CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀ ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
KHOA SINH HỌC

CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀ ỨNG DỤNG
CỦA ENZYME PROTEASE

Giáo viên hướng dẫn

Sinh viên thực hiện

Phùng Bích Hòa

Nguyễn Thị Vân Anh
MSV:16S3011004
Lớp : Sinh 2

Huế, 10/2017


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trong thế kỷ XXI đã chứng kiến sự phát triển chưa từng có của sinh học phân
tử và công nghệ sinh học, đặc biệt là các ứng dụng của enzyme. Việc nghiên cứu
về enzym có ý nghĩa vô cùng quan trọng đối với khoa học nói riêng và với toàn
xã hội nói chung. Enzyme đã trở thành một công cụ thực nghiệm quan trọng
không chỉ trong y học mà còn trong công nghiệp hóa học, chế biến thực phẩm và
nông nghiệp. Nó được sử dụng trong nhiều ứng dụng khác nhau như tổng hợp hóa
chất đa tính năng, các chất giặt tẩy và các chất làm sạch kính áp tròng…Một trong
những lĩnh vực đáng quan tâm nhất của enzym học hiện đại là việc ứng dụng các
chất ức chế enzym để làm các loại thuốc cho con người và động vật. Cùng với sự

phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme sản
xuất ra ngày càng nhiều . Hằng năm lượng Enzyme sản xuất trên thế giới đạt
khoảng 300.000 tấn,với giá trị trên 500 triệu USD. Trong những năm gần đây, giá
trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ
USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong
ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%).
Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide trong phân tử
protein. Nó được ứng dụng một cách rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như
công nghiệp chế biến thực phẩm chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát,
làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý
phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm ), y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc
da, công nghiệp sản xuất xà phòng , chất tẩy rửa... và chiếm khoảng 60% thị
trường enzyme. Chế phẩm enzyme này có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
như thực vật, động vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa số các
chế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn do có nhiều ưu điểm vượt trội như chu kỳ phát triển 280 ngắn, môi trường
nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…. Vì vậy, có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu
thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời
sống. Quá trình thu nhận các chế phẩm protease phụ thuộc rất nhiều yếu tố như
tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật, điều kiện thu nhận... Vì vậy, tùy từng


trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp để thu nhận các
chế phẩm protease phù hợp với mục đích sử dụng. Hiện nay, trên thế giới, các chế
phẩm protease đã được thương mại hóa và được đưa vào ứng dụng một cách rộng
rãi. Tuy vậy, trong thời gian gần đây, trên thế giới, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp
tục tiến hành nghiên cứu thu nhận, tinh chế, xác định các tính chất của chế phẩm
thu. Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về protease vi sinh vật, tuy nhiên
chỉ mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng enzyme vẫn
còn hạn chế.Enzyme Protease có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống của

con người,động vật. Để giúp mọi người hiểu rõ về cấu trúc,cơ chế xúc tác cũng
như ứng dụng của Enzyme Protease,em chọn đề tài “CƠ CHẾ XÚC TÁC VÀ
ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE” làm tiểu luận.
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Tìm hiểu cơ chế phản ứng và ứng dụng của enzyme protease trong các lĩnh vực
trong đời sống. Từ đó, giúp moi người hiểu rõ hơn về enzyme protease để ứng
dụng trong đời sống.
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu của đề tài là Enzyme Protease
-Phương pháp nghiên cứu trong bài tiểu luận đươc dùng chủ yếu là phương pháp
nghiên cứu lý thuyết, tổng hợp nhằm làm rõ vấn đề được nghiên cứu và giúp
người đọc có cai nhìn tổng quát hơn về loại enzyme này.


