Phân tích hàm lượng vitamin a trong một số loại trứng gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (tt)

M,

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------

NGUYỄN THANH BÍCH CHÂU

PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG
MỘT SỐ LOẠI TRỨNG GIA CẦM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
CHUYÊN NGÀNH : HÓA PHÂN TÍCH
Demo VersionMÃ
- Select.Pdf
SDK
SỐ : 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGÔ VĂN TỨ

Thừa Thiên Huế, năm 2016

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi,
các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực,
đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa từng đƣợc công bố

trong bất kỳ một công trình nào khác.

Tác giả

Nguyễn Thanh Bích Châu

Demo Version - Select.Pdf SDK

ii


Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS. Ngô Văn Tứ đã
giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn, đồng thời đã bổ sung cho tôi nhiều kiến thức
chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy giáo, Cô giáo trƣờng
Đại học Sƣ phạm, trƣờng Đại học Khoa học và phòng Đào tạo Sau
đại học đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong
suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các anh, chị và cán
bộ tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa
Select.Pdf
SDK
Thiên Demo
Huế đã Version
nhiệt tình- giúp
đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi để
tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã
động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản
luận văn này.
Chân thành cảm ơn!
Tác giả
Nguyễn Thanh Bích Châu

iiiiii


MỤC LỤC

PHỤ BÌA ...................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.....................................................................................8
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT .............................................................11
1.1. Tổng quan về trứng gia cầm...............................................................................11
1.1.1. Hình thái và cấu tạo.........................................................................................11
1.1.2. Thành phần dinh dƣỡng của trứng gia cầm.....................................................11
1.1.3. Bảo quản trứng ................................................................................................12
1.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trứng gia cầm .................................................13

Demo Version - Select.Pdf SDK

1.2. Tổng quan về vitamin.........................................................................................15

1.2.1. Khái niệm ........................................................................................................15
1.2.2. Phân loại ..........................................................................................................15
1.2.3. Vai trò..............................................................................................................15
1.3. Vitamin A ...........................................................................................................16
1.3.1. Lịch sử tìm ra vitamin A .................................................................................16
1.3.2. Tính chất..........................................................................................................17
1.3.3. Chức năng của vitamin A ................................................................................21
1.3.4. Ảnh hƣởng của vitamin đến sức khỏe con ngƣời ...........................................22
1.3.6. Nguồn cung cấp vitamin A ............................................................................24
1.4. Các phƣơng pháp xác định vitamin A ................................................................25
1.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis .......................................25
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .........................................................27
1.5. Giới thiệu về phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) .........................30

1


1.5.1. Vài nét về lịch sử phát triển của phƣơng pháp ................................................30
1.5.2. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC...............................................................31
1.5.3. Phân loại và ứng dụng .....................................................................................32
1.5.4. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC ....................................................................32
1.5.5. Detector trong HPLC ......................................................................................33
1.5.6. Phƣơng pháp định lƣợng trong HPLC ............................................................34
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................37
2.1. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................37
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................37
2.2.1. Lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu ...............................................................37
2.2.2. Chọn kỹ thuật xử lý mẫu .................................................................................38
2.2.3. Khảo sát các điều kiện phân tích HPLC .........................................................38
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích .............................................39

2.2.5. Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia
cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế .............................................................................43
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm..........................................................45

Version
- Select.Pdf SDK
2.3. Kỹ thuậtDemo
thực nghiệm
.........................................................................................
45
2.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................45
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ ..........................................................................................45
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................47
3.1. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC ...................................................................47
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC .....................................................................47
3.1.2. Ảnh hƣởng của thành phần pha động .............................................................48
3.1.3. Ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động ............................................................49
3.2. Kỹ thuật xử lý mẫu .............................................................................................52
3.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp HPLC xác định vitamin A .....................54
3.3.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC với detector RF ............................................54
3.3.2. Tính đặc hiệu của phƣơng pháp ......................................................................55
3.3.3. Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng ............................................56
3.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .....................................................57

2


3.3.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp ............................................................................58
3.3.6. Độ đúng của phƣơng pháp ..............................................................................59
3.4. Xây dựng quy trình phân tích.............................................................................61

3.5. Áp dụng quy trình phân tích để định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng
gia cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế .......................................................................62
3.5.1. Định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia cầm trên địa bàn Thừa
Thiên Huế ..................................................................................................................62
3.5.2. So sánh, đánh giá hàm lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia cầm trên
địa bàn Thừa Thiên Huế ............................................................................................65
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ......................................................................................69
1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................69
2. KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................70
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................71
PHỤ LỤC ................................................................................................................ P1

Demo Version - Select.Pdf SDK

3


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Stt Ký hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

