NGHIÊN cứu THU NHẬN ENZYME XYLANASE từ CHỦNG nấm ASPERGILLUS NIGER TRÊN môi TRƯỜNG lá mía cám gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM


---------------------------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME XYLANASE
TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS NIGER
TRÊN MÔI TRƯỜNG LÁ MÍA - CÁM GẠO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD

: Th.S HUỲNH QUANG PHƯỚC

SVTH

: VÕ LÊ PHƯƠNG THẢO

MSSV

: 09B1100176

Niên khoá

: 2009 – 2011

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 5/2011


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn ThS.
Huỳnh Quang Phước đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Minh, thầy Thái và tập thể cán bộ Phòng
thí nghiệm Hoá lý Khoa Công nghệ thực phẩm đã tận tình h ư ớ n g dẫn thí
nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn và tạo mọi điều kiện
về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Và cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo,
cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn
thành khoá học.
Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có được kết
quả như ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !
TP.HCM, tháng 05 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Võ Lê Phương Thảo


MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH
Chương 1 - MỞ ĐẦU

.............................................................1

Chương 2 - TỔNG QUAN

.......................................................3

2.1. Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger ........................................................3
2.1.1. Vị trí phân loại của Aspergillus niger ............................................................4
2.1.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus niger ......................................................4
2.1.3.Đặc điểm sinh hóa ...........................................................................................5
2.1.3.1.Khả năng lên men đường ............................................................................. 5
2.1.3.2.Khả năng tổng hợp enzyme .......................................................................... 5
2.1.3.3.Lên men rượu ............................................................................................... 6
2.1.4.Tác hại của Aspergillus niger ........................................................................ 6
2.1.5. Các ứng dụng của Aspergillus niger .............................................................. 7
2.2. Xylanase ..........................................................................................................7
2.2.1. Các đặc tính cấu trúc của xylan ................................................................................................... 7
2.2.2. Khái niệm và phân loại xylanase ........................................................................................10
2.2.2.1. Khái niệm về xylanase ........................................................................................................10
2.2.2.2. Phân loại xylanase ....................................................................................................... 10
2.2.2. Khái niệm và phân loại xylanase ........................................................................................10
2.2.2.1. Khái niệm về xylanase ........................................................................................................10
2.2.2.2. Phân loại xylanase ....................................................................................................... 11
2.2.3.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc .................................................................................14


2.2.4. Cơ chế hoạt động của xylanase ...................................................................................... 17

2.2.5. Ứng dụng của Xylanase ......................................................................................................19
2.2.5.1. Ứng dụng trong sản xuất thức ăn gia súc .................................................19
2.2.5.2. Ứng dụng trong sản xuất bánh mì, thực phẩm và ăn uống........................20
2.2.5.3. Ứng dụng trong công nghiệp dệt .............................................................. 20
2.2.5.4. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất bột cellulose và giấy ....................20
2.2.5.5. Ủ xilo thức ăn gia súc ...............................................................................20
2.2.6. Phương pháp bảo quản enzyme xylanase ....................................................21

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ CÁC PP NGHIÊN CỨU .................. 25
3.1. Vật liệu ............................................................................................................25
3.1.1. Lá mía, cám gạo .......................................................................................... 25
3.1.2. Nấm mốc ......................................................................................................25
3.1.3. Thiết bị ........................................................................................................25
3.1.4. Môi trường nuôi cấy nấm mốc .....................................................................26
3.2. Phương pháp nghiên cứu

.............................................................................27

3.2.1 Quy trình thu nhận enzym xylanase ..............................................................27
3.2.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu ..............................................................27
3.2.3. Khảo sát một số chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu .........................................28
3.2.3.1. Xác định hàm lượng N tổng số .................................................................28
3.2.3.2. Xác định độ ẩm ......................................................................................... 29
3.2.3.3. Xác định hàm lượng cellulose ..................................................................29
3.2.3.4. Xác định hàm lượng C tổng số ...............................................................................29
3.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 30
3.3.1. Khảo sát nguyên liệu ....................................................................................30
3.3.2. Khảo sát hoạt độ của enzym xylanase .........................................................30
3.3.2.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía (LM) và cám gạo (CG) ...............31
3.3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến quá trình nuôi cấy ...............................................31

