XÁC ĐỊNH đặc điểm SINH HOÁ và KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC của mầm BỆNH VI KHUẨN PHÂN lập TRÊN tôm sú (penaeus monodon) BỆNH PHÂN TRẮNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THUỶ SẢN

NGUYỄN THỊ TIÊN

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG
THUỐC CỦA MẦM BỆNH VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon) BỆNH PHÂN TRẮNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Năm 2007


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THUỶ SẢN

NGUYỄN THỊ TIÊN

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG
THUỐC CỦA MẦM BỆNH VI KHUẨN PHÂN LẬP TRÊN
TÔM SÚ (Penaeus monodon) BỆNH PHÂN TRẮNG

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

Năm 2007


LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Đặng Thị Hoàng Oanh và cô Nguyễn Thị Như Ngọc
đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu cũng như
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin rất cảm ơn các Thầy Cô và anh chị trong Bộ môn sinh học và Bệnh thuỷ
sản đã truyền đạt, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn
này.
Xin cảm ơn sự động viên và giúp đỡ của các bạn lớp bệnh học thuỷ sản khoá 29.

i


TÓM TẮT

Dựa vào kết quả mô học xác định mẫu tôm (Penaeus monodon) bênh phân trắng
nhiễm vi khuẩn, tiến hành định danh các dòng vi khuẩn này. Vi khuẩn được định
danh qua các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá đặc trưng riêng của từng
giống loài theo The Aquatic Animal Health Rearch Institure. Bangkok, Thailand
(2003) và Buller (2004). Riêng về vi khuẩn Vibrio được xác định 39 đặc điểm về
hình thái, sinh lý và sinh hoá qua chương trình phân tích cụm (Priest và Austin,
1993) của muời một chủng vi khuẩn Vibrio được phân lập, hai mươi bảy chủng
tham khảo và các chủng chuẩn được mã hoá sử dụng phần mềm Statistica để xác
định tỉ lệ không đồng dạng của các chủng vi khuẩn thể hiện qua sơ đồ gia phả. Kết
quả vi khuẩn định danh gồm Pseudomonas, Plesimonas shigelloides, Acinetobacter

calcoaceticus, năm loài vi khuẩn Vibrio như V. carchariae, V. mimicus, V. ordalii,
V. anguillarum, V. navarrensis và Vibrio sp. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của
mười chín chủng vi khuẩn với 6 loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thuỷ
sản. nhìn chung có 36,8% vi khuẩn kháng với ampicilin, 31,6% kháng
streptomycin, 10,05% kháng với tetracycline, 15,8% kháng với nitrofurantin,
chloramphenicol và norfloxacin có tỉ lệ kháng bằng nhau là 5,26%. Riêng về nhóm
vi khuẩn Vibrio có tỉ lệ kháng ampicilin cao nhất 26,3%, kháng streptomycin là
21,05% và tetracycline 5,26%. Đối với chloramphenicol, nitrofurantion và
norfloxacin rất nhạy với vi khuẩn Vibrio.
Trong khi đó đa số các chủng vi khuẩn kháng với hai loại kháng sinh chiếm 36,8%,
kháng với 1 loại kháng sinh chiếm 15,8%, đồng thời 5,25% các chủng vi khuẩn
kháng với 3 và 4 loại kháng sinh, không có chủng vi khuẩn nào kháng với 5 hoặc 6
loại kháng sinh trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chủng vi khuẩn đại diện cho từng loài với
chloramphenicol là Pseudomonas, Plesimonas shigelloides và Vibrio được xác
định là Vibrio sp. (64 ppm), V. ordalii (32 ppm), V. anguillarum (256 ppm), V.
navarrensis (32 ppm), V. carchariae (16 ppm), V. mimicus (2 ppm), Plesimonas
shigelloides (8 ppm) và giống Pseudomonas (4 ppm).

ii


MỤC LỤC
Trang
GIỚI THIỆU ................................................................. .........................................1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................ .........................................3
2.1 Cơ chế miễn dịch ở giáp xác ............................ ............................................ 3
2.2 Nguyên nhân phát sinh bệnh lý ...................... .........................................4
2.3 Các dạng bệnh vi khuẩn trên tôm sú .............. .........................................5
2.3.1 Bệnh hoại tử trên mắt tôm ..................... .........................................5

2.3.3 Bệnh do vi khuẩn dạng sợi..................... .........................................5
2.3.4 Bệnh phát sáng....................................... .........................................5
2.3.5 Bệnh đỏ dọc thân ................................... .........................................5
2.3.6 Bệnh đen mang ...................................... .........................................6
2.3.7 Bệnh đốm nâu và đốm đen .................... .........................................6
2.4 Bệnh phân trắng.............................................. .........................................6
2.4.1 Tình hình bệnh xảy ra ............................ .........................................6
2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý .................................... .........................................7
2.4.3 Tác nhân gây bệnh ................................. .........................................7
2.4.4 Điều trị ................................................... .........................................8
2.5 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tôm.......... .........................................9
2.5.1 Đặc điểm về vi khuẩn Pseudomonas ..... .........................................9
2.5.2 Đặc điểm về vi khuẩn Acinetobacter..... .........................................9
2.5.3 Đặc điểm về vi khuẩn Vibrio ................. .........................................9
2.6 Tình hình sử dụng thuốc và hoá chất.............. .......................................11
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... .......................................13
3.1 Nội dung nghiên cứu ...................................... .......................................13
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................... .......................................13
3.2.1 Vật liệu................................................... .......................................13
3.2.2 Vi khuẩn dùng cho phân tích ................. .......................................14
3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................ .......................................15
3.3.1 Phương pháp thu mẫu, phân tích và trữ mẫu .................................15
3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hoá (kiểm tra các
chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn ..................15
3.3.3 Lập kháng sinh đồ................................. .......................................16
3.3.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
thuốc lên vi khuẩn................................. .......................................16

iii

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................... .........................................18
4.1 Kết quả............................................................ .........................................18
4.1.1 Mô học ................................................... .........................................18
4.1.2 Kết quả định danh .................................. .........................................20
4.1.3 Kết quả kháng sinh đồ ........................... .........................................30
4.1.4 Kết quả MIC .......................................... .........................................33
4.2 Thảo luận ........................................................ .........................................36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................... .........................................40
5.1 Kết luận .......................................................... .........................................40
5.2 Đề xuất............................................................ .........................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................ .........................................43
PHỤ LỤC
.............................................................. .........................................45

iv


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập ........................................... 14
Bảng 3.2: Mức giới hạn xác định kháng, trung bình nhạy và nhạy
của 6 loại kháng sinh ......................................................................... 16
Bảng 3. 3: Thao tác pha loãng kháng sinh........................................................... 17
Bảng 4.1: Đặc điểm sinh lý – sinh hoá của các dòng Vibrio........................... 20
Bảng 4. 2: Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn
Plesimonas shigelloide ...................................................................... 27
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra các đặc điểm Acinetobacter calcoaceticus............. 28
Bảng 4.4: Kết quả định danh nhóm Pseudomonas............................................. 29
Bảng 4.5: Kết quả đường vô trùng của 19 dòng vi khuẩn .................................... 30

