KHẢO sát tỷ lệ NHIỄM VIRUS VIÊM não NHẬT bản TRÊN dơi BẰNG PHẢN ỨNG ức CHẾ NGƯNG kết HỒNG cầu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN THẾ VŨ

KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM VIRUS VIÊM NÃO NHẬT BẢN
TRÊN DƠI BẰNG PHẢN ỨNG ỨC CHẾ
NGƯNG KẾT HỒNG CẦU

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, Tháng 6/2008


CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trung

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm do virus lây
truyền qua muỗi. Trước đây, người ta luôn đặt câu hỏi: bằng cách nào mà virus có
thể tồn tại trong một quãng thời gian dài khi ký chủ không hoạt động trong suốt
mùa đông.
Qua một thời gian dài nghiên cứu, người ta đã đặt ra giả thuyết cho rằng
những động vật ngủ đông (dơi, các loài bò sát…) là nơi khu trú cho virus và là một
bằng chứng cho sự sống sót của chúng trong suốt mùa đông. Từ đó, việc nghiên
cứu về các động vật trên như là một nguồn bệnh trong tự nhiên ảnh hưởng đến sức
khoẻ của con người. Dơi được xem như là một động vật lý tưởng cho giả thuyết
này.

Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long, tỷ lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên
dơi vẫn chưa được xác định. Để hiểu rõ vai trò của dơi trong chu trình truyền bệnh
và để phòng bệnh trên người, được sự đồng ý của Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus viêm não
Nhật Bản trên dơi bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu” với mục đích:
 Xác định tỷ lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên 2 loài dơi: dơi
tâm
Học
Liệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
sen và dơi muỗi bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu.
 Tìm hiểu vai trò của dơi trong chu trình truyền bệnh.

1


CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN

Trung

2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản
Viêm não Nhật Bản là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi siêu vi trùng
thuộc nhóm Arbovirus có tính hướng tế bào thần kinh. Virus lây truyền từ động vật
qua người nhờ trung gian là muỗi (chủ yếu là muỗi Culex tritaeniorhynchus). Bệnh
có thể xảy ra rải rác hay thành dịch.
Bệnh đã được nói tới vào đầu thập niên 1870 tại Nhật Bản, nhưng mãi đến
năm 1924 người ta mới biết rõ về bệnh qua một trận dịch lớn với 6.000 trường hợp
mắc bệnh và tỷ lệ tử vong hơn 60%, được gọi là "viêm não mùa hè" (Buescher và
cộng sự, 1959).
Năm 1935, người ta phân lập được virus từ não của một bệnh nhân tử vong

tại Tokyo và cung cấp được chủng Nakayama nguyên mẫu. Virus này được gọi là
virus viêm não Nhật Bản B do có liên quan đến dịch viêm não mùa hè tại Nhật Bản
và để phân biệt với virus gây bệnh viêm não ngủ Von Economo có bệnh cảnh lâm
sàng và đặc điểm dịch tễ khác hẳn, do một loại Arbovirus thuộc nhóm A. Bệnh cũng
được ghi nhận tại các trận dịch trên người tại Hàn Quốc vào năm 1949, Ấn Độ và
Nepal
vào năm
1978
(Chu
và Joo,
1992).
tâm
Học
Liệu
ĐH
Cần
Thơ
@ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), hàng năm có khoảng 50.000 trường hợp
mắc bệnh viêm não Nhật Bản và có 10.000 trường hợp tử vong (trích dẫn của
Cheong Yock Loon D.V.M, 1999).
Hầu hết các động vật nuôi đều cảm nhiễm với virus, bao gồm: ngựa, bò, cừu,
dê và heo. Các động vật khác như thỏ, chuột, bồ câu, chó, vịt, gà, chim hoang và bò
sát cũng cảm nhiễm. Trong đó, heo là nguồn quan trọng nhất cho sự nhân lên của
virus trong tự nhiên (Chu và Joo, 1992), bệnh gây ra hiện tượng thất bại sinh sản
cho heo nái mang thai như: sẩy thai, thai khô, thai chết, heo con sinh ra yếu ớt và có
triệu chứng thần kinh, bệnh còn gây viêm cơ quan sinh dục ở heo đực và co giật ở
heo dưới 6 tháng tuổi.
Trên người, bệnh thường xảy ra ở thể nhẹ nhưng có thể gây chết ở trẻ em và
sẩy thai ở phụ nữ mang thai (Chaturvedi và cộng sự 1980). Ngoài ra bệnh còn gây

ra hiện tượng viêm não, viêm màng não, viêm sừng trước tủy sống, viêm não màng
não hoặc viêm não màng não tủy sống (chủ yếu ở trẻ em). Ngựa bị mắc bệnh có
bệnh tích trên hệ thần kinh trung ương, bệnh tích tương tự cũng được tìm thấy ở khỉ
và lừa, các loài động vật khác không có biểu hiện triệu chứng (Chu và Joo, 1992).

2


Tại Việt Nam, virus viêm não Nhật Bản lần đầu tiên được phân lập từ lính
viễn chinh Pháp vào năm 1952. Năm 1953, Puyuelo và Prévot đã báo cáo sơ bộ
việc phân lập được virus VNNB B trong quân đội Pháp và virus này đã được định
loại tại Tokyo (trích dẫn của Đỗ Quang Hà, 1965).
Trong thập kỷ 1960, có nhiều trận dịch viêm não siêu vi được gọi là hội
chứng viêm não cấp tính gọi tắt là hội chứng não cấp, xảy ra tại hầu hết các địa
phương ở miền Bắc, nhất là ở miền trung du và vùng đồng bằng châu thổ sông
Hồng, có nơi tỷ lệ mắc bệnh hằng năm lên tới 6 - 10/100.000 dân với tỷ lệ tử vong
từ 5,7% - 28,5% và siêu vi viêm não Nhật Bản là tác nhân gây ra 50% - 70% hội
chứng não cấp. Tại miền Nam, viêm não siêu vi xảy ra rải rác quanh năm, số mắc
cao nhất vào năm 1980 với tỷ lệ 4,95/100.000 dân và tỷ lệ tử vong 27,46%, thường
tập trung nhiều ở đồng bằng sông Cửu Long, vựa lúa của cả nước, nơi có thói quen
nuôi heo gần nhà, kết quả báo cáo sơ bộ của các bệnh viện tại thành phố Hồ Chí
Minh cho thấy: từ 64% - 69% hội chứng não cấp nhập viện do virus viêm não Nhật
Bản, với tỷ lệ tử vong vào khoảng 16% (trích dẫn của Bùi Đại và cộng sự, 2002).

