Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.85 MB, 94 trang )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


BK
TP.HCM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ
TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

SVTH:

LÊ ANH DŨNG

MSSV:

60700417

GVHD:

TS. TRẦN BÍCH LAM

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 01/ 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH LIPASE VÀ
TÍNH CHẤT CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH

SVTH:

LÊ ANH DŨNG

MSSV:

60700417

GVHD:

TS. TRẦN BÍCH LAM

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 01 / 2012
-i-

Luận văn tốt nghiệp

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
.............................................................................................................................
..................................................................................................................................

..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
Tp. HCM, tháng 12 năm 2011
Giáo viên hướng dẫn

-ii-

Luận văn tốt nghiệp

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
.............................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................
..................................................................................................................................

Lê Anh Dũng

-iv-

Luận văn tốt nghiệp

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất béo.
Enzyme này chiếm một vị trí nổi bật trong các loại xúc tác sinh học do khả năng
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như tổng hợp hữu cơ, chất tẩy rửa và
dinh dưỡng. Lipase được cố định nhằm làm tăng độ bền, khả năng tái sử dụng và
dễ dàng phân tách khỏi sản phẩm so với enzyme tự do. Các nghiên cứu trên thế
giới đã cố định thành công enzyme lipase lên rất nhiều loại chất mang khác nhau.
Đề tài “Nghiên cứu cố định lipase và tính chất của enzyme cố định” sử dụng các
loại chất mang có nguồn gốc trong nước để cố định lipase nhằm so sánh tính chất
của enzyme cố định so với các nghiên cứu khác.
Nội dung nghiên cứu của đề tài gồm:
 Chọn vật liệu để cố định enzyme lipase.
 Tối ưu hóa quá trình cố định enzyme lipase trên vật liệu này.
 Khảo sát tính chất của enzyme lipase sau khi cố định và so sánh với
enzyme tự do.

-v-

Luận văn tốt nghiệp

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................. iv
TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................. v
MỤC LỤC ................................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................... ix
DANH MỤC HÌNH .................................................................................... xi
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN....................................................................... 2
1.1 Lipase ............................................................................................. 2
1.1.1 Giới thiệu về lipase ............................................................................. 2
1.1.2 Đặc điểm của lipase............................................................................ 2
1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase ..................................................................... 3

1.2 Cố định lipase................................................................................. 4
1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định ............................................................ 4
1.2.2 Đặc điểm của enzyme cố định ............................................................ 5
1.2.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định ................................................... 6
1.2.4 Các phương pháp cố định enzyme lipase ........................................... 6
1.2.5 Các nghiên cứu gần đây về cố định enzyme lipase ............................ 8

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Nguyên liệu ................................................................................... 22
2.1.1 Enzyme lipase ................................................................................... 22
2.1.2 Chitosan ............................................................................................ 22
2.1.3 Natri alginate .................................................................................... 24
2.1.4 Dầu olive ........................................................................................... 27

2.2 Thiết bị.......................................................................................... 28
2.3 Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................... 29
-vi-

Luận văn tốt nghiệp
2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính riêng của lipase tự do ................. 29
2.3.2 Thí nghiệm 2: Chọn vật liệu cố định lipase ...................................... 30
2.3.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa quá trình cố định enzyme ........................ 32
2.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát tính chất của lipase cố định ....................... 33

2.4 Các phương pháp phân tích ......................................................... 36
2.4.1 Đo pH................................................................................................ 36
2.4.2 Đo độ hấp thu ................................................................................... 36
2.4.3 Xác định hàm lượng protein ............................................................. 38
2.4.4 Xác định hoạt tính riêng của enzyme lipase ..................................... 40

2.5 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 41
2.5.1 Phương pháp xử lý số liệu của phân tích ANOVA ........................... 41
2.5.2 Tính hệ số tương quan R bằng Excel ................................................ 42
2.5.3 Tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5.0 ............................................ 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................. 43
3.1 Xác định hoạt tính enzyme tự do .................................................. 43
3.2 Vật liệu cố định lipase .................................................................. 43
3.3 Tối ưu hóa quá trình cố định........................................................ 45
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ Na-alginate đến quá trình cố định lipase . 45
3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến quá trình cố định lipase ........... 49
3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình cố định lipase ................. 50
3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tự do đến quá trình cố định lipase 52
3.3.5 Sử dụng quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa quá trình cố định .... 53

3.4 Khảo sát tính chất của lipase cố định .......................................... 57
3.4.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lipase .................................... 57

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase ............................ 58
3.4.3 Động học phản ứng thủy phân ......................................................... 60
3.4.4 Khả năng tái sử dụng của lipase cố định ......................................... 64

-vii-

Luận văn tốt nghiệp
3.4.5 Phương pháp bảo quản của lipase cố định ...................................... 66

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................... 69
4.1 Kết luận ........................................................................................ 69
4.2 Kiến nghị ...................................................................................... 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 70
PHỤ LỤC ................................................................................................... 77