Bảng 4.6: Kết quả các dòng vi khuẩn phản ứng với thuốc kháng sinh
(vi khuẩn bao gồm cả Vibrio) ............................................................. 30
Bảng 4.7: Kết quả MIC ...................................................................................... 34

v


DANH SÁNH HÌNH
Trang
Hình 2.1:
Hình 2.2:
Hình 4.1:
Hình 4.2:

Mối quan hệ giữa mầm bệnh, môi trường và vật chủ........................... 4
Những đoạn phân của tôm sú bệnh phân trắng thải ra trong ao nuôi... 6
Biểu đồ thể hiện tỉ lệ mẫu mô nhiễm vi khuẩn................................... 18
(a) mô cơ quan lymphoid khoẻ, (b) các tế bào máu đang tập trung
bao quanh ổ vi khuẩn (mũi tên) ......................................................... 20

Hình 4.3: (a) mô khoẻ cơ quan gan tuỵ, (b) bạch cầu tiêu diệt ổ vi khuẩn
(mủi tên)..............................................................................................20
Hình 4.4: Sơ đồ gia phả phân loại của các chủng thuộc nhóm Vibrio .............. 22
Hình 4.5: Hình nhuộm gram vi khuẩn V. mimicus ........................................... 23
Hình 4.6: khả năng phát triển VP, indole, urease ............................................. 23
Hình 4.7: Hình nhuộm gram vi khuẩn V. carchariae........................................ 24
Hình 4.8: Phản ứng urease dương tính (màu hồng)........................................... 24
Hình 4.9: Khả năng phát triển nồng độ muối của V. anguillarum .................... 25
Hình 4.10: Khả năng phản ứng các axitamin của V. anguillarum ......................... 25
Hình 4.11: Đĩa vi khuẩn V. anguillarum ở 22h trên môi trường TSA ............... 26

Hình 4.12: Hình nhuộm gram vi khuẩn V. Ordalii ............................................. 26
Hình 4.13: Hình nhuộm gram vi khuẩn V. Navarrensis...................................... 27
Hình 4.14: Phản ứng với các loại đường của vi khuẩn V. Navarrensis .............. 27
Hình 4.15: Hình nhuộm gram vi khuẩn nhóm Plesimonas shigelloides ............. 28
Hình 4.16: Hình dạng đặc trưng của nhóm vi khuẩn Pseudomonas ................. 29
Hình 4.17: Loài Acinetobacter calcoaceticus kháng với 4 loại kháng sinh
C, AMP, TE, F (a và b), Plesimonas shigelloides nhạy với F, TE,
AMP bằng nhau 17mm (c) ................................................................ 32
Hình 4.18: Biểu đồ thể hiện tính kháng của vi khuẩn đối với từng loài
kháng sinh .......................................................................................... 33
Hình 4.19: Biểu đồ thể hiện tính kháng với một hoặc nhiều kháng sinh của
vi khuẩn.............................................................................................. 33
Hình 4.20: Plesimonas shigelloides (P301-đ) nhạy với chloramphenicol
(mũi tên) có đường kính lớn nhất (35mm) ....................................... 35
Hình 4.21: Kết quả MIC của V. Carchariae ở nồng độ là 16 ppm (mũi tên)...... 36
Hình 4.22: Đĩa petri thể hiện tính thuần kết quả MIC của V. Carchariae .......... 36
vi


PHẦN I
GIỚI THIỆU

Thủy sản được xem là một trong những mặt hàng quan trọng của nhiều nước
trên thế giới, đặc biệt tôm sú đang là thế mạnh đối với các nước thuộc khu vực
Đông Nam Á và nghề nuôi tôm dần chiếm vị trí quan trọng trong nghề nuôi
thủy sản. Châu Á đã không ngừng tăng sản lượng tôm sú và luôn đứng đầu
trong các Châu. Năm 2003 sản lượng tôm sú thế giới đạt 666.071 nghìn tấn
(FAO, 2003) và cũng trong thời gian này Việt Nam đứng đầu khu vực Đông
Nam Á về sản lượng tôm sú đạt 200.000 tấn. Qua thống kê thì việc nuôi tôm
sú thâm canh đạt lợi nhuận 50-80% (Lin, 1995).

Trước lợi nhuận hấp dẫn đó các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nói
riêng không ngừng mở rộng diện tích nuôi, đẩy nhanh sự tăng sản lượng, kỹ
thuật nuôi đa dạng tạo ra sự phát triển ồ ạt, gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng.
Tình trạng ô nhiễm môi trường tràn lan, dịch bệnh bùng phát, trình độ quản lý
kém đem lại nhiều tổn thất to lớn. Theo thống kê các nước châu Á thì dịch
bệnh gây thiệt hại hàng năm khoảng 3 tỉ USD (Lunden, 1997 được trích dẫn
bởi Nguyễn Văn Hảo, 2005). Đồng bằng sông Cửu long (ĐBSCL), trong
những năm 2000-2005 thì số hộ nuôi tôm biển bị lỗ bình quân 25-30% của
tổng số hộ nuôi (Lê Xuân Sinh, 2005), nguyên nhân chủ yếu là do tác nhân
virus như MBV, YHV, WSSV và nhiều loại vi khuẩn mà phần lớn bệnh do
nhóm vi khuẩn Vibrio.
Vi khuẩn Vibrio phân bố khắp nơi trên thế giới tập trung ở Châu Á, Châu Phi
và Châu Mỹ, gây thiệt hại nhiều nhất đối với nghề nuôi tôm biển cụ thể là
Trung quốc 1992-1993 dịch bệnh do V. alginolyticus và V. parahaemolyticus
lan tràn gây tỉ lệ chết 80% và sản lượng tôm giảm 70%. Các nghiên cứu cho
thấy trong các tác nhân gây bệnh thì tác nhân vi khuẩn xuất hiện với tần số lớn
nhất (45,3%) và nếu nhìn về góc độ nguy hại thì bệnh do tác nhân vi khuẩn
vẫn chiếm tỉ lệ cao nhất 50,9%. ĐBSCL qua kết quả phân tích vi sinh ở nguồn
nước khu vực tôm chết và kể cả tôm cho thấy chủ yếu thuộc nhóm Vibrio bao
gồm trong nước như V. anguilyticus, V. anguillarum, ở trong tôm thì có V.
vulnificus, V. alginolyticus, V.anguillarum, V. parahaemolyticus, V. cholerae01 và các giống khác như Pseudomonas, Proteus sp. và Aeromonas sp.
(Nguyễn Anh Tuấn, 1995).
Ngoài ra bệnh phân trắng, teo gan trên tôm sú hiện nay cũng đã gây thiệt hại
khá lớn cho các hộ nuôi tôm hiện nay. Bệnh tuy không xảy ra thành dịch lớn
1