Trung

2.2 Đặc điểm của bệnh viêm não Nhật Bản
2.2.1 Dịch tễ
tâm Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Tính chất dịch tễ của bệnh viêm não Nhật Bản được Konno miêu tả chi tiết
vào năm 1966 (trích dẫn của Chu và Joo, 1992), đến năm 1973 Self và cộng sự đã
nhận thấy rằng sự nhiễm virus viêm não Nhật Bản được duy trì trong chu trình bao
gồm: muỗi (chủ yếu là Cx. tritaeniorhynchus), chim và động vật hữu nhũ.
Tại các ổ dịch viêm não Nhật Bản ở người thì người ta nhận thấy rằng động
vật trong cùng khu vực có tỷ lệ nhiễm virus rất cao (Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn
Thiện, 2004).
Bệnh phát triển mạnh ở các nước: Nhật Bản, vùng viễn đông của Nga, Hàn
Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, Philippin, Indonesia, Singapore, Malaysia, Hồng
Kông, Việt Nam, Lào, Bangladesh, Nepal, Thái Lan, Burma, Srilanka, Ấn Độ và
một số đảo thuộc Thái Bình Dương (Chu và Joo, 1992).
Năm 1969, Petrixepva chia ra làm các dạng ổ dịch như sau: ổ dịch vùng đồng
cỏ (thảo nguyên), ổ dịch vùng biển, ổ dịch vùng cận rừng núi và ổ dịch vùng rừng
núi (trích dẫn của Bùi Đại và cộng sự, 2002).
Trong tự nhiên virus tồn tại theo chu trình “ Động vật có xương sống- muỗiđộng vật có xương sống”, chủ yếu là nhờ những con vật mang virus không biểu
hiện triệu chứng lâm sàng (Chu và Joo, 1992).

3


Trung

Sự phân bố bệnh theo mùa:
Vào mùa mưa, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và
phát triển mạnh trong thiên nhiên, trùng hợp với thời điểm bệnh xảy ra nhiều.
Vào mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 270C – 300C, virus thường phát
triển tốt trong cơ thể muỗi, nếu dưới 200C thì sự phát triển của virus dừng lại.
Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và lượng mưa cũng có ảnh hưởng đến
tình hình bệnh. Do đó, ở Việt Nam mô hình dịch tễ lại có sự khác biệt rất lớn giữa
2 miền Nam và Bắc. Tại miền Bắc, bệnh giảm vào các tháng lạnh nhưng lại tăng

vào những tháng hè và đỉnh cao là vào các tháng 5, 6 và 7, trong khi miền Nam thời
tiết nóng nên bệnh xảy ra rải rác quanh năm (Đoàn Hải Yến và Phan Thị Ngà,
2002).
Phân bố theo tuổi và giới tính:
Người chưa có miễn dịch, ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh. Ở những
vùng có bệnh viêm não Nhật Bản lưu hành, tỷ lệ mắc bệnh thường cao ở trẻ từ 2 10 tuổi, phần đông ở thể không có triệu chứng lâm sàng, số lượng trẻ có kháng thể
đặc hiệu tăng theo tuổi nên tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ lớn và người lớn. Bệnh không
liên quan tới giới tính nhưng trong thực tế số bệnh nam thường nhiều hơn nữ.
Tuy chu trình sinh thái của virus viêm não Nhật Bản trong thiên nhiên không
tâm
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
thay đổi, nhưng tình hình dịch tễ có biến đổi trước tác động của con người, như thay
đổi lề lối canh tác và chăn nuôi… Chẳng hạn, tại Đồng Bằng Sông Cửu Long, tháng
12 và tháng 1 mặc dù không mưa nhưng do sự giữ nước và bón phân trên đồng
ruộng cho vụ Đông Xuân đã làm mật độ muỗi gia tăng (Hồ Thị Việt Thu, 2008).

Hình 2.1 Bản đồ phân bố dịch tễ của bệnh viêm não Nhật Bản
( Nguồn: www.cdc.gov/travel/image.ashx)

4


2.2.2 Căn bệnh học
2.2.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc
Virus viêm não Nhật Bản là một Flavivirus, trước đây nó được xếp vào họ
Togaviridae thuộc nhóm B của Arbovirus, nhưng hiện nay nó được xếp vào họ
Flaviviridae. Có khoảng 60 loài Flavivirus nhưng chỉ có 3 loài có ý nghĩa trong thú
y là virus viêm não Nhật Bản, virus gây bệnh Louping và virus gây bệnh
Wesselsbron (Chu và Joo, 1992).

HìnhCần
2.2 Cấu
trúc @
virus
viêm
não học
Nhật tập
Bản và nghiên cứu
Trung tâm Học Liệu ĐH
Thơ
Tài
liệu
( Nguồn: www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/brgtherap/images/wnv_peyton_img5_e.gif)

Virus có kích thước nhỏ, hình cầu, đường kính trung bình khoảng 40 - 50
nm, qua lọc, hình thành vỏ capsid, vỏ bọc chứa một sợi ARN dương. Virus trưởng
thành có cấu trúc đối xứng 20 mặt, gồm 10.976 nucleotide tương đương 3.432
amino acid (trích dẫn của Chu và Joo, 1992).
Bộ gen chứa khoảng 11kb (kilo base) mã hóa cho 10 protein, trong đó có 3
protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc.
Ba protein cấu trúc là protein C (lõi), protein M (màng) và protein E (vỏ
ngoài).
Glycoprotein E của vỏ (54kDa) là protein nhỏ không có glycosylated M
(8kDa), gắn vào thụ thể tế bào và cũng là kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu,
tạo kháng thể trung hòa và gây đáp ứng miễn dịch tế bào. Có ít nhất 8 quyết định
kháng nguyên đã được tìm thấy trên protein E và một trong số đó biểu hiện tính đặc
hiệu của virus viêm não Nhật Bản (Kimura – Kuroda và Yasui,1986).
Protein C của capsid có khối lượng phân tử khoảng 13.000 Da, chứa 136
amino acid và giàu lysin. Protein C liên kết với ARN tạo thành phức hợp C- ARN.

5


Trung

Protein preM/M (tiền màng/màng). PrM có khối lượng phân tử 26 kDa, chứa
75 amino acid, là chất chưa được glycosyl hóa của protein M. PrM trải qua phân
cắt muộn tạo thành protein M và đoạn pr (đầu -NH2), đoạn này được tiết ra môi
trường ngoại bào. Sự phân cắt xảy ra trước hoặc khi virus chui ra khỏi tế bào.
Bảy protein phi cấu trúc là NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5.
NS1 là glycoprotein liên kết màng, chức năng của nó chưa được nghiên cứu
kỹ nhưng có lẽ nó tham gia vào quá trình sao chép sớm của virus. Đột biến ở
protein này cũng ảnh hưởng đến độc lực của virus.
NS2A và NS2B kỵ nước và có khả năng thay đổi, có chức năng giống màng
(trích dẫn của Lê Thị Thu, 2005).
NS3 là protein lớn thứ 2 trong hạt virus (68- 70 kDa), có hoạt tính enzym
proteaza, helicaza và ARN triphotphataza.
NS5 là protein cuối cùng được mã hóa bởi khung đọc mở, cũng là protein
lớn nhất (khoảng 104 kDa). Protein này cũng có hoạt tính enzym metyltransferaza
tham gia vào sự metyl hóa ở đầu 5’ và ARN-polymeraza. Có lẽ nó tham gia vào cấu
thành ARN-polymeraza phụ thuộc ARN.
2.2.2.2 Sự nhân lên của virus
Virus viêm não Nhật Bản có thể nhân lên trong các môi trường tế bào như
tâm
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
nguyên sợi bào phôi gà, tế bào thận chuột đất vàng (Baby hamster kidney - 21), tế
bào muỗi (C6/36).
Quá trình nhân lên của virus bao gồm các giai đoạn:

Hấp phụ và xâm nhập: virus di chuyển trong dịch gian bào để đến thụ thể
của tế bào dành cho glycoprotein E, sau đó xâm nhập vào tế bào theo cơ chế nhập
bào.
Tổng hợp các thành phần: sau khi cởi vỏ, ARN chuỗi dương được dùng
làm ARN thông tin để tổng hợp protein sớm (ARN- polymeraza). ARN chuỗi
dương cũng được dùng để tổng hợp ARN chuỗi âm bổ sung nhờ ARN- polymeraza
phụ thuộc ARN để tạo thành chuỗi RF (Replicative form) trung gian, rồi từ đó tổng
hợp chuỗi ARN dương theo nguyên tắc bán bảo tồn, đây là bộ gen của virus mới.
Sự tổng hợp ARN xảy ra trong tế bào chất. Các ARN mới tạo thành lại được dùng
làm mARN (ARN thông tin) để tổng hợp protein cấu trúc.
Quá trình lắp gáp và hoàn thiện virus diễn ra ở màng sinh chất, capsid hình
khối đa diện bên trong chứa một chuỗi ARN. Các virus tạo thành nằm trong các
nang của mạng lưới nội chất.

6


Trung

Giải phóng: Sau khi lắp ráp thành virus hoàn chỉnh, chúng tiến sát màng
sinh chất, phá vỡ tế bào để chui ra ngoài rồi lại tiếp tục chu kỳ nhân lên ở tế bào
mới.
2.2.2.3 Đặc tính kháng nguyên
Virus viêm não Nhật Bản có cấu trúc kháng nguyên gần giống với virus viêm
não Saint Louis, virus West Nile và virus viêm não Murray Valley (Kimura
- Kuroda và Yasui, 1986) thông qua sự tương đồng về nucleotide và các amino acid.
2.2.2.4 Sức đề kháng
Virus đề kháng kém với nhiệt độ: virus bị bất hoạt ở 560C trong 30 phút, ở
600C virus chết sau 10 phút, ở 700C chết sau 5 phút nhưng ở nhiệt độ rất lạnh
(-700C) thì giữ nguyên độc lực.

Cồn, ether, aceton làm mất độc lực của virus sau 3 ngày, lysol tiêu diệt virus
sau 5 phút, phenol 1% sau 10 phút, formol 0,5% sau 48 giờ và virus cũng bị bất
hoạt dưới ánh đèn tử ngoại.
Virus bền ở pH= 7-9, ổn định ở pH= 8,5 và pH = 9 là điều kiện cần thiết để
giữ khả năng ngưng kết hồng cầu.
2.2.2.5 Đặc tính nuôi cấy
Virus có thể nhân lên nhanh chóng trong nhiều loại tế bào một lớp cũng như
tâm
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
một số dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật hữu nhũ, chim và muỗi (Trích dẫn của
Lê Thị Thu, 2005).
Khi nuôi cấy virus tế bào thận chuột thì sau 60 phút đã có virus tiếp cận với
màng tế bào, sau 3 giờ thì virus tiếp cận trong nguyên sinh chất của một số tế bào
còn hầu hết các tế bào khác chưa thay đổi. Sau 3- 4 ngày hầu hết các tế bào thoái
hoá hoặc bong ra khỏi thành chai, lúc này virus đã nhân lên ở mức độ cao và tập
trung thành những đám lớn hoặc rải rác trong nguyên sinh chất tế bào (Trích dẫn
của Lê Thị Thu, 2005).
Có thể nuôi cấy virus trong môi trường tế bào gia cầm, màng nhung niệu
phôi gà, tế bào Hela và có thể tiêm truyền qua động vật thí nghiệm thường là chuột
bạch (tiêm màng não hoặc phúc mạc).
2.2.2.6 Đặc tính gây ngưng kết hồng cầu
Virus viêm não Nhật Bản có thể gây ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu,
cừu, chuột lang, thỏ nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con 1 ngày tuổi.
Đặc tính ngưng kết hồng cầu của virus viêm não Nhật Bản do glycoprotein E
của vỏ virus.

7

2.2.3 Sinh bệnh học
Trong tự nhiên heo bị nhiễm virus viêm não Nhật Bản do muỗi đốt, hiện
tượng virus huyết xảy ra sau 12 giờ đến vài ngày. Sự nhân lên của virus trên heo
chưa được biết rõ, Tuy nhiên, đã có một số nghiên cứu trên được ghi nhận trên
người, khỉ và chuột (Chu và Joo, 1992).
Sau khi nhiễm virus huyết, virus phân tán đến các mô mềm có nhiều mạch
máu đi qua như: gan, lách và bắp cơ và virus nhân lên ở các cơ quan này.
Virus sinh sản ở hệ thống tế bào thần kinh trung ương, thần kinh tuỷ sống,
màng tế bào, đại thực bào và tế bào lympho.
Ở người và chuột, virus xâm nhiễm có hướng thần kinh, chủ yếu là vùng
cuống não, hạch thần kinh và phía dưới vỏ não (Jonhson,1987).
Chưa biết rõ cơ chế xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương của virus. Tuy
nhiên, não bộ bị nhiễm lan tỏa chứng tỏ virus xâm nhập qua đường mạch máu. Mặt
khác, khi hàng rào mạch máu não bị tổn thương trong giai đoạn tiềm ẩn dễ tạo cơ
hội cho virus xâm nhập thần kinh như đã có sẵn bệnh gạo ở não, hoặc sau khi bị
chấn thương sọ não (Võ Công Khanh, 2005).

Trung tâm Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Ở muỗi, virus không gây bệnh lý cho tế bào. Virus được nhân lên ở đại thực
bào và các tế bào hồng cầu trong hai ngày (Johnson, 1987). Sau khi virus xâm nhập
vào cơ thể ký muỗi, virus sẽ lan rộng đến các cơ quan và có tính hướng thần kinh
trung ương (Leake và Johnson, 1987). Virus hiện diện ở hệ thần kinh vào ngày thứ
4, 1 hoặc 2 ngày sau đó có thể tìm thấy virus ở tuyến nước bọt.
2.2.4 Truyền nhiễm học
2.2.4.1 Nguồn truyền nhiễm
Viêm não Nhật Bản là một bệnh có ổ dịch trong tự nhiên. Ổ chứa virus là
nhiều loài động vật máu nóng, nhất là các động vật gậm nhấm nhỏ và chim thuộc họ
chim sẻ (Frosseriformes). Ở Nhật Bản, virus viêm não Nhật Bản đã được phân lập
từ chuột, chim sẻ và dơi (Sulkin và cộng sự, 1962). Các kháng thể trung hòa virus

đã tìm thấy ở chó, lợn, dê và cừu. Ở Liên Xô, virus đã được phân lập từ các loài
chim sẻ và từ ngựa.
Những động vật hoang dại, kể cả chim bị nhiễm virus không có triệu chứng,
cho nên cơ thể chúng thường sản sinh ra kháng thể kháng lại virus. Chim và dơi có
thể mang virus trong thời gian dài (LaMotte, 1958).

