm

CHƯƠNG 3
THỰC NGHIỆM
3.1. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.1. PHƯƠNG TIỆN
Dụng cụ
Máy soxhlet, máy cô quay, cột sắc ký.
Tủ sấy, máy xay bột cây, bình thủy tinh, chay ñựng dung dịch, chay bi, các dụng
cụ khác …
Hóa chất

Dung môi metanol (MeOH), eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol ñể tạo ra
các cao tương ứng và dùng trong quá trình sắc ký cột, dùng cho giải ly bản mỏng, dùng
trong quá trình chiết pha rắn và chiết lỏng-lỏng.
Silica gel 60 (0,04-0,63 mm) dùng trong sắc ký cột.
Silica gel 60 GF 254 dùng trong chiết pha rắn ñể tạo ra các phân ñoạn cao từ phân
ñoạn cao tổng metanol.
Dung môi dùng cho quá trình ñịnh tính các hợp chất hữu cơ có trong cây:
CH 3 OH , Pb(CH 3 COO) 2 , HCl, H 2 SO 4 …

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Xử lý nguyên liệu cây rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris”:
Thu hái và làm sạch, làm khô, xay nhuyễn.
Phương pháp tách chiết:
Dùng phương pháp ngâm dầm tạo cao thô ban ñầu từ bột cây và chiết pha rắn ñể
phân chia cao thô trên thành những phân ñoạn cao có tính phân cực khác nhau.
Chiết lỏng-lỏng cao MeOH tổng thu ñược các cao dùng trong quá trình ñịnh tính.
ðịnh tính các nhóm chất hữu cơ trong cây:
Từ các loại cao thực hiện các phản ứng ñịnh tính.
Phân lập các cấu tử hữu cơ từ cao chiết:
Sắc ký lớp mỏng các cao chiết trên.
Từ cao etyl acetat tiến hành sắc ký cột trên silica gel ñồng thời sắc ký lớp mỏng
các cao chiết thu ñược.
3.2. THỰC NGHIỆM
3.2.1. Xử lý nguyên liệu cây rau má lá sen “Hydrocotyte vulgaris”
Cây rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” sau khi thu hái vào thời gian 10-11 giờ
sáng hoặc 2-4 giờ chiều tại 6/8C Mậu Thân, TPCT. ðem rửa sạch, bỏ lá úa, lá sâu, phơi

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

16


Chương 3: Thực Nghiệm
gió cho ñến héo, sau ñó sấy ở nhiệt ñộ 45-50 0 C trong tủ sấy. Sau ñó ñược xay nhuyễn tạo
nguyên liệu ban ñầu (bột cây) dùng ngâm dầm với MeOH.

Hình 5: Rau má lá sen “Hydrocotyle vulgaris” ñã phơi gió và xay nhuyễn
3.2.2. Phương pháp tách chiết
Phương pháp ngâm dầm:
Lượng bột cây sau khi xử lý nguyên liệu ñem ngâm dầm (1,5 kg) với lượng
MeOH vừa ñủ trong 12 giờ mỗi ngày, dịch chiết ñược lọc qua giấy lọc ñem thu hồi dung
môi thu ñược cao chiết MeOH tổng có màu xanh ñen. Qúa trình cứ lặp ñi lặp lại ñến khi
chiết kiệt mẫu cây.
Thời gian ñể thực hiện: 15 ngày ñêm

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 6: Ngâm dầm bột cây với metanol

Hình 7: Cao MeOH tổng

Phương pháp chiết pha rắn:
Từ cao MeOH tổng thu ñược trên ñem chiết pha rắn với dung môi có ñộ phân cực
tăng dần lần lượt eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol, sau khi ñuổi dung môi thu
ñược những cao chiết tương ứng ñều có màu xanh ñen.
Thời gian ñể thực hiện:
Cao

eter dầu hỏa

cloroform

etyl acetat

metanol

Thời gian(giờ)

72

60

48

60

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

17


Chương 3: Thực Nghiệm

Hình 8: Máy sohxlet dùng chiết pha rắn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

18


Rửa sạch,phơi gió
sấy 45-50 0 C,xay nhuyễn

Chương 3: Thực Nghiệm Bột cây
Ngâm dầm với metanol
Cô quay thu hồi dung môi
Cao metanol tổng
Chiết pha rắn với eter dầu hỏa
Cô quay thu hồi dung môi

Cao eter dầu hỏa

Bã còn lại
Chiết pha rắn với cloroform
Cô quay thu hồi dung môi

Cao cloroform

Bã còn lại

Chiết pha rắn với etyl acetat
Cô quay thu hồi dung môi
Cao etyl acetat

Bã còn lại

Sơ ñồ 1: Qui trình ñiều chế các loại mẫu cao
rắnnghiên
với metanolcứu
Trung tâm Học liệu ĐH
Cần Thơ @ Tài liệu họcChiết
tậpphavà
Cô quay thu hồi dung môi

