CHẨN đoán BỆNH VIÊM não NHẬT bản TRONG hội CHỨNG rối LOẠN SINH sản tại TRẠI CHĂN NUÔI HEO tập TRUNG ở VĨNH LONG và AN GIANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

PHẠM MINH THƯ

CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG
HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO
TẬP TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, tháng


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

PHẠM MINH THƯ
CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG
HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP
TRUNG Ở VĨNH LONG VÀ AN GIANG

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Giáo Viên Hướng Dẫn

ThS Hồ Thị Việt Thu

Cần Thơ, tháng

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: Chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản trong hội chứng rối loạn
sinh sản tại trại chăn nuôi heo tập trung ở Vĩnh Long và An Giang
Do sinh viên: Phạm Minh Thư thực hiện tại Vĩnh Long và An Giang
từ 4/2006 đến 7/2007

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Cần Thơ, ngày tháng năm 2007
Duyệt Bộ môn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2007
Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2007
Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CẢM TẠ
2

Xin chân thành cảm ơn:
Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Quý Thầy, Cô Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình dạy dỗ em trong suốt thời
gian học tại trường.
Các anh, chị trong Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, các cô, chú,
anh chị ở các trại heo đã tận tình giúp đỡ tôi trong việc tiến hành thí nghiệm.
Các bạn lớp Thú Y K28 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Xin kính gởi đến quý Thầy, Cô, người thân và bạn bè tôi lời chúc sức khỏe, và
xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

3


MỤC LỤC

Trung

TRANG TỰA ...................................................................................................i
TRANG DUYỆT ............................................................................................ ii
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ iii
MỤC LỤC ......................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................vi
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................vi
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................vii
TÓM LƯỢC ................................................................................................ viii
CHƯƠNG I : ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................1

CHƯƠNG II: CƠ SỞ LÝ LUẬN .....................................................................2
2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) .............2
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................2
2.2.1 Tình hình nghiên cứư ngoài nước ...........................................2
2.2.2 Tình hình nghiên cứư trong nước ............................................2
2.3 Tác nhân gây bệnh ................................................................................3
2.3.1 Phân loại virut .........................................................................3
2.3.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................3
2.3.3 Sức đề kháng...........................................................................4
2.3.1 Đặc tính nuôi cấy ....................................................................4
2.3.5 Đặc tính kháng nguyên của virut VNNB .................................5
2.3.6 Đặc tính ngưng kết hồng cầu ...................................................5
2.4 Dịch tể ..................................................................................................5
tâm Học liệu
@ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.4.1ĐH
PhânCần
bố địa Thơ
lý..........................................................................5
2.4.2 Phân bố bệnh theo mùa............................................................5
2.4.3 Nhân tố trung gian truyền bệnh ...............................................5
2.4.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên .......................................6
2.4.5 Sinh bệnh học..........................................................................6
2.5 Miễn dịch học .......................................................................................7
2.6 Triệu chứng và bệnh tích.......................................................................8
2.6.1 Triệu chứng .............................................................................8
2.6.2 Bệnh tích .................................................................................8
2.7 Các phương pháp chẩn đoán .................................................................9
2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng ................................................................9
2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm ...................................................9

2.7.3 Xét nghiệm huyết thanh học..................................................11
2.8 Phòng và trị bệnh….. ..........................................................................13
2.8.1 Trị bệnh……. ........................................................................13
2.8.2 Phòng bệnh............................................................................13
CHƯƠNG III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................14
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................14
3.1.1 Thời gian…. ..........................................................................14
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu .............................................................14
3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi ....................................................................14
3.2 Phương tiện và phương pháp tiến hành thí nghiệm..............................14
3.2.1 Vật tư và thiết bị....................................................................14

4


3.2.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................14
3.2.3 Các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm .....................................15
3.3 Xử lý số liệu ………………. ..............................................................23
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN.......................................................24
4.1 Tình hình chăn nuôi trại tập trung .......................................................24
4.1.1 Điều kiện môi trường xung quanh .........................................24
4.1.2 Chuồng trại……....................................................................25
4.1.3 Biện pháp phòng trừ muỗi .....................................................25
4.1.4 Vệ sinh chuồng trại ...............................................................25
4.1.5 Tiêm phòng vaccine ..............................................................26
4.2 Kết quả chẩn đoán bệnh VNNB trong hội chứng RLSS ......................27
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… ..........................................31
5.1 Kết luận……………. .........................................................................31
5.2 Đề nghị ……………...........................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………… .............................................................32

PHỤ CHƯƠNG……………………. .............................................................38

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

5


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BHK_21
C
dNTP
DXN
ĐBSCL
E
LMLM
M
PCR
RLSS
RT_PCR
VNNB
Vero
XN
ƯCNK HC

: tế bào thận chuột đất vàng
: Capxit
: deoxyNucleic Acid
: Dịch xoang ngực
: Đồng bằng sông Cửu Long
: Vỏ

: Lở mồm long móng
: Màng
: Phản ứng khuyếch đại chuỗi gen
: Rối loạn sinh sản
: phản ứng chuỗi polymeraza_ phiên mã ngược
: Viêm não Nhật Bản
: tế bào thận khỉ
: Xét nghiệm
: Ức chế ngưng kết hồng cầu

DANH MỤC BẢNG

Trung tâmBảng
Học
Cần
@gáyTài
học..................................7
tập và nghiên cứu
2.1liệu
: MốiĐH
liên hệ
giữa Thơ
độ dài từ
đếnliệu
khấu đuôi
Bảng 3.1 : Cặp mồi dùng trong phản ứng RT_PCR ........................................22
Bảng 3.2 : Thành phần cho 1 phản ứng RT_PCR ( kit Titan-one-tube,Roche) 22
Bảng 4.1 : Qui trình tiêm phòng .....................................................................26
Bảng 4.2 : Kết quả kiểm tra kháng thể kháng virut VNNB ở heo nái
có RLSS……………...........................................................................27

Bảng 4.3 : Kết quả kiểm tra kháng thể kháng virut VNNB từ DXN và
huyết thanh heo con từ các lứa đẻ ......................................................... 29
Bảng 4.4:Bảng ghi nhận về mẫu thai có DXN dương tính ..............................30
Bảng 4.5:Kết quả xét nghiệm RT_PCR ..........................................................31

6


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Mô hình cấu trúc hạt virut Flavivirus ...............................................3
Hình 2.2: Cấu trúc của virut VNNB .................................................................4
Hình 2.3: Muỗi Culex triaeniorhynchus ...........................................................6
Hình 2.4: Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên ................................................6
Hình 3.1: Kết quả phản ứng HI ......................................................................18
Hình 3.2:Các mẫu huyết thanh sau khi cho cơ chất.........................................20
Hình 3.3:Các mẫu huyết thanh sau khi ngừng phản ứng bằng H2SO4 .............20
Hình 4.1: Điều kiện môi trường xung quanh trại Phước Thọ_Vĩnh Long .......24
Hình 4.2: Điều kiện môi trường xung quanh trại Vĩnh Khánh_An Giang .......25
Hình 4.3: Tỷ lệ nái dương tính với xét nghiệm ƯCNKHC và MAC_ELISA ..28
Hình 4.4: Tỷ lệ nhiễm virut VNNB trên nái sẩy thai và nái đẻ thai chết
heo con chết ………. ..........................................................................28
Hình 4.5: Heo con có triệu chứng thền kinh ...................................................29
Hình 4.6: Tích nước dưới da ..........................................................................29
Hình 4.7: Tích nước xoang ngực ....................................................................29
Hình 4.8: Ứ nước ở não………….. ................................................................29
Hình 4.9: Tỷ lệ nhiễm virut trên DXN của thai chết lưu, thai sẩy và heo con
yếu ớt, có triệu chứng thần kinh chưu bú sữa đầu ................................30
Hình 4.10: Kết quả phát hiện đoạn RNA đặc hiệu của virut VNNB bằng kỹ
thuật RT_PCR……………................................................................31