nhưng xuất hiện nhiều nơi đang là niềm trăn trở của các nhà nuôi tôm ở nhiều
tỉnh thuộc ĐBSCL và nhiều nơi khác trong nước. Do chưa xác định được tác
nhân gây bệnh dẫn đến việc điều trị gặp nhiều khó khăn, việc sử dụng quá

nhiều kháng sinh cho điều trị và không đúng liều lượng dẫn tới tình trạng
kháng thuốc và tốn kém không mang lại hiệu quả. Trước tình hình đó đề tài:
“Xác định đặc điểm sinh hoá của mầm bệnh vi khuẩn phân lập trên tôm
sú bệnh phân trắng” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Xác định đặc điểm sinh hóa của mầm bệnh vi khuẩn phân lập trên tôm sú bị
bệnh phân trắng từ các ao nuôi thâm canh, nhằm làm cơ sở cho việc xác định
tác nhân gây bệnh phân trắng và phương thức quản lý bệnh này.
Nội dung đề tài
1. Thu mẫu và phân lập vi khuẩn từ các mẫu tôm bị bệnh phân trắng nuôi
thâm canh tại hai huyện: Thạnh Phú-Bến Tre và huyện Hoà Đông - Sóc
Trăng.
2. Xác định đặc điểm sinh hóa và định danh các dòng vi khuẩn phân lập
được.
3. Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng
sinh đối với vi khuẩn

2


PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CƠ CHẾ MIỄN DỊCH Ở GIÁP XÁC
Hệ miễn dịch của giáp xác không có đáp ứng miễn dịch đặc hiệu như ở cá
xương và các động có xương sống bậc cao khác mà chỉ dựa vào đáp ứng miễn
dịch tự nhiên trong các đáp ứng bảo vệ cơ thể. Đáp ứng miễn dịch không đặc
hiệu ở giáp xác được thực hiện chủ yếu bởi các tế bào máu chuyên hoá như
thực bào, quá trình phong toả và sự sinh sản các chất kháng khuẩn hay diệt
khuẩn. Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2006) thì có 3 loại bạch cầu có chức

năng như sau: bạch cầu không hạt (hyaline) có khả năng thực bào, không có
khả năng phong toả và hoạt hoá hệ thống ProPO, về độc tố tế bào thì chức
năng này chưa rõ. Bạch cầu bán hạt (semigranular) thì khả năng thực bào có
hạn chế nhưng có khả năng phong toả, độc tố tế bào và hoạt hoá hệ thống
ProPO. Bạch cầu có hạt (granular) có khả năng hoạt hoá hệ thống ProP0 và
độc tố tế bào nhưng không có chức năng thực bào và khả năng phong toả rất
hạn chế.
Vi khuẩn và virus cũng có lectin (các phân tử lectin có hoạt tính miễn dịch,
lectin là các phân tử glycoprotein có thể gắn với phần đường của các phân tử
khác đặc biệt là các thể lạ) ở bề mặt, các phân tử này có thể nối kết tác nhân lạ
với huyết bào của tôm do đó vi khuẩn và virus sử dụng lectin để xâm nhập vào
tế bào tôm ở vị trí thụ thể để khởi đầu cho quá trình lây nhiễm (Hứa Quyết
Chiến, 2005).
Khi vi sinh vật hay vật chất lạ vào cơ thể của giáp xác thì chúng gặp phải bạch
cầu, hiện tượng thực bào xảy ra làm kích hoạt enzym protease có trong huyết
thanh. Khi men này hoạt hoá thì ngoài việc sản sinh ra quinone melamin rất
nhiều và tập trung ngay trên sinh vật hay vật lạ và bao lấy chúng không chỉ tạo
ra hiện tượng melamin hoá trên vỏ giáp xác mà còn tập hợp các thực bào lại
bao quanh vật thể lạ thúc đẩy hiện tượng thực bào diễn ra nhanh hơn. Peptid
kháng khuẩn có khả năng tương tác trực tiếp với bề mặt tế bào vi sinh vật tạo
nên những lổ thủng làm chết tế bào vi sinh vật. Với cấu trúc đặc biệt này làm
cho vi sinh vật khó có thể phát triển khả năng kháng thuốc kháng sinh. Cấu

3


trúc màng tế bào vật chủ và vi sinh vật nên chúng có thể tiêu diệt mầm bệnh
mà không gây ảnh hưởng cho vật chủ (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2006).
2.2 NGUYÊN NHÂN PHÁT SINH BỆNH LÝ
Đối với động vật thuỷ sản việc phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm thì rất khó,

thường phát hiện bệnh khi đã biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng. Có đôi khi
dấu hiệu bên ngoài cũng cho biết một cách mơ hồ về tình trạng sức khoẻ của
tôm, để biết chính xác tác nhân gây bệnh thì cần phải thực hiện các phân tích
trong phòng thí nghiệm.
Bệnh là biểu hiện trạng thái bất thường của cơ thể sinh vật với sự biến đổi xấu
của môi trường xung quanh, cơ thể nào thích ứng thì tồn tại, không thích ứng
thì mắc bệnh và chết (Từ Thanh Dung, 2001). Bệnh có thể xảy ra là do kết quả
tác động của 3 nhân tố là môi trường, mầm bệnh và ký chủ, khi sự thăng bằng
của 3 nhân tố trên bị xáo trộn (Theo Sniezko, 1974 được trích dẫn bởi Đặng
Thị Hoàng Oanh, 2006).

Hình 2.1: Mối quan hệ giữa mầm bệnh, môi trường và vật chủ

Khi thiếu một trong 3 nhân tố trên bệnh không thể xảy ra. Nếu như tôm mang
mầm bệnh mà trong khi đó môi trường thuận lợi cho vật chủ và bản thân vật
chủ có sức đề kháng đối với mầm bệnh thì bệnh không thể phát sinh. Bệnh có
thể bộc phát khi môi trường là nhân tố gây bệnh chủ lực thì tạo điều kiện cho

4


vi khuẩn gia tăng mật số và dễ dàng xâm nhập vào cơ thể vật chủ. Điều đó cho
thấy rằng 3 nhân tố trên có mối quan hệ mật thiết với nhau.
Do đó xem xét nguyên nhân gây bệnh không nên kiểm tra một yếu tố đơn độc
mà cần xem xét cả 3 nhân tố môi trường, mầm bệnh và vật nuôi. Bệnh chia ra
thành 2 dạng là bệnh truyền nhiễm gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm và
bệnh không truyền nhiễm như môi trường, dinh dưỡng và độc tố.
2.3 CÁC DẠNG BỆNH VI KHUẨN TRÊN TÔM SÚ
2.3.1 Bệnh hoại tử trên mắt tôm:
Tác nhân gây bệnh : V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V.