Cao metanol

Bã

Chiết lỏng-lỏng cao MeOH tổng:
Cao MeOH tổng ñem pha với nước và tiến hành chiết lỏng-lỏng với các dung môi
eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, butanol thu dược các cao tương ứng dùng trong quá
trình ñịnh tính.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

19


Chương 3: Thực Nghiệm

Hình 9: Bình lóng dùng chiết lỏng-lỏng
Thời gian ñể thực hiện:
Cao

eter dầu hỏa

cloroform

etyl acetat

butanol

Thời gian(giờ)

12

48

12

12

3.2.3. ðịnh tính các nhóm chất hữu cơ trong cây
ðịnh tính alcaloid: Có ba thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff,

Trung tâm
Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Bertrand…
Thực nghiệm
Lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm 2 ml mẫu thử, 1 ống nghiệm làm ñối
chứng và lần lượt cho từng giọt các thuốc thử trên vào các ống nghiệm thứ 2.
• Thuốc thử Mayer cho kết tủa màu vàng nâu với dịch chứa alcaloid
• Thuốc thử Dragendorff
Khi sử dụng lấy 20 ml dung dịch hỗn hợp 2 dung dịch (A+B), thêm vào
CHCOOH (20ml) và nước cất (100 ml). Cho trầm hiện màu vàng cam với dung dịch
chứa alcaloid.

• Thuốc thử Bertrand
Cho kết tủa màu trắng ñục với dịch chứa alcaloid.
ðịnh tính sự hiện diện của flavonoid: Thuốc thử Shibata
Cách thử: Cho mẫu thử (2ml) vào 2 ống nghiệm, ống thứ nhất làm ñối chứng.
Trong ống thứ nhì, thêm HCl ñậm ñặc (5ml), bột Mg, thêm alcol isoamil dọc theo thành
ống nghiệm, ñun nhẹ. Nếu có một vòng màu hồng từ từ xuất hiện rồi chuyển sang màu ñỏ
tím thì phản ứng dương tính.
ðịnh tính steroid
Phản ứng Liebermann – Burchard: Phản ứng dương tính là dung dịch ñổi thành
màu xanh nhạt, lục, hồng hoặc ñỏ.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

20


Chương 3: Thực Nghiệm
Phản ứng Salkowski: Hòa tan mẫu thử (1ml) và nhỏ thêm vào H 2 SO 4 ñậm ñặc
(1ml). Phản ứng dương tính là dung dịch tách thành 2 lớp, lớp H 2 SO 4 có màu xanh và
lớp cloroform có màu ñỏ với thuốc thử Salkowski.
ðịnh tính saponin
Cách thử: Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, ñường kính 16 mm. Cho vào
các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,…10 ml nước sắc (cao chiết lỏng). Thêm nước cất vào
mỗi ống cho ñủ 10 ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15
giây. Mỗi giây lắc 2 lần. ðể yên trong 15 phút. ðo chiều cao các cột bọt. Nếu cột bọt
trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, nghĩa là không có saponin.
ðịnh tính tanin :
Thuốc thử stiasny:
Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu ñỏ.
Dung dịch gelatin mặn:

Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện vô ñịnh hình màu vàng, ñể
lâu hóa nâu.
Dung dịch acetat chì bão hòa:
Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu vàng
Dung dịch FeCl 3 1% trong nước:
Dung dịch chuyển sang màu xanh lơ khi có sự hiện diện của tanin

Trung tâm Học
liệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
ðịnh tính
glicosid
Cách thử: Lấy 2 ống nghiệm cho vào ống thứ nhất 2 ml mẫu thử (làm ñối chứng).
Cho 2ml dung dịch mẫu thử vào ống nghiệm thứ nhì, cho từng giọt thuốc thử Molish vào.
Nếu thấy xuất hiện màu ñỏ là phản ứng dương tính
3.2.4. Phân lập các cấu tử hữu cơ từ cao chiết
Sắc ký bản mỏng các cao: Các cao thu ñược ñem sắc ký bản mỏng với hệ giải ly
và nhúng vào thuốc thử thích hợp ñể hiện hình vết.
Qúa trình sắc ký cột:
Sắc ký cột phân ñoạn I cao etyl acetat (1,2 g) ñể phân lập chất tinh khiết. Dùng
dung môi cloroform là dung môi giải ly ñầu tiên. Dung dịch giải ly hứng trong lọ thủy
tinh với thể tích như nhau 100ml mỗi lọ. Sau ñó ñem cô quay chân không ( thu hồi dung
môi) tạo dung dịch ñậm ñặc hơn và ñược sắc ký lớp mỏng trên cùng bản mỏng. Nếu các
lọ cho kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau thì gom lại chung một phân ñoạn, ñuổi dung
môi ở áp suất khí quyển và tính thu suất của nó.

SVTH: Nguyễn Thị Kim Phụng

21