CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CHUỐI GIÀ (musaspp )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ PHƯƠNG THƯ

CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CHUỐI GIÀ (Musa spp.)

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CHUỐI GIÀ (Musa spp.)

Giảng viên hướng dẫn:
TS. Lê Văn Bé

2010
TRƯỜNGCần
ĐẠIThơ,
HỌC C
ẦN THƠ

Sinh viên thực hiện:
Lê Phương Thư
MSSV: 3073104
Lớp: Trồng Trọt K33


KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG
Chứng nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài “CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG

CHUỐI GIÀ (Musa spp.)”. Do sinh viên LÊ PHƯƠNG THƯ thực hiện và đề nạp.
Kính trình Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng năm 2011.

TS. Lê Văn Bé


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC CÂY TRỒNG
Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài: “CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CHUỐI GIÀ LÙN (Musa spp.)”, do sinh viên LÊ PHƯƠNG THƯ thực hiện và bảo vệ
trước Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:…………………………..
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:…………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………

Duyệt Khoa
Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày…..tháng năm 2011.
Chủ tịch Hội đồng


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, các số liệu, các
kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.
Tác giả luận văn
Lê Phương Thư


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
Họ tên: Lê Phương Thư.
Ngày sinh: 23/11/1989.
Nơi sinh: Tp Cần Thơ.
Họ tên cha: Lê Quốc Thắng.
Họ tên mẹ: Tô Thị Đẹp.
Địa chỉ liên lạc: 36/2 Trần Việt Châu, P. An Hòa, Q. Ninh Kiều, Tp. Cần Thơ.
Quá trình học tập:
-

1995-2000: Trường tiểu học Lê Quý Đôn, Tp. Cần Thơ.

-

2000-2004: Trường trung học cơ sở Đoàn Thị Điểm, Tp. Cần Thơ.

-

2004-2007: Trường trung học phổ thông Bùi Hữu Nghĩa, Tp. Cần Thơ.

-

2007-2010: Trường Đại học Cần Thơ, ngành Trồng trọt, khóa 33, Khoa
Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng.
Cần Thơ, ngày…tháng… năm 2011

Lê Phương Thư


LỜI CẢM ƠN
Xin kính dâng lên cha mẹ và gia đình tôi!
Xin tỏ lòng tri ân sâu sắc!
Thầy Lê Văn Bé đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu trong suốt
quá trình thực hiện đề tài, người đã chỉ cho tôi cách mở khóa đến với thành công.
Cô Lê Thị Điểu, anh Nguyễn Văn Kha, đã trực tiếp chỉ dẫn, luôn động viên và
truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong thời gian qua.
Thầy cố vấn học tập Trần Văn Hâu đã quan tâm dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt 4
năm đại học.
Quý Thầy, Cô Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng
đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt khóa học.

Chân thành cảm ơn!

Chị Đặng Thúy Kiều, tập thể lớp Trồng trọt K33 B, Nhân, Thơ, Thuấn đã nhiệt tình
giúp đỡ, luôn gắn bó, động viên, chia sẻ những khó khăn cũng như vui, buồn trong suốt
quá trình học tập và làm luận văn.
Thân gửi đến thầy cô, anh chị và tất cả các bạn những lời chúc tốt đẹp và thành công
trong tương lai!
LÊ PHƯƠNG THƯ


LÊ PHƯƠNG THƯ. 2011. “CẢI TIẾN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG
CHUỐI GIÀ (Musa spp.)”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Trồng Trọt. Khoa
Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng-Đại học Cần Thơ. 41 trang. Người hướng dẫn
khoa học: TS. LÊ VĂN BÉ

