TÁI SINH CHỒI từ mẫu lá cây HOA cúc (chrysanthemumsp ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

PHẠM LÊ TUẤN

TÁI SINH CHỒI TỪ MẪU LÁ CÂY HOA CÚC
(Chrysanthemum sp.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT KHÓA 28

Cần Thơ - 2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD
BỘ MÔN SINH LÝ – SINH HÓA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT

TÁI SINH CHỒI TỪ MẪU LÁ CÂY HOA CÚC
sp) BẰNG
PHƯƠNG
PHÁP
Trung tâm(Chrysanthemum
Học liệu ĐH Cần Thơ
@ Tài liệu
học tập và

nghiên cứu
NUÔI CẤY MÔ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. LÂM NGỌC PHƯƠNG

PHẠM LÊ TUẤN
LỚP TRỒNG TRỌT K28

Cần Thơ - 2007


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ- SINH HOÁ
---------

Luận văn Tốt nghiệp Kỹ sư Trồng Trọt với đề tài

“TÁI SINH CHỒI TỪ MẪU LÁ CÂY HOA CÚC (Chrysanthemum sp)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ ”

Do sinh viên Phạm Lê Tuấn thực hiện.

Trung tâm
ĐH
Cần

liệu học tập và nghiên cứu
KínhHọc
chuyểnliệu
lên hội
đồng
chấmThơ
Luận @
văn Tài
Tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày.…..tháng……năm 2007
Cán bộ hướng dẫn

Lâm Ngọc Phương

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả trình bày trong Luận văn Tốt nghiệp là trung thực và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.
Tác giả luận văn

Phạm Lê Tuấn

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

iii

CẢM TẠ
Trải qua gần 5 năm học tập, rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ, em đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm của cha mẹ, sự giúp đỡ và chỉ dạy tận tình của
thầy cô để hôm nay em được hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Xin tỏ lòng biết sâu sắc đến
Cha, mẹ đã hết lòng nuôi con khôn lớn nên người.
Cô Lâm Ngọc Phương, người đã tận tình hướng dẫn, gợi ý và cho những lời
khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Quí thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức quí báu
cho em trong suốt các năm học.
Xin chân thành cám ơn
Chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong bộ môn Sinh Lý - Sinh Hoá,
Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã động
viên Học
và giúpliệu
đỡ tôiĐH
trongCần
suốt quá
trình@
làmTài
luậnliệu
văn tốt
nghiệp
Trung tâm
Thơ
học
tậpnày.và nghiên cứu
Gửi lời cảm ơn đến Cố Vấn Học Tập và các bạn lớp Trồng Trọt khóa 28 đã

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt khóa học.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

Phạm Lê Tuấn

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: PHẠM LÊ TUẤN

Giới tính: Nam

Sinh ngày: 15/07/1983

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: ấp Tân An B, Chánh An, Mang Thít, Vĩnh Long

Con ông Phạm Văn Giám và bà Lê Thị Lượng
Đã tốt nghiệp Tú Tài năm 2002 tại trường Phổ thông Trung học Mang Thít
Trúng tuyển vào trường Đại Học Cần Thơ năm 2002, học lớp Trồng Trọt khóa
28, thuộc Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ.

Ngày

tháng

năm 2007

Người khai ký tên

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
PHẠM LÊ TUẤN

v


PHẠM LÊ TUẤN, 2007. “Tái sinh chồi từ nuôi cấy mẫu lá cây hoa cúc
(Chrysanthemum sp.) bằng phương pháp nuôi cấy mô”. Luận văn Tốt nghiệp
Đại học, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Người hướng dẫn khoa học: Lâm Ngọc Phương
___________________________________________________________________ _

TÓM LƯỢC
Đề tài “Tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa cúc (Chrysanthemu sp.) bằng phương
pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm tìm ra nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
(2,4-D, NAA, IAA và BA) thích hợp cho sự tạo mô sẹo, tái sinh chồi trực tiếp và
gián tiếp từ mẫu lá, làm cơ sở cho công tác nhân và lai tạo giống mới.
Đề tài gồm 4 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 1 - 2
nhân tố, 4 – 6 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy 4 – 5 mẫu.
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
- Môi trường MS có thêm IAA 2 - 4 mg/l kết hợp với BA 1 - 2 mg/l
thích hợp nhất để tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá.