-viii-

Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Đặc tính của enzyme lipase ........................................................... 22
Bảng 2.2: Đặc điểm kỹ thuật của enzyme lipase ........................................... 22
Bảng 2.3: Các thông số của dầu olive ............................................................ 28
Bảng 2.4: Phương pháp pha loãng dung dịch protein chuẩn ......................... 39
Bảng 3.1:Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định trên
các loại chất mang khác nhau............................................................................... 43
Bảng 3.2: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các
giá trị nồng độ Na-alginate khác nhau ................................................................. 46

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến hiệu suất cố định protein
enzyme và hoạt tính lipase cố định ...................................................................... 49
Bảng 3.4: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các
thời gian ủ khác nhau ........................................................................................... 51
Bảng 3.5: Hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính lipase cố định ở các
nồng độ lipase tự do khác nhau ............................................................................ 52
Bảng 3.6: Các thông số để xây dựng phương trình hồi quy trong tối ưu hóa 54
Bảng 3.7: Kết quả các giá trị trong phương trình hồi quy ............................. 54
Bảng 3.8: Giá trị Vmax và Km của lipase tự do và cố định .............................. 62
Bảng 3.9: Giá trị Km và Vmax của lipase tự do và lipase cố định.................... 64
Bảng P.1: Độ hấp thu tại các nồng độ protein khác nhau .............................. 77
Bảng P.2: Độ hấp thu tại các nồng độ protein khác nhau .............................. 77
Bảng P.3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của lipase cố định . 79
Bảng P.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase cố định ............ 79
Bảng P.5: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của lipase cố định 79
Bảng P.6: Các thông số của lipase cố định để xác định các hệ số trong
phương trình Lineweaver – Burk ......................................................................... 79
Bảng P.7: Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính của lipase tự do ..... 80

-ix-

Luận văn tốt nghiệp
Bảng P.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase cố định ............ 80
Bảng P.9: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của lipase tự do ... 80
Bảng P.10: Các thông số của lipase tự do để xác định các hệ số trong phương
trình Lineweaver – Burk ...................................................................................... 80
Bảng P.11: Hoạt tính của lipase cố định qua các lần tái sử dụng .................. 81

-x-

Luận văn tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc nắp của lipase từ Candida rugosa ..................................... 3
Hình 1.2: Giản đồ mô tả việc cố định lipase trên polypropylene được xử lý
bằng poly(α-allylglucoside) ................................................................................. 14
Hình 1.3: Phương pháp tosyl hóa để cố định enzyme lipase trên agarnose... 16
Hình 1.4: Phương pháp trichorotriazine hóa để cố định enzyme lipase trên
SiO2 ...................................................................................................................... 16
Hình 1.5: Phương pháp cố định lipase lên LPS ............................................. 18
Hình 1.6: Các phương pháp hoạt hóa chất mang ........................................... 19
Hình 1.7: Phương pháp cố định enzyme lipase bằng liên kết đồng hóa trị lên
chất mang không có từ tính và có từ tính ............................................................. 21
Hình 2.1: Cấu tạo phân tử chitin và chitosan ................................................. 23
Hình 2.2: Cấu trúc của alginate...................................................................... 25
Hình 2.3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu đến khả năng thủy phân của
lipase..................................................................................................................... 27
Hình 2.4: Sơ đồ nghiên cứu chung................................................................. 29
Hình 2.5: Cơ chế của phản ứng Bradford ...................................................... 38
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính
lipase cố định trên các loại chất mang khác nhau ................................................ 44
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính
lipase cố định theo nồng độ Na-alginate .............................................................. 46
Hình 3.3: Cơ chế khuếch tán (tạo gel từ bên ngoài) ...................................... 47
Hình 3.4: Cơ chế tạo gel từ bên trong ............................................................ 47
Hình 3.5: Sự liên kết của Ca2+ với các mạch alginate theo thuyết “vỉ trứng” 48
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính
lipase cố định theo nồng độ CaCl2 ....................................................................... 49

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính
lipase cố định theo thời gian ủ ............................................................................. 51
-xi-

Luận văn tốt nghiệp
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn hiệu suất cố định protein enzyme và hoạt tính
lipase cố định theo nồng độ lipase tự do .............................................................. 52
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy trên hệ trục không gian ba
chiều ..................................................................................................................... 55
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme lipase và nồng
độ Na-alginate đến hiệu suất cố định ................................................................... 55
Hình 3.11:Enzyme lipase sau khi cố định lên Na-alginate ............................ 56
Hình 3.12:Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của lipase ....... 57
Hình 3.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của lipase tự do và lipase cố định
trên -carrageenan ở 35oC.................................................................................... 58
Hình 3.14: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lipase
.............................................................................................................................. 59
Hình 3.15: Độ bền nhiệt của lipase cố định trên sol-gel theo các phương pháp
khác nhau.............................................................................................................. 60
Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc thủy
phân ...................................................................................................................... 61
Hình 3.17: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa 1/V và 1/[S] .......................... 62
Hình 3.18: Đồ thị Lineweaver – Burk của phản ứng thủy phân p-NPP của
lipase tự do và lipase cố định trên -carrageenan. ............................................... 64
Hình 3.19: Đồ thị biểu diễn hiệu quá tái sử dụng của lipase cố định ............ 64
Hình 3.20: Độ bền của lipase cố định trên sol-gel theo các phương pháp khác
nhau qua các lần tái sử dụng ................................................................................ 66
Hình P.1: Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ protein . 77
Hình P.2: Đồ thị biểu diễn tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ protein . 78