PHẦN II:NỘI DUNG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
1.1.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME HIỆN NAY
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò
xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về
enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực
nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên
cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch
khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quangiữa cấu trúc và hoạt tính sinh
học của enzyme, khả năng ứng dụng enzym trong thực tế. Nghiên cứu về
công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng
của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin... sử dụng mầm mạ để sản
xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid
từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên
men rượu bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử
dụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất

độc...Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một
số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số
bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ
em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực
và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta.
1.1.2. Tình hình nghiên cứu về enzyme protease hiện nay
Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi
lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm, trong y học, trong
công nghệ gen và bảo vệ môi trường, protease đã có những đóng góp rất to
lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên
thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát
triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme
protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu
sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật
còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại
đây.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao (giá trị buôn bán
187.2 triệu USD) do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong
sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme
chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30%. Vì
vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm
thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Trong những năm gần


đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt
khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và
protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp
(60%)
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
1.2.1. Đặc điểm
- Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ

phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit
đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có
khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin.

Hình 1.1. Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein
1.2.2. Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36 x 48 x 36AO và
mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt
động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm
bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm
20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.Hoạt tính của papain dựa trên


hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain
khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt
tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là
50 – 57 độ C.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của protea
1.2.3. Cấu trúc tâm hoạt động của Protease (Papain)
- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen
bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng
liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.
- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino
acid là:
Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.


Hình 1.3. Cấu trúc tâm hoạt động của Protease (Papain)
1.2.2 Phân loại

Theo Bergman và Futon (1941-1942), Protease được phân chia thành 2
loại : endopeptidase và exopeptidase.
- Endopeptidase Enzyme này phá vỡ protein ở những nơi nhất định trong
các phân tử protein và cơ sở của chúng không ảnh hưởng đến các cụm nằm
ở cuối của phân tử. Ví dụ, endopeptidase là một enzyme pepsin được tìm
thấy trong ruột non và papain, một enzyme có trong đu đủ.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân
chia thành 2 loại :
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin,một dipeptide hoặc
tripeptide.
+ Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4
nhóm:
+ Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc
tác của enzyme. . Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như


chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme
vi khuẩn như Subtilisin Carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase
thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất
tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
+ Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.

Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin,
cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong
trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dưới tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
+ Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng it
thấy ở vi khuẩn.
+ Protease trung tính: pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả
dứa.
+ Protease kiềm: pH 9-11
1.2.3 Các nguồn cung cấp enzyme protease
1.2.3.1. Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp, men này do
tuyến tụy tiết ra, tiền thân của nó là Trypsinogen, được hoạt hóa bởi
Enterokinaza của ruột.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm Protease tên là renin. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có
khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca 2+. Đây là quá trình
đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất.


Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin
như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
1.2.3.2. Nguồn thực vật:
Có 3 loại protease thực vật như: Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu
được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ

quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant)

Hình 1.4. Nguồn thu enzyme protease từ thực vật
1.2.3.3. Nguồn vi sinh vật:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn...gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium,
Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men.
* Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống
thuộc chi Clostridium. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt
động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 58) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis,
B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng
pH rộng 7-12 .


Hình 1.5. Bacillus
* Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae,
A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)... Các loại
nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung
tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy
phân protein ở pH 2,5-3.

Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti...
cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong
sản xuất pho mat.

Hình 1.6. Nấm mốc
* Xạ khuẩn


Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có
khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S.
Trerimosus...

Hình 1.7. Xạ khuẩn

CHƯƠNG 2: CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENZYME
PROTEASE
2.1. SỰ PHÁT TRIỂN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA
ENZYME
Vào cuối thế kỷ XIX, Emil Fischer đã đề xuất mô hình “chìa khóa và ổ khóa”
cho mối quan hệ hoa học theo khuôn giữa các enzyme và cơ chất của chúng.
Một trong những nghiên cứu sớm nhất của Brown được công bố năm 1902 là
nghiên cứu về tốc độ của các phản ứng do enzyme xúc tác.Năm 1903, Victor
Henri đã công bố mô hình toán học đầu tiên thành công trong viêc mô tả động
học enzyme. Vào năm 1913, trong một tờ báo được phát hành rộng rãi,
Michaelis và Menten đã phát triển công trình của Henri và đưa ra phương
trình tốc độ enzyme “Phương trình Henri – Michaelis – Menten” là nền tảng
cho nhiều nghiên cứu hiện đại về cơ chế phản ứng của enzyme.Vào năm
1948, nhà lý hóa học Linus Pauling đã đề xuất rằng, enzyme làm tăng tốc độ
được là nhờ sự ổn định của trạng thái chuyển tiếp của phản ứng hóa học khi