3.3.2.3. Ảnh hưởng của độ ẩm trong quá trình nuôi cấy .......................................31
3.3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình nuôi cấy ......................................31
3.4. Phương pháp nuôi cấy .....................................................................................31
3.4.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc ..................................................................31
3.4.2. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger để thu nhận dịch chiết
enzyme xylanase ....................................................................................................32
3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ..........................................................32
3.5.1. Nguyên tắc ...................................................................................................32
3.5.2. Xây dựng đường xylose chuẩn ....................................................................32
3.5.3. Tiến hành phản ứng ......................................................................................33
3.5.4. Tính toán kết quả ..........................................................................................33
3.5.5. Xác định tính khác biệt của kết quả thu được ..............................................34

Chương 4 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .........................................35
4.1 Khảo sát nguyên liệu ........................................................................................35
4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía và cám gạo đến khả năng sinh tổng
hợp enzyme xylanase của Aspergillus niger ..........................................................35
4.3 Ảnh hưởng của PH đến quá trình nuôi cấy ......................................................37
4.4. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp xylanase của
Aspergillus niger ....................................................................................................39
4.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp xylanase của
Aspergillus niger ....................................................................................................40

Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................... 43
5.1. Kết luận ...........................................................................................................43
5.2. Kiến nghị .........................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................44
PHỤ LỤC ..............................................................................................................48

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Phân loại khoa học của Aspergillus niger ..............................................4
Bảng 2.2. Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase .................................................................. 13
Bảng 2.3. Đặc tính của của một số xylanase từ vi sinh vật .................................................. 15
Bảng 2.4. Các điều kiện bảo quản enzyme ............................................................22
Bảng 2.5. Thành phần của sản phẩm Biogalatosidase ..........................................23
Bảng 3.1. Tỷ lệ pha loãng của dung dịch xylose chuẩn ........................................32
Bảng 3.2. Xây dựng đường chuẩn xylose ..............................................................33
Bảng 4.1. Kết quả phân tích một số thành phần hóa học của thành phần môi
trường nuôi cấy ......................................................................................................35
Bảng 4.2. Kết quả xử lý thể hiện sự khác biệt giữa các tỉ lệ môi trường khảo ....36
Bảng 4.3. Trắc nghiệm LSD hoạt độ xylanase bị ảnh hưởng bởi môi trường nuôi
cấy .......................................................................................................36
Bảng 4.4. Kết quả xử lý thể hiện sự khác biệt giữa các khoảng pH khảo sát .....37
Bảng 4.5. Trắc nghiệm LSD hoạt độ xylanase bị ảnh hưởng bởi pH môi trường .38
Bảng 4.6. Kết quả xử lý thể hiện sự khác biệt giữa các độ ẩm khảo sát ..............39
Bảng 4.7. Trắc nghiệm LSD hoạt độ enzyme bị ảnh hưởng bởi độ ẩm ................ 40
Bảng 4.8. Kết quả xử lý thể hiện sự khác biệt giữa các khoảng thời gian khảo
sát ...........................................................................................................................41
Bảng 4.9: Trắc nghiệm LSD hoạt độ xylanase bị ảnh hưởng bởi thời gian ..........41
Bảng B1 . Đo OD dung dich chuẩn xylose ...........................................................51


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Nấm mốc Aspergillus niger trong môi trường PGA ..............................3
Hình 2.2. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae ...............................................................8
Hình 2.3. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật................................................................................ 8
Hình 2.4. O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng ........................... 10

Hình 2.5. Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm............................ 10
Hình 2.6 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans ...... 18
Hình 3.1. Quy trình thu nhận enzym xylanase ......................................................27
Hình 3.2. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................28
Hình 4.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía và cám gạo đến đến hoạt độ
enzyme xylanase .................................................................................36
Hình 4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ môi trường lá mía và cám gạo đến hoạt độ enzyme
xylanase .................................................................................................38
Hình 4.3 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường (%) đến hoạt độ enzyme xylanase ......39
Hình 4.4: Ảnh hưởng độ ẩm thời gian (giờ) đến khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanase ................................................................................................. 41
Hình A1. Sơ đồ phương pháp định lượng .............................................................50
Hình B1. Đồ thị đường chuẩn xylose ....................................................................51


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Chương 1.