Hình 4.11 : Tỷ lệ mẫu dương tính với xét nghiệm RT _PCR ..........................32

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

7


TÓM LƯỢC

Trung

Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người và
động vật. Trong đó heo, chim cư trú là ổ chứa virut quan trọng nhất và muỗi là
vectơ truyền bệnh. Qua trung gian muỗi, bệnh đã lây truyền sang người và
gây tử vong với tỷ lệ rất cao. Heo bị nhiễm bệnh không có biểu hiện bệnh lý
nhưng đối với nái mang thai bị nhiễm, sẽ gây rối loạn sinh sản với những biểu
hiện như: đẻ thai khô, thai chết, heo con yếu ớt có biểu hiện thần kinh. Ngoài
heo ra thì tất cả các loài động vật khác đều mẫn cảm vời bệnh như: trâu, bò, dê
,cừu…
Nhằm khẳng định virut VNNB là một trong những nguyên nhân gây rối
loạn sinh sản trên heo nái tại các trại chăn nuôi heo tập trung ở Vĩnh Long và
An Giang. Đề tài “Chẩn đoán viêm não Nhật Bản trong hội chứng rối loạn
sinh sản tại trại chăn nuôi heo tập trung ở Vĩnh Long và An Giang” được
thực hiện trong thời gian từ 4/2006 _ 7/2007 gồm có:
- 82 mẫu huyết thanh bao gồm 28 mẫu của heo nái có hiện tượng sẩy thai;
54 mẫu của nái đẻ thai chết hoặc heo con chết.
- 52 mẫu dịch xoang ngực gồm có 50 mẫu dịch xoang ngực thai chết lưu,
2 mẫu dịch xoang ngực thai sẩy; 7 mẫu huyết thanh.
- 60 mẫu não gồm có 9 mẫu não heo con, 2 mẫu não của thai sẩy, 49 mẫu
não của thai chết lưu.

Chúng tôi thu được kết quả:
- Tỷ lệ nái dương tính với xét nghiệm HI là 82,99% và dương tính với xét
tâmnghiệm
Học MAC_ELISA
liệu ĐH Cần
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
là 1,22%
- Tỷ lệdương tính với xét nghiệm HI của dịch xoang ngực của thai chết và
huyết thanh của heo con chưa bú sữa đầu là 22,03 %.
- Bằng kỹ thuật RT_PCR đã phát hiện ra hệ gen của virut trên thai bệnh và
heo con chưa bú sữa đầu là 8,33%.
Qua kết quả trên đã khẳng định được virut viêm não Nhật Bản là một trong
những nguyên nhân gây rối loạn sinh sản trên heo và làm giảm năng suất sinh
sản của heo nái.

8


CHƯƠNG I
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trung

Bệnh VNNB là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người và động vật.
Trong đó heo và chim cư trú là ổ chứa virut quan trọng và muỗi Culex là trung
gian truyền bệnh, bệnh có thể lây sang người đặc biệt là trẻ em với tỷ lệ tử
vong rất cao.Theo tổ chức y tế thế giới thì hằng năm có đến 50.000 người mắc
bệnh, nhưng có đến 10.000 người tử vong. Bệnh gây rối loạn sinh sản trên nái
mang thai với những biểu hiện như: đẻ thai khô, thai chết với nhiều kích thước
khác nhau, heo con sinh ra yếu ớt có triệu chứng thần kinh.

Hiện nay bệnh viêm não Nhật Bản chưa có thuốc đặc trị, vaccine phòng
bệnh trên heo chưa được sử dụng. Việc kiểm soát nhân tố truyền bệnh là muỗi
gặp nhiều khó khăn. Đặc biệt là đối với vùng ĐBSCL nơi có diện tích trồng
lúa lớn đây là điều kiện thuận lợi cho muỗi Culex sinh sống và ngành chăn
nuôi heo đang phát triển. Vì vậy bệnh viêm não Nhật Bản không những là mối
đe dọa cho con người mà còn gây thiệt hại cho nền kinh tế của người chăn
nuôi rất lớn.
Để có biện pháp phòng bệnh hiệu quả và kịp thời thì việc tìm hiểu nguyên
nhân gây bệnh và có biện pháp chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản một cách
chính xác hơn là điều hết sức cần thiết. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài:
“CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRONG HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN TẠI TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẬP TRUNG Ở
VĨNH LONG VÀ AN GIANG”
tâm Học
ĐH
Mục liệu
tiêu của
đề Cần
tài: Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Xác định vai trò của virut viêm não Nhật Bản trong hội chứng rối loạn sinh
sản trên heo bằng chẩn đoán huyết thanh học đẻ phát hiện kháng thể đặc hiệu
kháng virut viêm não Nhật Bản trên nái có biểu hiện rối loạn sinh sản, thai
bệnh, heo con chưa bú sữa đầu và bằng kỹ thuật RT_PCR phát hiện đoạn gen
đặc hiệu của virut.

9


CHƯƠNG II
CƠ SỞ LÝ LUẬN

Trung

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não nhật bản (Japanese encephalitis)
Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm cấp tính do virut gây ra và
muỗi là vectơ truyền bệnh. Hầu hết các loài gia súc đều mẫn cảm với bệnh bao
gồm ngựa, bò, cừu, ngỗng,heo... Những động vật khác như: thỏ, chuột, bồ câu
(Chang và ctv, 1984), chó, vịt, gà (Huang, 1982), chim hoang (Kaul, 1976) và
một số loài bò sát (Doi, 1983).Trong đó heo được coi là động vật cảm nhiễm
nhất. Bệnh gây ra rối loạn sinh sản đối với nái mang thai. Heo nái bị nhiễm
bệnh trong thời gian mang thai không có triệu chứng lâm sàng tuy nhiên có
những hiện tượng bất thường như: thai khô có những kích thước khác nhau,
heo con chết trước khi sinh với những biểu hiện phù thủng ở da và não, heo
con sinh ra yếu ớt và có những triệu chứng thần kinh (Chu và Joo, 1933).
Nhân tố trung gian truyền bệnh chủ yếu là loài muỗi Culex. Ở Việt Nam là
Culex triaenniorhynchus (Đỗ Quang Hà và ctv, 1964). Ở Mã Lai và Singapo
là Culex gelidus, Culex vishnui, Culex psedovishnui…Ngoài ra còn có các loài
muỗi khác cũng truyền bệnh như Aedes sinensis, Aedes sinensis, Adees
japanica. Muỗi cái có thể truyền virut từ đời mẹ sang đời con.
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Mùa hè năm 1693 ở , ở một làng bên bờ biển Thái Bình Dương của Nhật
Bản
đã xảy
ổ dịch
trên Thơ
người @
và ngựa.
Sau này
được