TÓM LƯỢC
Hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ được thực hiện ở điều kiện môi trường nuôi
cấy trong phòng tăng trưởng có nhiệt độ 24 – 20C, cường độ chiếu sáng trung bình
từ 1.000 – 2.000 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày và ngoài phòng tăng trưởng
(lồng kính) có 31 – 3oC, cường độ ánh sáng trung bình từ 6.000 – 8.000 lux.
Vào giai đoạn nhân chồi, kết quả cho thấy từ một chồi ban đầu cấy vào môi
trường nền MS (Murashige and Skoog, 1962), bổ sung 20% nước dừa và 1-4
mgBA/lít đều làm gia tăng số chồi như nhau (từ 4,8 – 5,4 chồi) so với đối chứng là
2,8 chồi, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Các chỉ tiêu khác như, chiều cao
chồi, trọng lượng tươi gia tăng, hàm lượng diệp lục tố cũng không khác biệt nhau.
Giai đoạn nhân chồi thực hiện trong phòng tăng trưởng hay ngoài phòng tăng
trưởng (lồng kính) cũng cho kết quả như nhau.
Vào giai đoạn ra rễ, kết quả cho thấy môi trường nền MS bổ sung 20% nước
dừa, và 1 – 2 mgNAA/lít cho số rễ nhiều nhất (13 – 17 rễ/chồi) so với đối chứng là
6 rễ/chồi. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Giai đoạn này tiến hành trong
phòng tăng trưởng hay ngoài phòng tăng trưởng (lồng kính) cũng không có sự khác
biệt.

Tỷ lệ sống khi ra ngoài vườn ươm là rất cao (100%). Sản xuất cây chuối cấy
mô theo quy trình sử dụng điều kiện ngoài phòng tăng trưởng (lồng kính) thay cho
phòng tăng trưởng thì chi phí sản xuất giảm 23% do giảm chi phí điện.


MỤC LỤC

TÓM LƯỢC
MỤC LỤC
DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT..................................................................................... i
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ ii
DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. iii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................... 3
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY CHUỐI .................................................. 3
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố........................................................................... 3
1.1.2 Đặc tính thực vật của cây chuối ................................................................. 3
1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT................................................... 4
1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam ............................................. 4
1.2.2 Các giai đoạn của vi nhân giống ................................................................ 5
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới vi nhân giống ..................................................... 7
1.2.3.1 Môi trường ........................................................................................ 7
1.2.3.2 Ánh sáng ......................................................................................... 10
1.2.3.3 Nhiệt độ........................................................................................... 12
1.2.4 Ưu khuyết điểm của vi nhân giống........................................................... 12
1.2.4.1 Ưu điểm .......................................................................................... 12
1.2.4.2 Khuyết điểm .................................................................................... 12
1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI NHÂN GIỐNG CHUỐI.............................. 13
1.4 GIẢM GIÁ THÀNH TRONG VI NHÂN GIỐNG.......................................... 13
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 16

2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ..................................................................... 16
2.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................. 16
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................. 16
2.1.3 Thiết bị và hóa chất.................................................................................. 16
2.1.4 Điều kiện thí nghiệm................................................................................ 16
2.2 PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................ 17
2.2.1 Giai đoạn tạo chồi ban đầu....................................................................... 17
2.2.2 Giai đoạn bố trí thí nghiệm ...................................................................... 18


2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại
cảnh đến sự nhân chồi chuối già lùn ........................................................... 18
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và môi trường ngoại
cảnh nuôi cấy lên sự ra rễ in vitro của chồi chuối già lùn ........................... 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN................................................................... 22
3.1 GHI NHẬN TỔNG QUÁT............................................................................. 22
3.2 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA VÀ MÔI TRƯỜNG
NGOẠI CẢNH ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI CHUỐI GIÀ LÙN ................................ 22
3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến số chồi ......... 21
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến sự gia tăng
chiều cao chồi................................................................................................... 26
3.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến sự gia tăng
trọng lượng tươi chồi ........................................................................................ 27
3.2.4 Hàm lượng diệp lục tố ............................................................................. 28
3.3 THÍ NGHIỆM 2: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ NAA VÀ MÔI TRƯỜNG
NGOẠI CẢNH LÊN SỰ RA RỄ IN VITRO CỦA CHỒI CHUỐI GIÀ LÙN ....... 30
3.4 ƯỚC TÍNH CHI PHÍ SẢN XUẤT CHỒI CHUỐI CẤY MÔ ......................... 36
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................. 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

ANOVA

Analysis of variance

BA

6 – Benzyl adenine

cm

centimeter

ha

hecta

HgCl2

Clorua thủy ngân

IAA

indole acetic acid

in vitro

trong ống nghiệm

MS

môi trường Murashige & Skoog (1962)

NAA

α-naphthalene acetic acid

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long


DANH SÁCH BẢNG

Bảng
3.1

Tên bảng

Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến số chồi
chuối 6 tuần sau khi cấy

3.2

26

Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến trọng

lượng tươi gia tăng của chồi chuối 6 tuần sau khi cấy

3.5

25

Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến chiều
cao chồi chuối 6 tuần sau khi cấy