MỞ ĐẦU
Nhiều vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm sợi được báo cáo có
khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase, trong đó nấm mốc có tiềm năng nhất.
Xylanase được sinh ra chủ yếu bởi giống Aspergillus trong môi trường lên men
chìm và trên môi trường lên men bán rắn với các nguồn cơ chất là xylan tinh khiết,
lá mía, cám gạo,... Trước đây, xylanase được sử dụng phối hợp với cellulase để
chuyển hóa lignocellulose thành năng lượng các chất trao đổi. Các ứng dụng khác
của enzym xylanase cũng được quan tâm như: làm trong nước trái cây và rượu
vang, tách chiết dầu thực vật, sản xuất oligosaccharide nhằm cải thiện giá trị dinh
dưỡng của thức ăn gia súc. Trong những năm gần đây, enzyme xylanase rất được

quan tâm ứng dụng trong công nghiệp giấy và bột giấy, công nghệ thực phẩm,
công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi….từ phế thải nông nghiệp. Ở nước ta, nhu
cầu sử dụng các chế phẩm enzyme ngày càng nhiều, trong đó có enzyme xylanase.
Nhưng việc nghiên cứu sản xuất enzyme này chưa được quan tâm nhiều.
Ở Việt Nam, nguồn lá mía rất dồi dào, có chứa cellulose nên được sử dụng
làm nguồn carbon hoặc sử dụng kết hợp với cám gạo (là nguồn cung cấp Nitơ- các
khoáng chất và vitamin) để cảm ứng Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme
xylanase trong lên men bán rắn. Ngoài ra, ở nước ta hầu hết lá mía sau khi thu
hoạch không sử dụng cho nhu cầu nào mà đem đốt bỏ đi và đây cũng là nguồn
nguyên liệu rẻ tiền và ổn định dễ dàng đáp ứng cho sản xuất enzyme xylanase ở
quy mô lớn.
Dựa trên những đặc tính trên nên đã hướng chúng tôi đến việc thực hiện đề
tài : ‘‘ Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên
môi trường lá mía - cám gạo’’ nhằm mục đích tận dụng lá mía kết hợp với cám gạo
làm môi trường nuôi cấy để thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy đó.
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 1


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Yêu cầu của đề tài:
 Khảo sát một số thành phần hóa học có trong lá mía và cám gạo.
 Khảo sát các tỷ lệ giữa lá mía và cám gạo khi tạo môi trường nuôi cấy.
 Khảo sát điều kiện nuôi cấy (pH, độ ẩm và thời gian nuôi cấy).
 Thu nhận dịch chiết enzyme xylanase.

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 2


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Chương 2.

TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về nấm mốc Aspergillus niger
Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên,
trong đó có các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,… có
giá trị sử dụng trong sản xuất enzyme, rượu, acid hữu cơ,…
Aspergillus niger là một loại nấm và là một trong những loài phổ biến nhất
của các chi Aspergillus. Nó gây ra mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như
nho, hành tây và đậu phộng; một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm. Nó có
thể được tìm thấy trong đất và các môi trường trong nhà. [28]
Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc
Aspergillus niger từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cốc,
bắp (ngô); Aspergillus niger cũng được phân lập từ các sản phẩm lên men cổ
truyền. [2]

Hình 2.1. Nấm mốc Aspergillus niger trong môi trường PGA [29]

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 3

Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

2.1.1. Vị trí phân loại của Aspergillus niger
Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901
Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này. Raper và
Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử
trần. Như vậy, Aspergillus niger có vị trí phân loại theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Phân loại khoa học của Aspergillus niger [30]
Giới

Fungi

Lớp

Eurotiomycetes

Bộ

Eurotiales

Họ

Trichocomaceae

Chi

Aspergillus

Loài

Aspergillus niger

Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào
tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu 5 – 6 x 20
– 30 µm, đôi khi 6 – 10 x 60 – 70 µm, màu nâu đen.
Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai
hình chai; bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có gai nhọn, có màu nâu đen đến
đen than, đường kính 4 – 5µm. [1], [3]
2.1.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus niger
Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6-8oC và tối đa
45-47oC, tối ưu ở 28-35oC, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm
môi trường thích hợp để lên men bán rắn Aspergillus niger là 60-65%, nó chỉ sinh
trưởng và phát triển khi có mặt O2 ở pH tối ưu là 4-6,5. Tuy nhiên, theo Patt (1981)
cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự thay đổi pH
môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6,5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 4