8


2.2.4.2 Đường truyền nhiễm
Môi giới truyền bệnh viêm não Nhật Bản là muỗi Culex và muỗi Aedes. Các
muỗi này sống trong thiên nhiên (hoang dại) và truyền virus từ heo sang người. Tại
Liên Xô các trận dịch viêm não thường thấy ở những nơi đất thấp nhiều ao hồ, đầm
lầy và thưa dân cư. Trong một vài trường hợp đã thấy ổ bệnh trong những vùng có
rừng (Dương Đình Thiện, 2001).
Ở Nhật Bản và Triều tiên, các loài muỗi là vectơ truyền bệnh viêm não Nhật
Bản có thể tìm thấy trong những vùng lân cận làng mạc và thành phố, môi giới
chính thay đổi tùy theo từng vùng, tại Nhật Bản là Cx. tritaeniorhynchus còn ở
Malaysia là Cx. gelidus…
Muỗi bị nhiễm virus sẽ mang virus suốt đời, chúng được bảo vệ qua mùa
đông và truyền cho thế hệ sau qua trứng. Sự phát triển của virus trong cơ thể muỗi
phụ thuộc vào nhiệt độ bên ngoài, ở 270- 300C có rất nhiều virus tích tụ trong cơ thể
muỗi nhưng khi nhiệt độ dưới 200C thì sự phát triển của virus trong cơ thể muỗi bị
kìm hãm. Vì vậy, phạm vi của các ổ dịch do muỗi nhỏ hơn phạm vi hoạt động của
muỗi (Dương Đình Thiện, 2001).
Ở Nhật Bản, các vụ dịch lớn thường xảy ra vào mùa nóng trong khi ở Liên
Xô chỉ thấy ở những mùa đặc biệt nóng.

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 2.3: Chu trình lây truyền của virus viêm não Nhật Bản
( />
9


Trung

2.2.4.3 Tính cảm thụ và miễn dịch
Tại những vùng có dịch có thể phát hiện được kháng thể kháng virus ở
những người có biểu hiện bình thường, điều đó chứng tỏ rằng không phải bất cứ
trường hợp nào bị nhiễm đều biểu hiện triệu chứng lâm sàng.
Nhiều tác giả cho rằng ở Nhật Bản, bệnh tiến triển nặng và tỷ lệ người mắc
bệnh cao ở nông thôn là do sức đề kháng của cơ thể yếu vì sống trong điều kiện
kém.
2.2.5 Ký chủ
Muỗi
Muỗi là trung gian truyền bệnh quan trọng nhất trong tự nhiên. Ở Nhật Bản
chủ yếu là muỗi Cx. tritaeniorhynchus, ở Malaysia và Singapore là Cx. gedilus.
Ngoài ra phải kể đến 3 loài muỗi Culex khác là Cx. vishnui, Cx. pseudovishnui ở Ấn
Độ và Cx. annulirostris ở Guam.
Hiện nay người ta đã phát hiện được virus viêm não Nhật Bản ở 30 loài muỗi
khác nhau thuộc 5 giống Culex, Anopheles, Aedes, Mansoni và Amergeres. Trong
đó có 2 loại Cx. tritaeniorhynchus và Cx. vishnui và vật chủ trung gian có khả năng
truyền bệnh cao (Võ Công Khanh, 2005).
Nhiều nghiên cứu đã khẳng định muỗi Cx. tritaeniorhynchus là trung gian
tâm
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
chính lan truyền virus viêm não Nhật Bản tại Việt Nam. Tuy nhiên, những nghiên
cứu gần đây cho thấy ở Đồng Bằng Sông Cửu Long thì Cx. pseudovishnui là trung

gian truyền bệnh chính (Hồ Thị Việt Thu, 2007).
Cx. tritaeniorhynchus sinh sản tại mương máng, đồng ruộng ngập nước, về
đêm muỗi cái ưa hút máu động vật có xương sống như gia súc, chim hoang và cả
người. Muỗi Cx. tritaeniorhynchus thích hút máu súc vật hơn máu người nên chúng
thường tập trung ở các khu vực có nhiều vật nuôi và chủ yếu đốt người ở ngoài nhà
(Phạm Văn Thân, 2001).
Muỗi hút máu động vật là heo, chim, dơi... trong thời kỳ nhiễm virus huyết,
virus nhân lên trong muỗi với hiệu giá cao, muỗi có khả năng mang virus suốt đời
và có thể truyền virus sang thế hệ sau qua trứng.
Muỗi Cx. tritaeniorhynchus phát triển quanh năm nhưng phát triển mạnh vào
những tháng nóng và mưa nhiều, từ tháng 4 đến tháng 9 và đỉnh cao là các tháng 4,
5 và 6.

10


Muỗi Culex pseudovishnui

Muỗi Culex tritaeniorhynchus

Hình 2.4: Muỗi Culex
( Nguồn: www.fehd.gov.hk/safefood/risk-pest-mosquito.html)

Trung

Heo
Heo sau khi bị muỗi đốt sẽ phát triển virus huyết (Chen và Beaty, 1982), hiện
tượng virus huyết kéo dài trong bốn ngày hay dài hơn.
Heo là nguồn nhiễm virus huyết quan trọng nhất trong tự nhiên (Chu và Joo,
1992) vì:

- Heo đẻ được nhiều lứa, tạo ra số lượng một quần thể heo cảm nhiễm
mới
- Luân chuyển thường xuyên mỗi 6 - 8 tháng
- Chỉ số heo nhiễm virus trong tự nhiên cao hơn tất cả gia súc khác
tâm Học Liệu
ĐH
Thơở heo
@ thường
Tài liệu
họcdễ tập
vàvirus
nghiên
cứu
- Nồng
độ Cần
virus huyết
cao nên
truyền
qua muỗi
Chim
Chim là vật chủ quan trọng chứa virus viêm não Nhật Bản trong tự nhiên.
Người ta phân lập được virus viêm não Nhật Bản từ nội tạng của chim hoang dã
(chim liếu điếu và một số loại chim khác), chim mang virus huyết kéo dài với nồng
độ cao nhưng lại không biểu hiện bệnh, và nguồn lây nhiễm cho các loài muỗi trong
tự nhiên.
Loài chim thiên di có thể lây truyền virus từ vùng này sang vùng khác.
Chim bị nhiễm trùng huyết với nồng độ cao và dài ngày nhưng không mắc
bệnh.