3.4

23

Sự tương tác giữa nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh lên số chồi
chuối

3.3

Trang

28

Ảnh hưởng của nồng độ BA và môi trường ngoại cảnh đến hàm
lượng diệp lục tố a, b, carotenoid (µg/g lá tươi) của chồi chuối 6

29

tuần sau khi cấy.
3.6

Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện ngoại cảnh đến số rễ và
chiều dài rễ của chồi chuối ở 6 tuần sau khi cấy

3.7

3.8

31

Ảnh hưởng của nồng độ NAA và môi trường ngoại cảnh đến chiều
cao và số lá của chồi chuối ở 6 tuần sau khi cấy

31

Ước tính giá thành sản xuất một chồi chuối cấy mô

39
40


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

2.1

Lồng kính đặt trong nhà lưới để vi nhân chồi

3.1
3.2

Chồi chuối sau khi cấy và sự nhân chồi 6 tuần sau khi cấy
Chồi chuối cấy mô nghiệm thức bổ sung 2 mgBA/lít 6 tuần sau khi
cấy

3.3

Chồi chuối trong giai đoạn ra rễ và sự ra rễ 6 tuần sau khi cấy

34

3.4

Chồi chuối ngoài vườn ươm sau 4 tuần

35

3
24
27


MỞ ĐẦU

Chuối (Musa spp.) là một trong những loại cây ăn quả quan trọng của vùng
nhiệt đới. Ước tính hiện nay trên thế giới có khoảng 200 giống chuối đang được

trồng ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Á và châu Phi. Năm 1987, tại Đông Nam Á
thì: Philippines có 330.500 ha chuối, Malaysia có 27.700 ha (Verheij và Coronel,
1992 được trích dẫn bởi Đỗ Huy Bích và ctv, 2003). Vào năm 1991 tổng diện tích
trồng chuối của Châu Mỹ là 244.000 ha, cụ thể: Ecuador có 105.000 ha, Colombia
có 40.000 ha…(Arias, 1993).
Tại Việt Nam năm 1998 thì tổng số diện tích trồng chuối của cả nước nói
chung là 96.132 ha và của ĐBSCL nói riêng là 34.884 ha (Ho Huu Nhi, 2001). Vì
thế, việc cung cấp số lượng lớn và đồng đều nguồn giống cho sản xuất gặp khó
khăn vì cây giống tạo ra bằng phương pháp nhân giống vô tính truyền thống có kích
thước không đồng đều, không đáp ứng được số lượng lớn. Đồng thời, sau thời gian
nhân giống cây dễ bị thoái hóa, tích lũy mầm bệnh làm cho năng suất, phẩm chất
giảm. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, chuối Philippines có hình dạng bên
ngoài đẹp nên người tiêu dùng sẵn sàng mua giá cao và quay lưng với chuối sản
xuất trong nước. Vì thế cần áp dụng một phương pháp nhân giống khác có thể khắc
phục những nhược điểm trên.
Để nâng cao chất lượng trái chuối thì việc sử dụng cây chuối cấy mô vào sản
xuất là một trong những cách giải quyết. Ưu điểm của cây chuối cấy mô là sức sống
khỏe, độ đồng đều cao. Khuyết điểm lớn nhất là giá thành quá cao. Hiện nay, cây
chuối cấy mô đủ tiêu chuẩn đem trồng ngoài đồng khoảng 8.000 đồng/cây. Nếu
trồng chuối cấy mô phải đầu tư khoảng 32 triệu đồng/ha tiền giống (4000 cây/ ha),
đây là một số tiền đầu tư quá lớn cho người nông dân (báo Nông Nghiệp Vĩnh
Long, 05/2009).
Để làm giảm giá thành cây chuối cấy mô có nhiều cách như: để bình nuôi
cấy trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng tự nhiên để tiết kiệm điện năng (Nguyễn
Thị Quỳnh và ctv 2006, 2007, Vũ Ngọc Phượng và ctv, 2007). Hoặc nuôi cây chuối
-1-


giống cấy mô ở giai đoạn cuối (trước khi ra nhà lưới) trong điều kiện ánh sáng và
nhiệt độ tự nhiên (Vũ Ngọc Phượng và ctv, 2007).