-xii-

Luận văn tốt nghiệp

LỜI MỞ ĐẦU
Xúc tác sinh học đang nổi lên thành một công cụ quan trọng trong quá trình
tổng hợp ở quy mô công nghiệp các loại hóa chất, dược phẩm và thành phần thực
phẩm. Ít nhất 134 quá trình chuyển hóa sinh học đã được phát triển trên quy mô
công nghiệp (Won, 2005). Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu sâu rộng trong khoa
học cũng như trong công nghiệp nhưng số lượng ứng dụng của xúc tác sinh học
vẫn còn khá khiêm tốn. Điều này có thể do một số hạn chế của xúc tác sinh học
như tính sẵn có, phạm vi cơ chất và độ bền hoạt động.
Độ bền của enzyme sử dụng trong các quá trình công nghiệp đã tăng lên đáng
kể trong những năm qua nhờ áp dụng công nghệ gene, cố định, cải tiến quy trình.
Cố định enzyme là phương pháp thông dụng nhất để đưa những tính chất mong
muốn của xúc tác dị thể vào xúc tác sinh học. Bên cạnh làm tăng độ bền, enzyme
cố định còn có thêm những tính chất ưu việt như khả năng tái sử dụng, dễ dàng
phân tách khỏi cơ chất và sản phẩm.
Lipase (EC 3.1.1.3) là tên gọi của một họ enzyme xúc tác phản ứng thủy phân
chất béo. Tuy nhiên, trong điều kiện thích hợp nó còn xúc tác phản ứng chuyển
ester, alcoholysis và phản ứng ester hóa. Việc cố định lipase đang trở thành
phương pháp phổ biến để tránh những yếu tố bất lợi của enzyme tự do mặc dù
lipase cố định cũng bị giảm hoạt tính so với enzyme tự do. Do đó chúng tôi thực
hiện nghiên cứu này nhằm tìm ra điều kiện tối ưu để cố định lipase và khảo sát
ảnh hưởng của môi trường đến phản ứng thủy phân của enzyme cố định.

Trang 1

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1

Lipase

1.1.1 Giới thiệu về lipase
Lipase (ester triacylglycerol hydrolase, EC 3.1.1.3) là một enzyme quan trọng
trong việc thủy phân chất béo và giải phóng các acid béo tự do, diacylglycerol,
monoacylglycerol và glycerol. Lipase có ở hầu hết mọi cơ thể sống, tế bào và có
vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, hấp thu và vận chuyển lipid.
Lipase từ vi khuẩn và nấm có thể ứng dụng làm chất xúc tác sinh học trong
công nghiệp vì cường lực xúc tác mạnh và dễ sản xuất bằng con đường lên men
và dễ thu nhận từ canh trường. Vì thế, hầu hết enzyme từ vi sinh vật có thể dùng
cho mục đích thương mại.
Ở động thực vật bậc cao, lipase cũng được nghiên cứu khá nhiều. Lipase tụy
heo đã được sử dụng làm enzyme kỹ thuật. Lipase từ động vật hữu nhũ được ứng
dụng nhiều trong ngành y để chữa trị các căn bệnh về trao đổi chất hoặc trực tiếp
tạo thành thuốc (Muller & Petry, 2004). Enzyme từ thực vật như đu đủ, dứa và
đặc biệt là trong hạt đang nảy mầm được ứng dụng làm chất xúc tác sinh học vì
chúng thể hiện tính chọn lọc đối với acid béo (Mukherjee & Hills, 1994).
Với sự đa dạng về nguồn gốc, sự phân bố và chức năng của chúng trong tế
bào mà các thông số lý hóa của lipase là rất khác nhau. Chính nhờ sự khác biệt
này mà lipase có những khoảng tối thích khác nhau và tính đặc hiệu khác nhau
cho những ứng dụng đa dạng trong công nghiệp. Nhiều cố gắng nhằm tăng
cường lực xúc tác của lipase bằng nhiều cách bao gồm tìm nguồn lipase mới, ứng

dụng những thành công trong công nghệ gene và trong kỹ thuật gây đột biến
gene lên những vi sinh vật đã biết.

1.1.2 Đặc điểm của lipase
Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990 (Brady;
Winkler, D'Arcy, & Hunziker), những nghiên cứu cho thấy vùng hoạt động của
enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu trúc di động, tạm gọi là
Trang 2

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

cái “nắp”. Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang hoạt động khi cái “nắp” từ
trạng thái đóng sang mở (Brzozowski, 1991; Grochulski, 1994). Cơ chế đóng mở
nắp có thể khác nhau giữa các lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung
tâm hoạt động của lipase thông suốt và có liên kết với lipid.