anguillarum, V. alginolyticus...
Dấu hiệu bệnh lý: tôm lờ đờ, ruột không có thức ăn, thân tôm chuyển màu
đen, cơ đuôi trắng, tôm lúc sắp chết mắt có dấu hiệu bị hoại tử, u hạt, mềm
nhũng (Bùi Quang Tề, 2003).
2.3.2 Bệnh do vi khuẩn dạng sợi
Tác nhân gây bệnh: chủ yếu là do Flexibacter sp., Thiothrix sp., Leucothrix
mucor,... vi khuẩn dạng sợi sống tự do trên biển.
Dấu hiêu bệnh lý: chúng phát triển trên bề mặt cơ thể tôm nhất là các mút trên
phần phụ của miệng, mang. Các thể bệnh nặng mang chuyển màu từ vàng
chuyển sang xanh lá hay nâu. Thường gây bệnh từ tôm giống (Bùi Quang Tề,
2003).
2.3.3 Bệnh phát sáng
Tác nhân gây bệnh: vi khuẩn thuộc V. harveyi, V. parahaemolyticus
Dấu hiêụ bệnh lý: bệnh thường xảy ra vào mùa hè, độ mặn cao, tảo tàn. Tôm
bệnh bơi lội nhanh nhẹn không định hướng và thân tôm trắng mờ đục, bệnh
nặng tôm có màu xanh lục phát huỳnh quang khi trong bóng tối, gan teo, ruột
rỗng. Bệnh nghiêm trọng tỉ lệ chết lên đến 100%. Bệnh thường xảy ra ở trại
giống, ấu trùng, tôm giống hay tôm nuôi giai đoạn còn nhỏ (Từ Thanh Dung,
2005).
2.3.4 Bệnh đỏ dọc thân
Tác nhân gây bệnh: V. alginolyticus
Dấu hiệu bệnh lý: lúc đầu xuất hiện một vài đốm đỏ trên mắt sau đó lan xuống
bụng. Bệnh nặng ống tiêu hoá bị đỏ, dị hình lắng xuống đáy. Gây chết rải rác,
bệnh trên ấu trùng và tôm giống (Trần Thị Tuyết Hoa và ctv, 2006).

5


2.3.5 Bệnh đen mang
Tác nhân gây bệnh: Vibrio sp. và một số nguyên nhân khác

Dấu hiệu bệnh lý: Mang tôm có màu nâu hay đen, tôm di chuyển chậm chạp.
Thường gây ra trên tôm thịt, chết rải rác hàng lọat (Bùi Quang Tề, 2003).
2.3.6 Bệnh đốm đen và đốm nâu
Tác nhân gây bệnh: do vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio, Aeromonas,
Flavobacterium và Pseudomonas.
Dấu hiệu bệnh lý: vỏ giáp, phụ bộ và mang tôm có những đốm nâu hay đen
đơn độc hoặc tạo thành đám rộng, vỏ bị ăn mòn lở loét đến lớp biểu bì, các
phụ bộ như râu, chân, càng , chuỷ cũng bị ăn mòn làm cho tôm lờ đờ, kém ăn,
khó lột xác, dị tật…bệnh lây lan nhanh và tỉ lệ nhiễm có thể lên đến 100% số
lượng tôm. Bệnh xảy ra ở các giai đoạn tôm (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).
2.4 BỆNH PHÂN TRẮNG
2.4.1 Tình hình bệnh xảy ra
Ở nước ta bệnh phân trắng, teo gan xuất hiện vài năm gần đây trong ao nuôi
thâm canh. Theo kết quả điều tra tỉnh Ninh Thuận bệnh xảy ra đầu tiên vào
năm 1998 ở những ao nuôi mật độ cao ít thay nước. Bệnh tuy chưa lớn thành
dịch bệnh nhưng gây thiệt hại đáng kể đối với nghề nuôi tôm hiện nay. Bệnh
đang xảy ra nhiều tỉnh mà nặng nề nhất là tỉnh Ninh Thuận hay các vùng nuôi
tôm trên cát trước đây ở khu vực miền Trung. Năm 2000 bệnh phát triển lây
lan nhanh, chẳng hạn năm 2002 huyện Tuy Hòa (Phú Yên) có 450 ha ao nuôi
xuất hiện bệnh, Khánh Hòa 300 ha, Bình Định 60 ha, Ninh Thuận năm 2003 bị
bệnh này trong 2 vụ lên đến 600 ha và đặc biệt chỉ trong 6 tháng 2004 bệnh
gây thiệt hại 500 ha. Riêng vùng nuôi tôm trên cát xuất hiện bệnh tỉ lệ cao
80% (Nguyễn Khắc Lâm, 2006).

Nguồn: internet
Hình 2.2: Những đoạn phân của tôm sú bệnh phân trắng thải ra trong ao nuôi.

6

Tại ĐBSCL, các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Sóc Trăng, Bến Tre... cũng bị thiệt
hại không kém. Nhiều người nuôi cung cấp thông tin là ao nuôi tôm của họ
luôn gặp tình trạng tôm bị phân trắng, teo gan và đối với những ao mắc bệnh
vụ trước thì vụ sau tỉ lệ bệnh gấp hai lần so với ao bình thường. Theo thống kê
của Huỳnh Văn Tùng (2006) thì bệnh phân trắng xảy ra ở các nơi thuộc khu
vực ĐBSCL chiếm tỉ lệ 18,5%, bệnh này chưa thấy xảy ra ở mô hình nuôi
quảng canh hay quảng canh cải tiến, trung bình số vụ nuôi bị nhiễm đối với
mô hình thâm canh là 28,1% và bán thâm canh là 32,9%, tỉ lệ tôm chết trung
bình 34,8%, kích cỡ tôm thu hoạch giảm trung bình 34,8%, năng suất trung
bình giảm 36,4% và giảm lợi nhuận trung bình 43,1% so với tôm nuôi ở ao
không bị nhiễm bệnh.
2.4.2 Dấu hiệu bệnh
Bệnh xuất hiện khi tôm vào giai đoạn 40-50 ngày tuổi nhiều nhất 80-90 ngày
tuổi. Khi bệnh, tôm thải ra những đoạn phân màu trắng đục và dễ quan sát hơn
ở góc ao nơi cuối gió, lúc này tôm giảm ăn 80%. Quan sát ruột tôm thì không
có thức ăn, hoặc thức ăn bị đứt đoạn, đường ruột có những đốm màu vàng
nhạt hoặc màu trắng, nhất là phần cuối ruột và nơi ruột tiếp giáp với gan phình
to ra (Nguyễn Khắc Lâm, 2006).
Giai đoạn sau khi tôm bệnh phân trắng thì chuyển sang là teo gan. Nếu như
không phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm để kịp thời xử lý thì gan tôm bắt đầu
teo lại, tình trạng bỏ ăn kéo dài và chết rải rác. Quan sát gan tôm thì thấy gan
chai cứng và chỉ bằng 1/3 so với gan bình thường, hoặc gan bị rữa ra giống
như sữa, nhưng điều đáng chú ý là không phải lúc nào tôm bệnh cũng phải qua
2 giai đoạn mà có khi chỉ là một trong hai giai đoạn trên (Nguyễn Khắc Lâm.
2006). Cũng là hiện tượng teo gan tương tự như ở giai đoạn ấu niên của loài
Penaeus vannamei cũng có hiện tượng gan bị teo nhỏ lại hơn so với bình
thường 50%, dẫn đến phù thủng nặng (Melba G. Bondad-Reantaso và ctv,
2005).
2.4.3 Tác nhân gây bệnh
Đến thời điểm hiện nay có nhiều ý kiến khác nhau về tác nhân gây bệnh phân

trắng.
Bùi Quang Tề (2003) khẳng định rằng tôm bệnh phân trắng là do trùng hai tế
bào (Geragine) làm tổn thương thành ruột, dạ dày đồng thời kết hợp với môi
trường nhiễm lượng Vibrio phát triển gia tăng, tôm ăn thức ăn ủ Vibrio, tác
nhân cơ hội này Vibrio vào ruột gây hoại tử. Vậy theo ông bệnh này chỉ do hai
loại tác nhân Vibrio và trùng hai tế bào. Theo nghiên cứu từ tỉnh Ninh Thuận
7


