Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi
sinh vật
Vietsciences- Dương Văn Hợp, Nguyễn Lân Dũng 03/03/2007

Những bài cùng tác giả

1. Phiếu thông tin về chủng vi sinh vật bảo quản:

Đại học Quốc gia Hà Nội
Trung tâm Công nghệ Sinh học
Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC)
Thông tin chung về
chủng vi sinh vật bảo quản

1. Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn
2. Tên khoa học:
Giống (Genus) Loài (Species) Dưới loài (Subspecies)
Tên khác nếu có (synnonym):
3. Nguồn phân lập:
Nơi phân lập:
4. Thời gian bắt đầu bảo quản tại VTCC:
5. Người phân lập:
6. Người cung cấp: Nơi cung cấp:
7. Ký hiệu chủng VTCC:
8. Ký hiệu là lý lịch chủng từ các bảo tàng khác:
VTCC < < < < <
9. Chủng chuẩn (Type) Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…)
10. Hình thức sinh sản:
11. Gây bệnh cho: Người Động vật Thực vật Không
12. Dấu chuẩn di truyền (nếu có):
13. Hình thái tế bào, khuẩn lạc:

14. Khả năng ứng dụng:
15. Tài liệu liên quan:
16. Các phương pháp bảo quản:
Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền
17. Môi trường nuôi cấy thích hợp:
18. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp:
19. Ghi chú:
2. Chức năng của bộ sưu tập vi sinh vật:
Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng
liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường.
Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng vi sinh vật
hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật có thể bằng nhiều
cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các chủng vi sinh vật phải được
định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có
hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật.
Bảo quản các chủng vi sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích của bảo quản không
những là duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo tính ổn định di
truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản. Thực tế không có một phương pháp bảo quản
nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh vật chỉ thích hợp với một vài
phương pháp bảo quản nhất định.
Các chủng vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó nhiệm vụ quan trọng của bộ
sưu tập vi sinh vật là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo quản cho người
sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v..Như
vậy yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững về vi sinh vật, di truyền
học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học vi sinh vật để kiểm soát được các đặc tính quan trọng của các
vi sinh vật bảo quản.
3. Một số điểm lưu ý đối với một Bộ sưu tập vi sinh vật:
3.1. Duy trì khả năng sống của vi sinh vật bảo quản:
Trong khi thực hiện các phương pháp bảo quản và trong quá trình bảo quản các tế bào vi sinh vật sẽ bị
chết do đó phải áp dụng phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp nhất khả năng chết của tế bào.

3.2. Quan tâm đến số lượng tế bào khi tiến hành bảo
quản:
Trong quá trình bảo quản thì số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian do vậy cần tính toán số
lượng vi sinh vật tại thời điểm bảo quản thích hợp để duy trì số lượng vi sinh vật sống trong thời gian bảo quản
dài.
3.3. Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vi sinh
vật bảo quản:
Nói chung với các chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với các chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng vi sinh
vật có ứng dụng trong công nghiệp thì yêu cầu duy trì đặc tính sinh học, tính trạng di truyền là rất quan trọng.
Các phương pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột biến hoặc mất plasmid. Vì vậy cần phải chọn
các phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng này.
3.4. Tính thuần chủng của vi sinh vật bảo quản:
Chủng vi sinh vật từ khi bảo quản đến khi sử dụng phải đảm bảo thuần chủng đúng theo tên và các đặc
điểm sinh học đặc trưng. Đây cũng là yêu cầu tiên quyết đối với công việc của một Bảo tàng vi sinh vật, do
vậy mà các thao tác và phương pháp tiến hành phải được thực hiện sao cho hạn chế tới mức tối thiểu đối với
các chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm.
3.5. Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật:
Kinh phí bao gồm kinh phí về lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng và điện nước tiêu
hao. Các kinh phí này tuỳ thuộc vào quy mô của Bộ sưu tập giống vi sinh vật và phương pháp bảo quản, phạm
vi dịch vụ thực hiện đối với khách hàng.
Tên Bảo tàng vi
sinh vật (viết tắt)
Nước
Số lượng chủng vi sinh vật
ATCC Mỹ 73507
DSMZ Đức 14460
NBRC Nhật 18300
Bảng 1. Quy mô của một số bộ sưu tập giống vi sinh vật.