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

niger.
Trên môi trường thạch Czapek, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính
khuẩn lạc khoảng 40 mm. Bổ sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn
lạc Aspergillus niger mọc tốt và to hơn, đạt đường kính trung bình khoảng 60mm.
Trên môi trường thạch malt (MEA), hệ enzym mọc tốt, nhưng không to như
trên trên môi trường thạch Czapek- cao nấm men (CYA). [3]

2.1.3. Đặc điểm sinh hóa
2.1.3.1.

Khả năng lên men đường

Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường
đôi như glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose. Aspergillus niger
đồng hóa được galactose, sorbose và lactose ở mức độ kém hơn.
2.1.3.2.
-

Khả năng tổng hợp enzyme

α-amylase (1,4 glucan- glucanhydrolase): Aspergillus niger có khả năng tổng
hợp α-amylase ngoại bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít
maltose và glucose.
Tinh bột

α-amylase

Dextrin (nhiều) + maltose (ít) + glucose (ít)

α-amylase của Aspergillus niger hoạt động tối ưu ở pH từ 4,5 – 4,7, trong
khi để đường hóa tinh bột, pH thích hợp nhất là 5 – 5,5, ở 50oC. Enzym bị mất
hoạt tính sau 30 phút ở pH = 2,5.
Aspergillus niger có khả năng tạo glucoamylase nhiều hơn α-amylase (Lê
Văn Nhương, 1978) để thủy phân tinh bột thành dextrin và sau đó thành
glucose ở pH và nhiệt độ tối thích tương ứng là 4 và 50oC. Park Y.K. (1970) đã
sử dụng Aspergillus niger để sản xuất sirô glucose từ khoai mì.
-

Protease: Theo Lương Đức Phẩm, Aspergillus niger có khả năng tạo hai loại
protease. Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton, còn
protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin. PH và
nhiệt độ tối thích cho hoạt động của chúng tương ứng là 3 – 4 và 50oC.

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 5


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

-

Cellulase: Cellulase là một phức hợp nhiều enzym, chủ yếu là cellulase Cl,
cellulase Cx và β-glucosidase hay cellobiase. Cellulase có tác dụng thủy phân
cellulose thành cellobiose rồi thành glucose theo trình tự như sau:
Cellulose

cellulas

Cellobiose cellobiase

Glucose

Cellulase của Aspergillus niger có pH và nhiệt độ hoạt động tối thích tương
ứng là 4-5 và 40oC trên cơ chất là giấy lọc hoặc CMC (carboxyl methyl
cellulose).

-

Pectinase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase ở nhiệt độ tối thích
25oC và pH 5,6. Tuy nhiên enzym thể hiện hoạt tính trong khoảng pH 2,5-6,8.

-

Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo xylanase ở nhiệt độ và pH tối
thích là 25oC và 5,6.
Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme

khác như: lipase, mananase, α- galactosidase, carboxypeptidase, α- mannosidase,
β- glucanase,… [1], [2]
2.1.3.3.

Lên men rượu

Theo Menezes (1978), loài Aspergillus niger có khả năng lên men rượu
trong điều kiện kỵ khí và tác giả đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mì để
sản xuất rượu ethanol.
2.1.4. Tác hại của Aspergillus niger
Aspergillus niger được xếp vào loại an toàn thực phẩm không chứa độc tố
aflatoxin, thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ các
ngành thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi.
Tuy nhiên Aspergillus niger cũng là nguyên nhân làm hư hại trái cây tươi
sau thu hoạch như táo, lê, đào, chanh, nho, dâu, xoài, lựu,…Ngoài ra, nó còn làm
hư hại trái sake, cà chua, hạt điều và gây nhiễm pho mát. Aspergillus niger cũng
sống bám trên đồ gỗ, đồ da.
Bệnh nấm ở cây cũng do Aspergillus niger gây ra như bệnh thối rửa chồi
cây bong vải, thối rửa thân cây dứa sợi. [30]

