Sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ
MINH
------------o0o-----------

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
SẢN XUẤT CHITIN – CHITOSAN TỪ VỎ TÔM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH
HỌC
MÃ NGÀNH: C73

GVHD: TS Nguyễn Hoài
Hương
SVTH :

Đặng Tiến Đông

TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 , năm 2010

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 1
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ
TPHCM

Ban chủ nhiệm thầy cô khoa Môi Trường và Công
Nghệ Sinh Học đã truyền đạt mọi kiến thức, giúp đỡ và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập ở trường.
Cô Nguyễn Hoài Hương trường Đại Học Kỹ Thuật Công
Nghệ TPHCM, cô Đỗ Thò Tuyến thuộc Viện Sinh Học Nhiệt
Đới, đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong thời
gian đang thực hiện khoá thực tập này.
Ban giám đốc cùng các cán bộ, nhân viên trực thuộc
phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học – Viện Sinh Học Nhiệt
Đới đã hướng dẫn và chia sẽ cùng tôi nhưng khó khăn
trong thời gian thực hiện khoá luận.
Các bạn bè trong lớp cũng như các bạn bè trong viện
đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực tập
này.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 2
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

MỤC LỤC
trang
LỜI CẢM ƠN...................................................................................
MỤC LỤC...........................................................................................
DANH SÁCH CÁC BẢNG...............................................................
DANH SÁCH CÁC HÌNH...................................................................
Chương 1 Mở đầu...........................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................2
1.2. Mục đích đề tài.......................................................................2

1.4. Nội dung....................................................................................2
Chương 2 tổng quan tài liệu.........................................................3
2.1. Nguồn gốc sự tồn tại chitin – chitosan trong tự nhiên......3
2.1.1.Cấu trúc hoá học của chitin..............................................4
2.1.2 Tính chất của chitin...............................................................5
2.1.3 Cấu trúc hoá học của chitosan.........................................6
2.1.4 Tính chất của chitosan..........................................................7
2.1.5 Nguồn thu nhận chitin...........................................................8
2.2 Phương pháp sản xuất chitin – chitosan.................................9
2.3 Ứng dụng của chitin – chitosan...............................................10
2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất trong và ngoài nước......12
2.5 Một số quy trình sản xuất trong và ngoài nước..............15
2.6 Nhu cầu sử dụng phương pháp sinh học kết hợp với hoá
học....................................................................................................20
2.7 Các nguồn enzyme protease....................................................20
2.8 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae...................22
2.8.1Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề
mặt...................................................................................................23
2.8.2 Thu nhận và tủa enzyme.....................................................25
2.8.3 Tinh sạch enzyme....................................................................26
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 3
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
2.9 Giới thiệu về sự cố đònh enzyme........................................27
2.9.1. Đònh nghóa..............................................................................27
2.9.2 Tính chất của enzyme cố đònh...........................................28
2.9.3. Vật liệu cố đònh..................................................................29
2.9.4. Phương pháp cố đònh...........................................................31

2.9.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cố
đònh...................................................................................................33
2.9.5.1. Bản chất và tính chất hoá học của chất mang.......33
2.9.5.2. Tốc độ khuyếch tán của cơ chất sản phẩm...........34
2.9.5.3 nh hưởng của pH lên enzyme không hoà tan...........34
2.5.6. Ứng dụng của enzyme cố đònh........................................34
2.9.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thuỷ phân bằng
enzyme...............................................................................................36
Chương 3 Phương pháp nghiên cứu..............................................40
3.1. Thời gian và đòa điểm thí nghiệm.......................................40
3.2. Vật liệu....................................................................................40
3.2.1. Đối tượng thí nghiệm...........................................................40
3.2.2. Thiết bò..................................................................................40
3.2.3. Hoá chất...............................................................................41
3.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................41
3.3.1 Phương pháp xác đònh hàm lượng protein theo Bradford..41
3.3.2 Đònh lượng protein theo phương pháp Biure.........................43
3.3.3. Phương pháp xác đònh hoạt tính enzyme theo Amano.......44
3.3.4. Xác đònh hoạt tính riêng của dòch chiết enzyme...........47
3.3.5 Phân tích thành phần nguyên liệu vỏ tôm...................47
3.3.5.1. Xác đònh độ ẩm của vỏ tôm khô.............................47
3.3.5.2. Xác đònh hàm lượng tro trong vỏ tôm khô tuyệt đối...........
48
3.3.5.3. Xác đònh hàm lượng Ca và P trong mẫu tôm khô
tuyệt đối.........................................................................................49
3.3.5.4. Xác đònh hàm lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp
Kieldahl..............................................................................................54
3.3.6 Phương pháp sản xuất chitin – chitosan .............................56
3.3.6.1 Điều chế enzyme protease bằng nấm mốc Aspergillus
oryzae................................................................................................56