STT Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước Giá thành (USD)

1 ATCC, Mỹ 80
2 CBS, Hà Lan 60
3 VKM, Nga 45
4 Thái Lan 40
Bảng 2. Giá thành cho bảo quản mỗi chủng vi sinh vật hàng năm

3.6. Bảo quản các chủng có giá trị:
Đối với các chủng vi sinh vật có giá trị thì tuỳ theo yêu cầu mà cần thực hiện nhiều phương pháp khác
nhau cũng như bảo quản tại các nơi khác nhau để hạn chế khả năng mất các đặc tính quý cũng như mất chủng
do những rủi ro ngẫu nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v..).
3.7. Cung cấp chủng giống cho khách hàng:
Đối với các chủng cần cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc các chủng cần cho nghiên cứu thường
xuyên) thì cần phải bảo quản với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc vận chuyển đến khách
hàng.
3.8. Cung cấp các thông tin liên quan đến chủng bảo quản:
Chất lượng của Bộ sưu tập giống liên quan đến các số liệu, thông tin về từng chủng vi sinh vật bảo quản.
Do đó, nhu cầu nghiên cứu để thu nhận các thông tin cần thiết cung cấp cho khách hàng là rất quan trọng.
3.9. Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản:
Các chủng của Bộ sưu tập vi sinh vật cần phải tuân theo các qui định nghiêm ngặt kiểm tra định kỳ theo
từng thời gian bảo quản như tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính di truyền như dấu chuẩn di truyền,
sự tồn tại của plasmid, đặc điểm phân loại, khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học…Một trong các cách
đánh giá khả năng sống sót của chủng vi sinh vật bảo quản là dựa theo phương trình sau:
t = 8Log(So/Log So-Log Sac)
Trong đó: t - Thời gian của mẫu bảo quản trong ampoule.
So - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi bảo quản.
Sac - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi tiến hành thí nghiệm.
3.10. Cơ sở dữ liệu của Bộ sưu tập vi sinh vật:
Ngày nay, khi tin học là lĩnh vực xâm nhập và làm thay đổi sâu sắc đến mọi lĩnh vực đời sống thì việc
quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật không còn là một ngoại lệ. Người ta đã ứng dụng các phần mềm máy tính phù
hợp để quản lý các chủng vi sinh vật bảo quản, các thông tin liên quan cũng như chương trình kiểm tra chất

lượng định kỳ. Sử dụng tin học là công việc có tiện ích lớn, nó giúp cho người quản lý nắm bắt được toàn bộ
thông tin cũng như lý lịch của các chủng vi sinh vật và dễ dàng tra cứu, làm báo cáo khoa học theo các tiêu chí
riêng. Nói chung với các bộ sưu tập có số lượng vi sinh vật không lớn thì có thể sử dụng phần mềm: Microsoft
Access, Access Visual Basic.
4. Giới thiệu chung về một số phương pháp bảo quản vi
sinh vật:
Trong phần này chúng tôi mô tả các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh vật chính
(vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo).
4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:

Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch
Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch
thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát
triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp. Quá trình này
được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới
trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như:
Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách này. Cho dù phương pháp này là phương pháp
khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng
đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:
- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.
- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.
- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.
- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.
- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.
- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi
lần cấy truyền.
* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:
Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng
vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:
a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5

năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel
là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi.
b. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau
đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản
được lượng mẫu lớn.
c. Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù
chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa
petri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm.
Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau.
Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà
các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn
ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau.
4.2. Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp
đông khô trực tiếp:
a. Phương pháp đông khô:
Hình 2. Đông khô vi sinh vật.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi
sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị
đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi
trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi
sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng
dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.
b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-
drying):