Hình 2.5: Diệc, nguồn mang virus quan trọng trong tự nhiên

( nguồn: www.camacdonald.com/.../GrayHeron)

11


Ở Việt Nam, có hai nhóm chim có khả năng truyền bệnh (Nguyễn Duy
Thanh, 1992).
Nhóm thứ nhất: những loài chim sống trong làng mạc, lũy tre, cây ăn quả
như: chim bông lao, chim rẽ quạt, chim sẻ nhà, chim liếu điếu, chim khách, chim
chích chòe.
Nhóm thứ hai: những loài chim kiếm ăn ngoài đồng, ít vào trong làng như
cò, sáo, quạ, cu gáy, chim chèo bẽo.

Chim hậu điểu
Muỗi
Nhiễm trùng tiềm tàng
các súc vật chưa biết
Cò đêm Dê

Bò

Ngựa

Heo

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Muỗi

Người
Phác đồ giả định những đường nhiễm virus viêm não Nhật Bản trong và ngoài

vụ dịch (Nguyễn Duy Thanh, 1992)
Các động vật máu lạnh
Virus viêm não Nhật Bản được tìm thấy trong 2 loài thằn lằn Takydromus
tadydromoides và Eumeces latiscutatus trong suốt thời gian ngủ đông và có thể
phân lập được virus từ máu của chúng khi nhiệt độ tăng cao. Thằn lằn có thể truyền
virus cho muỗi và những con thằn lằn có thể bị nhiễm virus do muỗi đốt hoặc ăn
phải những con muỗi có chứa virus viêm não Nhật Bản (Doi và cộng sự, 1983).
Ngoài ra, rắn, ếch và tắc kè cũng bị nhiễm virus viêm não Nhật Bản (Rosen, 1986).

12


Người và ngựa
Virus viêm não Nhật Bản cũng đã được phân lập từ máu người nhưng nồng
độ virus huyết rất thấp và thời gian mang virus cũng ngắn. Khi bệnh nhân biểu hiện
triệu chứng thì virus huyết cũng không còn trong máu. Do đó, người bị nhiễm virus
viêm não Nhật Bản khó có thể là nguồn truyền virus cho muỗi và chưa có nghiên
cứu nào chứng minh có sự lây truyền trực tiếp từ người sang người do muỗi đốt
(Rosen, 1986).
Ngoài con người, ngựa cũng có biểu hiện triệu chứng lâm sàng khi mắc bệnh
viêm não Nhật Bản nhưng cũng giống như người, ngựa không được xem là nguồn
chứa virus quan trọng cho muỗi (Rosen, 1986). Do đó, người và ngựa có thể được
xem là ký chủ cuối cùng của virus viêm não Nhật Bản.
2.2.6 Chẩn đoán
Có thể chẩn đoán virus viêm não Nhật Bản bằng cách phân lập virus từ bào
thai của heo mắc bệnh (Chu và Joo,1992). Trên người có thể lấy máu, dịch não tuỷ
hoặc từ não tử thi (mới chết chưa quá 2 giờ) (Bùi Đại và cộng sự, 2002).

Trung

Việc chẩn đoán bệnh viêm não Nhật Bản phải dựa vào các điều kiện dịch tễ
như vùng bị đe dọa, mật số muỗi, thời tiết khí hậu theo mùa,… kèm theo các triệu
chứng
lâm sàng.
tâm
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Chẩn đoán huyết thanh học dựa trên phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
(HI- Hemagglutination inhibition) và phản ứng trung hoà (dương tính kéo dài sau
nhiều tháng), kết hợp bổ thể (dương tính từ tuần thứ 2), phương pháp miễn dịch gắn
men (ELISA- Enzyme linked immunosorbent assay) là phương pháp có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao.
Kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu và kháng thể trung hòa tồn tại nhiều
năm, còn kháng thể kết hợp bổ thể thì giảm hiệu giá đáng kể sau 6 tháng và thậm
chí không phát hiện sau 2 năm kể từ khi khỏi bệnh (Trích dẫn của Nguyễn Hồ Thiện
Trung, 2000).
Người ta thường sử dụng phản ứng HI để chẩn đoán bệnh viêm não Nhật
Bản ở động vật vì phản ứng này tương đối đơn giản, ít tốn kém lại có khả năng định
lượng kháng thể virus viêm não Nhật Bản.
2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Năm 1954, Prévot, M.Puyuelo đã đưa ra những xác nhận đầu tiên về sự hiện
diện của virus viêm não Nhật Bản trong quân đội viễn chinh Pháp tại Việt Nam.

13


Trung

Năm 1956, Caubet và Netter, viện Pasteur Nha Trang kết luận tỷ lệ người

dân miền Nam có tiếp xúc với virus viêm não Nhật Bản là 20% (trích dẫn của Lê
Thị Thu, 2005).
Năm 1964, nhóm bác sĩ Đỗ Quang Hà, viện Vệ Sinh Dịch Tễ trung ương đã
phân lập được 4 chủng virus, trong đó có 3 chủng từ não bệnh nhân và 1 chủng từ
não chim Liếu Điếu (Garrulex persipilla gmelin), liên tiếp nhiều năm sau từ 1965
đến 1975 đã phát hiện ra nhiều chủng mới, nâng tổng số chủng phân lập được lên
18 chủng, trong số đó có một chủng từ não heo và một chủng từ muỗi Cx.
tritaeniorhynchus bắt từ khu dân cư quanh các trại heo.
Năm 1970, trong lần điều tra dịch tễ học trên heo đã cho thấy tỷ lệ heo có
mang kháng thể là 64,23% ở một số vùng ở phía Bắc. Nếu xét nghiệm từng vùng
trong từng thời gian tỷ lệ nhiễm có thể lên từ 93,47% đến 100%. Các gia súc khác
như: gà, vịt, ngang, ngỗng, chó, trâu, bò cũng mang kháng thể kháng virus viêm não
Nhật Bản từ 42,85% đến 56,52% (Trích dẫn của Lê Hồng Phong, 1995).
Năm 1990, Lê Hồng Phong và cộng tác viên phát hiện tỷ lệ nhiễm virus viêm
não Nhật Bản trên heo tại Thành Phố Hồ Chí Minh là 77,39%.
Năm 2000, Lê Thị Thu xét nghiệm 186 mẫu huyết thanh heo tại các trại tập
trung ở hai tỉnh Vĩnh Long và Bến Tre, kết quả có 123 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
66,13% (Lê Thị Thu, 2005).
Năm 2002, Đoàn Hải Yến, Phan Thị Ngà đã có kết quả xác định tần suất
nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên heo bằng phản ứng Mac-ELISA ghi nhận được
tỷ lệ nhiễm tại Hà Tây cao nhất vào mùa hè trong khi tại Tây Nguyên tần suất thấp
và diễn ra rải rác quanh năm.
2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Bệnh viêm não Nhật Bản được ghi nhận lần đầu tiên trên người năm 1871.
Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản làm chết 4000 người (Buescher và
cộng sự, 1959)
Năm 1930, các nhà dịch tễ học Nhật Bản đã chứng minh dịch bệnh xảy ra có
liên quan đến mùa của muỗi Culicinae (trích dẫn của Đỗ Quang Hà, 1965).