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 4
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
3.3.6.2 Kết quả tủa enzyme bằng cồn để tìm ra tỷ lệ tủa
thích hợp...........................................................................................56
3.3.6.3 Thuỷ phân vỏ tôm bằng enzyme protease kết tủa để
thu chitin – chitosan...........................................................................57
3.3.6.4 Tiến hành thuỷ phân vỏ tôm bằng enzyme để thu
nhận chitosan...................................................................................58

3.3.6.5 Kiểm tra sản phẩm chitosan thu được.............................59
3.3.6.6 Xác đònh độ deacety hoá dựa vào hàm lượng N tổng
số......................................................................................................60
3.3.6.7 Ứng dụng chitosan thu được làm giá thể cố đònh
enzyme...............................................................................................64
3.3.5. Xác đinh hàm lượng protein và chế phẩm protease ban
đầu...................................................................................................65
3.3.5.1. Xác đònh hiệu suất hoạt tính enzyme cố đònh............65
3.3.5.2 Xác đònh hàm lượng protein có trong 1g chất mang gắn
enzyme cố đònh...............................................................................65
3.3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme
trước và sau cố đònh....................................................................66
3.3.5.4 Khảo sát độ bền nhiệt lên hoạt tính enzyme trước và
sau cố đònh......................................................................................66
3.3.5.5 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố đònh
bằng phương pháp nhốt...............................................................66
Chương 4 Kết quả và thảo luận................................................68
4.1 Kết quả phần khảo sát enzyme..........................................68

4.2 Kết quả khảo sát vỏ tôm..................................................69
4.3 Động học của quá trình thuỷ phân trong vỏ tôm bằng
enzyme protease................................................................................69
4.3.1 Kết quả đo hàm lượng protein của dòch lọc sau khi thuỷ
phân.................................................................................................69
4.3.1.1 Ở nồng độ 5%..................................................................69
4.3.1.2 Ở nồng độ 7%..................................................................71
4.3.1.3 Ở nồng độ 9%..................................................................72
4.4 Kết quả đo hàm lượng protein tổng số của mẫu ...........74
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 5
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
4.4.1 Ở nồng độ enyzme 5%........................................................74
4.4.2 Ở nồng độ enzyme 7%........................................................75
4.4.3 Ở nồng độ enzyme 9%........................................................77
4.5 Kết quả của sản phẩm chitosan.........................................78
4.5.1 Hiệu suất thu hồi sản phẩm............................................78
4.5.2 Đònh tính...................................................................................78
4.5.3 Các tính chất lý hoá của sản phẩm chitosan...............78
4.6 Kết quả của quá trình cố đònh enzyme bằng chất mang
chitosan..............................................................................................80
4.6.1 Hiệu suất cố đònh..............................................................80
4.6.2 nh hưởng của pH đến enzyme protease trước và sau
cố đònh............................................................................................80
4.6.3 nh hưởng của nhiệt độ đến enzyme protease trước và
sau cố đònh......................................................................................82
4.6.4 nh hưởng của độ bền nhiệt đến enzyme protease
trước và sau cố đònh....................................................................84