Association of Official Analytical

Hiệp hội các nhà hóa phân

Chemists

tích

BHT

Butylated hydroxytoluene

Butyl hyđroxytoluen

3

DIPE

Diisopropyl ether

Điisopropyl ete

4

ĐKSK

Chromatography condition

Điều kiện sắc ký

5

Et2O

Diethyl ether

Đietyl ete

6

EtOAC

Ethyl acetate

Etyl axetat

7

Hex

Hexane

Hexan

8

HPLC

9

IPA

10

ISO

11

IU

12

IUPAC

13

1

AOAC

2

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Isopropyl alcohol

Isopropanol

International organization for

Tổ chức tiêu chuẩn hóa

standardization

Demo
Version - Select.Pdf SDK quốc tế
International unit

Đơn vị IU

International Union of Pure and

Hiệp hội Hóa học lý thuyết

Applied Chemistry

và ứng dụng Quốc tế

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

14

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

15

MeCN

Acetonitrile

Axetonitril

16

MeOH

Methanol

Metanol

17

NAD

Nicotinamide adenine dinucleotide

Coenzym NAD

18

NADH2

19

PDA

Nicotinamide adenine dinucleotide
plus hydrogen
Photodiode array detector

4

Coenzym NADH2
Detector mảng diot phát
quang


20

ppb

Part per billion

Phần tỉ

21

ppm

Part per million

Phần triệu

22

QCVN

23

RAE

Retinol activity equivalents

Đƣơng lƣợng retinol

24

Rev

Recovery

Độ thu hồi

25

RF

Fluorescence detector

Detector huỳnh quang

26

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

27

TCVN

Viet Nam Standard

Tiêu chuẩn Việt Nam

28

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahyđrofuran

National technical regulation

Demo Version - Select.Pdf SDK

5

Quy chuẩn kỹ thuật Quốc
gia


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tiêu đề

Stt Bảng

Trang

1

1.1

Thành phần dinh dƣỡng của trứng gà

12

2

1.2

Tính chất quang phổ của vitamin A

20

3

1.3

Thất thoát vitamin A trong quá trình chế biến, đóng gói

20

4

1.4

Lƣợng vitamin A cần cung cấp trong 1 ngày

24

5

1.5

Vitamin A trong thực phẩm

24

6

2.1

Thông tin về các mẫu trứng gia cầm

38

7

2.2

Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố

43

8

2.3

Bảng phân tích phƣơng sai theo ANOVA một yếu tố

44

9

3.1

Cách pha dãy dung dịch chuẩn

48

10

3.2

Kết quả hệ số đối xứng của các tỷ lệ hệ dung môi pha động

49

11

3.3 Demo
Các thông

số cơ bản
ở tốc độ dòng
khác nhau
Version
- Select.Pdf
SDK

12

3.4

13

3.5

Sự tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích

56

14

3.6

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

57

15

3.7

Kết quả diện tích peak khảo sát độ lặp lại

58

16

3.8

Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích

59

17

3.9

Kết quả thời gian lƣu và diện tích peak khảo sát độ đúng

60

18

3.10

Kết quả khảo sát độ đúng theo phƣơng pháp thêm chuẩn

60

19

3.11

20

3.12

Kết quả đánh giá độ ổn định của hệ thống HPLC xác định
vitamin A

Kết quả phân tích hàm lƣợng vitamin A trong một số mẫu
trứng gia cầm bằng phƣơng pháp HPLC
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (loại trứng)

6

52
54

62
65


21

3.13

22

3.14

23

3.15

24

3.16

Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (địa bàn lấy mẫu) đối
với các loại trứng gia cầm nuôi theo hộ gia đình
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (địa bàn lấy mẫu) đối
với các loại trứng gia cầm nuôi theo mô hình công nghiệp
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (mô hình nuôi) đối với
các loại trứng gia cầm ở Quảng Điền
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (mô hình nuôi) đối với
các loại trứng gia cầm ở Hƣơng Thủy

Demo Version - Select.Pdf SDK

7

66

66

67

68

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Stt

Hình

Tiêu đề

1

1.1

Cấu tạo mặt cắt dọc của quả trứng

11

2

1.2

Sản lƣợng trứng gia cầm ở Việt Nam từ 2000 – 2014

14

3

1.3

4

1.4

Quá trình tạo retinol từ β – caroten

18

5

1.5

Cấu tạo của một số vitamin A

19

6

1.6

Sơ đồ tổng hợp và chuyển hóa vitamin A

21

7

1.7

Mắt mắc bệnh đốm biot

22

8

1.8

Hệ thống HPLC

33

9

1.9

Detector huỳnh quang với hai bộ đơn sắc cách tử

34

10

3.1

Sắc đồ khảo sát thành phần pha động

49

Phân bố sản lƣợng trứng gia cầm ở Thừa Thiên Huế
năm 2015

Demo
- Select.Pdf
SDK 2O = 90:10 (v/v)

SắcVersion
đồ của hệ
pha động MeOH:H

Trang

14

11

3.2

12

3.3

Sơ đồ quy trình xử lý mẫu trứng gia cầm

53

13

3.4

Sắc kí đồ mẫu trắng (a) và mẫu trắng thêm chuẩn (b)

55

14

3.5

15

3.6

16

3.7

Sắc ký đồ mẫu trứng gà G1

64

17

3.8

Sắc ký đồ mẫu trứng vịt V1

64

18

3.9

Sắc ký đồ mẫu trứng cút C2

64

19

3.10

Hàm lƣợng vitamin A trong các mẫu thực tế

65

với các tốc độ dòng

Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và
nồng độ vitamin A
Quy trình phân tích vitamin A trong trứng gia cầm
bằng HPLC

