nghiên cứu xác định Auramine O trong thực phẩm bằng phương pháp von ampe hòa tan

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
LỜI CÁM ƠN

5

7

DANH MỤC BẢNG

8

DANH MỤC HÌNH

10

MỞ ĐẦU 13
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

15

1.1 Giới thiệu chung về chất nghiên cứu Auramine O

15

1.1.1. Cấu tạo của Auramine O (AO)................................................................15
1.2. Các phương pháp xác định Auramine O 18
1.2.1. Phương pháp sắc kí.................................................................................18
1.2.3. Phương pháp quang phổ.........................................................................20
1.3. Giới thiệu phương pháp von - ampe vòng (CV) 21
1.4. Giới thiệu về phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ

21

1.4.1. Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích..........................22
1.4.2. Nguyên tắc của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ:....................23
1.5. Điện cực làm việc

24

1.5.1. Điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE)....................................................24
1.5.2. Điện cực glassy carbon...........................................................................25
1.5.3. Ưu, nhược điểm của phương pháp Von - Ampe hòa tan hấp phụ............25
CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

28
28

1


2.2.1. Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp CV...........................................28
2.2.2. Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ
SqW, DP..................................................................................................................29
2.3. Quy trình xử lý mẫu 30
2.3.1 Mẫu thịt gà...............................................................................................30
2.3.2. Mẫu nước dưa.........................................................................................32
2.4. Trang thiết bị và hóa chất 33
2.4.1. Trang thiết bị...........................................................................................33

2.4.2. Hóa chất và dung môi.............................................................................33
2.4.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất............................................................34
2.4.3.1. Pha dung dịch gốc Auramine O 10- 3 M 34
2.4.3.2. Pha dung dịch đệm BR có pH (2 đến 12)

34

2.5. Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 34
2.5.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)......................34
2.5.2. Độ lặp lại của phương pháp....................................................................35
2.5.3. Hiệu suất thu hồi.....................................................................................36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Nghiên cứu đặc tính điện hóa của Auramine O bằng phương pháp von ampe vòng (CV)

37

3.1.1. Đặc tính điện hóa của Auramine O trên điện cực HMDE và GCE..........37
3.1.1.1. Đặc tính hấp phụ của AO trên HMDE................................................37
3.1.1.2. Đặc tính hấp phụ của AO trên điện cực GCE.....................................39
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng pH..........................................................................40
3.1.2.1. Khảo sát ảnh hưởng pH trên điện cực HMDE....................................40

2


3.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng pH trên điện cực GCE........................................41
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét 42
3.1.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét trên điện cực HMDE

42

3.1.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét trên điện cực GCE.....................43
3.2. Tối ưu hóa các điều kiện xác định A O trên điện cực HMDE và GCE 45
3.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH...............................................................45
3.2.1.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH trên điện cực HMDE.........................45
3.2.1.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH trên điện cực GCE.............................48
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ......................................................50
3.2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ trên điện cực HMDE................50
3.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ trên điện cực GCE....................52
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ.............................................53
3.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ trên điện cực HMDE.......53
3.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ trên điện cực GCE...........56
3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét.......................................................58
3.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét trên điện cực HMDE.................58
3.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét trên điện cực GCE.....................60
3.3. Đánh giá phương pháp

62

3.3.1. Xây dựng đường chuẩn...........................................................................62
3.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn trên điện cực HMDE....................................62
3.3.1.2. Xây dựng đường chuẩn trên điện cực glassy carbon..........................64
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp......................................................66
3.3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên điện cực HMDE...............66

3


3.3.2.2. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp trên điện cực GCE...................67
3.4. Áp dụng phân tích Auramine O trong mẫu thịt gà

68

3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi..........................................................68
3.4.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ACN trên điện cực HMDE..........68
3.4.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của etanol trên điện cực GCE............................69
3.4.2. Xây dựng đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà

71

3.4.2.1. Đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà đo trên HMDE......71
3.4.2.2. Đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu thịt gà trên GCE...............72
3.5. Áp dụng phân tích mẫu thật

74

3.5.1. Áp dụng phân tích mẫu thật trên điện cực HMDE..................................74
3.5.2. Áp dụng phân tích mẫu thịt gà đo trên điện cực GCE và đo đối chiếu trên
LC - MS...................................................................................................................75
3.5.3. So sánh ý nghĩa thống kê giữa hai phương pháp AdSV - DP và phương
pháp LC - MS..........................................................................................................79
3.6. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp

81

3.6.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp trên điện cực HMDE..................82
3.6.2. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp trên điện cực GCE......................82
3.7. Áp dụng phân tích Auramine O trong mẫu thịt gà