4.7 Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố đònh.......87
Chương 5 Kết luận và đề nghò...................................................90
5.1 Kết luận....................................................................................90
5.2 Đề nghò......................................................................................90
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................91

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Biểu diễn thành phần hoá học trong đầu tôm....8
Bảng 3.1 Xây dựng đường chuẩn albumin.................................33
Bảng 3.2 Lập đồ thò chuẩn nồng độ protein..........................44
Bảng 3.3 Tỷ lệ tủa cồn đối với dòch chiết enzyme.............38
Bảng 3.4 Hàm lượng N toàn phần trong mẫu chitin theo lý
thuyết (a).........................................................................................60
Bảng 3.5 Hàm lượng N toàn phần trong mẫu chitin theo lý
thuyết (b).........................................................................................61
Bảng 4.1 kết quả hàm lượng và hoạt tính của dòch chiết
enzyme...............................................................................................68
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 6
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Bảng 4.2 Kết quả hàm lượng và hoạt tính enzyme khi tủa
cồn...................................................................................................68
Bảng 4.3 kết quả hàm lượng và hoạt tính của chế phẩm
enzyme...............................................................................................69
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra nguyên liệu ban đầu..................69
Bảng 4.5 Kết quả hàm lượng protein còn lại sau thủy phân
5%......................................................................................................69
Bảng 4.6 Kết quả hàm lượng protein còn lại sau thuỷ phân

7%......................................................................................................71
Bảng 4.7 Kết quả hàm lượng protein còn lại sau thủy phân
9%......................................................................................................73
Bảng 4.8 Kết quả hàm lượng protein tổng số sau thuỷ phân
5%......................................................................................................74
Bảng 4.9 Kết quả hàm lượng protein tổng số sau thủy phân
7%......................................................................................................76
Bảng 4.10 Kết quả hàm lượng protein tổng số sau thủy
phân 9%...........................................................................................77
Bảng 4.11 Kết quả kiểm tra sản phẩm chitosan thu được.....78
Bảng 4,12 Kết quả hàm lượng và hoạt tính enzyme trước và
sau cố đònh......................................................................................80
Bảng 4.13 Kết quả ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme trước
và sau cố đònh...............................................................................81
Bảng 4.14 Kết quả ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính
enzyme trước và sau cố đònh......................................................82
Bảng 4.15 Kết quả ảnh hưởng độ bền nhiệt lên HT enzyme
trước và sau cố đònh....................................................................84
Bảng 4.16 Kết quả khảo sát số lần tái sử dụng của
enzyme cố đònh...............................................................................87

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 7
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

DANH SÁCH CÁC HÌNH

trang

Hình 2.1 Cấu tạo của chitin...........................................................5
Hình 2.2 Cấu tạo của chitosan......................................................6
Hình 2.3 Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi.................................23
Hình 3.1 Một số dụng cụ thực hiện thí nghiệm........................41
Hình 4.1 Đồ thò biểu diễn hàm lượng protein còn lại dòch lọc
sau thuỷ phân 5%..........................................................................70
Hình 4.2 Đồ thò biểu diễn hàm lượng protein còn lại dòch lọc
sau thuỷ phân 7%..........................................................................71
Hình 4.3 Đồ thò biểu diễn hàm lượng protein còn lại dòch lọc
sau thủy phân 9%..........................................................................73
Hình 4.4 Đồ thò biểu diễn hàm lượng protein tổng số vỏ tôm
sau thuỷ phân 5%..........................................................................75
Hình 4.5 Đổ thò biểu diễn hàm lượng protein tổng số vỏ tôm
sau thủy phân 7%..........................................................................76
Hìng 4.6 Đồ thò biểu diễn hàm lượng protein tổng số vỏ tôm
sau thủy phân 9%..........................................................................77
Hình 4.7 Chitosan được thuỷ phân từ enyzme protease..............79
Hình 4.8 Enzyme protease được cố đònh trong gel chitosan..........80
Hình 4.9 nh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme protease
trước và sau cố đònh....................................................................81
Hình 4.10 Đường biểu diễn hoạt tính enzyme trước và sau cố
đònh theo nhiệt độ.........................................................................83
Hình 411 Hình biểu diễn hoạt tính enzyme trước và sau cố đònh
theo độ bền nhiệt.........................................................................85
Hình 4.12 Đường so sánh phần trăm hoạt tính enzyme trước
và sau cố đònh...............................................................................86
Hình 4.13 Đướng biểu diễn hoạt tính enzyme protease theo số
lần tái sử dụng.............................................................................88
Hình 4.14 Đồ thò biểu diễn phần trăm hoạt tính enzyme theo
số lần tái sử dụng......................................................................88