Trung tâm Học -liệu
Cần Thơ
@vếtTài
liệucho

học
nghiên
cứu
Mẫu ĐH
cấy nguyên
lá có tạo
thương
hiệutập
quảvà
tái sinh
chồi cao
hơn so với mẫu cấy danh lá và cắt đôi lá.
- Môi trường MS có thêm 2,4-D, NAA nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với BA
2 mg/l thích hợp để tạo mô sẹo từ mẫu lá.
- Môi trường MS có thêm 2,4-D 0,05 mg/l cộng với BA 1 mg/l thích hợp
để tái sinh chồi từ mô sẹo.

vi


MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Trang
ii

Lời cam đoan

iii

Cảm tạ

iv

Tiểu sử cá nhân

v

Tóm lược

vi

Mục lục

vii

Danh sách hình

ix

Danh sách bảng

x

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

vii

DANH SÁCH HÌNH
Hình
3.1

Tựa hình
Tỷ lệ (%) tạo chồi từ mẫu lá sau 4 tuần trong môi trường có IAA
kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau

3.2

22

Chồi tái sinh trực tiếp từ mẫu lá cây hoa cúc trong môi trường MS
có thêm BA 1 mg/l + IAA 1 mg/l sau 4 tuần nuôi cấy.

3.5

21

Chiều cao chồi tái sinh từ mẫu lá sau 4 tuần trong môi trường có
IAA kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau..

3.4

20

Số chồi bất định tái sinh từ mẫu lá sau 4 tuần trong môi trường có
IAA kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau

3.3

Trang

22

Chồi tái sinh trực tiếp từ mẫu lá cây hoa cúc trong môi trường MS
có thêm BA 2 mg/l + 4 mg/l IAA (a) hay BA 2 mg/l + 2 mg/l IAA
(b) sau 4 tuần nuôi cấy

23

3.6 Học
Tỷ lệ
(%) ĐH
tạo mô
sẹo từThơ
mẫu lá
3 tuần
và 4học
tuần tập
nuôi cấy
Trung tâm
liệu
Cần
@sauTài
liệu
và trong
nghiên cứu
môi trường có NAA, 2,4-D và BA ở các nồng độ khác nhau.
3.7

Tỷ lệ (%) tạo chồi từ mẫu lá sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường
có NAA kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau.

3.8
3.9

25
26

Chồi tái sinh trực tiếp từ mẫu lá trong môi trường chứa NAA kết
hợp với BA

26

Chồi tái sinh từ mô sẹo trong môi trường có 2,4-D + BA

28

viii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng
3.1

Tựa bảng

Tỷ lệ (%) tạo mô sẹo từ mẫu lá sau 4 tuần trong môi trường có 2,4D, NAA và IAA kết hợp với BA ở các nồng độ khác nhau.

3.2

Trang

18

Tỷ lệ (%) tạo chồi và số chồi tái sinh từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có IAA và 2,4-D kết hợp với BA ở các nồng độ
khác nhau.

27

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

ix


1

GIỚI THIỆU
Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một trong ba loại hoa cắt cành được ưa
chuộng nhất trên thế giới. Hoa cúc rất đa dạng về chủng loại, màu sắc, phong phú
về kiểu dáng, khá bền và phù hợp với nhiều mục đích sử dụng. Đặc biệt, hoa cúc có
đặt tính khi tàng héo cánh hoa không rụng như một số loài hoa khác, do đó người
tiêu dùng và chơi hoa rất yêu thích (Lê Hữa Cân và Nguyễn Thị Hải Hà, 2004).
Cúc được trồng ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Hà Lan, Pháp,
Đức, Mỹ,…đặc biệt ở Nhật cúc được trồng nhiều nhất. Hằng năm, kim ngạch giao
lưu và buôn bán trên thị trường thế giới về cây hoa cúc ước đạt 1,5 tỷ USD. Ở Việt
Nam, cúc được trồng nhiều nơi và mang tính tập trung như Hà Nội (45 hecta),
Thành Phố Hồ Chí Minh (370 hecta), Đà Lạt (160 hecta), Hải Phòng (110 hecta).

Riêng ở Hà Nội, tổng thu nhập từ hoa cúc năm 1999 đạt 41,2 tỷ đồng, tốc độ tăng
hằng năm khoảng 10% (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003).
Hiện nay, có 4 phương pháp nhân giống chính đối với cúc đó là tách mầm giá,

Trung tâm
Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
giâm cành, nuôi cấy mô và nuôi cấy mô kết hợp với giâm cành. Đặng Văn Đông đã
tiến hành đánh giá ưu khuyết điểm của từng phương pháp trên và đưa ra khuyến cáo
nên sử dụng phương pháp nuôi cấy mô kết hợp với giâm cành cho trồng cúc ngoài
sản xuất đại trà.
Đề tài “Tái sinh chồi từ mẫu lá cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) bằng
phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho
tạo sẹo, tái sinh chồi và làm cơ sở cho việc nhân giống và lai tạo giống mới.