Hình 1.1: Cấu trúc nắp của lipase từ Candida rugosa
(a) Trạng thái đóng nắp; (b) Trạng thái mở. Phần bôi đen là nắp
(Polaina & MacCabe, 2007)
Nhiệt độ tối thích của lipase là rất rộng, thường từ 30 – 60oC, tùy thuộc vào
nguồn thu nhận lipase. Những vi sinh vật sống trong những môi trường khắc
nghiệt tạo ra lipase có nhiệt độ tối thích cao trên 70oC (như lipase từ Bacillus
thermocatenulatus) hoặc những lipase có hoạt tính cao ở nhiệt độ thấp (lipase từ
vi khuẩn vùng cực).
Hầu hết những lipase dùng làm chất xúc tác sinh học đều hoạt động ở pH
trung tính hay kiềm, trong nhiều trường hợp có pH tối ưu là 9,0 (lipase từ
Pseudomonas và Bacillus). Lipase acid ít thông dụng hơn có thể hoạt động ở pH

dưới 3,0. Nhiều lipase từ loài Bacillus có pH hoạt động rộng (Gupta, Gupta, &
Rathi, 2004).

1.1.3 Tính đặc hiệu của lipase
Khả năng ứng dụng của lipase dùng làm xúc tác sinh học đều dựa vào tính
chọn lọc và đặc hiệu rất tinh tế của nó. Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc có thể là
chọn lọc vị trí không gian, ví dụ như vị trí nhóm phân tử cơ chất của liên kết
ester bị thủy phân hoặc hình thành; cũng có thể là chọn lọc hóa học, ví dụ như
khả năng nhận biết cơ chất; và chọn lọc đồng phân lập thể.
Trang 3

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

Hầu hết lipase thông dụng có tính đặc hiệu vị trí nhóm hydroxyl 1, 3 (sn-1,3;
tương ứng các alcohol bậc 1) trong mạch glycerol, mặc khác cũng có lipase có
tính đặc hiệu cho vị trí sn-2 cho phép việc thủy phân hoàn toàn triglyceride thành
acid béo và glycerol.
Về tính chọn lọc đối với acid béo, lipase có thể chuyển hóa ester với mạch có
độ dài trung bình đến dài (C4 đến C18, có thể lên đến C22) nhưng với hiệu quả
khác nhau. Ngay cả những enzyme từ cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác
nhau ở tính chất này. Một số lipase lại có thể chọn lọc acid béo không no như
lipase từ Geotrichum candidum với tính đặc hiệu với cơ chất chứa acid béo
không no (Δ-9) dạng cis. Lipase tụy và một số lipase từ vi sinh vật thể hiện hoạt
tính trên các acid béo không no nhiều nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA).
Những lipase thủy phân chất béo với những tính đặc hiệu khác nhau có thể
ứng dụng riêng lẻ hoặc kết hợp để đạt được mục đích công nghệ mong muốn,
như tạo ra những triglyceride cấu trúc trong việc tăng giá trị dinh dưỡng, bơ

cacao thay thế, và dầu ăn với hàm lượng PUFA cao (Polaina & MacCabe, 2007).
Trong lĩnh vực sản xuất thuốc, lipase cũng đang được ứng dụng để acyl hóa chọn
lọc các phân tử như carbohydrate, amino acid, peptide (Le, 2003).
Một tính chất quan trọng khác của lipase, nhất là trong công nghiệp sản
xuất hóa chất, thuốc và trong một số sản phẩm nông nghiệp, chính là tính chọn
lọc với đồng phân lập thể. Tính chất này cho phép lipase xúc tác đặc hiệu cho
phản ứng với từng loại đồng phân quang học và phản ứng chọn lọc hỗn hợp
racemic. Lipase được ứng dụng trong quá trình sản xuất trên nhắm vào các
alcohol có đồng phân quang học, ester acid carboxylic, các hydroxy acid, diester,
lactone, amine, diamine, aminoalcohol, dẫn xuất của amino acid (Schmidt,
2001).

1.2

Cố định lipase

1.2.1 Định nghĩa về enzyme cố định
Enzyme cố định (hay enzyme không tan) được hiểu theo 2 nghĩa (Nguyễn
Đức Lượng, 2004):

Trang 4

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

 Nghĩa hẹp: Enzyme cố định là những enzyme được đưa vào pha riêng, có
thể tách riêng được với pha dung dịch tự do. Pha enzyme không hòa tan
trong nước và gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.

 Nghĩa rộng: Enzyme cố định bao gồm cả enzyme đã được cố định vào
chất mang, enzyme có trong tế bào sống được cố định trong các bình phản
ứng sinh học, có gắn kết vào chất mang, cho phép sử dụng lại nhiều lần.
Enzyme cố định thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất
mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme từ trạng
thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.

1.2.2 Đặc điểm của enzyme cố định
 Enzyme cố định có hoạt độ riêng thấp hơn hoạt độ riêng của enzyme hòa
tan.
-

Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi gắn enzyme vào chất mang
có điện tích khác với điện tích enzyme, cấu trúc không gian của
enzyme có sự thay đổi nhất định, làm cho sự tương tác của enzyme với
cơ chất chậm lại, phản ứng xảy ra yếu hơn.