là bệnh cứu
tâm Học
liệuraĐH
Cần
Tài liệu
học
tậpxácvàđịnh
nghiên
VNNB.
Bệnh lần đầu tiên được mô tả trên người ở Nhật Bản năm 1871, sau đó
bệnh luôn tái diễn có định kỳ, những trận dịch lớn được ghi nhận vào năm
1924, 1935 và 1948 ( Miyake,1964; Shiraki,1970)
1933 Fujita cũng đã phân lập và định danh virut từ não của bệnh nhân chết
do bệnh (Fujita,1933)
1934, virut được phân lập từ não của bệnh nhân chết do bệnh viêm não,
virut này được xem như chủng virut mẫu của virut mẫu của virut VNNB và
được đặc tên là Nakayama.
1940_1941, A.K.Sublatze, P.A.Pettiseva phân lập virut VNNB ở Liên Xô
cũ và xác định ký chủ trung gian truyền bệnh là các giống muỗi Culex và
Acdes
1942 Sabin và đồng nghiệp đã sản xuất vaccine đông khô và vaccine bất
hoạt bằng formol từ huyễn dịch não chuột 10% đã gây nhiễm với chủng
Nakayama.
4/1979, theo báo cáo WHO bệnh VNNB gây nguy hiểm cho người và gây
bệnh thiệt hại nghiêm trọng cho heo sơ sinh.
2.2.2Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 1956, Caubet và P Netter viện Pesteur Nha Trang qua kết quả xét
nghiệm huyết thanh học đã kết luận là 20% người Việt Nam tiếp xúc với virut
VNNB.

10


Năm 1964, virut được phân lập từ 23 mẫu não của trẻ em dưới 12 tuổi có
hội chứng viêm não; từ 28 mẫu máu của trẻ em dưới 10 tuổi được chẩn đoán
lâm sàng là viêm màng não, viêm não, tăng lâm ba cầu; từ 23 não của 14 loài
chim hoang dã; ngoài ra 16 trường hợp được phân lập từ muỗi. Từ những
chứng cứ trên tác giả đã khẳng định được sự lưu hành virut VNNB ở miền Bắc
và sự tồn tại của virut trong các ổ chứa virut trong tự nhiên (Đỗ Quang Hà và
Đoàn Xuân Mượn)
Từ năm 1978-1995, các trung tâm nghiên cứu đã phân lập được 29 chủng
virút VNNB, trong đó có 10 chủng trong máu bệnh nhân, 7 chủng từ não tủy
bệnh nhân và 12 chủng từ muỗi ở các địa phương ngoại thành phố Hồ Chí
Minh, Đồng Tháp, Sông Bé, Đồng Nai, Long An (Hạ Bá Khiêm, 1998).
Năm 2001, Nguyễn Đa Phúc_Chi cục Thú Y Vĩnh Long, qua kết quả kiểm
tra huyết thanh học tỷ lệ nhiễm virut VNNB trên heo tại các hộ nuôi cá thể
(81,11%) cao hơn trại nuôi heo tập trung (65%) ( Nguyễn Đa Phúc, 2001)

Trung

Nghiên cứu điều tra huyết thanh học trên đàn heo sinh sản tại các trại chăn
nuôi tập trung tỉnh Cần Thơ, kết quả tỷ lệ dương tính là 72,64 % và nhóm
dương tính có tỷ lệ rối loạn sinh sản là 45,88% cao hơn nhóm heo âm tính
22,22% (Lê Thị Thu, 2005).
2.3 Tác nhân gây bệnh
2.3.1 Phân loại virut
Virut VNNB là một loại Flavivirus, được xếp vào họ Togavividae thuộc
nhóm B của Arbovirrus. Nhưng hiện nay virút này được xếp vào chi
là chi
duyCần

nhất của
họ @
Flavividae.
Chihọc
Flavivirus
có trên
60 loại cứu
tâmFlavivirus,
Học liệu
ĐH
Thơ
Tài liệu
tập và
nghiên
nhưng chỉ có 3 loại là có ý nghĩa trong thú y là: virut gây bệnh VNNB, virut
gây bệnh Louping và virut gây bệnh Weselsbron.

M: Màng

E: Vỏ

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc hạt virut Flavivirus

2.3.2 Đặc điểm hình thái
Virut hình khối cầu, có 20 mặt, đường kính khoảng 40nm. Cấu trúc di
truyền là một chuỗi RNA dương được bao bọc trong vỏ capsid hình thành từ
những protein C riêng rẽ sắp xếp thành hình khối 20, mặt sợi RNA có hệ số
lắng là 44S, trọng lượng phân tử 4.106D, chiếm 6% trọng lượng hạt virút. Khi
giải mã hoàn toàn cấu trúc di truyền có chứa 10.976 nucleotide tương ứng với
3432 gốc acid amin. Virut có 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc.

Những protein cấu trúc bao gồm glycoprotein E của vỏ (54kD), protein không
có glycosylate M vỏ (8kD) và protein capsid C (14kD). Protein vỏ E có chứa
epitope gây đáp ứng kháng thể trung hòa. Protein E có ít nhất là 8 epitope, một
11


epitope ở vị trí quyết định trên protein biểu thị tính đặc hiệu của virút (Kimura
– Kuroda và Yasui, 1986). Glycoprotein E trên bề mặt hạt virút tham gia chủ
yếu vào việc nhận diện thụ thể của tế bào, gây cảm ứng tạo kháng thể trung
hòa, gây đáp ứng miễn dịch tế bào và là kháng nguyên gây ngưng kết hồng
cầu. Những protein không cấu trúc NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b,
NS5.

Hình 2.2 Cấu trúc của virut VNNB
( />
Trung

2.3.3 Sức đề kháng
Virut chịu đựng kém với nhiệt độ: ở 60oC virut bị bất hoạt sau 10 phút, ở
o
70 C virut bị bất hoạt sau 5 phút. Ở nhiệt độ -70oC thì giữ nguyên độc lực.
Ngoài ra virut còn dễ dàng bất hoạt bởi các chất sát trùng như: ether,
cũngTài
như liệu
các loại
enzyme
protein cứu
tâmchloroform,
Học liệusodium
ĐH desoxycholate

Cần Thơ @
học
tậpphân
và giải
nghiên
hoặt lipid. Virut sống thích hợp ở pH=8,5
Virut tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh ở -20oC và ngoài ra còn là loại
gây nhiễm với môi trường nuôi cấy.
2.3.4 Đặc tính nuôi cấy.
Virut có thể nhân lên nhanh chóng trên nhiều loại tế bào một lớp nguyên
phát cũng như một số dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú bao gồm tế
bào thận khỉ (tế bào Vero), tế bào thận chuột đất vàng con ( tế bào BHK) –21,
và từ muỗi Aedes. Ngoài ra virut cũng có thể nhân lên ở tế bào sợi phôi gà,
màng nhung niệu của phôi gà và chuột bạch.
Virut từ mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên các dòng tế bào cảm nhiễm
như C6/36, vero, BHK-21. Phương pháp này kém nhạy hơn là phương pháp
tiêm trực tiếp vào muỗi sống. Nhưng có ưu điểm là dễ thực hiện hơn, rẻ tiền
và cùng lúc làm được nhiều bệnh phẩm.
Sự nhân lên của virut VNNB trong tế bào
• Sự hấp phụ và xâm nhập
Virut sẽ tiếp xúc với tế bào vật chủ tương ứng tại thụ thể đặc biệt trên bề
mặt tế bào. Trong quá trình này các men lizozim có tác dụng hoà tan
peptidolican ở một bộ phận của thành tế bào. Sau đó xâm nhập vào màng tế
bào, vỏ ngoài của virut sẽ được phân hủy để giải phóng nucleocapxit
Phiên mã RNA: vì virut VNNB có nhân là sợi RNA dương làm 2 chức
năng: vừa làm khuôn tổng hợp sợi RNA âm, vừa làm chức năng RNA thông
tin
12