2

CHƯƠNG 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 Đặc điểm thực vật của cây hoa cúc
1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố
Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp., thuộc họ Asteraceae,
phân họ Asteroideae, chi Chrysanthemum. Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật
Bản và một số nước Châu Âu, được nhập vào Việt Nam từ lâu đời (Nguyễn Xuân
Linh, 1998).
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Thân: Cây hoa cúc thuộc loại thân thảo, đứng hoặc bò, thân cao 30-80 cm.
Rễ: Thuộc rễ chùm, ít ăn sâu, phát triển theo chiều ngang.
Lá: Thường là lá đơn, không có lá kèm, mọc so le nhau, bán lá xẻ thuỳ lông

chim, phiến lá mềm mỏng. Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên
nhẵn, gân hình mạng.
Hoa: Hoa cúc chủ yếu có hai dạng

Trung tâm Học- Dạng
liệu lưỡng
ĐH Cần
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
tính tức là trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái.
- Dạng đơn tính chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái. Đôi khi có dạng vô tính
(không có cả nhị và nhụy), hoa này thường ở ngoài đầu. Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa
nhỏ hợp lại trên một cuốn hoa, hình thành hoa tự đầu trạng là một bông hoa.
Quả: Quả bế, đóng, chứa một hạt, có phôi thẳng và không có nội nhũ.
1.2 Các phương pháp nhân giống
Đối với cúc, sử dụng phương pháp nhân giống vô tính là chính, còn phương
pháp nhân giống hữu tính không thuận tiện. Thu hoạch hạt cúc khó khăn, đa số cúc
thường không có hạt, phần lớn các loại cúc mọc từ hạt chỉ sống một năm nên cách
này chỉ áp dụng để tạo giống mới (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Việc nhân giống vô
tính truyền thống ở cúc bao gồm các kỹ thuật như giâm ngọn, tách mầm giá (Đặng
Văn Đông, 2004).
1.2.1 Nhân giống bằng phương pháp tách mầm giá
Cúc là loại cây sống lưu niên, có đặc điểm là xung quanh gốc thường phát
sinh những chồi non mọc lên từ rễ. Bình thường sau mỗi vụ thu hoạch, khi hoa tàn


3

thì các mầm giá đã phát sinh rất nhiều. Ta chọn và tỉa những mầm khỏe, mập và có
rễ đem trồng trực tiếp hoặc trồng cây nầy làm cây mẹ để lấy chồi.
1.2.2 Nhân giống bằng phương pháp giâm cành

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển phải luôn theo dõi chọn những cây
khỏe, không bị sâu bệnh, có chất lượng hoa tốt và đảm bảo được những đặt trưng
hình thái của giống. Sau khi cắt hoa hay hoa đã tàn, ta cắt thân chỉ để chừa lại
khoảng 10-15 cm kể từ gốc, từ đó cành nhánh sẽ phát sinh nhiều, lưu ý mỗi cây mẹ
nên để khoảng 3 chồi để lấy cành giâm.
1.2.3 Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
Đây là phương pháp tìm ra môi trường thích hợp để cho hệ số nhân giống cao
nhất, các chồi tạo ra đồng nhất về mặt di truyền, có sức sống cao, cây phát triển
mạnh, ít biến dị.
Theo Nguyễn Đức Thành (2000), phương pháp này có nhiều ưu điểm:
Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
Có thể tạo được một số loài thực vật mà không thể tiến hành invivo, nhân

Trung tâm
liệu
ĐH
Thơ
Tàicủaliệu
giốngHọc
invitro
có thể
cảmCần
ứng được
sự @
trẻ hóa
mô. học tập và nghiên cứu
Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ.
Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các
cây giống sạch bệnh.
Làm hạ giá thành vận chuyển, bảo quản cây giống cũng thuận tiện.

1.3 Cơ sở lý luận của sự nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô
1.3.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann cho rằng các
tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền giống hệt như các tế bào đầu
tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh. Đây là những đơn vị độc lập, có thể xây dựng lại
toàn bộ cơ thể từ những thông tin di truyền mà nó đã mang.
Tư tưởng về tính toàn năng của tế bào soma thực vật được Haberlandt (1902)
khởi xướng và được khẳng định bằng các công trình của Stward và ctv., (1958) trên
mô rễ cây cà rốt. Các tác giả đã nuôi cấy mô rễ cà rốt trên môi trường rắn có nước
dừa và đã nhận được khối mô sẹo gồm những tê bào nhu mô. Khi chuyển mô sẹo


4

này sang môi trường lỏng, lắc có cùng thành phần thì nhận được huyền phù, gồm
những tế bào riêng rẽ và các nhóm tế bào. Tiếp tục nuôi cấy trong môi trường lỏng
không cấy chuyển thì thấy hình thành rễ. Khi chuyển các cụm tế bào có rễ lên môi
trường rắn các tác giả đã nhận được chồi và cây hoàn chỉnh.
1.3.2 Sự phát sinh cơ quan và các yếu tố ảnh hưởng
Theo Nguyễn Đức Thành, (2000) trong các tế bào nuôi cấy thường xảy ra hai
dạng phân hóa đó là phân hóa cơ quan bằng con đường hình thành nhu mô và phân
hóa cơ quan qua sự tạo phôi soma.
- Phân hóa nhu mô: sự phân hóa của những tế bào đã được biệt hóa trở lại
trạng thái ban đầu của nhu mô, rồi từ nhu mô phân hóa thành cơ thể hoàn chỉnh.
- Phân hóa phôi: sự tái phân hóa của những tế bào đã được biệt hóa trong
mô nuôi cấy và sau đó xảy ra quá trình tạo phôi.
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) sự tái sinh cơ quan
(tạo mới hoặc tạo cơ quan bất định) không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà
trải qua một quá trình phức tạp vì có những mối tương quan cần phải phá vỡ để lặp