Vì vậy, đề tài “Cải tiến quy trình vi nhân giống cây chuối già (Musa spp.)”
được thực hiện nhằm mục tiêu tìm ra quy trình mới để sản xuất cây chuối cấy mô
bằng cách sử dụng ánh sáng, nhiệt độ tự nhiên (trong lồng kính) thay cho phòng
tăng trưởng để tiết kiệm chi phí điện nhằm mục đích làm giảm chi phí sản xuất.
.

-2-


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY CHUỐI
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố.
Cây chuối có tên khoa học là Musa spp., thuộc họ Chuối (Musaceae). Cây
chuối có nguồn gốc ở các vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Đại Dương. Hiện nay, ở
các nước thuộc Nam Á và Đông Nam Á, Tân Ghinê và các vùng đảo Châu Đại
Dương vẫn còn gặp các loài chuối mọc hoang phân bố trong các rừng ẩm. Chuối đã
được trồng ở Ấn Độ khoảng 1.000 năm trước công nguyên, sau đó mới lan sang
Trung Quốc và các nước Đông Nam Á. Đến thế kỷ XVI, chuối mới được đưa sang
Châu Mỹ và từ đó nó trở thành cây trồng của toàn thế giới (Nguyễn Phi Hạnh và
Đặng Ngọc Lân,1980).
1.1.2. Đặc tính thực vật của cây chuối
Rễ: chuối thuộc ngành một lá mầm, thân thảo. Rễ chuối phát sinh từ tử trục
trung tâm của củ chuối. Rễ chùm, đường kính từ 5 – 10 mm có thể ăn sâu 60-70 cm
và đường kính phát triển có thể tới 4 – 5 m (Võ Thành Thuận, 2000).
Thân: chuối là loại thân ngầm (thân thật mà ta quen gọi là củ chuối). Củ
chuối khi phát triển đầy đủ có thể rộng đến 30cm, phần bên ngoài xung quanh củ
chuối được bao phủ bởi những sẹo từ bẹ lá có dạng tròn. Mỗi bẹ lá có một chồi
mầm nhưng chỉ có các chồi từ giữa củ trở lên mới phát triển được thành cây con và
có khuynh hướng mọc chồi dần lên (Nguyễn Danh Vàn, 2009).

Thân giả: bẹ của những lá chuối ốp chặt lại với nhau tạo thành thân giả.
Thân giả cao từ 2 – 3 mét, toàn bộ cây chuối cao khoảng 3 – 5 m, có khi thân giả
cao tới 8 m, toàn bộ cây cao tới 10 m (giống chuối sáp) (Nguyễn Danh Vàn, 2009).
Lá: lá chuối bao gồm: bẹ lá, phiến lá, cuốn lá. Lá chuối có kích thước lớn.
Phiến lá to có thể rộng tới 60 – 65 cm, dài 1 – 1,5 m chưa kể cuống (Phạm Văn
Duệ, 2005).
Các loại lá trên cây gồm có:

-3-


+ Lá vảy: mọc trên chồi lúc còn nhỏ, chỉ có bẹ và gân lá.
+ Lá mác: lá có bẹ với phiến lá rất nhỏ, hình lưỡi mác.
+ Lá mo (lá bắc): mọc trên phát hoa và trên buồng hoa (bắp chuối).
+ Lá cờ: chỉ có một lá cờ, xuất hiện báo hiệu cây sắp trổ hoa. Phiến lá to,
ngắn, cuống lá rất rộng.
+ Lá bàng: là loại lá chính của cây, cấu tạo gồm bẹ lá, cuống lá, phiến lá với
gân chính và các gân phụ.
+ Đọt xì gà: là giai đoạn phiến lá chưa nở ra, vẫn còn cuộn tròn lại.
Hoa: khi cây chuối trưởng thành (có từ 13 – 15 lá), điểm sinh trưởng của
chuối phân hóa thành phát hoa, rồi củ chuối từ chỗ bề rộng khoảng 30 cm nay hẹp
dần lại chỉ còn khoảng 5 – 8 cm tạo thành cuống chính của hoa nằm giữa thân giả,
vươn lên ngọn cây rồi chui ra khỏi thân giả mang theo một phát hoa. Hoa tập trung
ở đầu cuống hoa thành chùm (gọi là buồng, quầy), trong đó các hoa nhỏ xếp thành
từng hàng (gọi là nải). Mỗi hàng hoa có một đài chung. Hoa nhỏ là loại hoa lưỡng
tính, sau khi thụ phấn bầu nhị lớn dần lên thành trái. Những hoa ở cuối buồng
không có khả năng thụ phấn để cho trái gọi là hoa đực (Nguyễn Danh Vàn, 2009).
Trái: trái chuối hình ống, hai đầu nhỏ, thẳng hoặc hơi cong. Khi còn non vỏ
trái có màu xanh dính liền với ruột trái, chứa nhiều tinh bột. Khi chín vỏ chuyển dần
sang màu vàng, dễ tách rời khỏi ruột (Nguyễn Danh Vàn, 2009).