8

51

56

61


MỞ ĐẦU
Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần đƣợc
cung cấp đủ các chất dinh dƣỡng, ngoài các thành phần chính nhƣ đạm, béo, đƣờng
còn có những thành phần thiết yếu khác đảm bảo sức khỏe cho con ngƣời, một
trong những thành phần đó chính là “vitamin”. Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có
phân tử lƣợng lớn và các tính chất vật lý, hoá học rất khác nhau. Tác dụng của

chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khác nhau nhƣng đều cần thiết cho sự sống
của sinh vật, nhất là đối với ngƣời và động vật. So với nhu cầu về các chất dinh
dƣỡng cơ bản nhƣ protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp. Trong cơ thể
vitamin đóng vai trò tạo ra các coenzym cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá
khác nhau. Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều
có sự tham gia trực tiếp của vitamin [8], [23].
Có khoảng 40 loại vitamin và khoáng chất cần thiết cho con ngƣời. Trong
đó, vitamin A là một trong những chất có hàm lƣợng đáng kể nên đã và đang đƣợc
nghiên cứu để phát huy tác dụng của nó đối với con ngƣời. Vitamin A không tồn tại
dƣới dạng một
hợp Version
chất duy -nhất,
mà dƣới SDK
một vài dạng. Trong thực phẩm có
Demo
Select.Pdf
nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin A là retinol, chủ yếu có trong: gan, cá
biển, bơ, sữa, trứng,... Vitamin A tồn tại trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật
dƣới dạng caroten (tiền vitamin A) nhƣ rau muống, rau ngót,… các loại củ, quả có
màu đỏ, vàng nhƣ: cà chua, bí đỏ, cà rốt, đu đủ,.... hay các loại ngũ cốc nhƣ ngô,
gạo, đậu,… [15], [8].
Vitamin A rất cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển xƣơng ở trẻ em, cho
sự nhìn thấy, sự nguyên vẹn bề mặt biểu mô và niêm mạc, ngoài ra, còn có tác dụng
chống ung thƣ, chống lão hóa do kìm hãm và ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự
do. Biểu hiện của bệnh thiếu vitamin A là quáng gà, khô mắt, nhuyễn giác mạc và
có thể gây mù, đặc biệt ở trẻ em. Bệnh thiếu vitamin A rất dễ xảy ra ở trẻ em trƣớc
tuổi đi học, chủ yếu là ở các nƣớc chậm phát triển: nó luôn kèm theo việc thiếu dinh
dƣỡng nói chung vì chất béo rất cần thiết cho sự hấp thụ caroten, protein kích thích
việc hấp thụ vitamin A [42]. Hằng năm, trên thế giới có tới 250000 trẻ bị mù do
thiếu vitamin A [8].

9


Vitamin A hòa tan trong chất béo nên việc thải lƣợng dƣ thừa từ ăn uống là
khó khăn hơn so với các vitamin tan trong nƣớc. Vì vậy quá liều có thể dẫn đến ngộ
độc vitamin A. Nó có thể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa,
nhìn mờ, đau đầu, tổn thƣơng cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình [55].
Để phân tích và đánh giá hàm lƣợng vitamin A trong một số loại thực phẩm
ngƣời ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp trắc quang, sắc
ký, hóa học,… Nhƣng do vitamin A tồn tại ở trạng thái tan trong dầu, khó phân tích
nên cần phải lựa chọn phƣơng pháp mang lại hiệu quả cao nhất. Vì vậy trong những
năm gần đây, phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã đƣợc sử dụng
nhiều để đo các chất chuyển hóa quan trọng trong thực phẩm nói chung và vitamin
A nói riêng. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao khi phân tích các hợp chất dễ bị oxi
hóa, dễ bị phân hủy nhiệt, khá hiện đại, phù hợp với điều kiện ở phòng thí nghiệm
của các trung tâm.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vitamin A bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt đƣợc kết quả phân tích tốt và đƣợc áp dụng trên
nhiều đối tƣợng nhƣ: thực phẩm [33], [37], [39], sữa tƣơi [41], sữa lỏng [32], huyết

DemoỞVersion
Select.Pdf
thanh [27], [52],...
Việt Nam- thì
việc nghiênSDK
cứu xác định hàm lƣợng vitamin A
còn hạn chế, chƣa đƣợc quan tâm rộng rãi và chủ yếu mới áp dụng trên đối tƣợng
sữa [2], [4], [8].
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân tích hàm
lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao’’ với mục đích của đề tài nhằm giải quyết 2 vấn đề cơ bản sau:
-

Xây dựng quy trình phân tích hàm lƣợng vitamin A bằng phƣơng pháp

HPLC với detector huỳnh quang.
-

Cung cấp thông tin cơ bản về hàm lƣợng vitamin A trong một số loại

trứng gia cầm trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế.

10