tương tác với vị trí enzyme hoạt động. Năm 1965, Monod, Wyman và
Changeux đã phát triển học thuyết về sự chuyển hoạt tính enzyme để giải
thích các quan sát trước đó.
2.2. Cơ chế
Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau
nhưng chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo
cùng cơ chế chung như sau:
E + S → ES → ES’ + P1 → E + P2
Trong đó:
E: Enzyme ; S: Cơ chất ; ES: Phức chất enzyme – cơ chất.
ES’: Phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa (Acyl enzyme).
P1: Sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới được
tạo thành).
P2: Sản phẩm thứ hai của chuỗi phản ứng (nhóm carboxyl tự do mới được
tạo thành)

Hình 2.1. Mô hình quá trình tác dụng phức hợp cơ chất – enzyme


Hình 2.2. Mô hình “chìa khóa và ổ khóa” của Pisher giải thích cơ chế tác
dụng của cơ chất và enzyme


Hình 2.3. Sơ đồ minh họa cơ chế hoạt động của chymotrypsin
2.2.1. Giai đoạn 1: Acyl hóa
Cơ chất kết hợp với enzyme tạo phức trung gian ES. Sau khi tạo thành
phức hợp ES, cacbon trong nhóm cacbonyl của liên kết peptide dễ bị phân
cắt (ví dụ: trên vị trí P1) bởi serin ở trung tâm hoạt động, qua đó tạo thành

một chất trung gian tứ diện (tetrahedral) với một trung tâm oxyanion trên
cacbon cacbonyl làm nhớ lại trạng thái chuyển tiếp của phản ứng. Trạng
thái chuyển tiếp này được làm bền bởi các tương tác liên kết hydro đặc hiệu
giữa các gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm oxyanion của cơ
chất.
+ Trong subtilizin, liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của serin 195
trong bộ khung (ai nhân trung tâm hoạt động) và của serin 155 chuỗi bên.
+ Trong chymotrypsin, các liên kết hydro này được tạo thành từ nitơ của
gốc serin ái nhân và một glyxin ở trung tâm hoạt động.
Trong sơ đồ hình 2.3:
- Các gốc Ser-195 và His-57 trực tiếp tham gia trong phản ứng cắt đứt liên
kết peptide của cơ chất. Băt đầu là nguyên tử O 2 của Ser-195 tấn công vào
nguyên tử C của nhóm -CO- trong liên kết peptide, do đó liên kết đôi giữa


C và O của -CO- trở thành liên kết đơn, O 2 tích điện âm (gọi là oxyanion).
Các nguyên tử liên kết với C của -CO- săp xếp như một khối bốn mặt, do
đó được gọi là phức trung gian tứ diện tức thời (trạng thái chuyển tiếp), sau
đó giải phóng sản phẩm P1 và phức acyl-enzyme. Để tạo thành phức diện
tức thời còn có sự tham gia của hai nhóm -NH- của mạch chính enzyme.
Chúng tạo liên kết hydrogen với oxyanion (O2 của -CO-)
2.2.2. Giai đoạn 2: Deacyl hóa
Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2O theo chiều ngược lại
của giai đoạn acyl hóa. Enzyme bị khử acyl do sự tác dụng ái nhân của
phân tử nước đi vào trung tâm hoạt động của enzyme từ một khoang do
đích đến của sản phẩm peptide đầu tiên. Phản ứng khử acyl xảy ra cùng với
sự tạo thành trong quá trình acyl hóa và gắn liền với sự làm bền liên kết H
với enzyme.Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ
serine cho nhóm amin để tái sinh lại enzyme.
Trong sơ đồ hình 2.3:

-Sản phẩm amine đang liên kết với His-57 bằng liên kết hydrogen sẽ
khuyếch tán ra ngoài. Thế vào đó là H2O. His-57 lấy H+ của H2O. Ion OHđược tạo thành tấn công C của -CO- đang gắn với Ser-195 để tạo thành
phức trung gian tứ diện tức thời. Sau đó, His-57 dâng H + cho oxygen của
Ser-195, đồng thời giải phóng P2 (phần acid của cơ chất). P2 khuếch tán ra
ngoài
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính xúc tác của enzyme
2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Tốc độ của phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với nồng độ của enzyme
có trong dung dịch khi nồng độ cơ chất là xác định. Mối liên hệ giữa vận tốc
phản ứng và nồng độ enzyme được thể hiện thông qua biểu thức:
V= k[E]
Trong đó: V: Tốc độ phản ứng
[E]: Nồng độ enzyme


Hình 2.4. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
- Do tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme (khi cơ chất đầy đủ)
nên nồng độ enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất bị biến đổi càng
nhiều bấy nhiêu. Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng sẽ
chậm
lại.
- Trong điều kiện thừa cơ chất tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc
tuyến
tính
vào
nồng
độ
enzyme
- Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay hoạt
hóa thì tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với

[E] đó.
2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một cơ chất

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
v1 =

k1[E][S]

v-1 = k-1[ES]


v2 = k2[ES]
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]
(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2)
Gọi E0 là nồng độ ban đầu:
[E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3)
Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:
(k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S]
k1 [Eo] [S]
ES=
k-1 + k2 + k1 [S]
Nếu đặt Km= k-1 + k2/ k1 (Km: gọi là hằng số Michalis Menten)
Ta có: [ES] = [E0][S]/ Km+[S]
Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:
V = k2[ES]
Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:

k2 [Eo] [S]
V=

(4)
Km + [S]

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme
càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất,
nghĩa là:
Vmax= k2[E0]
Thay vào phương trình (4) ta được:
[S]
V= Vmax

(5)
Km + [S]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten
Km gọi là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. K m đặc
trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, K m có trị số càng nhỏ thì ái lực
của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do
enzyme xúc tác càng lớn.


Hình 2.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính
protease
Nồng độ cơ chất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme xảy ra theo ba
giai
đoạn:
• Giai đoạn đầu: enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp

enzyme-cơ chất (ES). Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ
phản ứng V phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
• Giai đoạn 2: ở giai đoạn này thì phức hợp ES được tạo thành ở giai đoạn
đầu sẽ bị tách ra, tốc độ phản ứng đạt cực đại và nó hoàn toàn không phụ
thuộc
vào
nồng
độ
cơ chất.
• Giai đoạn 3: enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hiện tượng
này

là đúng

khi

phản

ứng

chỉ

có

một

cơ

chất

duy

nhất.

2.3.3. Ảnhhưởng của nhiệt độ
Bản chất của enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng đến cấu trúc
của chúng. Tốc độ ảnh hưởng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt
độ nào đó mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc. Đa số enzyme bị mất hoạt
tính ở nhiệt độ >700oC, vì thế nên khi vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản


ứng enzyme sẽ bị giảm dần và dẫn đến mức triệt tiêu. Tại khoảng nhiệt độ
mà enzyme có thể tồn tại vận tốc phản ứng tăng từ 1.4-2 lần khi tăng
100oC.