(Nguyễn Khắc Lâm, 2006) đưa ra kết quả là tác nhân gây bệnh gồm: vi-rút thì
có sự hiện diện HPV chiếm tỉ lệ 36%, vi khuẩn thì có nhóm Vibrio như V.
proteolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi chiếm tỉ lệ cao nhất 80% và nhóm
tảo lam chiếm 45,4%, đặc biệt xuất hiện ở những ao có điều kiện môi trường
không đảm bảo.
Một số tác giả cho rằng thành ruột tôm bệnh có màu vàng nhạt có liên quan
đến sự xuất huyết ở ruột tôm do chất độc (Aflatocxin) của nấm gây ra. Tác giả
cho rằng trong môi trường ao nuôi có sự tồn tại của loài tảo độc rất cao khi
tôm ăn vào sẽ bị bệnh. Ở ĐBSCL theo kết quả sưu tập từ các mẫu bệnh thuỷ
sản của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) trong đó có các mẫu bệnh phân
trắng đã định danh được 16 chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio. Các chủng vi
khuẩn đó là Vibrio sp. (tám chủng), V. vulnificus (ba chủng), V. cholerae (hai
chủng), V. navarrensis (một chủng) và V. hollisae (một chủng).
Qua các kết luận đã đưa ra thì vẫn chưa xác định chính xác tác nhân gây bệnh
một cách rõ ràng. Hiện nay có khả năng là bệnh phân trắng và teo gan do bốn
mầm bệnh gây ra đó là virus, trùng hai tế bào, tảo độc và vi khuẩn Vibrio gây
ra trong đó mầm bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio chiếm tỉ lệ cao nhất.
2.4.4 Điều trị
Hiện nay đối với người nuôi tôm sú khi gặp phải tình trạng tôm bị bệnh phân
trắng, teo gan thì trị với nhiều cách khác nhau. Qua đợt điều tra thực tập giáo
trình chuyên môn bệnh thuỷ sản thông tin từ nhiều người dân cho biết là dùng

kết hợp giữa nhóm sulphamid kết hợp với trimethoprime trộn vào thức ăn cho
tôm ăn, hay chỉ dùng tetracylin đồng thời bổ sung thêm vitamin C, men tiêu
hoá để tăng cường sức đề kháng cho tôm. Nhiều người nuôi có xu hướng trị
bằng các loại thảo dược như sử dụng đọt ỏi và đọt lựu xay ra lấy nước pha với
nước ao phun xuống ao.
Để nghiên cứu thuốc trị đối với bệnh phân trắng là hoạt chất hisdrasitin trong
chế phẩm PT – 04 được chiết xuất từ cây hoàng đàn có khả năng trị bệnh trên
tôm nhưng không ức chế sự sinh trưởng của tôm. Ở trại thử nghiệm thực tế tại
huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng, nhưng việc điều trị chưa được đem ra thực
tế để dùng cho việc trị bệnh (Hứa Quyết chiến, 2005).
2.5 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN TÔM
Trong môi trường ao nuôi hay ngoài tự nhiên thì có nhiều loài vi khuẩn gây
bệnh trên tôm sú như Pseudomonas, Plesiomonas shigelloides, acinetobacter,
Flexibacter sp., Thiothrix sp. … nhưng đặc biệt gây bệnh chủ lực nhất là nhóm
vi khuẩn Vibrio tác hại rất lớn.
8


2.5.1 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas
Đây là loài vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm, phát
triển ở môi trường đơn giản hay hiếu khí. Đa số các loài thuộc nhóm này có
phản ứng oxi hoá và một số ít không oxi hoá hay lên men, nhiệt độ cho sự tồn
tại và phát triển là 4 - 430C. Một số tạo ra sắc tố vàng hay xanh hoặc một ít
không sinh sắc tố. Phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất và trong
nước. Pseudomonas có loài phân bố nước ngọt như Pseudomonas flourescens
và phân bố ở biển như Pseudomonas anguilliseptica, Pseudomonas
chlororaphus và một số loài khác. Pseudomonas spp. xâm nhập vào cơ thể sẽ
phá huỷ các mô, các chức năng trong cơ thể, khi các cơ quan bị phá huỷ có thể
gây chết 70% - 80%. Đây là nhóm tác nhân cơ hội trên các loài động vật thủy
sản (Từ Thanh Dung, 2005).

2.5.2 Đặc điểm vi khuẩn Acinetobacter
Vi khuẩn Acinetobacter gram âm nhưng hình cầu, oxidase âm tính, không sinh
sắc tố, arginine âm tính, không tạo axít từ carbohydrates. Có khả năng phát
triển ở nhiệt độ 440C (Ashley & Kwantes, 1961 trích dẫn bởi Buller, 2004).
2.5.3 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio
2.5.3.1 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa
Trên tôm tìm thấy được 28 loài Vibrio khác nhau ở cơ quan gan tuỵ, ruột và dạ
dày của tôm khoẻ. Vibrio chia thành hai nhóm, nhóm Vibrio môi trường tức là
tồn tại nhiều ngoài môi trường nước và nhóm Vibrio mầm bệnh chủ yếu gây
bệnh trên đối tượng thuỷ sản (Buller, 2004).
Nhóm vi khuẩn Vibrio gram âm, hình chữ V hay hình dấu phẩy, di động, hiếu
khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Khi phân lập trên môi trường TCBS chia ra
hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose có khuẩn lạc màu vàng,
nhóm không có khả năng lên men đường sucrose thì khuẩn lạc có màu xanh lá
cây. Khi nuôi cấy phát triển trong môi trường thạch với 2-3% nồng độ muối,
tuy nhiên có những loài phát triển trên môi trường với nồng độ muối rất cao
10% như V. alginolyticus. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển nhanh của
nhóm vi khuẩn này là 25-30˚C. Độ mặn từ 20-40‰. Có hai nhóm Vibrio là
nhóm nước mặn và nước ngọt, những loài Vibrio nước mặn thì sinh trưởng
nhanh hơn và thường gây bệnh hơn (Lightner, 1996).
2.5.3.2 Mức độ gây bệnh