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
lại những mối tương quan khác, có thể đưa đến sự tái sinh cơ quan, gồm các quá
trình sau:
Sự phản phân hóa của những tế bào đã phân hóa (có thể dẫn đến sự tái
xác định và trẻ hóa của tế bào).
Sự phân chia tế bào đôi khi tạo thành mô sẹo, khi tế bào phân chia thì bắt
đầu xảy ra quá trình hình thành cơ quan.
Sự hình thành cơ quan.
Sự phát triển của cơ quan.
Có một số hạn chế về mặt số lượng lẫn chất lượng:
+ Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy.
+ Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính cũng như ngoài thiên
nhiên.
+ Vị trí của mẫu cấy trên cây.
+ Thời gian thu mẫu trong năm.
+ Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh.


5

+ Kích thước của mẫu cấy, phương pháp nuôi cấy, thành phần dưỡng chất
trong môi trường nuôi cấy, các yếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ
ánh sáng,… sự bổ sung của nột số chất khác ngoài môi trường.
1.3.2.1 Mô sẹo
Khái quát chung về mô sẹo
Xét về mặt cấu trúc thì mô sẹo là một khối vô định hình cuả các tế bào nhu
mô có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Hay nói một
cách khác đó là những tế bào nhu mô không có tổ chức (Nguyễn Văn Uyển và ctv,
1984).
Còn xét về mặt chức năng thì mô sẹo là một tổ chức tế bào không phân hóa

(Nguyễn Đức Thành, 2000).
Mô sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loại:
Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và
không bào to.
Loại cứng: các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào

Trung tâm
nhỏ. Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Ứng dụng từ nuôi cấy mô sẹo
Sau khi tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn để cho ra các dòng thuần
bên cạnh việc xử lý colchicin người ta có thể thông qua việc tạo sẹo từ các cây đơn
bội sau đó tái sinh cây (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Mô sẹo cũng là vật liệu trong chọn dòng tế bào thực vật vì như chúng ta đã
biết mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các tế bào không
đồng nhất. Ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi
(Nguyễn Đức Thành, 2000). Mô sẹo còn được dùng để chọn các dòng chống chiụ
như chịu bệnh, chịu muối và dòng cho năng suất thứ cấp cao.
Bên cạnh đó, người ta có thể kết hợp xử lý các tác nhân gây đột biến để làm
tăng tần số đột biến và các kiểu đột biến. Nhân giống in vitro ở những loài thực vật
mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ít hiệu quả hoặc không
thực hiện. Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan (Vũ Văn Vụ, 1999).


6

Hiệu quả của auxin và cytokinin trong tạo và nuôi cấy mô sẹo
Auxin thường được bổ xung vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tạo mô
sẹo. Loại và nồng độ thay đổi khác nhau tuỳ thuộc vào vật liệu nuôi cấy. Loại auxin
thường được sử dụng cho mục đích này là 2,4-D. Nhưng nếu tiếp tục duy trì mô sẹo
trong môi trường có 2,4-D này thì tế bào dễ bị đột biến. Vì vậy người ta có thể cảm

ứng việc tạo sẹo bằng NAA hay IAA. Hoặc sau khi cảm ứng mô sẹo bằng 2,4-D thì
mẫu cấy được chuyển sang môi trường có NAA hoặc IAA.
Đa số mẫu cấy thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo sẹo trên môi
trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp với cytokinin. Chẳng hạn như
môi trường để tạo sẹo đối với cây thuốc lá là môi trường MS có chứa 1 mg/l NAA
và 0,1 mg/l BA (Nguyễn Đức Thành, 2000). Hay đối với hoa Lili, lát cắt bầu nhụy
không phản ứng tạo sẹo trên tất cả các môi trường có tổ hợp NAA với kinetin hoặc
chỉ có 2,4-D. Tỷ lệ lát cắt bầu nhụy phát sinh mô sẹo đạt cao nhất (44,3%) trên môi
trường có 2,4-D nồng độ 1,5 mg/l kết hợp với kinetin 0,1 hay 0,2 mg/l (Cao Thị
Huyền Trang và ctv, 2006).