Trung

• Sinh tổng hợp protein
Protein của virut được tổng hợp của mạng lưới nội chất hạt. Protein cấu
trúc và phi cấu trúc được tổng hợp với tỷ lệ không đổi do được phiên mã từ
một sợi RNA thông tin duy nhất.
• Lắp ráp các nuleosit và vỏ bọc
Khi các protein capsit và acid nucleoic của virut đã được tích lũy phong
phú trong tế bào vật chủ thì sẽ bắt đầu quá trình lắp ráp. Các protein capsit sẽ
liên kết với RNA của virut tạo thành nucleotid, Tiếp theo, virut tiếp nhận một
phần màng của tế bào chất vật chủ bao bọc lấy lõi nucleocapit khi virut đi qua
màng tế bào chất của vật chủ
• Sự phóng thích
Sau khi lắp ráp thành virut hoàn chỉnh, chúng đến màng tế bào, thoát khỏi
và tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác
2.3.5 Đặc tính kháng nguyên của virut VNNB
Virút viêm não Nhật Bản có 3 loại kháng nguyên: protein màng V1
(hoặc M) là nucleoprotein, protein lõi V2 (hoặc C) chính là RNA và protein vỏ
V3 (hoặc E) là glycoprotein. Trong đó protein kháng nguyên vỏ ngoài E nằm
trên bề mặt của hạt virút đóng vai trò quan trọng nhất trong bước đầu tiên của
phản ứng virut và vật chủ , tạo ra kháng thể miễn dịch bảo vệ cơ thể (kháng
thể ức chế ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hòa) (Kobayashi và ctv,
1985).
2.3.6 Đặc tính ngưng kết hồng cầu
khả Thơ
năng ngưng
kết hồng
gà,tập
ngỗng,
câu, cừu, cứu

tâm HọcVirut
liệuVNNB
ĐH có
Cần
@ Tài
liệu cầu
học
vàbồnghiên
chuột lang, thỏ. Nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con một ngày tuổi (Kobayashi
và ctv, 1984).
Yếu tố pH có ảnh hưởng tới ngưng kết hồng cầu:
- Kháng nguyên chế từ não pH tối ưu là 6,3- 6,5.
- Kháng nguyên chế từ nuôi cấy tế bào pH tối ưu là 6,0- 6,2.
2.4 Dịch tể
2.4.1 Phân bố địa lý.
Bệnh có chất dịch hoặc dưới dạng địa phương gần như mỗi quốc gia Châu
Á. Bệnh thường có tính chất mùa và phổ biến ở vùng Siberia, Nhật Bản, Trung
Quốc, Đài Loan, Philippines, Viêt Nam, Thái Lan, Mã Lai, Singapore,
Indonesia, Miến Điện, Srilanke và Ấn Độ (Hana và ctv,1996)
2.4.2 Phân bố bệnh theo mùa.
Ở vùng ôn đới bệnh có tính chất dịch với phần lớn ca bệnh tập trung vào
một vài tháng mùa hè hoặc gió mùa. Trong những vùng nhiệt đới, bệnh có tính
chất địa phương với số ca bệnh thấp rãi rác suốt năm.
2.4.3 Nhân tố trung gian truyền bệnh.
Nhân tố truyền bệnh chính là muỗi và đây là vectơ duy nhất truyền bệnh
cho người, đặc biệt là vai trò của giống muỗi Culex như Culex
Tritaeniorhynchus, Culex Gelidus, Culex Vishnu…Muỗi hút máu động vật
heo, chim trong giai đoạn nhiễm trùng huyết. Virut sinh sản nhanh chóng
trong vectơ muỗi và còn có khả năng truyền cho thế hệ sau.

13


Sự phát triển của muỗi chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, ẩm độ và lượng mưa.
Ở Việt Nam, mật độ muỗi vào mùa hẻ là thời tiết thích hợp cho muỗi phát
triển và đặc biệt là vùng nông thôn.

Hình 2.3 Muỗi Culex tritaeniorhynchus
( />
2.4.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên.
Virut được duy trì và truyền bệnh qua chu trình bao gồm: nhân tố trung
gian truyền bệnh là muỗi; ký chủ khuyếch đại là chim di trú và heo; ký chủ
cuối cùng là động vật hữu nhũ. Sự tồn tại củ virut chủ yếu dựa vào những
động vật cảm nhiễm với virut nhưng không có triệu chứng lâm sàng
Heo và chim được xem là động vật cảm nhiễm nhất và là nguồn chứa virut
quan trọng để truyền cho muỗi. Những động vật khác trâu, bò, dê, cừu, cũng
cảm nhiễm với virut VNNB nhưng ở mức độ thấp.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.4 Chu trình truyền bệnh trong tự nhiên
( />
2.4.5 Sinh bệnh học
Cách thức lan truyền chính là thông qua vết muỗi cắn có chứa virut
VNNB. Muỗi tiết nước bọt khi hút máu và truyền nước bọt bị nhiễm vào máu.
Ở động vật khuyếch đại ( Heo, chim) có khoảng 10.000 virut trong một lần
muỗi đốt với lượng virut này thì muỗi hút máu dễ dàng truyền bệnh sang
người cũng như những động vật khác (Huỳnh Phương Liên,1998)
Trong tự nhiên heo bị nhiễm do muỗi mang virut đốt, sau thời gian gây
nhiễm virut huyết sơ tán khoảng 12 giờ đến vài ngày, virut phát tán ra tới các

mô như mô mạch gan, lách, mô cơ…Virut truyền đến hệ thần kinh trung ương
qua đường dịch não tuỷ, tế bào nội mô, đại thực bào, lâm ba cầu nhiễm virut
hoặc qua đường máu.

14


Trung

Đối với nái mang thai, bào thai có thể bị nhiễm do heo mẹ bị nhiễm virut
truyền qua nhau thai. Thí nghiệm, tiêm truyền virut vào tĩnh mạch heo nái, có
thể tìm thấy virut trong bào thai sau 7 ngày. Tuy nhiên việc truyền virut qua
nhau thai còn tuỳ thuộc vào tuổi của bào thai và dòng virut. Sự truyền virut
qua nhau thai và gây bệnh rõ ràng nhất khi heo nái nhiễm ở giai đoạn giữa của
thai kỳ. Hiện tượng thai chết và thai khô có liên quan đến heo nái bị nhiễm
virut trong giai đoạn từ 40_50 của thai kỳ. Đối với heo nái bị nhiễm virut sau
ngày 85 của thai kỳ thì heo con sinh ra ít bị ảnh hưởng (Sugimori và ctv,
1974). Thai chết được cho là có liên quan đến việc không kiểm soát được sự
nhân lên của virut và sau đó phá huỷ các tế bào sống của bào thai.
Heo con nhạy cảm nhất, heo đực giống nhiễm bệnh là nguồn lây lan mạnh,
virut được phóng thích cùng với tinh dịch vào cơ quan sinh dục cái, virut qua
nhanh màng bào thai và xuất hiện trong các cơ quan nội tạng của phôi thai,
gan, lách, cơ… trong giai đoạn này thường là ngày thứ 40-80 của thai kỳ
(Orasa,A và ctv, 1977).
Heo con cai sữa và heo trưởng thành virut không gây bệnh lý và triệu
chứng lâm sàng ( Nguyễn Đa Phúc, 2003).
2.5 Miễn dịch học
Trong miễn dịch đặc hiệu, sau khi bị nhiễm virut, ta có thể phát hiện được
kháng IgG và IgM. Kháng thể IgM được tạo ra rất sớm nhưng lại giảm rất
nhanh, chỉ tồn tại khoảng 2 tuần ( Burke và ctv, 1985) và thường ứng dụng