9


Khả năng gây bệnh của nhóm vi khuẩn Vibrio ở ba mức độ nguy hiểm khác
nhau: bệnh cấp tính thường gây hiện tượng chết rải rác đến hàng loạt, bệnh thứ
cấp tính và bệnh mãn tính có thể làm tôm chậm lớn và phân đàn.
2.5.3.3 Khả gây bệnh của vi khuẩn Vibrio
Ngoài việc gây bệnh trên các loài tôm biển, nhóm vi khuẩn này còn gây bệnh

cho rất nhiều loài thủy sản đặc biệt nước lợ và mặn, gây bệnh trên nhuyễn thể
như hầu, vẹm, điệp, bào ngư... khi chúng nhiễm bệnh phát hiện có sự hiện diện
của V. alginolyticus, V. anguillarum và Vibrio sp.. Các loài cua biển cũng bị
bệnh do nhóm Vibrio tỉ lệ chết có khi >50% (Sundermann và Lightner, 1987).
Bên cạnh đó chúng còn gây bệnh nhiều nhất là trên cá ở châu Âu bao gồm cá
hồi, cá bơ sao, cá chình… do V. aguillarum (Pedersen, 1999). Ở Việt Nam
chúng gây bệnh trên các loài như cá chẽm, cá mú hay một số loài cá sống ở
nước lợ và mặn.
Bệnh do vi khuẩn Vibrio rất phổ biến ở tôm nuôi và thường gặp là 8 loài
Vibrio, các loài này có độc lực gây bệnh cao nên gây bệnh nguy hiểm trên tôm
như V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. damsela, V. fluvialis, V.
anguilarum, V. alginolyticus, V. cholerae (Lightner, 1996).
Biểu hiện tôm bệnh do vi khuẩn Vibrio sẽ có nhiều tên gọi khác nhau như là:
“Hội chứng tôm chết sau một tháng tuổi ” tức là do vi khuẩn Vibrio sp và các
dạng nhiễm khuẩn khác (Mycobacterium ssp. và Rickettesia) có liên quan đến
sự suy thoái môi trường. “Hội chứng bilitos” tức là tình trạng biểu mô hình
cầu bị tróc ra ở trong ruột (Nguyễn Anh Tuấn và ctv dịch, 2001). Nhóm vi
khuẩn Vibrio có khả năng tiết ra các men kitinase, lipase và protesa gây ăn
mòn hoại tử (Hứa Quyết chiến, 2005).
Nhóm Vibrio thường được xem là mầm bệnh cơ hội nhưng Lightner đã từng
cho rằng: căn cứ vào những ổ dịch xảy ra trên tôm sú do Vibrio gây ra cho
thấy loài này dường như được xem là loài vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự
chớ không phải là vi khuẩn cơ hội. Loài vi khuẩn này đôi khi có những loài
gây bệnh khi môi trường chỉ có một điều kiện bất lợi nhỏ và cũng có loài gây
bệnh khi môi trường rất xấu hay tôm bị tổn thương trầm trọng. Một điều dễ
nhận thấy rằng khi tôm bị bệnh do nhiễm khuẩn thì chúng biểu hiện một số
bệnh khác nhau với những dấu hiệu bệnh lý khác nhau như bệnh phát sáng ấu
trùng tôm: khi tôm bệnh thì phát ra ánh huỳnh quang vào ban đêm hay chỗ tối.
Bệnh hoại tử cục bộ thường tạo ra các đốm nâu, đốm đen tại lớp biểu bì dưới
vỏ hay ở đầu mút phụ bộ tôm, ăn mòn phụ bộ hay vỏ hoặc tạo ra đốm trắng

giả trên tôm hay gây ra hiện tượng đỏ toàn thân và nhiều dấu hiệu khác (Đỗ
Thị Hòa và ctv, 2004).
10


Theo Lightner (1983) cho rằng vi khuẩn Vibrio gây chết ấu trùng tôm giống,
tôm thương phẩm, cả tôm trưởng thành và có thể gây chết lên đến 100%.
Nhưng cũng tùy theo giai đoạn phát triển của tôm mà tỉ lệ nhiễm vi khuẩn
Vibrio cũng khác nhau. Đối với tôm giống khỏe hay bệnh đều nhiễm vi khuẩn
Vibrio ở mức cao hơn hậu ấu trùng (Đỗ Thị Hòa và ctv, 1994-1995). Đặc biệt
gần đây người ta đã tìm được 2 loài Vibrio gây bệnh đường ruột ở loài tôm
Sicyonia ingentis là V. parahaemolyticus và V. haveyi gây ra sư thoái hoá ở
ruột, các tế bào biểu mô bị mất, bị hoại tử, hình dạng ruột thay đổi (Martin và
ctv, 2004). Vibrio gây bệnh có thể là tác nhân gây bệnh sơ cấp hay thứ cấp mà
nguyên nhân đầu tiên là yếu tố môi trường, yếu tố cơ học hay sinh vật khác kí
sinh gây thương tổn ở các bộ phận trên cơ thể, chính điều đó tạo điều kiện cho
Vibrio xâm nhập vào cơ thể một cách dễ dàng và thường gây bệnh trên các cơ
quan như cơ, máu, gan tuỵ, lympho…
Vi khuẩn Vibrio tồn tại mọi nơi trong môi trường nước, nền đáy ao, thức ăn
hay nói cách khác là trong môi trường thuỷ vực chúng tồn tại như một quần
thể tự nhiên. Điều đó cũng nói lên rằng bất cứ tôm chết hay sắp chết đều có
nhiễm một vài dạng của Vibrio và mật độ của chúng trong nước biển hay ven
bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động, gió mùa hay áp thấp
nhiệt đới (Đỗ Thị Hòa, 1997). Chính điều đó mỗi khi có sự thay đổi về khí hậu
có thể làm cho tôm bị sốc thì tôm sẽ yếu đi kèm theo sức đề kháng kém trong
lúc đó môi trường thuận lợi cho vi khuẩn phát triển đủ số lượng tức là ở mật
độ có thể gây bệnh. Tỉ lệ nhiễm nhóm vi khuẩn này chẳng những tăng theo
không gian mà còn tăng theo cả thời gian như Bùi Quang Tề (2003) đã khẳng
định là lượng vi khuẩn Vibrio trong bể ương ấu trùng tăng theo thời gian, tầng
đáy cao hơn tầng mặt. Do đó khi xi phong tầng đáy có tác dụng giảm mật độ