Trung tâm Học
Thơkhác,
@ Tài
học
tập
cứu
Tuy liệu
nhiên ĐH
một sốCần
đối tượng
ta có liệu
thể kích
thích
việcvà
tạo nghiên
sẹo trên một
loại chất điều hòa sinh trưởng là auxin hoặc cytokinin. Cây hoa hồng với một chất
điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin là thidiazuron (TDZ) (nồng độ 1,8; 2,7
và 3,6 micro mol) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất từ lá (85-100%) khi để trong điều

kiện tối 3 tuần (Fatih A. Canli, 2003).
Huang Tao và ctv. (2002) đã sử dụng 2,4-D (0,9-9,1 mM) để cảm ứng tạo
sẹo từ lá Citrus grandis trưởng thành.
Đối với cây hoa cúc theo Bhattachary và ctv. (1990) đã sử dụng môi trường
MS với 2 mg/l 2,4-D để tạo sẹo từ mẫu lá và thân.
Mô sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có
auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nhưng nếu chuyển sang môi trường có đủ các
thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của
mô sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng sinh của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần
cũng như nồng độ auxin.


7

Hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào thành phần cũng như nồng độ
của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện. Nếu giữ nguyên loại cũng như
nồng độ auxin nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần cũng như nồng độ cytokinin thì
hình thái của mô sẹo cũng thay đổi. Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của
BA trong môi trường nuôi cấy kích thích việc tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu
và có khả năng sinh phôi, mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường
không có khả năng sinh phôi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích mô sẹo dạng bở
nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và ctv,
1992).
1.3.2.2 Sự phát sinh phôi từ tế bào soma
Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào
soma, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật), có thể dấn thân vào sự phân chia theo một trật tự nhất định để
cho một phôi, theo kiểu giống hay gần giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi
Trang Việt, 1994).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Sự tạo phôi trực tiếp, gián tiếp

• Tế bào ở giai đoạn trước khi hình thành phôi được gọi là tế bào tiền phôi
(Sharp và 1982). Tế bào tiền phôi có thể phân chia để hình thành phôi trực tiếp nên
được gọi là sự phát sinh phôi trực tiếp.
• Sự tạo phôi xảy ra từ mô sẹo nên còn được gọi là sự phát sinh phôi gián
tiếp.
Khả năng sinh phôi từ các tế bào soma
Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin, có vai trò trong sự
thành lập các tế bào có khả năng sinh phôi là do chúng ảnh hưởng lên tính hữu cực
của tế bào (làm mất tính hữu cực) và kích thích các phân chia không cân xứng sau
đó. Sự thành lập lại tính hữu cực như là bước đầu tiên trong sự sinh phôi. Quá trình
phá vỡ tính cân xứng căn bản của tế bào cần thiết cho sự phát triển của một cấu trúc
phôi, lần lược xảy ra bởi sự thành lập một trụ, sau đó là sự phân hóa của cực chồi và
cực rễ, kế đó là sự tượng các lá (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2000).


8

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt là auxin hay auxin kết hợp
với cytokinin cần thiết cho sự hình thành phôi soma từ những loại mô khác nhau
(Fujimura và Komamine, 1979). Một số loài có thể cảm ứng sự tạo phôi bởi các loại
auxin khác nhau như ở Daucus carota đã sử dụng NAA (Ammirato và Komamine,
1979); 2,4-D (Fujimura và Komamine, 1979) hay IAA (Sussex và Frei, 1968). Ở
một số loài khác việc áp dụng auxin hạn chế hơn như ở các loài ngũ cốc, chỉ có 2,4D mới có tác dụng (Vasil và ctv, 1980). Nồng độ auxin áp dụng cũng khác nhau và
thay đổi theo từng loại cũng như tuỳ vào kiểu gen thực vật trong môi trường tạo
phôi. Thí dụ trên Azadirachta indica cần NAA 0,5 mg/l (Shrikhande và ctv, 1993);
trên Cheiranthus cheiri cần 2,4-D 0,1 mg/l (Khanna và Stanba,1970); Ammi majus
cần IAA 2,0 mg/l (Grewal và ctv, 1976). Tuy nhiên, ở một số loài tế bào soma chỉ

có thể sinh phôi trong môi trường đã hoàn toàn loại bỏ auxin như Daucus carota
(Fujimura và Komamine, 1979).
Bên cạnh auxin thì cytokinin cũng có vai trò rất lớn trong quá trình hình
thành phôi. Nhu cầu về cytokinin có tính chuyên biệt đối với từng loài thực vật. Sự

Trung tâm
Họcsoma
liệuở Solanum
ĐH Cần
Thơ @
liệu
học
và nghiên
cứu
tạo phôi
carolinense
thì Tài
cần 0,5
mg/l
BA tập
(Reynold,
1986), trong
khi đó Daucus carota lại cần zeatine (Fujimura và Komamine, 1979). Sự tạo phôi ở
Brassica nigra được quan sát thấy trên môi trường có BA hoặc BA kết hợp với
NAA ở nồng độ thấp.
1.3.2.3 Sự tạo chồi bất định và các yếu tố ảnh hưởng
Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc từ
những vùng không phải là trục lá và chồi ngọn. Rễ, vi củ, chồi bất định và những
cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, rễ, củ. Chồi bất định có thể
có nguồn gốc từ mô sẹo và mô sẹo được xem là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây

con (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2000).
Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như là phương pháp nhân
giống vô tính nhằm làm tăng số lượng cây con mong muốn. Các loại cây thường
được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như Saintpaulia, Begonia,
Achimenes, Streptocarpus, Lili, lan dạ hương, Nerin,..
Có một số điểm giống nhau trong sự tạo chồi bấc định và rễ bất định:


9

• Các phần của cây non có khả năng tạo chồi dễ dàng hơn. Ví dụ trong nuôi
cấy cây thuộc nhóm khỏa tử, chồi bấc định chỉ có thể tạo thành từ phôi cây con, và
các phần của cây con mà không phải xảy ra ở các mẫu cấy thu từ cây trưởng thành
(David, 1982; Anonymous, 1984).
• Đường luôn đóng vai trò quan trọng trong trong sự tạo cơ quan (chồi và
rễ).
• Sự hình thành chồi và rễ điều bị ức chế bởi gibberellin và abscicsic acid.
* Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định
- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp.
Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin và cytokinin để tạo chồi
bất định. Ví dụ như cây cải Luna lưỡng niên (biennial honesty) (Pierik, 1967), rau
diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972; Rossini và
Nitsch, 1966). Tuy nhiên khi bổ sung auxin hoặc cytokinin vào môi trường nuôi cấy
thì những chất này cũng có tác dụng lên sự tạo chồi.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để tạo chồi, trong khi auxin

lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968).

Có một nhóm thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi như trường hợp của lan
dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975).
Một nồng độ cytokinin cao kết hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng
trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như begonia (Ringe và Nitsch,
1968; Heide, 1965), cây cải ốc biển (Horse radish) (Warm, 1960; Sastri, 1963), cây
mao địa hoàng (foxlove) (Dolfus và Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna
(Zenkteler, 1971) và cây bông cải (Margara, 1969). Có thể kết luận rằng những cây
này cần cytokinin và auxin cho sự tạo chồi bất định, nồng độ cytokinin cao còn
nồng độ auxin thì thấp. Tỷ lệ giữa hai chất điều hòa này sẽ xác định sự tạo cơ quan:
tỷ lệ cao tạo chồi, tỷ lệ thấp tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953;
Paulet, 1965; Gautheret, 1959).
Cooke (1977) đã sử dụng 2 mg/l IAA kết hợp với 0,08 mg/l BA để tái sinh
chồi từ cuốn lá Violet.


10

Đối với giống cúc Nhật “Rivalry” sử dụng môi trường MS có bổ sung 1,5
ppm BA cho hiệu quả tái sinh chồi từ lá cao nhất 3,1 chồi/mẫu sau 4 tuần (Nguyễn
Quang Thạch và Nguyễn Thị Lý Anh, 2005).
Theo Miyazaki và ctv (1976); Rout và ctv (1997); Miyazaki và Tashiro
(1978) sử dụng môi trường B5 bổ sung 2,5 đến 3 mg/l kết hợp với IAA 1 đến 1,5
mg/l cho hiệu quả cao trong việc tái sinh chồi từ mô lá cây hoa cúc. Trên môi
trường này ta có thể tạo được 12,4-36,4 chồi/mẫu.
Theo Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Quang Thạch (2004) đã sử dụng môi
trường MS có bổ sung 1,5 mg/l BA hay 2 mg/l kinetin để tái sinh chồi từ mô lá và
mầm ngủ trên giống cúc Nhật “Rivalry”, cho hệ số nhân cao nhất trên giống này.
- Ánh sáng
Trong nhiều trường hợp ánh sáng kích thích sự tạo chồi. Cũng có trường hợp
ngoại lệ là một số cây trồng lại có thể tạo chồi tốt hơn trong điều kiện tối như chồi

hoa của Fressia (Pierik và Steegmens, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và
Nerine bowdenii (Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read

Trung tâm
Học
ĐHcác
Cần
liệuhyrbida
học tập
nghiên
cứu
(1986)
cho liệu
biết rằng
mẫuThơ
cấy lá@
củaTài
Petunia
tăngvà
trưởng
trên môi
trường không có cytokinin và được xử lý với ánh sánhg đỏ thì tạo ra nhiều chồi có
trọng lượng tươi lớn hơn là được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trong
môi trường có BA thì khi xử lý dưới ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số
lượng chồi và trọng lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môi
trường không có cytokinin.
- Nhiệt độ
Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp
ngoại lệ như Begonia (Heide, 1965) và Sreptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).
- Cách đặt mẫu cấy trong môi trường nuôi cấy

Pierik và Swart chứng minh rằng sự tạo chồi bất định của nẫu cấy lá tăng
nhiều khi để cho lớp biểu bì dưới của phiến lá Kalanchoe farinacea tiếp xúc trực
tiếp với môi trường nuôi cấy và các ông rút ra kết luận rằng nếu đặt mẫu cấy nằm
thẳng trên môi trường thì sẽ tạo được nhiều chồi hơn là cấy thẳng đứng.