-

Do enzyme bị nhốt vào trong khuôn gel: lúc đó gel sẽ bao lấy phân tử
enzyme tạo thành một vật cản đối với cơ chất của enzyme, nên sự tiếp
xúc giữa trung tâm hoạt động enzyme với cơ chất sẽ gặp khó khăn hơn
so với enzyme tự do.

 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten. Tuy
nhiên, trong phản ứng giữa cơ chất với enzyme cố định có những sai khác
nhất định:
-

Có thể xảy ra hiện tượng cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang.

-

Hiện tượng cản trở khuếch tán cơ chất và các sản phẩm của phản ứng
làm giảm tốc độ phản ứng.

 Enzyme cố định có tính bền nhiệt hơn enzyme hòa tan cùng loại vì chúng
được bảo vệ trong chất mang.
 Enzyme cố định có xu hướng chuyển dịch pH tối ưu sang kiềm hoặc acid
so với pH tối ưu của enzyme hòa tan cùng loại.
 Enzyme cố định có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme hòa tan cùng loại.
 Có thể tái sử dụng enzyme cố định nhiều lần.
Trang 5

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

1.2.3 Ưu nhược điểm của enzyme cố định
 Ưu điểm:
-

Enzyme cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài.

-

Enzyme cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng
enzyme, do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm.

-

Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang –
enzyme ra khỏi dung dịch cơ chất.

-

Enzyme cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn
enzyme tự do.

-

Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.

 Nhược điểm:
-

Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.

-

Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau
quá trình cố định.

Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà
enzyme cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định
enzyme cũng như ứng dụng enzyme cố định vào sản xuất công nghiệp.

1.2.4 Các phương pháp cố định enzyme lipase (Murty, Bhat, &
Muniswaran, 2002; Nguyễn Đức Lượng, 2004)

1.2.4.1

Phương pháp nhốt enzyme (entrapment)

 Nguyên tắc: Enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer
tự

nhiên

như

polysaccharide,

protein,

polymer

tổng

hợp như

polyacrilamide. Sử dụng phương pháp này, enzyme được tự do trong dung
dịch nhưng bị hạn chế di chuyển do cấu trúc lưới của gel.
 Ưu điểm: Có thể cố định được nhiều enzyme lên 1 chất mang.
 Nhược điểm:
-

Kích thước lỗ gel lớn làm thất thoát enzyme ra ngoài.

-

Chất mang có thể làm cản trở cơ chất nên enzyme cố định chỉ dùng để
thủy phân những cơ chất có khối lượng phân tử thấp.

Trang 6

Luận văn tốt nghiệp
1.2.4.2

Chương 1: Tổng quan

Phương pháp vi bao (microencapsulation)

 Nguyên tắc: Phương pháp này có nguyên tắc tương tự phương pháp nhốt.
Tuy nhiên chất mang của enzyme trong phương pháp này chủ yếu là các
màng membrane có kích thước lỗ từ 10 – 100 μm.
 Ưu điểm:
-

Kích thước lỗ nhỏ nên protein enzyme không thể đi qua màng. Còn cơ
chất và sản phẩm nhỏ dễ dàng đi qua màng.

-

Có thể cố định nhiều enzyme để sử dụng cho 1 quá trình nhất định.

 Nhược điểm: Chỉ sử dụng để thủy phân cơ chất khối lượng nhỏ.
1.2.4.3

Phương pháp hấp phụ (adsorption)

 Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng các tương tác giữa chất mang và
enzyme để giữ enzyme trên bề mặt chất mang. Các tương tác này chủ yếu
là các lực kị nước.
 Ưu điểm: Rẻ tiền, nhanh chóng và đơn giản; không cần thay đổi về mặt
hóa học enzyme và chất mang.
 Nhược điểm: Các lực liên kết yếu nên enzyme dễ bị giải hấp phụ khi thay
đổi nhiệt độ, pH, lực ion hoặc sự có mặt của cơ chất. Ngoài ra những chất
lạ cũng có khả năng hấp phụ vào chất mang, có thể gây ra những vấn đề
khác nhau bao gồm cả việc biến tính enzyme.
1.2.4.4

Phương pháp liên kết đồng hóa trị (covalent binding)

 Nguyên tắc: Dựa trên sự hình thành liên kết đồng hóa trị giữa chất mang
và các nhóm chức của những amino acid còn lại trên bề mặt enzyme.
Thông thường chất mang sẽ được hoạt hóa trước bằng hóa chất để nhóm
chức của chúng trở nên ái điện tử (electrophilic) mạnh. Sau đó nhóm chức
này được cho phản ứng với các nhóm chức ái nhân (nucleophilic) của
enzyme.
 Ưu điểm: Liên kết tạo thành là liên kết mạnh nên enzyme cố định khá bền.
 Nhược điểm: Đắt tiền, hiệu suất thấp do cấu hình không gian và hoạt tính
enzyme bị ảnh hưởng bởi liên kết đồng hóa trị.
Trang 7