Vibrio. Tuy vi khuẩn này không gây chết ồ ạt đối với tôm thịt trong thời gian
ngắn nhưng qua các thông tin trên cho ta thấy được nhiều rủi ro do vi khuẩn
Vibrio gây ra đối với động vật thủy sản nói chung và trên tôm sú nói riêng
đang là vấn đề trầm trọng và cần phải quan tâm.
2.6 Tình hình sử dụng thuốc và hoá chất
Hiện nay trong nuôi thuỷ sản cũng như nuôi tôm sú thâm canh hay bán thâm
canh sử dụng rất nhiều loại thuốc và chất trong việc phòng bệnh và trị bệnh.
Việc thiếu hiểu biết và không quan trọng khi dùng thuốc kháng sinh trong việc
trị bệnh hay dùng những kháng sinh cấm đã tạo ra tình trạng kháng thuốc ngày
cao, không có hiệu quả kinh tế mà còn gây tồn lưu kháng sinh trong thực
phẩm. Theo khảo sát chi cục tỉnh cà mau (2002) thì có trên 300 loại hoá chất
và thuốc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản. Tại hai tỉnh Sóc Trăng và Bạc
Liêu có 19 loại kháng sinh dùng trong nghề nuôi tôm. Trước tình hình sử dụng
11


thuốc và hoá chất như thế thì theo Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) là chi phí thuốc
và hoá chất chiếm 24,8% tổng chi phí chỉ đứng sau chi phí thức ăn. Riêng về
bệnh phân trắng kết quả từ nhiều phương pháp điều trị không mang lại kết quả
mong muốn, vì không thấy hiệu quả rõ ràng. Khi tôm hết bệnh có lẽ là do
ngẫu nhiên mặc dù mang nghĩa là hết bệnh tức là không còn thấy triệu chứng
của bệnh nhưng sau đó tôm sẽ tăng trưởng chậm hay người dân thường gọi là
tôm bị chay không tăng trưởng nếu tiếp tục duy trì thì sẽ tổn thất. Hiện nay
việc dùng kháng sinh trong điều trị gặp nhiều khó khăn, đôi khi còn gây tồn
lưu kháng sinh trong cơ thể tôm do sử dụng kháng sinh trong điều trị, đặc biệt
các kháng sinh ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng. Trên thực tế hiện
nay bệnh phân trắng do chưa biết chính xác tác nhân gây bệnh, nếu như thời
gian kéo dài thì tình hình kháng thuốc càng nghiêm trọng hơn

12

PHẦN 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện với các nội dung nghiên cứu như sau:
ª Phân lập và lưu trữ vi khuẩn từ huyết tương của tôm sú khi tôm bị bệnh
phân trắng.
ª Dựa theo kết quả mô học để xác định có sự hiện diện mầm bệnh vi khuẩn
trong mẫu tôm.
ª Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa và sơ đồ phân loại gia phả
thể hiện quan hệ của các dòng vi khuẩn
ª Lập kháng sinh đồ để xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn.
ª Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh lên vi khuẩn.
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Vật liệu
3.2.1.1 Vật liệu trong phòng thí nghiệm
-

Bộ tiểu phẫu: dao, kéo, pen,...
Que cấy, đèn cồn, bình xịt cồn, găng tay.

-

Đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, kim tiêm. Cồn 70 ˚, cồn 96˚.
Chai nấu môi trường, bình tam giác, cá từ…
Tủ ấm, tủ sấy, nồi autoclave, bếp nấu môi trường…

3.2.1.2 Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

-

Trypticase soya agar (TSA)
Thiosulphate citrate bilesalt sucrose agar (TCBS).
Nutrient broth (NB)
NaCl

3.2.1.3 Môi trường, hoá chất và thuốc thử để kiểm tra đặc điểm sinh hoá
-

Các môi trường, hóa chất và thuốc thử dùng để thực hiện các phản ứng
sinh hóa được trình bày ở phần phụ lục.
- Các loại kháng sinh được dùng để lập kháng sinh đồ gồm có: Ampicillin
(AMP10μg); chloramphenicol (C30μg); nitrofurantoin (F300μg);
norfloxacin (NOR10μg); tetracycline (TE30μg); streptopmycin (S25μg).
13


- Kháng sinh dùng xác định nồng độ ức chế tối thiểu là chloramphenicol.
3.2.2 Vi khuẩn dùng cho phân tích
Vi khuẩn phân lập từ ao nuôi bệnh phân trắng của hai tỉnh Bến Tre và Sóc
Trăng.
- Tổng só mẫu phân tích: 132 mẫu
- Tổng số chủng tham khảo và chủng chuẩn: 27 chủng
Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập
Stt
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34

35
36
37

Mã số

Nguồn gốc phân lập

P104
P1010
P203-N
P203- Đ
P209
P301-K
P301- Đ
P307
P509
P5011
P102
P204
P402
P406
P408
P502
P504
P603
P604
V. alginolyticus ATCC 33838 T
V. carchariae ATCC 43516 T
V. harveyi ATCC 33866 T

V. cholerae
V. mimicus ATCC 33653 T
V. hollisae NCTC 11640 T
V. ichthyoenteri HWU P 8603
V. natriegens ATCC 33898 T
V. navarrensis CIP 103193 T
V. nigripulchritudo LMG 3896 T
V. ordalii ATCC 33509 T
V. Pel I
V. Pel II
V. penaeicida
V. angiullarum
V. furnissii
V. fluvialis
V. splendidus biovar I NCIMB 1 T

Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon

Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
Penaeus monodon
người
nước
Oncorhynchus kisutch
cá

14

Địa điểm thu
mẫu
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Bến Tre
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng

Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng


38
39
40
41
42
43
44
45
46

V. splendidus biovar II NCIMB 2251 T
V. tubiahii NCIMB 1340 T
V. harveyi S65
V. harveyi S75
V. harveyi S80
V. harveyi S84
V. harveyi S87
V. harveyi S88
V. harveyi S91

nước
ấu trùng nhuyễn thể
Penaeus monodon/Postlarvae
Pangasius bocourti/ lá lách
Penaeus monodon/Postlarvae

Penaeus monodon/Postlarvae
Penaeus monodon/Postlarvae
Pangasius bocourti/ thận
Pangasius bocourti/ lá lách

ATCC: American Type Culture Collection; T: Type strain; NCIMB: National Collection of Industrial
and Marine Bacteria, Aberdeen, UK; AAHRI: Aquatic Animal Health Research Institute, Bangkok,
Thailand; HWU: Heriot-Watt University, Edinburgh, UK; NTCC: National Type Culture Collection,
Colindale, UK; LMG: Laboratorium voor Microbiologie, Rijksuniversiteit Gent, Belgium; CIP:
Collection of the Pasteur Institute, Paris, France; Vietnamese strains (Oanh et al. 2002).