1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
1.2.1 Hiện trạng nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nghiên cứu trên 30
năm. Nhưng áp dụng trong thực tế sản xuất trong các lãnh vực vi nhân giống cây
hoa cảnh, cây nông nghiệp, cây lâm nghiệp và cây dược liệu trong khoảng 10 – 20
năm trở lại. Nhiều phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ
sinh học với các trang thiết bị hiện đại cũng được xây dựng ở các thành phố lớn như
Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh. Bên cạnh đó, có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi

-4-


cấy mô và tế bào thực vật cũng được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên
cứu, sở khoa học và công nghệ của các tỉnh, thành phố.
Ngoài ra, nhiều phòng thí nghiệm tư nhân cũng được xây dựng từ miền Bắc
đến miền Nam để phục vụ sản xuất. Thành phố Đà Lạt được thiên nhiên ưu đãi
nhiều về khí hậu nên có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tư nhân phục vụ
sản xuất (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)
1.2.2 Các giai đoạn của vi nhân giống
Vi nhân giống gồm 5 giai đoạn:
Giai đoạn 0: chọn cây mẹ và chuẩn bị
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) thì khi chọn cây mẹ
phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là
chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng. Cây mẹ phải được bón
phân và phun thuốc trừ sâu bệnh chu đáo.
Giai đoạn 1: nuôi cấy khởi động
Đây là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt
(Nguyễn Quang Thạch và ctv., 2005).
Trước hết mẫu thu phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút đến 2 giờ, sau đó

rửa mẫu bằng xà bông bột sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm trên những mẫu
cấy thu ngoài đồng. Mẫu sau khi được rửa sạch sẽ được ngâm trong dung dịch khử
trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử
dụng để khử trùng mẫu là hyphochlorite sodium 0,5 – 5,25%. Các dung dịch khác
cũng được sử dụng để khử trùng như: cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate
bạc, dung dịch bromine, clorua thủy ngân.
Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất hai lần vô
trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những
phần bị tổn thương phải được cắt bỏ đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích
thước thích hợp. Nếu bị nhiễm thì sẽ dễ đàng nhận ra sau 3 đến 5 ngày kể từ khi bắt
đầu nuôi cấy. Còn nếu như tình trạng nhiễm xuất hiện sau 10 ngày thì mẫu bị nhiễm
-5-


bên trong hoặc là do có kiến hay rận hiện diện trong phòng nuôi và làm lây lan
nguồn gây nhiễm (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Giai đoạn 2: Nhân nhanh
Đây là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi
vô tính.
Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp
để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ
kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi cấy thường là 25 – 27oC và 16 giờ chiếu sáng/ngày,
cường độ ánh sáng 2.000 – 4.000 lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi
cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần quang kỳ chiếu
sáng 9 giờ/ngày, nhân nhanh phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che
tối…(Nguyễn Quang Thạch và ctv., 2005).
Giai đoạn 3: tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Mục đích của giai đoạn này là chuẩn bị những cây con sẵn sàng cho sự
chuyển ra ngoài. Nó bao gồm việc ra rễ, phát triển cây con, cũng như tạo sự cứng

cỏi cho chúng thích ứng với những xáo trộn sau này (Lâm Ngọc Phương, 2009).
+ Giai đoạn 3a: kéo dài các chồi được hình thành ở giai đoạn 2 để đạt kích
thước thích hợp cho việc tạo rễ đầy đủ. Môi trường kéo dài thường không chứa
cytokinin hay một lượng cytokinin thấp hơn ở giai đoạn 2. Tùy thuộc vào kiểu cây
mà có thể kéo dài trên chồi đơn hay cụm chồi (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy
Tiên, 2002).
+ Giai đoạn 3b: kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ là chất điều hòa sinh trưởng thực vật,
khoáng đa lượng, vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất (chất làm đặc môi trường),
ánh sáng, nhiệt độ. Ít có loài thực vật nào có thể ra rễ trong môi trường nhân giống,
nguyên nhân là do cytokinin hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự hình
thành rễ, vì vậy cần có một môi trường chuyên biệt để cảm ứng sự tạo rễ.