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 8
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Chitin là một polysaccharide đứng thứ hai về lượng trong
tự nhiên chỉ sau cellulose. Chitin và các sản phẩm của
chúng hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lónh vực
như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý
môi trường. Ngoài ra khi ta khử acetylene trong hợp chất chitin
sẽ tạo thành chitosan là đơn vò cao phân tử của glucosamine,
là một chất có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp nhẹ, thực phẩm, nông nghiệp. Việc nghiên cứu và
tách chiết chitin từ vỏ giáp xác đã được thực hiện hơn một
thế kỷ nay.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của
ngành thuỷ sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo
báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lượng tôm năm 2003 là
193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản
phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70%
khối lượng nguyên liệu. Tương ứng với sản lượng tôm hàng
năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ
tôm được tạo ra. Hiện nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu
và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn. Tình trạng
trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công

nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu
quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 9
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có
giá trò cao, chitin – chitosan.
Tuy nhiên, quy trình sản xuất chitin được sử dụng phổ
biến hiện nay là theo phương pháp hoá học, protein trong đầu
và vỏ tôm được loại bỏ bằng cách xử lý với NaOH. Như
vậy, vừa tốn một lượng hoá chất vừa có hại cho môi
trường, hơn nữa con đường xử lý hoá học làm giảm chất
lượng sản phẩm chitosan vì phản ứng với NaOH làm giảm đi
độ nhớt của chitosan.
Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là sử
dụng chế phẩm enzyme thuỷ phân protein trong vỏ tôm để
sản xuất ra sản phẩm chitin có chất lượng cao và vừa giải
quyết được vấn đề môi trường. Nhiều loại enzyme protease
đã được trích ly từ tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi như:
protease từ nội tạng tôm cá, bromelaine từ dứa, papain từ đu
đủ, protease từ vi sinh vật ..vv.
Việc sử dụng enzyme vào sản xuất công nghiệp không
những đem lại hiệu quả cao mà còn có thể làm giảm chi
phí sản xuất bằng cách tái sử dụng lại enzyme. Để có thể
tái sử dụng được enzyme ta có thể tiến hành cố đònh
enzyme vào một chất mang bằng phương pháp nhốt và
chitosan là một chất được xem là có nhiều triển vọng trong
việc cố đònh enzyme và tế bào. Vớùi mong muốn góp phần

giải quyết những yêu cầu trên, chúng tôi đã thực hiện
đề tài “sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm”
1.2. Mục đích khoá luận
Sản xuất chitin – chitosan bằng cách sử dụng enzyme
protease thu được từ nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 10
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
bằng các nguyên liệu rẻ tiền, đồng thời nghiên cứu ứng
dụng chitosan thu được làm giá thể cố đònh enzyme
1.3. Nội dung
Thu nhận enzyme protease từ Aspergillus oryzae.
Khảo sát quá trình kết tủa của enzyme protease.
Sử dụng enzyme protease trong sản xuất chitin – chitosan
từ vỏ tôm. Khảo sát quá trình thuỷ phân.
ng dụng chitosan làm giá thể cố đònh enzyme protease.

CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitosan trong
tự nhiên
Chitin – chitosan là một polysaccharide tồn tại trong tự
nhiên với sản lượng rất lớn đứng thứ hai sau cellulose. Trong
tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và thực vật.
Chitin – chitosan là polysaccharide có đạm không độc, có
khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các
monosaccharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi

các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ
chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và
hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trò (coralente)
với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác.
Về mặt lòch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu
tiên vào 1821, trong cặn dòch chiết từ một loại nấm. Ông
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 11
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc
của nó. Năm 1823 Odier phân lập một chất từ bọ cách
cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghóa
là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của
nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến
kết luận chitin có dạng công thức giống như cellulose.
2.1.1 Cấu trúc hoá học của chitin
Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn.
Bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. người ta có thể chứng
minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ- chitin.
Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau
về hướng của mỗi mắt xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong
mạch.
Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên
chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH 3, thì các
cấu trúc α, β, γ - chitin được mô tả như sau:

α – chitin

β- chitin

γ – chitin

α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược
chiều nhau đều đặn, nên ngoài liên kết hydro trong một lớp
và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp do
các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các
mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt
không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ biến
trong tự nhiên.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 12
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
β,γ- chitin da mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song
(β- chitin ) và hai song song một ngược chiều (γ- chitin ), giữa
các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β- chitin cũng có
thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hoá cho
cấu trúc tinh thể bền vững hơn.
Qua nhiều nghiên cứu về sự thuỷ phân chitin bằng
enzyme hay acid HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin có
cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vò Nacetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β- (1-4)
glucozit.
Công thức phân tử: [C8H13O5N]n
Phân tử lượng: Mchitin = (230.09)n

Hình 1 Công thức cấu tạo của chitin

Tên gọi: poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose
Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 13
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
2.1.2 Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc –
NHCOCH3 ở vò trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa
các mạch và trong mạch với nhau
Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm
nhưng kém bền trong môi trường acid
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid
loãng, trong kiềm loãng, các thuốc thử Schweitzer và các
dung môi hữu cơ như rượu, este,. .. nhưng nó hoà tan trong một
số dung dòch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitrit, formic,
acid khan). Đặc biệt nó còn hoà tan trong dung dòch đặc
nóng của muối thioxianat liti (LiSCN) và muối thixianat canxi
[Ca(SCN)2] tạo thành dung dòch keo
Chitin ổn đònh với các chất oxy hoá khử như KMnO 4,
H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2, ... lợi dụng tính chất này để khử màu
chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bò
khử bởi gốc acetyl tạo thành chitosan
2.1.3 Cấu trúc hoá học của chitosan
Trong các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong
những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và
có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần

dung môi, hoá chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được
bằng phản ứng deacetyl hoá chitin, biến đổi nhóm N-acetyl
thành nhóm amin ở vò trí C2.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 14
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên
người ta qui ước nếu độ deacetyl hoá (degree of deacetylation)
DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% gọi là chitin
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vò 2-amino-2deoxy-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4)
glucozit.
Công thức phân tử chitosan [C6H11O4N]n
Phân tử lượng: Mchitosan = (161.07)n

Hình 2 Công thức cấu tạo của chitosan
Tên gọi khoa học: poly(1-4)-amino-2-deoxy-β-D-glucose
Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose.
Qua cấu trúc của chitin – chitosan ta thấy chitin chỉ có
một nhóm chức hoạt động là –OH ( H ở nhóm hydroxyl bậc
1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh)
còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH, -NH 2, do đó
chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hoá học hơn chitin. Trong
thực tế chitin – chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản
phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức
tạp.
2.1.4 Tính chất của chitosan
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 15

SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Trọng lượng phân tử chitosan tuỳ thuộc vào điều kiện
sản xuất, thường nằm trong khoảng 10.000 – 1.000.000 Da với
mức độ deacetyl hoá thường là 70 – 90%
Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không
vò, không tan trong nước, kiềm, aicd đậm đặc nhưng tan trong
acid loăng, tan tốt trong dung dòch acid acetic loãng (0.5 – 1.5%)
tạo thành dung dòch keo, trong suốt. Lợi dụng tính chất này
của chitosan để thực hiện cố đònh enzyme bằng phương pháp
nhốt
Chitosan là một polyamine, nó được xem như là một
polymer cationic có khả năng cho các ion kim loại nặng bám
dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức chất với kim
loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung
dòch
Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là
trên các khuẩn gây bệnh như E.coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm
Candida albicans
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 – 311 0C
Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt,
khả năng hấp phụ tốt, có tính chất cơ lý bền vững, ổn
đònh, thường được dùng cố đònh enzyme qua cầu nối
glutaradehyde.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành
muối khó tan, tác dụng với iod và acid sulfuric thành phản
ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích đònh tính chitosan

Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được
xem là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá để cho ra các
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 16
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lónh vực thực
phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường
2.1.5 Nguồn thu nhận chitin
Chitin có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên trong đông vật,
thực vật và cả vi sinh vật
Trong động vật chitin là một thành phần quan trọng của
các vỏ một số động vật không xương sống như: cồn trùng,
nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động vật bậc cao
monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da
nó giúp cho sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da.
Trong

thực

vật

chitin

có

ở

thành

tế

bào

nấm

họ

zygenmyctes, và các sinh khối nấm mốc, một số loài
tảo .. .
Tuy nhiên trên thực tế vỏ tôm cua lại chiếm thành
phần chitin khá cao(14-35%). Với giá thành rẽ nên hầu hết
các cơ sở sản xuất chitin – chitosan đều từ vỏ tôm. Vì lý do
giảm thiểu ô nhiễm môi trường (sản xuất chitin – chitosan
chủ yếu bằng phương pháp hoá học). Nâng cao chất lượng
sản phẩm, tận thu các phế phẩm có giá trò (vỏ tôm từ
nhà máy).. vv góp phần giải quyết ô nhiễm mà còn đem
lại hiệu quả kinh tế cao.
Bảng 2.1: bảng biểu diễn thành phần hoá học
trong đầu tôm
Thành

m

Đạm

Protein

phần

độ

toàn

thô

73.22

phần
1.86

11.64

Hàm

Lipide

Calci

Phosphor

2.01

2.19

0.37

lượng
2.2 Phương pháp sản xuất chitin – chitosan

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 17
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Hiện nay sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương
pháp hoá học và phải qua các quá trình sau:
a) Quá trình khử khoáng
Trong vỏ tôm thành phần chủ yếu là muối CaCO 3,
MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2. nên người ta thường dùng các loại
acid như HCL, H2SO4 .. để khử khoáng. Khi khử khoáng, nếu
dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H 2SO4 sẽ tạo
muối khó tan nên ít sử dụng. Phản ứng của HCl để khử
khoáng như sau:
MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O.
CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O
Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4
Trong quá trình rửa thì muối Cl- tạo thành được rửa trôi,
nồng độ acid HCl có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của
chitosan thành phẩm, đồng thời có ảnh hưởng lớn đến
thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nến nồng độ HCl cao
sẽ rút ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt
mạch do có hiện tượng thuỷ phân các liên kết β- (1-4)
glucozit để tạo ra các polymer có trọng lượng phân tử trung
bình thấp, có khi bò thuỷ phân triệt để đến glucosamin.
Ngược lại nếu nồng độ HCl quá thấp thì quá trình khử
khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, công đoạn
này có tác dụng rửa trôi hết các muối, acid dư tan trong