Năm 1933, Fujita lần đầu tiên phân lập được virus (Chu và Joo, 1992).
Năm 1936, Tamiguchi và cộng sự đã tiến hành định danh virus phân lập từ
ngựa là virus viêm não Nhật Bản (Chu và Joo, 1992).
Năm 1939, Smorodintsev và Chubladze đã đề ra phương pháp phòng bệnh
đặc hiệu (trích dẫn của Nguyễn Duy Thanh, 1992).

14


Trung

Năm 1958, Buescher đã nhận thấy vai trò quan trọng của các loài chim thuộc
họ Heron trong việc gieo rắc mầm bệnh cho các loài tiết túc truyền bệnh cho người
(trích dẫn của Chu và Joo, 1992).
Năm 1958, La Motte ghi nhận sự nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên dơi và
cho rằng dơi có khả năng nhiễm virus qua đường tiêu hoá và gieo rắc mầm bệnh
cho loài tiết túc.
Năm 1962, Sulkin chứng minh rằng, ngoài viêm não Nhật Bản, dơi còn có
khả năng nhiễm các loài Arbovirus khác qua đường tiêu hoá.
Năm 1966, Konno và cộng tác viên đã mô tả tính chất dịch tễ đặc trưng của
bệnh viêm não Nhật Bản (trích dẫn của Chu và Joo, 1992).
Năm 1973, Self và cộng tác viên đã chứng minh vật môi giới truyền bệnh
viêm não Nhật Bản là muỗi Culex (chủ yếu là Cx. tritaeniorhynchus).
Năm 1976 Hashimura, 1977 Ogasa và cộng sự đã chứng minh vai trò của
virus viêm não Nhật Bản trong rối loạn sinh sản ở heo đực (Trích dẫn của Chu và
Joo, 1992).
Vào các năm 1954, 1977, 1979 lần lượt các tác giả đã phát hiện phương thức
tác động của virus viêm não Nhật Bản đến phôi và thai trên heo nái sơ sinh (trích
dẫn của Chu và Joo, 1992).
tâm Học

Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Tháng 4 năm 1979 WHO công bố bệnh viêm não Nhật Bản gây nguy hiểm
cho con người và gây thiệt hại nghiêm trọng trên đàn heo sinh sản. Heo là nguồn
quan trọng chứa virus và có thể làm cho phạm vi lây lan rộng do virus có thể truyền
bằng con đường phối giống, nhất là bằng kỹ thuật gieo tinh nhân tạo. Ở các nước
Đông Á, virus viêm não Nhật Bản được xem là nguyên nhân chính gây hiện tượng
chết heo sơ sinh.
Năm 1980, Chaturvedi và cộng sự đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của virus
viêm não Nhật Bản đến sự sẩy thai trên người.
Năm 1983, Doi và cộng sự đã chứng minh có sự mang virus trên các loài
động vật máu lạnh có xương sống, thông qua sự phân lập được virus viêm não Nhật
Bản trên hai loài thằn lằn Takydromus tadydromoides và Eumeces latiscutatus trong
thời gian ngủ đông.
Năm 1986, Kimura, Kuroda và Yasui đã tìm ra loại protein có tính đặc hiệu
của virus viêm não Nhật Bản và chứng minh virus viêm não Nhật Bản có cấu trúc
kháng nguyên gần giống với virus viêm não Saint Louis, virus West Nile và virus
viêm não Murray Valley.

15


Trung

Năm 1986, Bhattacharya nhận định rằng gà và chim hoang, đặc biệt là diệc
và bạch diệc có khả năng duy trì huyết thanh dương tính quanh năm (trích dẫn của
Chu và Joo).
Năm 1987, Sumivoshi và các cộng tác viên đã mô tả cấu tạo và hình dạng
của virus viêm não Nhật Bản. Cùng năm, Kadarnath và cộng sự đã cho rằng môi
trường bạch cầu của một số loài động vật hữu nhũ khác nhau có thể nuôi cấy được
virus (trích dẫn của Chu và Joo, 1992).

Năm 1988, Takashima đã chứng minh sự tồn trữ của virus viêm não Nhật
Bản qua mùa đông, nhưng sự nhiễm virus trên heo trong mùa đông là không quan
trọng.
Năm 1989, Pedro và Acha đã thành công trong việc truyền virus viêm não
Nhật Bản cho các loài thằn lằn qua muỗi Cx. pipiens pallens (trích dẫn của Phạm Sỹ
Lăng và Nguyễn Thiện, 2004).
2.4 Vai trò của dơi trong chu trình truyền bệnh
Trong tự nhiên, người ta đã phân lập được nhiều chủng virus khác nhau
thuộc Flavivirus bao gồm: virus viêm não St. Louis, viêm não Nhật Bản.... Đã có
bằng chứng về sự tồn tại virus huyết trên dơi khi bị nhiễm virus St. Louis và virus
viêm não Nhật Bản.
tâm Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Dơi nhiễm virus huyết do muỗi đốt, trong điều kiện bình thường sẽ phát triển
virus huyết và thời gian tồn tại của virus huyết là 15 – 30 ngày (Sulkin và cộng sự,
1963).
Đã có nhiều nghiên cứu cho rằng dơi là một ký chủ lý tưởng cho sự tồn tại
của các loài Arbovirus qua giai đoạn mùa đông: La Motte (1958) đã tiến hành
nghiên cứu sự tồn tại của virus viêm não Nhật Bản trên loài dơi qua trong thời gian
ngủ đông, trong điều kiện thực nghiệm, muỗi mang virus hút máu dơi và truyền
virus sau đó đưa dơi về điều kiên 100C để dơi rơi vào trạng thái ngủ đông, khi dơi
đang ở trạng thái ngủ đông tác giả nhận thấy không có sự phát triển virus huyết và
sự mang virus này sẽ lưu giữ qua các tháng mùa đông, vào mùa xuân khi nhiệt độ
tăng lên thì sẽ phát triển virus huyết và có đủ khả năng để truyền virus cho muỗi.
Ngoài ra, các loài dơi ăn muỗi có thể bị nhiễm Arbovirus qua đường tiêu hoá
do ăn phải muỗi nhiễm virus. Đã có dẫn chứng về sự nhiễm virus gây bệnh sốt vàng
do ăn phải muỗi mang virus (Sulkin và cộng sự,1962) và virus viêm não Nhật Bản
(La Motte, 1958) và khi nhiễm virus qua đường tiêu hoá vẫn phát triển virus huyết.
Sự phát triển virus huyết bắt đầu diễn ra khi nhiệt độ môi trường ở 240C và
sự phát triển này mạnh nhất khi nhiệt độ tăng lên đến 370C. Tuy nhiên, dơi không

16


có biểu hiện viêm não hay bệnh tích gì cho dù có phát triển virus huyết (Sulkin và
cộng sự, 1966).
Đối với dơi mang thai có mang virus viêm não Nhật Bản thì virus có thể
truyền cho dơi con qua đường nhau thai, có thể nói đây là một con đường để duy trì
sự nhiễm virus lâu dài của loài dơi trong tự nhiên.