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 6


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Aspergillus niger ít có khả năng gây bệnh cho con người so với một số loài
Aspergillus khác. Nhưng nếu hít vào số lượng bào tử lớn, có thể sẽ gây bệnh phổi
nghiêm trọng. Ngoài ra, Aspergillus niger là một trong những nguyên nhân phổ
biến nhất của bệnh otomycosis (nhiễm trùng tai do nấm), có thể gây đau, tạm thời
không nghe được và trong trường hợp nghiêm trọng dẫn đến hư ống tai và màng
nhĩ. [28]
2.1.5. Các ứng dụng của Aspergillus niger
Từ lâu đời người ta biết sử dụng Aspergillus niger để sản xuất các chế phẩm
sinh học như acid hữu cơ, các loại enzyme, các chế phẩm giàu protein,… phục vụ
phát triển công nghệ thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…
Aspergillus niger được nuôi để sản xuất trong công nghiệp. Nhiều chủng
Aspergillus niger được sử dụng trong các chế phẩm công nghiệp của acid citric
(E330) và acid gluconic (E574) và đã được đánh giá là chấp nhận được đối với
lượng hàng ngày của Tổ chức Y tế Thế giới.
Nhiều enzym hữu ích được sản xuất bằng cách sử dụng lên men công
nghiệp của Aspergillus niger. Ví dụ, Aspergillus niger enzym glucoamylase được
sử dụng trong sản sirô bắp cao fructose, và pectinaza được sử dụng trong rượu táo
và rượu vang. α-galactosidase, một loại enzyme mà phá vỡ một số loại đường phức
tạp, là một thành phần của Beano và các thuốc khác mà các nhà sản xuất khẳng
định có thể làm giảm chứng đầy hơi. [30]
2.2. Xylanase
2.2.1. Các đặc tính cấu trúc của xylan

Xylan là một polysaccharide hỗn tạp có chứa các nhóm phụ là các gốc acetyl, 4-Omethyl-D-glucuronosyl và α-arabinofuranosyl liên kết với bộ khung được tạo bởi các gốc
xylopyranose. Bộ khung này được liên kết với nhau theo kiểu β-1,4- glycozit. Lignin bao
quanh xylan, liên kết với xylan bằng liên kết este bằng các gốc của axit 4-O-methyl-Dglucuronic.

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 7


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Hình 2.2. Cấu trúc của arabinoxylan của cỏ Graminiae [32]
Xylan, một trong những thành phần cơ bản của hemicellulose được tìm thấy trong
thành tế bào thực vật là polysaccharide cơ bản thứ hai sau cellulose, chiếm gần một phần ba
carbon hữu cơ có thể phục hồi trên trái đất . Xylan là thành phần chính của hemicelulose, một
phức hợp polysaccharide gồm: xylan, xylanglucan, glucomannan, galactoglucomannan và
arabinogalactan. Phức hợp này cùng với cellulose và lignin hình thành nên thành phần
polymer của vách tế bào thực vật. Xylan được tìm thấy lượng lớn trong gỗ cứng từ thực vật
hạt kín (15-30%), trong gỗ mềm từ thực vật hạt trần (7- 10%) và trong cây hàng năm (30%).
[15]

Hình 2.3. Sơ đồ cấu trúc vách tế bào thực vật [33]
Ba thành phần chính trong cấu trúc vách tế bào thực vật, tương tác với nhau nhờ các
liên kết cộng hóa trị và không cộng hóa trị. Xylan là ranh giới giữa ligin và cellulose, đây là vị
trí quan trọng cho sự kết dính chất xơ và tính toàn vẹn của vách tế bào thực vật.
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 8

Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch
kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính.
Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực
vật. Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, Dmannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong
liên kết glycoside. Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit Dgalacturonic và axit glucuronic. Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, Dglucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác
với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các
dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng
một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó.
Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào
mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan. Các
polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến
trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác
nhau như gỗ, rơm rạ,…
Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào
thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-Dxylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử
xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay thế chủ yếu trên
khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm
này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose
và các polymer khác.
Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác
nhau. Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng
(Hình 2.4), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm (Hình 2.5), hay
thành phần cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-Omethyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. [31]

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 9


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Hình 2.4. O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng [31]