83

3.7.1. Xây dựng đường chuẩn xác định AO trong nền mẫu dưa đo trên điện cực
GCE........................................................................................................................83
3.7.2. Áp dụng phân tích một số mẫu dưa trên thị trường.................................84
KẾT LUẬN

86

TÀI LIỆU THAM KHẢO

87

PHỤ LỤC...........................................................................................................90

4


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
STT

Tiếng anh

Tiếng việt

Viết tắt

1

Adsorptive Stripping

Von ampe hòa tan hấp phụ

AdSV

Voltammetry
2

Accumulation time

Thời gian tích lũy

tacc

3

Anodic Stripping

Von ampe hòa tan anot

ASV

Voltammetry
4

Auramine O

Vàng ô

AO

5

Britton – Robinson buffer

Britton - Robinson

B-R

6

Carbon Paste Electrodes

Điện cực than nhão

CPE

7

Cathodic Stripping

Von ampe hòa tan catot

CSV

Voltammetry
8

Cyclic Voltammetry

Von ampe vòng

CV

9

Chemiluminescence

Phương pháp phát quang

CL

method

hóa học

Differential Pulse

Von ampe xung vi phân

DDP

10

Voltammetry
11

Glassy carbon

Điện cực than gương

GCE

12

Hanging Mercury

Điện cực giọt thủy ngân

HMDE

Dropping Electrode

treo

High Perfomance Liquid

Phương pháp sắc ký lỏng

Chromatography

hiệu năng cao

International agency for

Tổ chức nghiên cứu ung

research on cancer

thư thế giới

13

14

5

HPLC

IARC


15

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

16

Limit of Quantity

Giới hạn định lượng

LOD

17

Liquid chromatography –

Sắc ký khối phổ

LC - MS

mass spectrometry
18

Mercury Film Electrodes

Điện cực màng thủy ngân

MFE

19

Pararosalin

Pararosalin

PA

20

Recovery

Hiệu suất thu hồi

H%

21

Relative Standard

Độ lệch chuẩn tương đối

RSD %

Deviation
22

Rhodamine B

Rhodamin B

RB

23

Solid Phase Extraction

Chiết pha rắn

SPE

24

Square Wave Voltammetry

Von ampe sóng vuông

SqW

25

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

SD

26

Static Mercury Drop

Điện cực thủy ngân tĩnh

SMDE

Electrode

LỜI CÁM ƠN
Trước hết, tôi xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Kim
Thường đã tận tình hướng dẫn, hỗ trợ và định hướng cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng
và khoa hóa học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quý báu và tạo điều
kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

6

Tôi cũng xin cảm ơn các bạn sinh viên, học viên trong bộ môn hóa phân tích
đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè, đã động viên giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Dương Văn Thắng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Khối lượng sản xuất Auramine O ở một số quốc gia năm 2008
16
Bảng 1.2: Kết quả nghiên cứu ở động vật

17

Bảng 1.3: Kết quả nghiên cứu xác định AO, PA, RB bằng phương pháp HPLC
19
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát tốc độ quét bằng đường CV trên HMDE

7

42

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tốc độ quét bằng đường CV trên GCE

43

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng trên HMDE
45
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng trên GCE
48
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thế hấp phụ đến cường độ dòng trên
HMDE

50

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng
trên GCE

52

Bảng 3.8: khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ dòng trên
HMDE

54

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ
dòng trên GCE

57

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng

trên HMDE 58
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng
trên GCE

60

Bảng 3.12: Các điều kiện tối ưu xác định AO trên GCE

61

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ Auramine O đến cường độ dòng trên
HMDE 62
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ AO đến cường độ dòng trên
GCE 64
Bảng 3.15: Đo độ lặp lại ở hai mức nồng độ 10 -7 M; 1,2.10- 6 M trên HMDE
66
Bảng 3.16: Đo độ lặp lại ở hai mức nồng độ 4.10 - 8 M và 2.10- 7 M trên GCE
67

8


Bảng 3.17: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thành phần dung môi trên
HMDE

68

Bảng 3.18: Sự phụ thuộc cường độ dòng píc vào thành phần dung môi trên
GCE 70
Bảng 3.19: Kết quả đo cường độ dòng của AO trong mẫu thịt gà trên HMDE

71
Bảng 3.20: Kết quả đo cường độ dòng của AO trong mẫu thịt gà trên GCE
73
Bảng 3.22: Kết quả đo mẫu thịt gà trên HMDE

75

Bảng 3.23: Kết quả đo mẫu thịt gà trên GCE và đo đối chứng trên LC - MS
76
Bảng 3.24: Kết quả hiệu suất thu hồi AO trên HMDE