trong chẩn đoán. Còn kháng thể IgG tồn tại lâu dài sau khi nhiễm virut huyết
và tồn tại đến 3 năm.
tâm Học
liệunáiĐH
Cần
Thơ
@virut,
Tài virut
liệusẽhọc
Khi heo
mang
thai bị
nhiễm
phát tập
triển và
trongnghiên
máu 2-4 cứu
ngày, kháng thể được sinh ra từ 1-4 tuần sau khi nhiễm. Vì vậy thai trong giai
đoạn từ 40-70 ngày tuổi sẽ bị ảnh hưởng. Còn thai ở trong giai đoạn từ 85-110
ngày tuổi, thai đã có khả năng tạo miễn dịch nên nếu nái bị nhiễm trong giai
đoạn này thai vẫn phát triển bình thường. Việc xác định tuổi của thai dựa vào
mối liên hệ giữa độ dài từ gáy đến khấu đuôi (Straw, 1986)
Bảng 2.1 : Mối liên hệ giữa độ dài từ gáy đến khấu đuôi
Kích thước từ gáy đến khấu đuôi của
thai (mm)

Tuổi thai

20
27

49
89
135
170
207
270

25
30
40
50
60
70
85
110

15


Trung

2.6 Triệu chứng và bệnh tích
2.6.1 Triệu chứng
Trên heo
Có thể thấy một vài triệu chứng lâm sàng ở heo con nhiễm virut VNNB
như: nhiệt độ tăng lên 39oC trong 3 ngày, biếng ăn, bồn chồn, run và co giật
(Kyoguko và ctv, 1986)
Heo trưởng thành và heo nái bị nhiễm, triệu chứng không đặt trưng. Tuy
nhiên có một số biểu hiện khác thường ở các lứa đẻ của heo nái mang thai bị
nhiễm bệnh như: trong lứa có nhiều thai khô, heo con yếu ớt với triệu chứng

thần kinh như run co giật rồi chết. Thai khô có nhiều kích cỡ khác nhau; thai
chết còn có thể thấy phù thủng dưới da, heo con yếu ớt, run, ứ nước dưới da, ở
não (Shimuzi và ctv,1954), có triệu chứng thần kinh và chết sau một vài ngày.
Sự sẩy thai không phải là biểu hiện đặt trưng của sự viêm nhiễm bên trong tử
cung.
Heo đực bị nhiễm có thể bị viêm dịch hoàn, thủy thủng, mào tinh cứng và
có thể giảm tính dục và thải virut qua tinh dịch. Các heo nọc này giảm thể tích
tinh dịch, số lượng tinh trùng và có nhiều tinh trùng bị dị dạng. Trong phần
lớn trường hợp việc giảm sút chỉ tạm thời và sau đó sẽ phục hồi hoàn toàn
nhưng trong một số trường hợp nghiêm trọng có thể ảnh hưởng đến khả năng
sinh sản.
Trên ngựa.
Thời gian nung bệnh 7-10 ngày.Con vật có triệu chứng sốt 40oC_41.5oC.
bị nhiễm, ngựa bỏ ăn, khó nuốt, xuất huyết lấm chấm ở niêm mạc hoặc da
tâmKhi
Học
liệubịĐH
@ Tài
tập
nghiên
cứu
và niêm mạc
vàng.Cần
NhữngThơ
triệu chứng
thầnliệu
kinh học
như mất
điềuvà
hoà,

loạn
choạng, cổ cứng tạm thời và bại liệt (Hồ Thị Việt Thu,2006). Bệnh thường dẫn
đến chết sau 15 đến 20 ngày, cũng có trường hợp thú lành bệnh nhưng thường
có các di chứng thần kinh (Salle và ctv, 1999)
Trên người
Bệnh gây viêm não, tiểu não và tuỷ sống . Bệnh nhân có triệu chứng sốt,
nhức đầu, cứng gáy, thay đổi cảm giác, ói mửa, mắt mờ, mất ngủ hoặc ngủ li
bì. Tỉ lệ chết khoảng 10-30% và đáng lo ngại là có đến 50% bệnh nhân khỏi
bệnh mắc di chứng thần kinh. Hiện tượng sẩy thai cũng được ghi nhận trên
phụ nữ có mang (Nguyễn Chương, 1996).
2.6.2 Bệnh tích
Bệnh tích đại thể.
Heo nái bị nhiễm không có bệnh tích không được ghi nhận. Tuy nhiên một
số bệnh lý được ghi nhận ở các lứa đẻ bất thường của heo nái bị nhiễm bệnh
như: chết thai hoặc heo con sinh ra yếu ớt do viêm não tích dịch, phù thủng
dưới da, tràn dịch xoang ngực, xuất huyết điểm ở màng tương, hoại tử điểm ở
gan và lách, sung huyết màng não hoặc tuỷ sống ( Burns, 1950) hơn nữa vỏ
não cực mỏng trong một vài trường hợp viêm não tích dịch (Shimiju và ctv,
1954)
Bệnh tích vi thể
Bệnh tích vi thể quan trọng thể hiện ở hệ thống thần kinh trung ương bao
gồm: viêm não không mưng mủ với điểm đặc trưng là sự xâm nhập xung

16


Trung

quanh mạch của các loại tế bào: Đơn nhân lớn, tế bào lympho, tế bào plasma,
bào tương và tế bào thần kinh đệm thoái hoá, viêm màng não.

Ở heo nọc, bệnh tích vi thể là ứ nước, viêm với sự xâm nhiễm ở của nhiều
tế bào ở mô kẻ của mào tinh và màng bao dịch hoàn. Thường thấy những biến
đổi thoái hoá ở biểu mô ống sinh tinh.
2.7 Các phương pháp chẩn đoán
2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào dịch tể học: Vùng bị bệnh đe doạ, mùa, mật độ muỗi
Triệu chứng bệnh: heo nái thường sẩy thai, thai khô, heo con yếu ớt có
những triệu chứng thần kinh trong ổ đẻ có những triệu chứng bình thường.
Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh gây rối loạn sinh sản khác như: bệnh
do porcine parvoviris, bệnh Aujeszki, bệnh do toxoplasma, bệnh dịch tả, bệnh
do leptospira… Không có triệu chứng bệnh ở heo mẹ và sự phân bố bệnh theo
mùa là đặc điểm riêng được dùng để phân biệt rối loạn sinh sản do virút
VNNB với những nguyên nhân khác.
2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Phân lập virut trên tế bào nuôi cấy
Não của thai chết hoặc thai sẩy và nhau là những bệnh phẩm thường dùng
trong phân lập virút, bệnh phẩm cần được bảo quản trong lạnh và phải được
vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Bệnh phẩm não cần được chia làm đôi
cho việc thực hiện phiến đồ tổ chức, đồng thời cần thu thập mẫu huyết thanh
từ thai chết, thai sẩy và cả huyết thanh của heo mẹ. Huyết thanh của heo mẹ
những
đẻ bất
thường
do virut
viêmliệu
não Nhật
có và
hàmnghiên
lượng cao cứu
tâmtrong