Hình 2.5. Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm [31]
2.2.2. Khái niệm và phân loại xylanase
2.2.2.1. Khái niệm về xylanase
Xylanase là một hydrolase xúc tác thủy phân của các loại đường phức tạp
(chủ yếu là xylan và một số hợp chất liên quan) đến đường đơn giản (các sản phẩm
chính được xylose).
 Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase;
 Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase;
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 10


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

 Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan;
 Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4-xylanase;
xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-βD-xylanase;

1,4-β-xylan

xylanohydrolase;

β-

xylanase;

β-1,4-xylan

xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase . [34], [16]
2.2.2.2. Phân loại xylanase
Xylanase được phân loại thành hai nhóm dựa vào đặc tính lý hóa của chúng như là
khối lượng phân tử và điểm đẳng điện và trên các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng.
Endo-xylanase có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp thuộc về glycanase họ 10
(trước đây gọi là họ F), trong khi đó các endoxylanse khối lượng phân tử thấp với giá trị pI
cao được phân loại thành glycanase họ 11 (trước đây là họ G).
Biely và các cộng sự sau khi mở rộng phạm vi nghiên cứu trên sự khác biệt trong
các đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase kết luận rằng endo-xylanase của họ 10 khác với
các thành viên của họ 11 là khả năng có thể tấn công các liên kết glycozit cạnh các điểm
nhánh và hướng về đầu không khử. Trong khi, endo- xylanase của họ 10 cần hai gốc
xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh, endo- xylanase của họ 11 cần có ba gốc
xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Theo đó, các endo-xylanase của họ 10 có nhiều các
hoạt động xúc tác, cái mà tương ứng với β-xylosidase. Các endo-xylanase của họ 10 giải
phóng các xylopyranosyl ở đầu tận cùng gắn với một gốc xylopyranosyl thay thế, nhưng
chúng cũng thể hiện hoạt độ aryl-β-D-xylosidase.
Sau khi kiểm tra một nghiên cứu phân tích tác nhân rộng rãi, Sapag và các cộng sự
đã ứng dụng một phương pháp mới mà không liên quan tới phân tích trình tự trước đó cho
việc phân loại xylanase họ 11, để chia xylanase thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa
chủ yếu các enzym của nấm. Các enzym nhóm I và II thường là các enzym có khối lượng
khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzym
nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía acidt. Các enzym của

nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi
khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp
bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương.
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 11


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Nhóm B và C thì chứa các enzym chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài
thường sống trong dạ cỏ. [4], [34]
2.2.3. Nguồn thu nhận xylanase
Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật. Nhiều loại vi khuẩn và nấm
được công bố là có khả năng sản xuất xylanase. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu về
xylanase có nguồn gốc từ thực vật, ví dụ, sự sinh tổng hợp endo- xylanase trong quả lê
Nhật Bản trong suốt giai đoạn chín của quả. Cleemput và các cộng sự đã tinh chế được một
loại endo-xylanase với khối lượng phân tử là 55 kDa từ bột mì của cây lúa mì châu Âu. Một
số loài động vật thân mềm dưới nước cũng có khả năng sinh tổng hợp xylanase. [17], [18]
2.2.3.1. Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn
Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều các enzym sử dụng cho các quá trình công
nghiệp. Trong đó, có xylanase vì đặc tính bền nhiệt của nó. Một số loài sinh tổng hợp
xylanase với hoạt độ cao ở pH kiềm và nhiệt độ cao là Bacillus sp, Bacillus ssp-34 có khả
năng sinh tổng hợp xylanase với hoạt độ 506 U/ml trong môi trường tối ưu. Trước đó, thì
Ratto và các cộng sự đã công bố Bacillus circulans tổng hợp lên xylanase có hoạt độ 400
U/ml. Nó hoạt động tối ưu ở pH 7 và 40% hoạt độ được duy trì ở pH 9,2. Streptomyces
cuspidosporus sinh tổng hợp được xylanase có hoạt độ 49 U/ml trong môi trường xylan.
Bacillus sp NCL 87-6-10 tổng hợp được xylanase với hoạt độ 93 U/ml trong môi trường có
cảm ứng zeolit và có hiệu quả hơn khi sử dụng Tween 80. Một chủng khác là Bacillus

circulans AB16 tổng hợp xylanase có hoạt độ 19,28 U/ml khi sinh trưởng trên môi trường
rơm gạo. Streptomyces sp qg-11-3 có khả năng sinh enzym xylanase có hoạt độ 96 U/ml. Các
sinh vật khác sinh tổng hợp xylanase được đưa ra ở bảng 2.2.