Hình 2.6: Dơi, một nguồn bệnh quan trọng trong tự nhiên
(Nguồn: www.exzooberance.com)

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

17


CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương tiện thí nghiệm
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện đề tài từ 03/2008 đến 05/2008
Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Bệnh Truyền Nhiễm - Bộ môn Thú Y
- Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học ứng Dụng - Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng và địa điểm lấy mẫu
 Đối tượng lấy mẫu
Hai loài dơi trong tự nhiên: dơi sen (120 mẫu) và dơi muỗi (61 mẫu) được
thu thập đem về phòng thí nghiệm.
 Địa điểm lấy mẫu: Sóc Trăng, Kiên Giang, Bạc Liêu và Hậu Giang.
3.1.3 Vật liệu, hóa chất dùng trong thí nghiệm

 Vật liệu và dụng cụ lấy mẫu
Ống nghiệm vô trùng để đựng máu, thùng trữ lạnh và nước đá.
Vật liệu và dụng cụ xử lý, xét nghiệm
Trung tâm Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Kháng nguyên viêm não Nhật Bản chủng Nakayama chuẩn do viện Pasteur
Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Ống tiêm 12 ml và kim tiêm 23G vô trùng để lấy máu ngỗng
Các chai, lọ, bình tam giác, pipet
Micropipet, dispenser
Máy ly tâm
Hematocrit
Đĩa microplate đáy chữ U 96 giếng
Týp nhựa đựng huyết thanh
Máu ngỗng
 Các dung dịch cần thiết cho xét nghiệm
Dung dịch Alsever (dung dịch chống đông)
Dextrose (C6H12O6 )
20,50g
NaCl
4,20g
Citric acid
0,55g
Sodium citrate
8g
Nước cất hai lần vừa đủ
1000ml

18

Trung tâm

Sấy ướt 1100C trong 10 phút
Dung dịch DGV (Dextrose- Gelatine- Veronal)
Veronal
0,58g
Gelatine
0,6g
Sodium veronal
0,38g
CaCl2
0,02g
MgSO4.7H2O
0,12g
NaCl
8,5g
Glucose
10g
Nước cất hai lần vừa đủ
1000ml
Dung dịch dùng trong phản ứng
Dung dịch NaCl 1,5M
NaCl
43,85g
Nước cất vừa đủ
500ml
Dung dịch acid boric 0,5M
BO3H3
7,73g

Nước cất vừa đủ
250ml
(Hòa tan trong nước nóng sau đó thêm vào nước cất vừa đủ)
Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập
Dung dịch NaOH 1N
NaOH
40g
Nước cất vừa đủ
1000ml
Dung dịch Na2HPO4 0,5M
Na2HPO4.12H2O
179,08g
Nước cất vừa đủ
1000ml
Dung dịch NaH2PO4 1M
NaH2PO4.2H2O
156,01g
Nước cất vừa đủ
1000ml
Dung dịch VAD
Dung dịch NaCl 1,5M
100ml
62ml
Dung dịch Na2HPO4 0,5M
Dung dịch NaH2PO4 1M
160ml
Nước cất vừa đủ
1000ml
Dung dịch borat pH= 9

Dung dịch NaCl 1,5M
80ml
100ml
Dung dịch BO3H3 0,5M
24ml
Dung dịch NaOH 1N

19

và nghiên cứu


Trung

Nước cất vừa đủ
1000ml
Dung dịch 4% bovalbumine (Fraction V)
Bovalbumine
2g
Dung dịch borat pH= 9 vừa đủ
50ml
(Chỉnh lại pH=9 bằng dung dịch NaOH 1N)
Dung dịch BABS 0,4%
Dung dịch bovalbumine 4% pH=9
10ml
90ml
Dung dịch borat pH= 9
Dung dịch Kaolin 25%
Kaolin
25g

Dung dịch borat pH= 9
100ml
0
Trữ lạnh ở 4 C
3.2 Phương pháp thí nghiệm
Trong đề tài này tôi sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để
phát hiện kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản trên dơi.
Nguyên lý của phản ứng HI:
Virus viêm não Nhật Bản có đặc tính gây ngưng kết với một số loại hồng
cầu, kháng thể đặc hiệu kháng virus viêm não Nhật Bản có thể ức chế ngưng kết
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
hồng cầu. Do đó, nếu trong mẫu huyết thanh xét nghiệm làm ức chế ngưng kết hồng
cầu thì xem như có kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản.
Các bước tiến hành như sau:
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
Máu dơi được lấy từ tĩnh mạch cổ để ở nhiệt độ thường. Khi thấy máu ra
huyết thanh thì cho vào thùng có nước đá, sau đó chiết lấy huyết thanh. Huyết thanh
được chiết vào týp nhựa vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ - 200C.
3.2.2 Rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng
Máu ngỗng được lấy từ tĩnh mạch cánh, trước khi lấy phải sát trùng vị trí lấy
máu. Dùng ống tiêm 10ml và kim tiêm 23G vô trùng hút 1,5ml dung dịch Alsever
để chống đông, lấy khoảng 8,5ml máu ở tĩnh mạch cánh và lắc nhẹ cho tan đều và
máu không bị đông. Sau đó bơm nhẹ vào ống nghiệm vô trùng.
Tương tự, lấy cho đến khi đủ lượng máu cần thiết cho việc xét nghiệm
Hồng cầu ngỗng được rửa 4 lần trong dung dịch DGV
Hoà một khối lượng máu toàn phần và 2,5 khối lượng DGV, lắc nhẹ cho đều,
ly tâm 1000 vòng /phút trong 15 phút, rút bỏ phần nước nổi bên trên.
Rửa tiếp hai lần nữa với DGV (cách rửa như trên).