Luận văn tốt nghiệp
1.2.4.5

Chương 1: Tổng quan

Phương pháp liên kết ion (ionic binding)

 Nguyên tắc: Sử dụng các tương tác điện (như liên kết ion và liên kết
hydro) giữa các nhóm mang điện khác nhau của chất mang và enzyme.
 Ưu điểm và nhược điểm: Tương tự như phương pháp hấp phụ, tuy nhiên
cấu hình enzyme bị ảnh hưởng bởi phương pháp này cao hơn phương pháp
hấp phụ và thấp hơn phương pháp liên kết đồng hóa trị.
1.2.4.6

Phương pháp cross-linking

 Nguyên tắc: Liên kết các enzyme tự do lại với nhau để tạo ra một cấu trúc
không gian 3 chiều. Liên kết này được tạo thành bằng các chất có 2 hay
nhiều nhóm chức như glutaraldehyde.
 Nhược điểm: Hiệu suất cố định rất thấp, độ bền và tính chất cơ học thấp.

1.2.5 Các nghiên cứu gần đây về cố định enzyme lipase
1.2.5.1

Phương pháp nhốt enzyme

a. Phương pháp nhốt enzyme trong gel
Một trong những loại gel phổ biến để cố định lipase là -carrageenan. carrageenan có thể dễ dàng chuyển thành trạng thái gel khi có mặt ion kim loại,
amine, amino acid và dung môi hữu cơ hòa tan trong nước. Desai, Daveb, &
Devi (2004) đã tiến hành thí nghiệm nhốt lipase trong gel -carrageenan bằng
cách nhỏ -carrageenan vào polyethyleneimine (PEI) trong môi trường đệm kali
phosphate có pH 7. Điều kiện tối ưu cho quá trình cố định: nồng độ lipase
10mg/ml, nồng độ PEI 2% w/v, nồng độ -carrageenan 3% w/v, thời gian cố

định 2h.
Jegannathan, Chan, & Ravindra (2009) cũng tiến hành nhốt lipase trong gel carrageenan nhưng lại nhỏ -carrageenan vào dung dịch KCl. Các thông số của
quá trình cố định: nồng độ lipase 1g/ml, nồng độ KCl 2%. Sau khi cố định, tính
chất vật lý và độ bền của enzyme tăng: bền trong pH = 6 – 9, bền nhiệt đến 50oC
và bền trong một số dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, iso-propanol, nhexane và n-heptane. Hoạt tính sau khi tái sử dụng 6 lần là khá cao, còn lại
72,3% so với ban đầu.
Trang 8

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

Một số tác giả cũng thực hiện việc nhốt lipase trong hạt gel với chất mang
khác, chẳng hạn như alginate. Knezevic và cộng sự (2002) đã tạo gel bằng cách
nhỏ hỗn hợp Na-alginate và lipase vào trong dung dịch CaCl2 bằng thiết bị
electrostatic droplet generator tạo ra hạt có đường kính nhỏ hơn 1mm. Kết quả
cho ra điều kiện tối ưu là: điện thế 4,9kV, kích thước đầu kim 21 gauge, nồng độ
Na-alginate 2% (w/v), kích thước hạt gel 0,65mm.
Matsumoto & Ohashi (2003) đã tiến hành thí nghiệm khả năng chịu nhiệt của
lipase cố định trong các chất mang khác nhau. Các tác giả sử dụng enzyme cố
định trong gel Ca-alginate, vi bao trong calcium silicate và trong hạt acrylic. Kết
quả cho thấy hoạt tính của lipase cố định trên gel alginate là cao nhất khi nhiệt độ
nhỏ hơn 60oC (gel alginate > hạt acrylic >calcium silicate > tự do). Nhưng kết
quả lại khác khi tăng nhiệt độ hơn 60oC, calcium silicate ≈ hạt acrylic > gel
alginate ≈ tự do.
Kế thừa những kết quả trên, Cheirsilp, Jeamjounkhaw, & H-Kittikun (2009)
nghiên cứu tối ưu hóa việc cố định lipase trên alginate để thu nhận
monoacylglycerol (MAG) một cách tối ưu. Điều kiện tối ưu của quá trình cố định
lipase là: nồng độ alginate 2% (w/v), nồng độ CaCl2 100mM, nồng độ lipase

30U/ml, hạt gel có kích thước 2,03mm. Để hạn chế sự thất thoát enzyme, hạt gel
được phủ lên một lớp silicate. Điều này giúp khả năng tái sử dụng của lipase cố
định hiệu quả hơn. Tiếp theo, các tác giả thực hiện tối ưu quá trình thu nhận
monoacylglycerol. Kết quả thu được: tỉ lệ mol glycerol:dầu cọ là 10:1, không bổ
sung nước, lượng lipase cố định là 27 U và dung dịch 50% (w/v) dầu cọ trong 2methyl-2-butanol sẽ cho lượng MAG nhiều nhất. Trong khi đó dung dịch 10%
(w/v) dầu cọ trong 2-methyl-2-butanol sẽ thủy phân tốt nhất triacylglycerol
(100%) thành 54% monoacylglycerol, 9% diacylglycerol và 37% acid béo tự do
sau 4 giờ.
Cũng có một số thí nghiệm so sánh hiệu quả nhốt lipase trên gel alginate với
gel chitosan và gel agarose. Betiger & Steven (2002) đã tiến hành thí nghiệm xác
định khả năng cố định, sự giải phóng và hoạt tính của lipase được cố định trên
các loại polymer khác nhau. Các hạt agarose có sự trương nở không theo mong
muốn trong việc giải phóng lipase, và polymer này không thích hợp cho các
Trang 9