11

1.4 Nuôi cấy mô cây cúc
1. 4.1 Giai đoạn tạo nguồn mẫu khởi đầu
Tạo nguồn mẫu sạch có khả năng sống là điều kiện tiên quyết cho sự thành
công cuả công việc nuôi cấy in vitro. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Lý
Anh và Nguyễn Quang Thạch (2004) thì khử trùng mẫu cấy bằng HgCl2 nồng độ
0,2% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sạch, sống đối với mô lá là 76,7% và mô
thân là 86,7% trên giống Dendranthema indicum Gr.
Còn đối với giống cúc CN20 (Sray Chrysanthemum) Nguyễn Thị Kim Lý và
Nguyễn Xuân Linh (2004) đã tiến hành so sánh hiệu quả của 2 chất khử trùng H202
và HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau. Kết quả cho thấy khử
trùng bằng H202 cho tỷ lệ sống cao nhất là 71,4% ở nồng độ 20%, trong thời gian 15
phút. Còn khử trùng bằng HgCl2 ở các nồng độ và thời gian khác nhau đều cho tỷ lệ
mẫu sống giảm đi và mẫu chết tăng. Giống CN97 (có nguồn gốc ở Nhật nhập vào
Việt Nam năm 1997) khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ
mẫu sống và vô trùng cao nhất.

Trung tâm
liệunhân
ĐHnhanh
Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
1.4.2Học
Giai đoạn

Đây là giai đoạn tìm ra môi trường thích hợp để cho hệ số nhân giống cao
nhất, các chối tạo ra đồng nhất về mặt di truyền, có sức sống cao, cây phát triển
mạnh ít biến dị. Theo Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Quang Thạch (2004) đã sử
dụng môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l BA hay 2 mg/l kinetin để tái sinh chồi từ
mô lá và mầm ngủ trên giống cúc Nhật “Rivalry”, cho hệ số nhân cao nhất trên
giống này.
Đối với giống CN01 (Standard Chrysanthemum) thì ở nồng độ 0,5 mg/l BA
trên môi trường MS là thích hợp cho việc nhân chồi. Nồng độ BA càng cao hệ số
nhân chồi giảm (Trần Khắc Hạnh và ctv, 2004).
Còn trên giống CN97 thì cần sử dụng BA ở nồng độ 0,1 mg/l để cho hệ số
nhân chồi cao nhất (Hoàng Thị Lan Phương và ctv, 2004).
1.4.3 Giai đoạn tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Khi có hoặc không có bổ sung auxin, 100% các chồi cúc đều ra rễ (Nguyễn
Quang Thạch và ctv, 2004; Trần Khắc Hạnh và ctv, 2004; Hoàng Thị Lan Phưong


12

và ctv, 2004). Tuy mhiên trong môi trường không có bổ sung auxin, mặt dù rễ dược
tạo ra nhưng số rễ tạo ra trung bình trên cây ít, rễ dài, mảnh và kém sức sống. Còn
trên môi trường có bổ sung NAA số rễ đuược tạo thành trung bình trên cây lớn hơn
và độ dài rễ ngắn hơn, các rễ đều khỏe, mập, có sức sống cao. Chẳng hạn nồng độ
NAA thích hợp cho việc tạo rễ giống cúc CN20 là 0,2 mg/l (Nguyễn Thị Lý Anh và
Nguyễn Xuân Linh, 2004).
1.4.4 Giai đoạn vườn ươm
Giá thể có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển cuả cây
cúc cấy mô. Theo các kết quả đã được công bố thì giá thể trấu hun cho kết quả tốt
nhất (Nguyễn Thị Lý Anh và Nguyễn Quang Thạch, 2004; Hoàng Thị Lan Phương
và ctv, 2004; Lê Hữu Cân và Nguyễn Thị Hải Hà, 2005; Trần Khắc Hạnh, 2004).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu


13

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện
2.1.1 Vật liệu thực vật
Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu lá in vitro giống CN44.
2.1.2 Thiết bị và hoá chất
- Trang thiết bị thí nghiệm: tủ cấy vô trùng, cân điện tử, nồi thanh trùng
(Autoclave), máy đo pH, bếp khử trùng dụng cụ cấy, tủ sấy giấy, các dụng cụ thuỷ
tinh dùng cho thí nghiệm: ống đong, keo, ống nghiệm,…
- Các hoá chất
Môi trường nuôi cấy: khoáng đa lượng - vi lượng (MS) (Murashige và Skoog,
1962). Có bổ sung vitamin như Thiamin, pyridoxin, nicotinic acid, myo-inositol.
Các chất điều hoà sinh trưởng: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4- D),