20


Dùng hematocrit để xác định tỷ lệ hồng cầu, sau đó pha hồng cầu 8% trong
DGV và bảo quản lạnh ở 40C.
Hồng cầu 8% sẽ được tiếp tục pha loãng trong VAD theo tỷ lệ 1/24 khi sử
dụng trong phản ứng HA và HI (hồng cầu 0,33%), bảo quản lạnh ở 4 0C để làm phản
ứng.
3.2.3 Xử lý huyết thanh

Trung

Trước khi thực hiện phản ứng phải xử lý huyết thanh nhằm mục đích loại bỏ
chất kìm hãm ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu.
Hấp thụ Kaolin: dùng micropipet hút 0,1ml huyết thanh cho vào ống
nghiệm vô trùng và 0,4ml dung dịch borat (pH=9) và 0,5ml dung dịch kaolin lắc kỹ
hỗn dịch trong 5 phút/lần (4 lần) bằng máy lắc, sau đó đem ly tâm 1000 vòng/phút
bằng máy ly tâm trong 15 phút. Lấy phần nước trong ta sẽ được huyết thanh pha
loãng 1/10.
Hấp thụ chất ngưng kết: phần nước trong sau khi cho hấp thụ với kaolin đã
pha loãng 1/10 cho vào ống nghiệm vô trùng cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc
lắc nhẹ cho đều, đặt trong nước đá tan, cho tiếp xúc 20 phút, sau đó đem ly tâm
1000 vòng/phút trong 15 phút, lấy phần nước trong bên trên cho vào týp nhựa vô
trùng,
ta được
huyết
thanh
đã xửThơ
lý. Trữ
xử lýtập

ở nhiệt
-200C. cứu
tâm
Học
Liệu
ĐH
Cần
@huyết
Tàithanh
liệuđãhọc
vàđộnghiên
3.2.4 Thực hiện phản ứng HA
Thành phần của phản ứng HA
Kháng nguyên chuẩn chủng Nakayama pha loãng 1/10 trong dung dịch
borat.
Dung dịch borat.
Hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% trong dung dịch VAD.
Tiến hành phản ứng
Cho vào tất cả 12 giếng, mỗi giếng 0,05ml dung dịch borat, tiếp tục cho vào
giếng thứ nhất 0,05ml kháng nguyên đã pha loãng 1/10, trộn đều, hút 0,05ml sang
giếng thứ hai, trộn đều, hút 0,05ml sang giếng thứ ba,... tiếp tục như thế đến giếng
thứ mười hai thì bỏ đi 0,05ml. Sau đó, cho vào mỗi giếng 0,05ml hồng cầu 0,33%
rồi lắc nhẹ đĩa để trộn kháng nguyên, hồng cầu và borat, để ở nhiệt độ phòng sau
một giờ đọc kết quả.
Đọc kết quả phản ứng HA
 Dương tính 4(+): nếu hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả
đáy giếng.

21

Trung

 Dương tính 3(+): nếu đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng,
nhưng đáy giếng còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành
hình nhẫn.
 Dương tính 2(+): đại đa số hồng cầu tụ lại ở đáy giếng thành cụm,
xung quanh có một ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm.
 Âm tính: hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Từ kết quả của phản ứng HA, ta có thể xác định được hiệu giá kháng
nguyên: hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng
nguyên còn khả năng ngưng kết ở mức độ 4(+) hay 3(+) và gọi là một đơn vị ngưng
kết.
3.2.5 Thực hiện phản ứng HI
Thành phần phản ứng
 Dung dịch BABS 0,4%
 Huyết thanh đã xử lý.
 Kháng nguyên có 8 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch
BABS 0,4% để ở nhiệt độ 40C trong một giờ.
 Hồng cầu ngỗng 0,33% pha loãng trong VAD.
TiếnLiệu
hành ĐH
phản Cần
ứng Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
tâm Học
Cho vào mỗi giếng của microplate 0,025ml dung dịch BABS 0,4%
Cho 0,025ml huyết thanh đã xử lý vào giếng thứ nhất, trộn đều, hút 0,025ml
sang giếng thứ hai, trộn đều, hút 0,025ml sang giếng thứ ba... Tiếp tục như thế cho
đến giếng thứ 12 và hút bỏ đi 0,025ml.
Tiếp tục cho vào mỗi giếng 0,025ml kháng nguyên đã pha loãng trong BABS

0,4% (trữ lạnh ở 40C), lắc đều. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 40C trong khoảng 8 đến 18
giờ hoặc 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Cho vào mỗi giếng 0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33% để ở nhiệt độ phòng. Ghi
nhận kết quả sau 1 giờ.
Đọc kết quả HI
Giếng nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu là dương tính, giếng nào có
ngưng kết hồng cầu là âm tính. Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu của huyết
thanh là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh còn có khả năng ngăn trở ngưng
kết hồng cầu, có thể đọc được
Dương tính ở lỗ thứ 1 tương ứng với hiệu giá 1/20
Dương tính ở lỗ thứ 2 tương ứng với hiệu giá 1/40
Dương tính ở lỗ thứ 3 tương ứng với hiệu giá 1/80
..................................................................................

22


Trung

3.2.6 Thực hiện phản ứng đối chứng
* Đối chứng dương: Cho vào mỗi giếng của đĩa microplate 0,025ml dung
dịch BABS 0,4%, cho vào giếng đầu tiên 0,025ml mẫu đối chứng dương, pha loãng
bậc hai như cách pha loãng bậc hai của huyết thanh. Sau đó cho vào 0,025ml kháng
nguyên đã pha loãng trong BABS 0,4%, ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ và cho tiếp
0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33%, sau một giờ quan sát để làm đối chứng dương.
* Đối chứng âm: Cách làm giống như đối chứng dương nhưng thay mẫu
chứng dương bằng mẫu chứng âm.
* Đối chứng hồng cầu: Cho vào 10 giếng, mỗi giếng 0,05ml BABS 0,4%,
sau đó cho tiếp 0,05ml hồng cầu 0,33%.
* Kiểm tra nồng độ kháng nguyên

Kháng nguyên sau khi đã pha loãng ở 8 đơn vị HA cần kiểm tra lại nồng độ:
Cho 0,025ml borat pH=9 vào trong 6 lỗ, cho tiếp 0,025ml kháng nguyên đã pha
loãng ở 8 đơn vị HA vào giếng thứ nhất và giếng thứ hai, pha loãng bậc hai từ giếng
thứ hai cho đến giếng thứ sáu, cho tiếp vào giếng thứ nhất 0,05ml hồng cầu 0,33%
và các giếng còn lại là 0,025ml. Lắc nhẹ, sau một giờ đọc kết quả kiểm tra: nếu từ
giếng thứ nhất đến giếng thứ tư có hiện tượng hồng cầu ngưng kết, giếng thứ năm
và thứ sáu lắng hồng cầu, kết luận kháng nguyên đã pha đúng nồng độ.
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.3 Các chỉ tiêu theo dõi
Tỷ lệ nhiễm virus viêm não Nhật Bản trên các loài dơi
Tỷ lệ nhiễm được tính bằng công thức:
Tổng số mẫu dương tính
Tỷ lệ nhiễm (%) =

x 100
Tổng số mẫu xét nghiệm

Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của các loài.
Công thức tính GMT:
GMT = Antilog [ Σ log10 (mshg) /n ]
Trong đó:
mshg: mẫu số hiệu giá kháng thể
n: số mẫu dương tính

23


3.4 Xử lý số liệu
Tất cả các số liệu thu thập được sẽ được tính toán bằng chương trình

Microsoft Office Excel và so sánh tỷ lệ bằng trắc nghiệm (χ2) trong phần mềm
Minitab.

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

24