Học
liệulứaĐH
Cần
Thơ
@ Tài
họcBản
tập
kháng thể thường không bền với 2-mercaptoethanol lúc đẻ (Otsuka và ctv,
1966).
Bệnh phẩm đã chuẩn bị được phân lập bằng cách tiêm vào não chuột 1-5
ngày tuổi, chuột có triệu chứng thần kinh và chết trong thời gian từ 4 ngày đến
14 ngày. Thu hoạch não chuột chết và bảo quản ở -80oC dùng làm kháng
nguyên. Kháng nguyên này được truyền cấy tiếp qua tế bào muỗi và một tế
bào khác.
Phản ứng khuyếch đại chuỗi gen ( RT_PCR Reverse Transcription
Polymerase chain reaction)
RT_PCR là sự kết hợp giữa phản ứng tổng hợp dây chuyền với phản ứng
phiên mã ngược, giúp khuyếch đại cDNA từ RNA . Sau khi phản ứng phiên
mã ngược kết thúc, sản phẩm cDNA sẽ được khuyếch đại nhiều lần trong phản
ứng PCR là phản ứng khuyếch đại DNA theo hàm mũ. Đây là kỹ thuật đặc
biệt quan trọng để định lượng RNA
+ Phản ứng RT:
Là phản ứng phiên mã ngược dùng để chuyển mạch RNA của virut thành
cDNA là nguyên liệu trong phản ứng PCR
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng RT
• RNA tinh chế : Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ .Vì
vậy cần phải loại bỏ các chất làm ảnh hưởng đến RNA tinh chế là Rnaz
(ribonucleases) nội bào bằng cách bổ sung chất ức chế Rnaz để tăng lượng
cDNA đích.

17


• Enzymee phiên mã ngược: Là enzymee xúc tác phản ứng RNA
thành cDNA từ khuôn RNA theo chiều 5’_3’, khi có mặt của mồi. Hiện nay
ngoài thị trường, enzymee phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV (Avian
Myeloblastosis Virut) và MMLV ( Moloney Murine Leukemia Virut)
• Mồi:Có 3 loại mồi thường dùng trong phản ứng RT: mồi ngẫu
nhiên, mồi oligo(dT) và mồi chuyên biệt.
+ Phản ứng PCR

Trung

Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR
dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước, mỗi bước kéo dài
khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau :
+ Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên cao hơn nhiệt Tm của phân tử ,
thường là khoảng 940C – 95oC để làm biến tính nucleic acid đích từ dạng sợi
đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biến tính
(denaturation) DNA đích.
+ Kế đó là giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc này nhiệt độ trong buồng ủ
PCR hạ xuống ( thấp hơn Tm của mồi) thường khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc
vào Tm của các mồi sử dụng, để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên
tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích. Đây là giai đoạn quyết
định nên tính đặc hiệu thì những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu.
+ Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng
lên khoảng 720C là nhiệt độ tối hảo để men polymerase chịu nhiệt xúc tác
phản ứng tổng hợp bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn
các sợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai
tâmlà

Học
liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
đoạn bắt cặp).
Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử
nghiệm PCR đã tổng hợp được N.2n bản sao. Với một số lượng bản sao, hay
còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon, lớn như vậy (trên 109
bản sao sau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp
phát hiện nucleic acid
Các thành phần của phản ứng PCR là :
- Deoxynucleoside triphosphat (dNTP): có cấu tạo gồm một đường
deoxyribose có gắn với 1 bazơ ở vị trí C1 gồm có các loại dATP ( gắn với
Adenine), dTTP (gắn với Thymine), dCTP (gắn với Cytosine), dGTP(gắn với
Guanine). 3 phân tử phosphate (triphosphat) được gắn tại C5 của phân tử
deoxyribose và đây chính là nơi dNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi bổ xung trên
chuỗi đích. Năng lượng được dùng cho phản ứng này được lấy từ các nối
phosphate giàu năng lượng của triphosphat trên dNTP. Ngoài ra dNTP còn
gắn với Mg2+ vì vậy còn phụ thuộc vào nồng độ MgCl2
- cDNA khuôn: sản phẩm của phản ứng phiên mã ngược RT là chuỗi
acid nucleic mà phản ứng PCR khuyếch đại lên để chúng có thể được phát
hiện trong bệnh phẩm.
- Dung dịch đệm: thường sử dụng dung dịch muối đệm là MgCl2 Nồng
độ MgCl2 sẽ ảnh hưởng đến độ chuyên biệt và lượng sản phẩm vì vậy cần phải
tối ưu hoá nồng độ MgCl2 .
- DNA polymerase chịu nhiệt: là những men polymerase ly trích từ các
vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus gọi là Taq polymerase. Nhược
18


Trung

điểm của Taq polymerase là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao
chép DNA, dẫn đến những đột biến trong chuỗi DNA .Có những men
polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi
nucleic acid bổ sung (3-5exonuclease). Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq
polymerase và proofreading có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn độ chính xác
của DNA.
- Mồi (primer): hay còn gọi là amplifier (nhân tố khuyếch đại) là đoạn
DNA đơn có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn
kết thúc của chuỗi DNA đích. Primer có hai vai trò
+ Quyết định tính đặc hiệu của chuỗi đích.
+ Khởi động men polymerase, vì men này sẽ chỉ bắt đầu tổng hợp sợi
bổ sung cho chuỗi DNA đích khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà
nó xúc tác cho 1 dNTP gắn vào). Thông thường trong phản ứng PCR
người ta thường dùng một cặp mồi là mồi xuôi (down stream prime) và
mồi ngược (up stream prime)
Việc chọn mồi phải tuân thủ một số nguyên tắc:
- Trình tự các nucleoic của mồi được chọn không có sự bắt cặp bổ sung
giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp
bổ sung giữa các thảnh phần khác nhau của mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa.
- Thành phần nucleoic của các mồi phải cân bằng , phải tránh các cặp G
và C lặp lại nhiều lần.
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuyếch đại, không
vớiliệu
trình ĐH
tự lặpCần
lại trênThơ
gen. (Hồ
Thuỳhọc
Dương,

1998)
tâmtrùng
Học
@ Quỳnh
Tài liệu
tập
và nghiên cứu
2.7.3 Xét nghiệm huyết thanh học
Phản ứng ức chế ngăn kết hồng cầu (HI_ Haemagglutination inhibition
test)
Được xây dựng bởi Clacke và Casals năm 1958. Nguyên lý của phản ứng
này là: Dùng một lượng hồng cầu đã gắn kháng nguyên đã biết cho gắn với
một lượng nhất định kháng thể đặc hiệu đã biết. Nếu trước khi làm phản ứng
kháng thể này được ủ với bệnh phẩm (có kháng nguyên đặc hiệu) thì kháng
thể đã bị bão hoà bởi kháng nguyên. Tiếp đó, nếu cho kháng thể đã bảo hoà
này làm phản ứng, thì không còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu, khi đọc
kết quả nếu không có hiện tượng ngưng kết hồng cầu thì có nghĩa là phản ứng
đó dương tính (Trích dẫn Đặng Đức Trạch và ctv, 1987). Tiền thân của
phương pháp xét nghiệm này là phản ứng ngưng kết hồng cầu ( HA) Vì virut
VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loài lông vũ (ngỗng,
gà..). Dùng phản ứng HA để định lượng và chuẩn độ kháng nguyên virut
VNNB
Virut VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ở pH nhất định. Khi loại
bỏ những yếu tố ức chế ngăn kết hồng cầu ( không đặc hiệu) bằng cách xử lý
với aceton, ether hoặc kaolin trước khi thực hiện phản ứng HI (Monath và ctv,
1970)
Xét nghiệm này có ưu điểm đơn giản dễ làm. Do đó thường được dùng
nhất trong chẩn đoán bệnh VNNB. Tuy nhiêm gặp một số bất lợi vì khó đạt