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 12


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Bảng 2.2. Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [19]
Vi sinh vật

Xylanase (U/ml)

Nấm mốc
Aspergillus awamori VTT-D-75028

12,00

Aspergillus niger KKS

138

Aspergillus niger

250

Fusarium oxysporum VTT-D-80134

3,70

Phanerochate chrysosporium

15-20

Piromyces sp.strain E 2

7,96

Thermomycer lanuginosus
Trichoderma reesei

650-780
960

Vi khuẩn
Bacillus ssp-34

506

Bacillus circulans

400

Bacillus stearothermophilus StrainT6

2,33

Bacillus sp.

120

Bacillus sp.strain NCL 87-6-10

93

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 13


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Bacillus circulans AB 16

19,28

Streptomyces sp. QG-11-3

96

Thermoactinomyces thalophilus sub group C

42

2.2.3.2. Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc

Các enzym xylanase được sinh tổng hợp từ nấm mốc thường có pH tối ưu thấp hơn
so với các xylanase có nguồn gốc từ vi khuẩn. Giá trị pH tối ưu của xylanase từ nấm mốc
thủy phân xylan thì thường dao động từ pH 3 - 8 và ổn định ở pH 5 (bảng 2.3).
Giá trị pH tối ưu của xylanase vi khuẩn nhìn chung cao hơn so với pH tối ưu của
xylanase từ nấm. Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy, để sử dụng xylanase từ nấm
mốc cần phải hạ pH xuống thấp do đó mà xylanase từ nấm mốc ít được dùng hơn so với vi
khuẩn. Tuy nhiên trong nhiều ngành công nghiệp khác, như công nghiệp sản xuất đồ uống,
công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu, thì đây lại là một ưu thế rất lớn của xylanase nấm mốc
vì môi trường cho enzym hoạt động là môi trường axit. Gomes và các cộng sự đã công bố thu
được hoạt độ xylanase là 188,1 U/ml với pH tối ưu 4,5 từ Trichoderma viride. Tương tự với
Trichoderma viride, Trichoderma reesei cũng được biết đến với khả năng sinh tổng hợp
xylanase cao với hoạt độ 960 U/ml. Giống như Trichoderma sp, Schizophillum commune
cũng là một trong những loài tổng hợp xylanase cao với hoạt độ xylanase là 1244 U/ml. Nằm
trong nhóm nấm màu trắng, một loài nấm phá hủy thành tế bào thực vật có tiềm năng là
Phanerochaete chrysosporium sản xuất xylanase có hoạt độ 15-20 U/ml trong môi trường
nuôi cấy. Aspergillus niger có hoạt độ xylanase là 76,6 U/ml sau 5,5 ngày lên men. Nấm sinh
tổng hợp xylanase có một số các hạn chế đó là khi sản xuất enzym trên môi trường lỏng ở
quy mô công nghiệp thì hoạt độ thu được thường thấp hơn thực tế. Điều này là do khi tiến
hành lên men trong môi trường lỏng các sợi nấm kết lại thành các pellet làm cản trở quả
trình tiếp xúc với chất dinh dưỡng và đặc biệt là các ứng suất xảy ra trong thiết bị lên men
làm sinh khối của nấm dễ bị phá vỡ dẫn đến việc làm giảm lượng enzym thu được. [13],
[17]

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 14


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Bảng 2.3. Đặc tính của của một số xylanase từ vi sinh vật [19]
Km
pI
Điều kiện tối ưu

Độ bền

KLPT
(KDa)
Vi sinh vật
pH

Nhiệt

pH

độ

(giờ)

Vmax

(mg/ (µmol/
ml)

phút)

Nhiệt
độ

(giờ)

Nấm mốc
Acrophialophora

22

7,0

55

-

60 (1)

-

26

-

Aspergillus

39

5,5-6

55

-

-

5,7-

1,0

10000

awamori

6,7
23

5,0

50

-

-

3,7

0,33

3333

26

4,0

45-50

-

-

3,3-

0,09

455

3,5
Aspergillus

34

6

56

4,0-6,7

56

3,4

0,97

1091

25

4,8

54

4,5

50

9,4

7,6

2650

35

7,5

50

-

-

6,3

5,26

118,4

24

7,5

50

-

-

4,4

4,16

145,2

nidulans

Aureobasidium
pullulans
Cephalosporium
sp.