-6-


Ở một số loài thực vật, để cảm ứng sự ra rễ nhất thiết phải chuyển chồi sang
môi trường hoàn toàn không có cytokinin. Tuy nhiên cũng có những loài sự ra rễ
nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin. Những loại auxin thường được bổ sung
vào môi trường để cảm ứng sự ra rễ là IAA (0,1 – 10 mg/l), NAA (0,05 – 1,0 mg/l)
và IBA (0,5 – 3,0 mg/l) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Giai đoạn 4: Thuần dưỡng cây con ngoài môi trường tự nhiên
Giai đoạn này tạo ra môi trường gần giống bên ngoài, giúp cây quen dần với
môi trường mới. Đây là giai đoạn cuối nhưng là một bước rất cần thiết trong các
quy trình vi nhân giống. Trong suốt tiến trình này cây con phải thích nghi với điều
kiện môi trường mới như ẩm độ tương đối thấp, cường độ ánh sáng cao, những biến
động về nhiệt độ và các tác nhân gây bệnh (Preece và Sutter, 1991). Chất lượng của
cây con trong giai đoạn in vitro là một trong những nhân tố quan trọng nhất quyết
định tỷ lệ thành công trong suốt quá trình chuyển ra ngoài nhà lưới (Huylenbroeck
và Debergh, 1996). Cây con phải được rửa sạch agar, sau đó trồng trên giá thể thích

hợp, được giữ ẩm độ cao, tránh ánh sáng cao. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi
này khoảng 2-3 tuần (George, 1993).
1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới vi nhân giống
1.2.3.1 Môi trường
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường
nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Môi trường bao gồm
các thành phần sau:
Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp, người ta sử dụng
nước cất hai lần hay nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)
Dinh dưỡng khoáng
Môi trường được sử dụng phổ biến là Murashige và Skoog (1962) (môi
trường MS), vì nó thích hợp với nhiều loại cây trồng. Nó được cho là môi trường có
-7-


hàm lượng muối cao so với các công thức môi trường khác (hàm lượng đạm,
potassium và một số vi lượng đặt biệt là boron và manganese) (Cohen, 1995).
Carbonhydrate
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp, hoặc nếu có
quang hợp cũng rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện
khác… Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất carbonhydrate vào thành phần môi
trường nuôi cấy. Loại carbonhydrate được sử dụng phổ biến là saccarose. Những
loại đường khác như: fructose, glucose, maltose, lactose, rafinose, sorbitol ... chỉ
dùng trong những trường hợp cá biệt. Hàm lượng đường thấp được sử dụng trong
nuôi cấy tế bào trần, ngược lại các hàm lượng đường cao hơn có thể dùng cho nuôi
cấy hạt phấn, phôi… (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế
bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự
phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy
mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)
Nước dừa
Nước dừa là nội nhũ lỏng cung cấp các chất dinh dưỡng nuôi phôi dừa.
Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường sử dụng nước từ quả bánh tẻ và quả
dừa già. Thành phần của nước dừa khá phong phú nhưng có chứa inositol và các
chất thuộc nhón cytokinin như zeatin… Các thành phần này có hàm lượng thay đổi,
khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau giữa những quả có cùng độ
tuổi. Vì vậy nước dừa cũng là một thành phần phức hợp không xác định. Hàm
lượng sử dụng của nước dừa: 10 – 20% (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Agar
Agar là một polysacarit làm từ rong biển. Agar được dùng để chuẩn bị môi
trường đặc. Agar tan ở 1000C và đông đặc ở 450C. Trong môi trường acid thì agar

-8-


không thể đông đặc. Nồng độ thường được dùng là 0,6 đến 0,7% tùy theo từng loại
agar (Nguyễn Đức Thành, 2000).
pH
pH của đa số môi trường nuôi cấy mô được điều chỉnh từ 5,5-6,0. pH dưới
5,5 thì agar khó chuyển qua trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 thì agar có thể rất
cứng. Sự bền vững và hấp thụ một loạt chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt
các chất như NAA, gibberrllin, vitamin rất mẫn cảm với pH. Sự hấp thụ các hợp
chất sắt cũng phụ thuộc vào giá trị pH (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Chất điều hòa sinh trưởng
Cytokinin