19

Trung

trình độ chính xác cao do phản ứng chéo với các Flavivirus có đặc tính kháng
nguyên gần gũi với với virut VNNB
Phản ứng MAC-ELISA (antibody capture enzyme linked
immunosorbent assay)
Đây là một xét nghiệm đơn giản, cho kết quả nhanh và không đòi hỏi các
thiết bị quá phức tạp. MAC_ELISA dựa trên nguyên tác phát hiện các kháng
thể IgM đặc hiệu với virut VNNB, kháng thể này xuất hiện khi cơ thể vứa mới
mắc bệnh và phát triển nhanh hơn so với kháng thể IgG. Xét nghiệm này có độ
nhạy là 73% và tính đặc hiệu là 95%. Ngoài ra còn có thể khắc phục được hiện
tượng phản ứng chéo giữa các kháng thể IgG của các Flavivirus.Một cách tóm
tắt phản ứng được thực hiện như sau: sử dụng IgG dê kháng IgM của heo gắn
trên tấm nhựa 96 giếng đáy bằng, ủ qua đêm. IgM có trong mẫu xét nghiệm sẽ
kết hợp với IgG kháng IgM của heo. Nếu mẫu có IgM đặc hiệu kháng virút
VNNB, nó sẽ kết hợp với kháng nguyên VNNB ở những bước tiếp theo. Khi
cho IgG kháng virút VNNB có gắn emzyne, nó sẽ kết hợp với kháng nguyên
này nó sẽ cho một phức hợp không màu. Khi có mặt cơ chất, emzyne sẽ hoạt
hoá cơ chất sinh ra có màu. Sự có mặt của IgM đặc hiệu kháng virút VNNB
trong huyết thanh được thể hiện gián tiếp bởi mật độ quang (Optical densityOD) được ghi nhận bằng máy đo quang phổ.
Phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử ( PRNT _ Plaque reduction
Neutralization Test)
Đây là phản ứng xét nghiệm có độ đặc hiệu và độ nhậy cao nhất trong chẩn
đoán virut VNNB. Các dòng tế bào LLC_MK2, Vero hay BHK-21 thường
tâmđược
Học
liệu
ĐHđịnh

Cần
@thể
Tài liệu học tập và nghiên cứu
dùng
để xác
hiệu Thơ
giá kháng
Nguyên tắc của phản ứng này là dùng lượng vi khuẩn chuẩn biết trước
nồng độ cho trung hoà với kháng thể cần xác định hiệu giá. Đem cấy hỗn hợp
virut- kháng thể này vào tế bào sau đó phủ thạch.
Phản ứng trung hoà này ít được dùng trong chẩn đoán huyết thanh vì rất
đắt tiền và khó thực hiện, mặc dù phản ứng này được coi là có độ nhạy và đặc
hiệu nhất.
Phản ứng hoá mô miễn dịch
Đây là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc phát hiện kháng nguyên
virut viêm não Nhật Bản trong tổ chức bệnh và dùng chẩn đoán trong trường
hợp không thể thực hiện được các xét nghiệm huyết thanh hoặc phân lập virút.
Có rất nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virut trong mô
của bệnh phẩm: kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp, kỹ thuật huỳnh quang gián
tiếp, kỹ thuật kết nối men peroxidase và kết nối alkaline phosphatase (Hồ Thị
Việt Thu, 2006).
2.8 Phòng và trị bệnh
2.8.1 Trị bệnh
Chưa có thuốc điều trị đặc hiệu. Tuy nhiên có 3 loại sản phẩm được
nghiên cứu trên động vật về tính hiệu quả trong điều trị bệnh VNNB: Kháng
thể đơn dòng, kháng virut và interferon. Kháng thể đơn dòng cho thấy có hiệu
quả trên động vật (Kimur-Kuroda và Yasui, 1988; Zhang và ctv, 1989). Trên

20

Trung

người, việc sử dụng tái tổ hợp interferon-α-A trong điều trị bước đầu cho kết
quả khả quan.
2.8.2 Phòng bệnh
Do chưa có thuốc đặc trị nên phòng bệnh là cách tốt nhất để hạn chế sự lây
lan bệnh VNNB. Phá vỡ chu trình truyền bệnh trong tự nhiên là biện pháp tốt
nhất.
Kiểm soát nhân tố trung gian truyền bệnh
Diệt muỗi và ấu trùng muỗi bằng các hoá chất. Tuy nhiên có thể gây ra
hiện tượng kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường.
Ngoài ra còn có thể áp dụng các biện pháp khác như:
- Loại bỏ những nơi có nước đọng không cho muỗi sinh sản
- Chuồng trại chăn nuôi phải cách xa khu dân cư
- Nuôi tôm cá trên ruộng lúa
- Tránh muỗi đốt cho heo bằng cách sử dụng lưới chắn muỗi vào ban
đêm
- Không dùng tinh của nọc mắc bệnh
Tiêm phòng vaccine
Tiêm phòng vaccine cho đàn heo giống là biện pháp phòng ngừa tốt nhất.
Heo nọc và cái hậu bị trước khi sử dụng làm giống cần phải được tiêm ngừa
trước khi phối giống.. Ngoài ra việc tiêm phòng trên heo có thể giảm tỷ lệ mắc
bệnh trên người. Có nhiều loại vaccine giảm độc lực đã được nghiên cứu và sử
dụng rộng rãi trong việc phòng bệnh VNNB trên heo. Vaccine phòng bệnh
nãoliệu
Nhật ĐH
Bản có
thể sửThơ
dụng đồng

thời liệu
với cáchọc
vaccine
vaccine cứu
tâmviêm
Học
Cần
@ Tài
tậpkhác
vànhư
nghiên
dịch tả heo, vaccine Parvovirus…

21


CHƯƠNG III
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trung

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ 4/2006 –7/2007
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu
- Trại chăn nuôi heo tập trung
+ Trại chăn nuôi Vĩnh Khánh_ An Giang
+ Trại chăn nuôi Phước Thọ_Vĩnh Long
- Phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm Bộ môn Thú Y-khoa Nông NghiệpTrường Đại Học Cần Thơ
- Phòng Arbovirus, viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh

3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi
- Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virut VNNB trên heo bằng phản ứng
HI và MAC_ELISA trên heo nái có biểu hiện rối loạn sinh sản
- Kiểm tra kháng thể kháng kháng virut VNNB từ dịch xoang ngực của thai
chết và huyết thanh của heo con từ các lứa đẻ rối loạn sinh sản
- Phát hiện virut VNNB bằng kỹ thuật RT_PCR
3.2 Phương tiện và phương pháp tiến hành thí nghiệm
3.2.1 Vật tư và thiết bị
Vật tư
tâm Học liệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
- Ống tiêm y tế 5-12ml, kim tiêm số 22G, 20G, 18G
- Ống nghiệm vô trùng, týp nhựa đựng huyết thanh
- Đĩa 96 giếng đáy hình chữ U và đáy bằng.
- Thùng trữ lạnh, nước đá khô, dây khớp mõm
- Cối, chày, cồn 70o, bông gòn vô trùng
- Micropipett 0.5-10µm, 25-100µm, 5-50µm,50-300µm
- Pipet vô trùng: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml
- Plate nhựa MaxiSorp 96 giếng đáy bằng của NUNC - IMMUNO PLATE.
Thiết bị
- Tủ đông - 20oC, - 80oC
- Máy ly tâm, máy ly tâm lạnh vận tốc cao, máy autoclave
- Haematocrte
- Máy đo pH, máy đọc ELISA EL x 800 và máy rửa EL x 50 của Sanofi,
máy nhân gen
- Tủ ấm 28oC, 37oC, tủ cấy vô trùng
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
Lấy và bảo quản mẫu
• Phương pháp chọn mẫu
+ Lấy bệnh phẩm từ nái mẹ