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 15


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Erwinia

42

5,5

55

4-7

35

8,8

-

-

33

7,0

60

6,0-7,5

40 (3)

8,6

-

-

23

3,5

50

4,5-5,5

40 (3)

5,9

-

-

22

5

53

-

-

9,3

4,5

160

20

5,0

50

-

40

-

0,58

0,106

20

7

50

3,0-4,0

6,5-8

7,1

9,4

4330

99

6,0

75

-

70 (4)

0,7

145

Bacillus sp. W1

21,5

6

65

4,5-10

-

8,5

4,5

-

(JCM2888)

49,5

7,9

70

4,5-7,0

-

3,7

0,95

-

Streptomyces T-7

20,64

4,5-5,5

60

5,0

37

7,8

10

7600

(144)

(264)

chrysanthemi42

Penicillium
purpurogenum

Trichoderma
viride

Trichoderma
harzianun

Vi khuẩn

Aeromonas
caviae ME1
Bacillus sp. Strain
SPS-0

SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 16


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Streptomyces sp.

50

5,5-6,5

60-65

5,5-6,5

55

7,1

9,1

-

25

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10,0

-

-

11,2

-

No 3137
6
25

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10,2
6

Thermotoga
thermarum

266b

6

80

-

-

-

0,36

1,18

35c

7

90

-

-

-

0,24

19,5

2.2.4. Cơ chế hoạt động của xylanase
Hàng loạt các mô hình đã được đưa ra để giải thích cơ chế hoạt động của xylanase.
Hoạt động của xylanase dẫn đến sự thủy phân xylan. Sự thủy phân nhìn chung có thể là kết
quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric của các monomer đường khử
của cacbohydrat. Đề xuất này bao gồm một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học. Sự dịch
chuyển glycosyl thường dẫn đến trong sự thay thế tính ái nhân ở cacbon bão hòa của trung
tâm anomeric và diễn ra với sự duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric. Hầu hết
các enzym thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase và xylanase được biết đến với sự
thủy phân các cơ chất của chúng với sự duy trì của cấu hình anomeric của C1. Có sự liên
quan của cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm . Cơ chế dịch

chuyển kép bao gồm các đặc điểm:
- Xúc tác acid với việc thêm một proton vào cơ chất.
-

Một nhóm carboxyl của enzym ở trạng thái hoạt động.

-

Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzym với

cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên kết
này đối lập với đường của cơ chất.
-

Các tương tác không phải là cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên

(hình 2.6). [4]
SVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 17


Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase từ chủng nấm Aspergillus niger trên môi trường lá
mía – cám gạo

Hình 2.6 Cơ chế phản ứng thủy phân của xylan bởi xylanase của Bacillus circulans [20]
(a) Cấu trúc xylan xoắn là phù hợp với dạng lõm giữa Tyr 65 và Tyr 69. Glu 172 là tác nhân
xúc tác axit/bazo và Glu 78 là ái nhân. (b) Glycone liên kết với Glu 78. Chất trung gian này
được giữ lại trong suốt phản ứng chuyển glycosyl. (c) Nước chiếm chỗ của nucleophile. (d)
Sự tách và khuếch tán của glycone (xylobiose) cho phép sự di chuyển của enzym tới một vị

trí mới trên cơ chất. Xylanase của họ 11 biểu lộ một cơ chế endo và ngẫu nhiên hơn trong
quá trình phân cắt. Điều này là bởi vì aglycone được giải phóng ở bước (b) và glycone ở
bước (d).
Leggio và các cộng sự đề xuất rằng cơ chế xúc tác của xylanase là:
1. Xylanase nhận biết và liên kết với xylan.
2. Gốc xylosyl ở vị trí-1 bị làm biến dạng và được thả xuống hướng về phía gốc xúc tác,
liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên kết cộng hóa trị enzymSVTH: Võ Lê Phương Thảo

Trang 18