1-

naphthalene acetic acid (NAA), 3-indolyl acetic acid (IAA), benzyl adenin (BA), và
các chất khác như đường sucrose, agar, nước dừa.
Trung tâm
Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Điều kiện thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện phòng nuôi cấy mô (nhiệt độ: 26 ±
20 C, cường độ chiếu sáng 1000-2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày), và các

dụng cụ cần thiết khác.
2.1.3 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc bộ
môn sinh lý sinh hóa, khoa Nông Nghiệp và sinh học ứng dụng, truờng đại học Cần
Thơ.
- Thời gian: Từ tháng 08/2006 đến tháng 02/2007.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường nền là môi trường đa vi lượng theo Murashige và Skoog
(MS), 1962; có bổ sung đường sucrose (30 g/l), agar (7 g/l), nước dừa tươi (150
ml/l), vitamin theo Morel (1951), myo-inositol (0,1 g/l). Tuỳ theo từng thí nghiệm


14

mà bổ sung chất điều hoà sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau. Môi trường nuôi
cấy được điều chỉnh ở pH 5,7 – 5,8, cho vào mỗi keo 30 ml rồi chuyển vào nồi hấp
khử trùng có nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút.
2.2.2 Bố trí thí nghiệm
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của 2,4-D, NAA, IAA và BA đến sự phát sinh hình
thái từ mô lá
- Mục tiêu: Bước đầu khảo sát mức hiệu quả của 2,4-D, NAA, IAA và BA đến sự
tạo sẹo và tái sinh chồi từ mẫu lá.
- Phương pháp: Chọn những lá ngọn in vitro có kích thước và vị trí tương đương
nhau, sau đó cắt bỏ cuốn, tạo vết thương ở mặt dưới. Khi cấy thì để mặt bị cắt tiếp
xúc với môi trường. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên một
nhân tố, gồm có 7 nghiệm thức và 6 lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại là 1 keo, mỗi keo cấy
4 mẫu lá.
1) 2,4-D 1 mg/l
2) 2,4-D 1 mg/l + BA 0,2 mg/l

Trung tâm Học3)liệu
Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2,4-DĐH
2 mg/l
4) NAA 1 mg/l
5) NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l
6) IAA 2 mg/l
7) IAA 2 mg/l + BA 0,2 mg/l
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo.
+ Tỷ lệ mẫu tạo chồi.
+ Các hiện tượng khác: tạo rễ, chết, thay đổi màu sắc,…
- Thời gian lấy chỉ tiêu: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi cấy.
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của IAA kết hợp với BA đến sự tái sinh chồi từ
mẫu lá
- Mục tiêu: Tìm ra nồng độ IAA kết hợp với BA thích hợp cho sự tái sinh chồi trực
tiếp từ mô lá.


15

- Phương pháp: Chọn những lá ngọn in vitro có kích thước và vị trí tương đương
nhau, sau đó cắt bỏ cuốn. Có 2 nghiệm thức, một nghiệm thức để nguyên lá có tạo
vết thương ở mặt dưới, nghiệm thức còn lại thì tiến hành danh lá và cắt lá làm đôi
theo chiều ngang. Cả 2 nghiệm thức đều để mặt dưới của lá tiếp xúc với môi trường.
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố với, gồm có 5
lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1 keo mỗi keo cấy 5 mẫu.
Nhân tố 1: kiểu mẫu bố trí có 2 nghiệm thức cả lá và nữa lá.
Nhân tố 2 (nồng độ chất điều hòa sinh trưởng): có 8 nghiệm thức

1) IAA 1 mg/l + BA 0,5 mg/l
2) IAA 2 mg/l + BA 0,5 mg/l
3) IAA 4 mg/l + BA 0,5 mg/l
4) IAA 1 mg/l + BA 1 mg/l
5) IAA 4 mg/l + BA 1 mg/l
6) IAA 1 mg/l + BA 2 mg/l
7) IAA 2 mg/l + BA 2 mg/l

Trung tâm Học
liệu4 mg/l
ĐH +Cần
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8) IAA
BA 2 mg/l
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi.
+ Số chồi.
+ Cao chồi
- Thời gian lấy chỉ tiêu: 7, 14, 21, 28 ngày sau khi cấy.
2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của NAA, 2,4-D và BA đến sự tạo sẹo từ mẫu lá
- Mục tiêu: Tìm ra nồng độ NAA và 2,4-D kết hợp với BA thích hợp cho sự tạo
sẹo.
- Phương pháp: Chọn những lá ngọn in vitro có kích thước và vị trí tương đương
nhau, sau đó cắt bỏ cuốn. Rồi tiến hành danh lá và cắt lá làm đôi theo chiều ngang,
khi cấy úp mặt trên của lá xuống. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn
ngẫu nhiên 1 nhân tố gồm có 12 nghiệm thức với 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1
keo mỗi keo cấy 5 mẫu lá.
1) 2,4-D 0,5 mg/l + BA 1 mg/l