Cytokinin là nhóm phytohoocmon thứ ba được phát hiện sau auxin và
gibberellin. Nó có hiệu quả đặc trưng nhất đối với thực vậy là kích thích sự phân
chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của
thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi (Vũ Văn Vụ và ctv., 2005).
Hiệu quả của cytokinin được chú ý nhiều nhất là trong nuôi cấy mô thực vật.
Khi được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ
phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chồi
bên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Các cytokinin thường gặp là kinetin và 6 – Benzyl adenine (BA). Kinetin
được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết xuất axit nucleic. BA là cytokinin
tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hợn kinetin. Kinetin và BA cùng có tác
dụng kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh
và làm hạn chế sự hóa già của tế bào. Ngoài ra các chất này còn có tác dụng lên quá
trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường
hoạt tính của một số enzyme (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Một số nghi nhận trong các nghiên cứu nhân chồi in vitro cho rằng nếu tăng
nồng độ cytokinin sẽ nhận được nhiều chồi, tuy nhiên sẽ dẫn đến hiện tượng cây
sinh trưởng bất thường, lá nhỏ, cong queo, mất diệp lục tố, đặc biệt trong môi
trường lỏng; người ta gọi hiện tượng này là dư thừa nước (hyperhydricity) (Debergh
và Read, 1991). Để giảm bớt hiện tượng này phải giảm hàm lượng cytokinin trong

-9-


môi trường cấy hoặc kết hợp với nhóm auxin (George, 1993). Ngoài ra, trên một số
cây trồng lại cho thấy tỷ lệ nhân giống giảm khi tăng nồng độ cytokinin.
Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường
xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẻ với các thành phần
dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,

huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
Các auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indole acetic acid
(IAA). Năm 1937, Went và Thimann phát hiện ra NAA, chất này có tác dụng làm
tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh
đến trao đổi nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường.
NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. NAA có
vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Theo kết quả nghiên cứu của
Butenko vào năm 1964 cho thấy NAA cho tác dụng tạo rễ mạnh hơn các auxin khác
(Nguyễn Đức Thành, 2000).
1.2.3.2 Ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố môi trường quan trọng kiểm soát sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật, vì nó liên quan đến quang hợp, sự quang dưỡng và sự phát triển
hình thái (Salisbury và Ross, 1994; Read và Preece, 2003). Sự chiếu sáng có thể
quan trọng nhất vì nó liên quan rất nhiều đến quang hợp và hô hấp (Matthijs và ctv,
1993). Theo George (1993) các đặc tính của ánh sáng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
in vitro là: độ dài sóng, cường độ sáng và thời gian chiếu sáng hay chu kỳ sáng.
Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tạo chồi và tạo rễ
Theo Murashige (1974) thì chồi trong ống nghiệm phát triển ở cường độ
sáng khoảng 1.000 lux (14 – 15 µmol.m-2. s-1). Cây Limonium sinh trưởng trong
điều kiện quang tự dưỡng in viro kết hợp với cường độ chiếu sáng cao (200
µmol.m-2. s-1) cho nhiều lá, hàm lượng diệp lục tố, tỷ lệ quang hợp thuần và phần
trăm sống sót khi đem ra ngoài cao hơn những cây sinh trưởng trong điều kiện
chiếu sáng yếu (50 và 100 µmol.m-2.s-1). Cây Siningia có thể tạo chồi ở cường độ

- 10 -


sáng từ 3.000-10.000 lux (Haramaki, 1971), cây hoa kiểng nhiệt đới cũng tạo chồi
mạnh với điều kiện sáng từ 3.000 – 10.000 lux (Miller và Murashige, 1976). Tùy