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

nghiên cứu tiếp theo. Alginate hay chitosan được tạo thành hạt gel khi nhỏ vào
dung dịch CaCl2 hay dung dịch tripolyphosphate (TPP). Sau đó chúng được đem
sấy thăng hoa. Kết quả thu được cho thấy hạt alginate giải phóng enzyme nhiều
hơn hạt chitosan. Tuy nhiên, hiệu suất cố định lipase trong chitosan cũng như
trong alginate khác nhau là gần như nhau, 43 – 50%. Hoạt tính của lipase cố định
trên alginate (240  33 và 220  26 U/ml lần lượt cho không có và có sấy thăng
hoa) thấp hơn chitosan (1110  51 và 1150  11 U/ml). Từ đó kết luận rằng hạt
chitosan có hiệu quả hơn trong việc nhốt lipase hơn hạt alginate.
Sau đó, Alsarra, Neau, & Howard (2004) đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh
hưởng đến hạt gel chitosan. Ảnh hưởng của pH, nồng độ tripolyphosphate (TPP),

và độ mạnh của lực ion trong môi trường tạo gel đến hiệu suất cố định, mức độ
giải phóng và hoạt tính của lipase cố định trong hạt hydrogel chitosan được khảo
sát. Dung dịch lipase từ Candida rugosa được chuẩn bị trong chitosan 1,5%
(w/v) và acid acetic 1% (v/v) sau đó được nhỏ vào dung dịch TPP. Theo kết quả
thì pH và nồng độ TPP có ảnh hưởng đến các yếu tố nêu trên trong khi lực ion lại
không ảnh hưởng. Hoạt tính lipase cố định giảm không đáng kể sau 5 lần tái sử
dụng. Theo phân tích thống kê, thời gian tối ưu cho hiệu quả cố định và hoạt tính
của lipase, đồng thời giảm tối thiểu lượng enzyme thất thoát là 36h trong đệm
Tris.
Kim và cộng sự (2011) nhốt lipase trong các chất mang hydrogel cellulosebiopolymer. Lipase lần lượt được nhốt vào các chất mang khác nhau như
cellulose,

cellulose-carrageenan,

cellulose-chitosan,

cellulose-agarose

và

cellulose-agar. Hoạt tính enzyme trên các chất mang đó lần lượt là 35; 9,6; 39,7;
41,4 và 52,6% so với enzyme tự do. Từ đó ta nhận thấy cellulose-biopolymer là
những chất mang phù hợp cho quá trình cố định lipase, ngoại trừ cellulosecarrageenan.
b. Phương pháp nhốt enzyme trong sol-gel
Yilmaz, Sezgin, & Yilmaz (2010) đã tiến hành nhốt lipase lên chất mang solgel trơ về mặt hóa học với sự có mặt của sporopollenin hoặc sporopollenin được
hoạt hóa(sporopollenin được xem như là phụ gia). Chất mang sol-gel được tổng
Trang 10

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

hợp từ phản ứng trùng ngưng giữa tetraethoxysilane với octyltriethoxysilane. Kết
quả cho thấy chất mang có sporopollenin thì lượng enzyme cố định được ít hơn
sporopollenin được hoạt hóa, nhưng hoạt tính enzyme cố định lại cao hơn. Từ đó
kết luận hiệu quả cố định trên sporopollenin tốt hơn trên sporopollenin được hoạt
hóa. Lipase sau khi cố định bền với pH acid (pHopt = 5) so với lipase tự do (pHopt
= 7). Nhiệt độ tối ưu của lipase tự do, cố định trên sporopollenin và trên
sporopollenin được hoạt hóa lần lượt là 35, 40, 45oC. Như vậy thì lipase sau khi
cố định chịu được khoảng nhiệt độ rộng hơn và chịu được nhiệt độ trong khoảng
thời gian dài so với lipase tự do. Một tính chất quan trọng khác là khả năng tái sừ
dụng của lipase, sau 8 lần sử dụng hoạt tính của lipase nhốt trong sporopollenin
và trong sporopollenin được hoạt hóa còn 28 và 26% so với ban đầu. Người ta
cũng nhận thấy hoạt tính của lipase trên sporopollenin được hoạt hóa và
sporopollenin còn lại sau 50 ngày bảo quản là khá cao, 95 và 93%. Trong lúc đó
của lipase tự do chỉ còn 15% sau 12 ngày.
Và Uyanik, Sen, & Yilmaz (2011) cũng tiến hành thí nghiệm trên cùng một
chất mang như trên, nhưng lại bổ sung calix(aza)crowns như là chất phụ gia mới.
Phần trăm hoạt tính enzyme và khả năng thủy phân của lipase cố định cao hơn
hơn lipase tự do. pH tối ưu của lipase sau khi cố định vẫn giống như tự do, nhưng
ở môi trường pH acid thì hoạt tính của lipase cố định cao hơn tự do và ngược lại
khi ở pH kiềm. Nhiệt độ tối ưu của lipase tự do dịch chuyển từ 35oC thành 45oC
sau khi cố định. Ngoài ra, lipase cố định vẫn còn giữ được 18% hoạt tính sau 6
lần tái sử dụng.
c. Phương pháp nhốt enzyme trong photo-crosslinkable
Moniera, Wei, & Sarhan (2010) nghiên cứu cố định lipase trên chất mang
photo-crosslinkable chitosan. Chitosan được đem phản ứng với -cyano-4hydroxycinnamic