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Phương pháp thu mẫu, phân tích và trữ mẫu tôm
3.3.1.1 Thu mẫu
Tôm khỏe thu khoảng 2-3 con/ao, đối với tôm biểu hiện bệnh lờ đờ, sắp chết
thì thu từ 15-20 con/ao. Sau đó cho vào thùng trữ mẫu có sục khí oxy và vận
chuyển nhanh về phòng thí nghiệm lập tức tiến hành phân tích ngay mà chỉ
phân tích mẫu tôm còn sống và tối thiểu 10 con/ao.
3.3.1.2 Phân tích mẫu
Dùng ống tiêm 1ml lấy huyết tương từ chân ngực thứ 5 sau đó nhỏ 1 giọt vào
đĩa môi trường TSA +1,5% NaCl và dùng que cấy để cấy mẫu. Sau khi cấy
xong cho đĩa petri mẫu vào tủ ấm 28˚C, sau 16-24h quan sát. Nếu có vi khuẩn
phát triển trên đường cấy thì chọn 1 khuẩn lạc đặc trưng để tách ròng (nếu
trong đĩa có vài khuẩn lạc khác nhau về kích cỡ thì chọn tách ròng sang nhiều
đĩa).
3.3.1.3 Trữ mẫu
Khi việc tách ròng đã thuần thì trữ mẫu tiến hành như sau: chọn 1 khuẩn lạc từ
đĩa TSA + 1,5% NaCl nuôi tăng sinh trong dung dịch NB + 1.5% NaCl ở 280C
trong 24h, sau đó cho 0.9 ml dung dịch vi khuẩn và 0.9 ml glycerol 50% vào
ống eppendoft có dung tích 2 ml, lắc đều và trữ ở điều kiện -800C. Tổng số

mẫu trữ hai địa điểm thu: 132 mẫu.
3.3.2 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa (kiểm tra các chỉ
tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá của vi khuẩn)
15


Hình dạng, kích thước, tính ròng và các đặc điểm sinh lý sinh hóa của vi
khuẩn được xác định bằng phương pháp của Barrow & Feltham (1993).
Riêng đối với nhóm Vibrio định danh qua sơ đồ gia phả. Kiểm tra qua 39 chỉ
tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hoá được mã hoá bằng số 0 tương ứng với kết
quả âm tính và số 1 tương ứng với kết quả dương tính. Số liệu sau đó sử dụng
mức độ giống nhau giữa các chủng vi khuẩn phân lập và biểu hiện bằng sơ đồ
gia phả qua chương trình phân tích cụm (Priest & Austin, 1993). Sử dụng phần
mềm Statistica. Mức độ giống nhau giữa các chủng vi khuẩn được xác định
bằng khoảng cách Euclid-UPGMA.
3.3.3 Lập kháng sinh đồ
Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn được xác định theo phương pháp của
Huys và ctv (2005). Vi khuẩn sau khi phục hồi trên môi trường TSA +1.5%
NaCl, kiểm tra tính thuần. Sau 24h nuôi cấy, dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít
khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch 0,85% NaCl đã tiệt trùng
để tạo dung dịch có độ đục tương ứng với độ đục dung dịch chuẩn 1.0
MeFarland. Sau đó lấy 100ml dung dịch vi khuẩn tán đều trên môi trường
TSA +1,5% NaCl. Sau 1 phút dùng 6 loại kháng sinh gồm ampicillin (AMP
10μg), chloramphenicol (C 30μg), nitrofurantoin (F 300μg), norfloxacin (NOR
μg10), tetracycline (TE 30μg), streptomycin (S 30μg) đặt lên mặt thạch và ủ
280C trong 24h. Đường kính vòng vô trùng được tính bằng mm. Đường kính
vòng vô trùng đó phân thành 3 loại là kháng, trung bình nhạy và nhạy. Dùng
phần mềm Excel để tính số liệu và vẽ đồ thị thể hiện phần trăm các loại kháng
với thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn. Dựa theo bảng 3.2 để xác định
tính nhạy hay kháng.

Bảng 3.2: Mức giới hạn xác định mức độ kháng, trung bình nhạy và nhạy của 6 loại kháng sinh
Kháng sinh
Ampicillin (AMP 10)
Chloramphenicol (30),
Nitrofurantoin (F300)
Norfloxacin (NOR 100)
Tetracycline (TE30)
Streptpmycin (S25)

Kháng
(mm)

Trung bình nhạy
(mm)

Nhạy
(mm)

<=11
<=12
<=14
<12
<14
<=10

12-13
13-17
15-16
13-16
15-18

13-20

>=14
>=18
>=17
>17
>19
>=21

3.3.4 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc lên
vi khuẩn
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp của Huys (2002).
16


3.3.4.1 Nuôi vi khuẩn và pha thuốc kháng sinh
Vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ủ 280C trong 24h. Kiểm tra hình
dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm gram kiểm tra tính thuần.
Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa TSA nuôi trong ống nghiệm chứa 10 ml
NB, ủ 280C trong 24h. Pha hai ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50ml. Ống thứ
nhất có hàm lượng thuốc 1024 ppm, ống thứ hai là 256 ppm. Chloramphenicol
pha trong 3 ml dung môi ethanol 95% sau đó cho thêm nước muối sinh lý cho
đủ 50 ml. Bảng 3.3
Bảng 3. 3: Thao tác pha loãng thuốc kháng sinh
Ống
nghiệm

Nồng độ cần đạt
được
(ppm)

Thể tích dung dịch chloramphenicol
(ml)

Thể tích nước
muối sinh lý
(ml)

1
2
3
4
5
6
7
8
9

1024 ppm
512 ppm
256 ppm
128 ppm
64 ppm
32 ppm
16 ppm
8 ppm
4 ppm

25ml (dd thuốc gốc 1)
25 ml (1024 ppm)

25 ml (512 ppm)
25 ml (256ppm) (dung dịch thuốc gốc 2)
25 ml (128 ppm)
25 ml (64 ppm)
25 ml (32 ppm)
25 ml (16 ppm)
25 ml (8 ppm)

25 ml
25 ml
25 ml
25 ml
25 ml
25 ml
25 ml
25 ml

3.3.4.2 Đo mật độ vi khuẩn
Đo mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 590 nm. Đều
chỉnh mật độ vi khuẩn bằng môi trường NB để đạt 0D = 0.1 ± 0.02. Sau đó
cho 2 ml vi khuẩn đã điều chỉnh mật độ vào mỗi ống nghiệm có 2 ml kháng
sinh có hàm lượng thuốc từ 4-1024 ppm. Hai ống đối chứng gồm: đối chứng
dương (2 ml vi khuẩn + 2 ml nước cất) và ống đối chứng âm (2 ml NB + 2 ml
nước cất). Tất cả các ống nghiệm ủ trong 24h ở 280C. Mỗi chủng vi khuẩn sau
khi điều chỉnh mật độ thì cấy lên môi trường TSA để kiểm tra tính thuần
chủng của chúng và ủ chung với các ống MIC.
3.3.4.3 Đọc kết quả
Kiểm tra tính thuần trên đĩa TSA. Nếu đĩa không thuần thì không đọc kết quả.
Sự phát triển của vi khuẩn được xác định bằng cách so sánh độ đục của mỗi
ống MIC với ống đối chứng dương và âm. Loạt ống nghiệm nào phát triển

không liên tục thì phải bị loại. Giá trị MIC được xác định là hàm lượng thuốc
trong ống nghiệm mà không có vi khuẩn phát triển. Trong trường hợp các ống
17