82

Bảng 3.25: Kết quả hiệu suất thu hồi AO trong thịt gà trên GCE 82
Bảng 3.26: Kết quả đo cường độ dòng của Auramine O trong mẫu dưa trên
GCE 83
Bảng 3.27: Kết quả xác định AO trong dưa ở một số địa phương trên GCE
85

9


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Auramine O
Hình 3.1: Đường CV của AO trên HMDE

15
37

Hình 3.2: Đường CV của AO ghi 5 vòng liên tiếp trên HMDE

38

Hình 3.3: Đường Von - Ampe vòng của dung dịch AO trên GCE 39
Hình 3.4: Đường CV của AO ghi 5 vòng liên tiếp trên điện cực GCE
Hình 3.5: Đường CV của AO trên HMDE

40

41

Hình 3.6: Đường CV của AO phụ thuộc vào tốc độ quét trên HMDE
Hình 3.7: Sự phụ thuộc của logIp vào logV trên HMDE

42

43

Hình 3.8: Đường CV của AO phụ thuộc vào tốc độ quét.trên điện cục GCE
44
Hình 3.9: Sự phụ thuộc của logIp vào - logV trên GCE

44

Hình 3.10: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc giữa cường độ dòng vào giá
trị pH trên HMDE 47
Hình 3.11: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào giá trị pH trên HMDE
47
Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa thế đỉnh píc và pH trên HMDE
48

Hình 3.13: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị pH trên GCE
Hình 3.14: Sự phụ thuộc của log Ip vào – log(pH) trên GCE

10

50

49


Hình 3.15: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi giá trị thế hấp phụ trên
HMDE

51

Hình 3.16: Sự phụ thuộc của cường độ dòng píc vào giá trị thế hấp phụ trên
HMDE

51

Hình 3.17: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc vào thế hấp phụ trên GCE
52
Hình 3.18: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị thế hấp phụ trên GCE
53
Hình 3.19: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi thời gian hấp phụ ở nồng độ
10- 6 M trên HMDE

55

Hình 3.20: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi thời gian hấp phụ ở nồng độ

2,4.10-7 M trên HMDE

55

Hình 3.21: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào thời gian hấp phụ trên HMDE
56
Hình 3.22: Đường von - ampe hòa tan khi thay đổi giá trị thời gian hấp phụ
trên GCE

57

Hình 3.23: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào thời gian hấp phụ trên GCE
57
Hình 3.24: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị
tốc độ quét trên HMDE 59
Hình 3.25: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị tốc độ quét trên HMDE
59
Hình 3.26: Đường von - ampe hòa tan của AO phụ thuộc vào tốc độ quét trên
GCE 60
Hình 3.27: Sự phụ thuộc của cường độ dòng vào giá trị tốc độ quét trên GCE
61

11


Hình 3.29: Cường độ dòng pic phụ thuộc vào sự thay đổi nồng độ AO trên
HMDE

62

Hình 3.30: Đường chuẩn của AO trong khoảng nồng độ 4.10 - 8 M đến 6,4.10- 7 M
trên HMDE 63
Hình 3.31: Đường von - ampe phụ thuộc vào nồng độ của AO trên GCE
64
Hình 3.32: Đường chuẩn AO từ khoảng nồng độ 1.10- 8 M đến 4.10- 7 M trên
GCE 65
Hình 3.33: Đường von - ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung môi
trên

HMDE

69

Hình 3.34: Đường von- ampe hòa tan phụ thuộc vào thành phần dung môi trên
GCE; 70
Hình 3.35: Cường độ dòng pic khi thay đổi nồng độ AO trong mẫu thịt gà trên
HMDE

71

Hình 3.36: Đường chuẩn xác định AO trong mẫu thịt gà ở hàm lượng 7,1 µg.g-1
đến 30,38 µg.g-1 trên HMDE

72

Hình 3.37: Cường độ dòng pic thu được khi thay đổi nồng độ AO trong mẫu
thịt gà trên GCE

73

Hình 3.39: Tín hiệu khi đo mẫu thịt gà trên HMDE 75
Hình 3.40 a, b, c : Cường độ dòng khi đo một số mẫu thịt gà trên GCE 79
Hình 3.41: Sự phụ thuộc cường độ píc vào nồng độ AO trong mẫu dưa trên
GCE 83
Hình 3.42: Đường chuẩn AO trong mẫu dưa ở nồng độ 10- 8 M đến 10- 7 M trên
GCE 84
Hình 3.43: Cường độ dòng khi đo các mẫu dưa trên GCE 85