acid

với

sự

có

mặt

dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide

của

chất

hoạt

hydrochloride

hóa
(EDC),

N-(3N-

hydroxysuccinimide (NHS) để tạo thành chất mang chitosan--cyano-4hydroxycinnamated (chitosan-ACHCA). Chitosan-ACHCA trộn với dung dịch
lipase, khuấy đều ở nhiệt độ thấp. Sau đó đổ 1 lớp mỏng vào đĩa petri và để khô
trong bình đá ở điều kiện chân không rồi được chiếu UV. Kết quả thu được khá
Trang 11

Luận văn tốt nghiệp

Chương 1: Tổng quan

tốt, hoạt tính tương đối của enzyme sau khi cố định đạt 98,6% so với ban đầu.
Các điều kiện tối thích của lipase sau khi cố định là: nhiệt độ 40oC, pH = 8 và
chịu được khoảng pH rộng. Ngoài ra, hoạt tính của nó giảm rất chậm sau 6 lần tái
sử dụng.
1.2.5.2

Phương pháp vi bao enzyme

Người ta thường vi bao lipase trên các chất mang như polyvinyl alcohol
(PVA), carboxymethycellulose (CMC) hay hỗn hợp PVA:CMC. Dalla-Vecchia
và cộng sự (2005) đã tiến hành vi bao lipase trên cả 3 chất mang này dưới dạng
lớp film mỏng, đồng thời đã chọn được lipase từ Rhyzopus oryzae (ROL) và tỉ lệ
lipase/chất mang bằng 50 mg/0,5g là phù hợp nhất. Dưới tác dụng của nhiệt độ
(25 – 50oC), khả năng ester hóa của lipase sau khi cố định đạt 99%, trong khi đó,
lipase tự do chỉ đạt 6 – 33%. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ cũng được khảo
sát. Khả năng ester hóa của lipase sau khi cố định cũng cao hơn hẳn lipase tự do.
Không những vậy, hoạt tính của lipase được cố định chỉ mất sau 10 lần tái sử
dụng cũng như sau 80 ngày bảo quản. Trong khi đó, lipase tự do mất hoạt tính
chỉ sau 35 ngày bảo quản. Từ đó, ta có thể kết luận các polymer như PVA, CMC
và PVA:CMC có thể dùng làm chất mang để cố định lipase một cách hiệu quả.
Bên cạnh đó, Dhake và cộng sự (2011) cũng tiến hành vi bao lipase từ
Rhyzopus oryzae dưới dạng film mỏng với chất mang được tạo ra từ
hydroxylpropyl methyl cellulose (HPMC) và PVA để tổng hợp được citronellol
ester khi có mặt CO2 siêu tới hạn (Sc-CO2). Với mục đích thực hiện phản ứng
chuyển ester, các thông số như tỉ lệ khối lượng, mức độ acyl hóa, thời gian, nhiệt
độ, nồng độ enzyme, áp suất và co-solvent được tối ưu. Kết quả thu được: có sự

tăng lượng citronellol ester khi dùng lipase cố định (91%), gấp 8 lần so với lipase
tự do (11%) trong Sc-CO2. Việc phát triển của các phương pháp trong lĩnh vực
xúc tác sinh học cho phép sử dụng lượng xúc tác thấp (1,5% w/v), nhiệt độ phản
ứng thấp 45oC, áp suất thấp 8MPa so với những nghiên cứu trước. Phương pháp
cố định đã làm tăng đáng kể độ bền của enzyme dưới tác dụng của Sc-CO2.
Ngoài ra, lipase cố định vẫn có hiệu quả thủy phân sau 3 lần tái sử dụng.
Một số tác giả cũng tiến hành vi bao lipase trong hệ sợi thay vì vi bao enzyme
trên màng. Wang & Hsieh (2008) đã cố định lipase từ Candida rugosa vào sợi có
Trang 12

Nghiên Cứu Cố Định LIPASE Và Tính Chất Của ENZYME Cố Định

Tài liệu liên quan

Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về