theo loài mà yêu cầu cường độ sáng khác nhau trong giai đoạn nhân chồi. Cây
Gloxinia tạo chồi ở cường độ sáng khoảng 3.200 lux, nhưng khi tăng cường độ ánh
sáng lên 10.700 lux thì sự sinh trưởng của chồi bị giới hạn (Haramaki, 1971).
Ánh sáng cũng cần thiết cho sự ra rễ ở một số loài thực vật xác định. Nhu
cầu ánh sáng xảy ra ở một số loại thực vật để củng cố hàm lượng carbonhydrate nội
sinh khi sự tạo rễ xảy ra. Carbonhydrate có thể được cung cấp trực tiếp trong môi
trường nuôi cấy hoặc được cung cấp qua quá trình quang hợp của chồi (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên). Một số nghiên cứu khác thì cho rằng điều kiện
tối, thích hợp cho sự thành lập rễ (Hammerschlag, 1982). Áng sáng làm giảm sự ra
rễ là do sự suy giảm hàm lượng IAA nội sinh trong cây (George, 1993).
Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp
Ánh sáng là điều kiện cơ bản để tiến hành quang hợp. Cường độ ánh sáng và
cả thành phần quang phổ của nó đều ảnh hưởng đến hoạt động quang hợp của cây.
Đối với một số cây trồng, cường độ chiếu sáng tối thích như sau: các loại rau ăn lá,
ăn quả thì cường độ chiếu sáng trên 1.000lux, đậu Hà Lan: 1.100lux, đậu tương:
2.400lux, ngô: 1.400 – 8.000lux. Các đèn huỳnh quang (ánh sáng tương tự ánh sáng
ban ngày) là nguồn sáng nhân tạo rất tốt cho cây sinh trưởng và phát triển, cho năng
suất, chất lượng sản phẩm cao (Nguyễn Kim Thanh và Nguyễn Thuận Châu, 2005).
Diệp lục tố là sắc tố trong cây trồng rất cần cho quang hợp. Tất cả các hoạt
động của sắc tố được tìm thấy trong lục lạp. Điểm nổi bật nhất về cấu trúc lục lạp là
hệ thống mở rộng của các màng nội bào gọi là thylakoids. Tất cả các diệp lục tố
được chứa đựng trong hệ thống màng này, là vị trí của các phản ứng ánh sáng của
sự quang hợp. Các sắc tố hiện diện trên màng thylakoids của thực vật bậc cao chủ
yếu gồm có hai loại chlorophylls (chl) là chl a và chl b. Cũng có sắc tố từ màu vàng
tới cam của carotenoids, có hai loại là hydrocacbon tinh khiết carotenes và
xanthophylls có chứa oxygen. Ngoài ra còn có violaxanthin (là một xanthophyll)
cũng hiện diện trên vỏ lục lạp, làm cho nó có màu vàng ( Lê Văn Hòa và Nguyễn
Bảo Toàn, 2004).

- 11 -

1.2.3.3 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau lên tiến trình sinh lý như hô hấp và quang
hợp, và từ lâu người ta đã biết nó ảnh hưởng rất lớn đến nuôi cấy mô thực vật và vi
nhân giống (Altman, 2000; Read và Preece, 2003). Nhiệt độ kích thích sự ra rễ tốt
nhất là 25 ÷ 28oC (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nhiệt độ ảnh
hưởng đến quang hợp phụ thuộc vào các loài cây khác nhau, vào trạng thái sinh lý
của cây, thời gian tác dụng, giới hạn nhiệt độ tác động và các điều kiện khác. Nhiệt
độ không những làm thay đổi vận tốc của quá trình quang hợp mà còn gây ra những
biến đổi sâu sắc về quá trình trao đổi chất và hình thành các sản phẩm trong quang
hợp. Trong sản xuất, ta cần bố trí thời vụ thích hợp cho từng loại cây trồng theo nhu
cầu nhiệt độ của chúng đối với quang hợp, để chúng có hoạt động quang hợp tối ưu
và tích lũy cũng tối ưu (Nguyễn Kim Thanh và Nguyễn Thuận Châu, 2005).
1.2.4 Ưu khuyết điểm của vi nhân giống
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) thì vi nhân giống có những ưu và khuyết
điểm sau:
1.2.4.1 Ưu điểm
- Cây con tạo ra có đặc điểm di truyền giống cây mẹ.
- Nhân giống từ các mẫu cấy rất nhỏ.
- Tạo ra cây sạch bệnh.
- Tạo ra số lượng cây nhiều trong thời gian ngắn.
- Không lệ thuộc vào thời tiết hay mùa vụ.
- Mẫu vật có thể dự trữ lâu dài.
- Không đòi hỏi diện tích nhiều như duy trì cây gốc ngoài đồng ruộng.
- Không tốn chi phí lao động để chăm sóc cây mẹ.
1.2.4.2 Khuyết điểm
- Chi phí đầu tư ban đầu khá tốn kém.

- 12 -