Đối với nái sẩy thai: lấy máu khi heo mới sẩy thai

22


Trung

Đối với nái đẻ thai khô, thai chết, heo con yếu có triệu chứng thần kinh
(chưa bú sữa đầu) lấy máu một lần sau khi đẻ.
+ Lấy mẫu bệnh phẩm từ heo con, thai chết, thai khô
Trước khi tiến hành lấy mẫu, cần ghi nhận tổng số và đo kích thước của
từng thai
Đối với heo con yếu và chết trước khi bú mẹ, tiến hành lấy máu tim hoặc
dịch xoang ngực và não
• Phương pháp lấy mẫu
+ Lấy máu heo
Khớp mõm, cố định heo sao cho toàn thân heo thành một đường thẳng, hai
chân trước hơi dang rộng sang hai bên kéo cho đầu ngẩng cao.
Sát trùng vị trí lấy máu
Dùng ống tiêm vô trùng 12ml và kim số 18 để lấy máu. Xác định vị trí lấy
máu ở tĩnh mạch cổ heo: là chỗ hõm sâu nhất ngay dưới cổ, kim đâm vào phải
thẳng góc, nếu đúng vị trí máu ra rất nhẹ và nhanh.
Lấy kim ra, bơm nhẹ cho máu chảy theo thành ống nghiệm đã được vô
trùng, để máu đông tự nhiên. Sau đó bảo quản ở bình trữ lạnh. Máu được ly
tâm để chiếc lây huyết thanh.
Huyết thanh được chiết vào các type nhựa vô trùng và trữ lạnh ở -20o
+ Lấy máu dịch xoang ngực
Dùng kéo cắt 1 đường giữa ngực, dùng ống tiêm vô trùng hút lấy dịch
trong của xoang ngực cho vào túp nhựa vô trùng bảo quản –20oC.
tâm Học liệu+ĐH

Cần
Lấy mẫu
nãoThơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Sát trùng vùng đầu bằng cồn 70oC, dùng cưa vô trùng cắt xương sọ, bộc lộ
não, dùng kéo và pen vô trùng lấy não bao gồm bán cầu não, tiểu não và hành
tuỷ cho vào tube nhựa.
Mẫu não được bảo quản ở -80oC.
Phương pháp xét nghiệm
Sử dụng kỹ thuật RT_PCR để phát hiện hệ của virut VNNB
Dùng kỹ thuật HI và MAC_ELISA để phát hiện kháng thể kháng virut
VNNB từ huyết thanh của heo mẹ và từ dịch xoang ngực (hoặc huyết thanh)
của heo con
3.2.3 Các kỹ thuật trong phòng thí nghiệm
Thực hiện phản ứng HI (Haemagglutination inhibition test)
+ Hoá chất xét nghiệm
Natri citrát, Natri clorua, Véronal (axit 5,5 diethyl barbiturique), Gélatine,
Natri véronal, Canxi clorua, axit boric, NaOH, Na2HPO4 . 12H2O,
NaH2PO4.2H2O.
+ Tiến hành
Bước 1: Lấy, rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng
- Máu ngỗng lấy từ tĩnh mạch cánh, trước khi lấy phải sát trùng vị trí lấy máu.
- Lấy 1.5ml chất chống đông Alsever vào ống kim 12ml, rút từ tĩnh mạch cánh
ngỗng 8,5ml máu, lác nhẹ để máu được trộn đều với chất chống đông.

23


Trung

- Một khối lượng máu toàn phần + 2,5 khối lượng DGV (Dextrose Gélatin

Véronal), lắc nhẹ để trộn đều, quay ly tâm 1.000vòng/phút, trong 15 phút, bỏ
nước nổi trên.
- Hoà hồng cầu 3 khối lượng DGV, lắc nhẹ để trộn đều, quay ly tâm 1.000
vòng/phút, trong 15 phút, bỏ nước nổi trên. Rửa tiếp hai lần nữa với DGV
(tổng cộng 4 lần rửa).
- Dùng Hematocrit để xác định tỉ lệ hồng cầu, sau đó pha hồng cầu 8% trong
DGV để bảo quản ở nhiệt độ 40C.
- Hồng cầu được tiếp tục pha loãng trong VAD (theo tỉ lệ 1/24 khi sử dụng
trong phản ứng HA và HI (Hồng cầu 0,33%).
Bước 2: Xử lý huyết thanh
Mục đích: là để loại bỏ chất kiềm hãm chất ngưng kết hồng cầu không đặc
hiệu trước khi làm phản ứng.
• Hoá chất:
- Hồng cầu ngỗng đặc.
- Dung dich Borat pH = 9.
- Dung dịch Kaolin 25%.
• Xử lý huyết thanh.
- Hấp thụ Kaolin: Dùng micropipet hút lấy 0,1ml huyết thanh cho vào ống
nghiệm vô trùng + 0,4ml dung dịch Borat (pH=9) + 0,5ml dung dịch Kaolin,
lắc kỹ hỗn dịch 5 phút một lần trong 20 phút, ly tâm 1.500 vòng/phút trong 15
phút, hút lấy phần nước trong ta được huyết thanh pha loãng 1/10.
tâm- Học
liệu
Cần
@huyết
Tài thanh
liệu đã
học
nghiên
Hấp thụ

chấtĐH
ngưng
kết: Thơ
Cho 1ml
phatập
loãngvà
1/10
vào ống cứu
nghiệm vô trùng, cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc, lắc nhẹ cho đều, để
trong nước đá tan, cho tiếp xúc 20 phút, ly tâm 1.500 vòng/phút, trong 10
phút, hút lấy phần nước trong bên trên cho vào tube nhựa vô trùng, ta được
huyết thanh đã xử lý. Trữ huyết thanh ở nhiệt độ (-200C).
Bước 3: Thực hiện phản ứng HA
• Thành phần phản ứng HA
- Kháng nguyên chuẩn chủng Nakayama pha loãng 1/10 trong dung
dịch Borat.
- Dung dịch Borat.
- Hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% trong dung dịch VAD.
• Tiến hành phản ứng
- Cho vào tất cả 12 lỗ của đĩa microplate 0,05ml dung dịch Borat, tiếp tục cho
vào lỗ thứ nhất 0,05ml kháng nguyên đã pha loãng 1/10, trộn đều, hút 0,05ml
sang lỗ thứ hai, trộn đều, hút 0,05ml sang lỗ thứ 3… tiếp tục như thế đến lỗ
thứ 12 thì bỏ đi 0,05ml. Sau đó cho vào mỗi lỗ đã có kháng nguyên 0,05ml
hồng cầu ngỗng 0,33%, lắc tấm nhựa để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu,
để ở nhiệt độ phòng, sau một giờ đọc kết quả của phản ứng HA.
• Đọc kết quả phản ứng HA
- Dương tính 4(+): khi hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả đáy lỗ.
- Dương tính 3(+): đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng, nhưng đáy lỗ
còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành hình nhẫn.

24