Hình 2.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng
của
enzyme
Nhiệt độ ứng với tốc độ phản ứng cao nhất được gọi là nhiệt độ tối thích
của enzyme. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau tùy vào nguồn
gốc của chúng. Nhưng phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ
400C đến 500C. Khi nhiệt độ cao hơn mức tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị
giảm. Ngược lại, ở nhiệt độ 00C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh,
nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức
tối ưu. Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của kim loại, cơ
chấtvà pH.
Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vốc độ phản ứng của
enzyme là hệ số nhiệt Q10. Hệ số này càng lớn thì phản ứng khó xảy ra ở
nhiệt độ thường.
Khi nhiệt độ càng tăng cao thì thời gian phản ứng càng rút ngắn. Tuy

nhiên, ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến
tính dần protein của enzyme với nhiệt độ, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì
enzyme sẽ không còn hoạt động nữa. Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt
độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến
và bảo quản thực phẩm.
2.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường
Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, với mỗi
enzyme chỉ hoạt động mạnh ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích.
pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc
biệt là ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Tốc độ phản ứng sẽ tăng dần đến
giá trị cực đại sau đó giảm dần. Đa số enzyme bền ở pH 5 - 9. Độ bền của
enzyme sẽ tăng nếu có mặt của cơ chất, Ca2+... Người ta thường sử dụng
ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương
thực, thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật...

Hình 2.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH môi trường đếntốc độ
phản ứng của enzyme
Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:
+ Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp.


+ Ở hai sườn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay
coenzyme.
+ Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất.
+ Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn
đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và thay đổi hoạt
tính cực đại.
Nhờ xác định Vmax và Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận định lại bản

chất của các nhóm tham gia vào liên kết cơ chất và quá trình tự xúc tác.
2.3.5. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn
tác dụng của enzyme. Các chất kìm hãm có thể là ion kim loại, các anion, các
hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein.
● Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition)
Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất (S) và chất kìm hãm (I) đều
tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzyme. Chất kìm hãm (I) choán chổ
của cơ chất (S) ở enzyme.

Hình 2.8. Chất kìm hãm cạnh tranh


Hình 2.9. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng
độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm cạnh tranh
Khi cơ chất dư thừa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại bỏ tác dụng
của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất kìm hãm cao
thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn.
Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục tung ở một
điểm là 1/Vmax.
● Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition)
Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với phức hợp
ES, mà không liên kết với enzyme tự do.


Hình 2.10. Mô hình minh họa phản ứng enzyme khi có chất ức chế phi
cạnh tranh
Phương trình :
1

Km
=

V

1
x

Vmax

[I]
α’
+

[S]

Trong đó: α’= 1+

, k’I =
K’I

Vmax

[ES] x [I]
[ESI]

[I] là nồng độ chất ức chế
K’I là hằng số phân ly phức ESI

Hình 2.11. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào

nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm phi cạnh
tranh
● Kìm hãm hỗn hợp


Hình 2.12. Mô hình minh họa chất kìm hãm hỗn hợp gắn với enzyme
Phương trình :
1

αKm
=

V

1
x

Vmax

α’
+

[S]

Vmax

Trường hợp α=α’ gọi là kìm hãm không cạnh tranh (noncompetitive).

Hình 2.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào
nồng độ cơ chất theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm hỗn hợp

Bảng 1. Ảnh hưởng của kiểu kìm hãm lên Vmax và Km


Vmax
Km

Cạnh tranh

Phi cạnh
tranh

Hỗn hợp

Không ảnh
hưởng

Giảm

Giảm

Giảm

Tăng

Tăng

Không có
kìm hãm
Giảm
Không ảnh

hưởng

2.3.6. Ảnh hưởng của các chất kích hoạt
Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm.
Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu cơ như các
vitamin tan trong nước. Các chất kích hoạt thường kết hợp trực tiếp với
enzyme, làm thay đổi cấu tạo không gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt
động xúc tác của enzyme.
Tính chất hoạt hóa của các cation kim loại:
+ Mỗi cation kim loại hoạt hóa cho một kiểu phản ứng nhất định.
+ Cation kim loại có tính đặc hiệu tương đối hay tuyệt đối.
+ Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion.
+ Phụ thuộc nồng độ cation kim loại .
+ Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích.
+ Phụ thuộc bản chất cation kim loại.