nước. Quá trình rửa kết thúc khi dòch rửa cho pH = 7.
b) Quá trình loại protein

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 18
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng. Ta tiến hành loại bỏ
hoàn toàn protein bằng dung dòch NaOH 3%, protein bò kiềm
thuỷ phân thành các amin tự do tan và được loại ra theo quy
trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ
vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 -12 là được để đảm bảo việc
loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 -95 0C trong
3.5- 4 giờ (trong quá trình nung lưu ý vấn đề trào dung môi
do tạo bột nhiều và mùi bay ra khó chòu) sản phẩm sau khi
nung được rửa sạch bằng nước thường hoặc nước cất đến
pH = 7.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục
đích rửa trôi hết các, muối natri, các amin tự do và NaOH dư.
Sấy khô ở 600C thu được chitin thô.
c) Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin)
chitin thô có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin.
Do chitin ổn đònh với các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO 4)
oxy già (H2O2) nước javen (NaOCl + NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3 .. ..
lợi dụng tính chất này ta sử dụng KMnO 4 và H2O2 để khử
màu cho chitin.
d) Điều chế chitosan
quá trình điều chế chitin thành chitosan thực chất là
quá trình deacety hoá chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH 3

thành nhóm NH2 và loại bỏ nhóm –CH 3CO, chuyển hoá
thành muối natri (CH3COONa. Để thực hiện được quá trình
deacetyl hoá hoàn toàn, người ta sử dụng NaOH đậm đặc
50% thời gian 4 giờ nhiệt độ ở 110 – 120C . ở đây dựa vào
tính chất chitosan tan được trong dung dòch acid loãng tạo thành
dung dòch keo trong suốt, trong khi chitin không tan do đó ta có
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 19
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
thể sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hoá chitin thành chitosan
bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH 3COOH 1%. Nếu
sản phẩm tan tạo thành dung dòch keo trong suốt là được. Sau
đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu
trắng sáng. Quá trình điều chế chitosan tử chitin cho hiệu
suất tương đối cao (60 -75%)
2.3 Ứng dụng của chitin – chitosan
a) Trong công nghiệp thực phẩm
Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo
quản thực phẩm tươi sống.
Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo.
Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện
nước ép từ trái cây như nước táo, cà rốt, chất này làm
thay thế các chất cũ như silicasol, gelatin, ...
b) Trong mỹ phẩm
Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt,
thuốc làm mềm da, làm tăng khả năng hoà hợp sinh học
giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc đònh hình tóc, kem bôi
da lột mặt, ...

c) Trong y tế
Chitosan dùng làm chất phụ gia rất tốt cho kỹ nghệ
bào chế dược phẩm (keo kết dính viên, tá dược độn, chất
tạo nang mềm, ...)
Chitosan là chất mang polymer sinh học để gắn thuốc
bằng liên kết cơ học hay hoá học nhằm tạo ra thuốc polymer
có nhiều tác dụng mới. Chitosan được coi là một hệ thống
vận tải thuốc khá lý tưởng.

GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 20
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng
làm thuốc chữa bệnh: thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc
chữa trò các vết thương, vết bỏng. Thuốc chữa đau dạ dày,
thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn
dòch cơ thể và khả năng chống nhiễm HIV, ...
d) Ngành y
Chitosan là vật liệu cho y khoa rất tốt như: da nhân tạo,
mô ghép, chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu, kem chữa bỏng,
thuốc chữa lành nướu sau khi nhổ răng, ..
e) Trong nông nghiệp
Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong
thuốc phòng trừ nấm (đạo ôn, khô vằn, ..), dùng làm
thuốc kích thích sinh trưởng cho cây lúa, cây công nghiệp,
cây cảnh, cây ăn quả, ..
f) Trong công nghệ hoá học
Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp,

có khả năng tạo phưc với các kim loại nặng độc hại, dùng
để lọc nước sạch tiêu dùng
g) Trong công nghệ sinh học
Chitosan được dùng làm chất nang để cố đònh enzyme
và các tế bào
2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong
thực tế của chitin và chitosan ở việt nam và thế giới
Trước đây người ta đã thử tách chiết chitin từ thực vật
biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu
cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có nguồn gốc từ
vỏ tôm cua. Trong một thời gian các chất phế thải này
không được thu hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 21
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến
hành xác đònh giá trò của chitin và protein trong vỏ tôm, cua
đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng
trong công nghiệp. Phần protein thu được sẽ dùng để chế
biến thức ăn gia súc, còn lại chitin sẽ được dùng làm như
một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều
ứng dụng trong lónh vực công nghiệp
Việc nghiên cứu chitin – chitosan và các ứng dụng của
chúng trong sản xuất phục phụ đời sống là một hướng
nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm
1978 đến 1980 trường Đại học thủy sản nha trang đã công
bố quy trình sản xuất chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh
Phụng, như chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần

đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh
đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật
mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thò trường của
chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay
vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin –
chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng
dụng của chúng trong các lónh vực sản xuất công nghiệp.
Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang
nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan như: Trường Đại Học
Nông Lâm – TPHCM. Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện
Khoa Học Việt Nam, Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt
Nam tại TPHCM, Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 2.
miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với xí
nghiệp thuỷ sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 22
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
trong lónh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu
được một số kết quả đáng kích lệ.
miền Nam Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ
sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại Học Y Dược
TPHCM, phân Viện Khoa Học Việt Nam. Viện Khoa Học nông
nghiệp miền nam, .. . đang nghiên cứu sản xuất và ứng
dụng chitin – chitosan trong lónh vực nông nghiệp, y dược và
mỹ phẩm.
Trong nông nghiệp chitosan được sử dụng để bảo vệ
các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của
nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố đònh

phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cương khả năng nảy mầm
của hạt
Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các
nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh hoá của mạ
lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy
chitosan vi lượng làm tăng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng
thời hàm lượng các enzyme amylase, catalase hay peroxidaza
cũng tăng lên.
Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ
sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng.
Những ứng dụng của chitin – chitosan và những dẫn
xuất của chúng ngày càng phát triển. Một số đã được
ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo, thấu kính
chiết xuất, và một số ứng dụng khác đang được nghiên
cứu như : tác động kích thích miễn dòch, chống sự phát triển
của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu, trò bỏng
nhiệt .. ..
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 23
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một
tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần đến
khi khỏi. Da nhân tạo bò phân huỷ sinh học từ từ cho đến
lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau,
giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng.
Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Dược Hà Nội, Trung
tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia cũng đã chế
tạo thành công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng

dụng hiệu quả.
Chitin – chitossan và các oligo của nó có đặc tính miễn
dòch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn
dòch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh.
Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligo, Nacetyl-glucosamin và glucosamin, các chất này có một số
tính chất của các polymer tương ứng nhưng lại có ưu thế là
tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ.
Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng
chitosan làm chất mang để cố đònh enzyme và tế bào.
Enzyme cố đònh đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi
enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích.
Enzyme cố đònh được sử dụng lâu dài, không cầc thay đổi
chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm sạch nước, làm
trong nươc hoa quả, sử dụng enzyme cố đònh rất thuận lợi và
đạt hiệu quả cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với chất
mang có phân tử lượng lớn, bền vững không tan và ổn
đònh với các yếu tô hoá học.
Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được
nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sẩn xuất giấy cũng
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 24
SVTH: Đặng Tiến Đông


Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu người ta thấy
nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bò
ướt hay tăng độ nét khi in.
Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó
có tác dụng làm tơ sợi bền, mòn, bóng đẹp, cố đònh hình in,
chòu được acid hay kiềm nhẹ.

Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da
do tính chất của chitosan là có thể cố đònh dễ dàng trên
biểu bì của da nhờ các nhóm –NH 4+ . các nhóm này liên
kết với các tế bào sừng hoá của da, nhà vậy các nhà
khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem
dưỡng da chống nắng.
Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu
protein và nhờ khả năng dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg ..
. do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn nước thải
công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm.
Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong
quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm.
Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo
thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc,
chống mất nước.
Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên
các mặt sau:
Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin – chitosan sẽ lấy đi từ
các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu 2+. Như
vậy vi sinh vật sẽ bò chết do sự mất cân bằng liên quan
đến các ion thiết yếu.
Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương 25
SVTH: Đặng Tiến Đông