12


MỞ ĐẦU
Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhạy cảm, nhức
nhối, và gây xôn xao dư luận. Hàng loạt các vụ việc vi phạm an toàn vệ sinh thực
phẩm bị phát hiện: rau có thuốc trừ sâu; hoa quả có tồn dư chất kích thích, rượu giả,
sữa nhiễm độc.... Đặc biệt, gần đây việc lạm dụng các chất phụ gia, thuốc nhuộm
trong thực phẩm đã gây nhiều bức xúc và là một vấn đề gây ảnh hưởng tiêu cực đến
sức khỏe con người. Auramine O là chất màu tổng hợp, chỉ được sử dụng trong
công nghiệp để nhuộm nhiều sản phẩm như vải, giấy, gỗ…và dùng để làm màu sơn
quét tường, không được dùng trong thực phẩm. Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư
quốc tế của Tổ chức y tế thế giới (WHO/IARC), Auramine O là chất đứng hàng thứ
5 trong 116 chất gây ung thư hàng đầu trên thế giới. Tuy nhiên, vì lợi nhuận trước
mắt, nhiều người kinh doanh thực phẩm đã dùng chất Auramine O để nhuộm màu
vào thực phẩm như măng tươi, thịt gà,dưa muối, nước tương, bim bim… làm tăng
màu vàng, nhìn cho đẹp mắt để có thể bán thực phẩm với giá thành cao. Khi người
tiêu dùng sử dụng những thực phẩm đó sẽ dễ hấp thụ luôn lượng Auramin O còn

13

tồn dư, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây ung thư. Do đó, cần có
phương pháp để kiểm tra hàm lượng Auramine O trong mẫu thực phẩm.
Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi thấy
rằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng ghép nối khối phổ xác
định Auramine O trong mẫu thực phẩm có độ nhạy cao nhưng giá thành thiết bị và
giá thành phân tích cao, thời gian phân tích lâu. Phương pháp von - ampe hòa tan
hấp phụ là phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình phân
tích không quá phức tạp, thiết bị phân tích không đắt, không tốn dung môi, chi phí
phân tích không cao. Hơn nữa, chưa có công trình nào xác định Auramine O trong
thực phẩm bằng phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ nên việc lựa chọn đề tài
rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mặt khác, cần có phương pháp kiểm tra nhanh,
đảm bảo độ nhạy, độ đúng, độ chính xác để có thể kiểm tra được mẫu thực phẩm
nhiễm Auramine O hay không là rất cần thiết và cấp bách đối với xã hội.
Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đề tài: “nghiên cứu xác định
Auramine O trong thực phẩm bằng phương pháp von - ampe hòa tan”.

14


15


CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung về chất nghiên cứu Auramine O
1.1.1. Cấu tạo của Auramine O (AO)
Auramine O (vàng ô, basic yellow) thuộc phân nhóm ketoimin, có tên khoa
học là diarylmethane, tên danh pháp theo IUPAC: 4,4 – carbonnimidoylbis [N,N –
dimethylbenzenamine]. Công thức phân tử của Auramine O là : C17H22N3Cl. [15]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Auramine O

Auramine O có khối lượng phân tử là 303,83 (g/mol) và có nhiệt độ nóng
chảy ở 267oC (540 K). Auramine O là chất rắn có dạng tinh thể hình kim vàng, nó
tan rất tốt trong nước (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml), tan trong ethyl ether (60
mg/ml). [15, 19]
1.1.2. Ứng dụng của Auramine O
Auramine O được sản xuất lần đầu tiên ở châu Âu (Thụy Sĩ, Đức, Anh và
Pháp), và sau đó ở Hoa Kỳ. Hiện nay Auramine O sản xuất chủ yếu ở Ấn Độ và
Trung Quốc năm (2008). [18]

16


Bảng 1.1: Khối lượng sản xuất Auramine O ở một số quốc gia năm 2008 [18]
Năm

Sản lượng Auramine O (103 pounds)

1986

10 - 500

1994

10 - 500

1998

10 - 500

Trong y học: Auramine O có thể được dùng như chất huỳnh quang để xác

định vi khuẩn axit có trong đờm, mô nhiễm bệnh. Auramine O còn được sử dụng
kết hợp cùng thuốc rhodamine để phát hiện các vi khuẩn mycobacterium
tuberculosis. [24]
Trong công nghiệp: Auramine O là chất nhuộm màu tổng hợp, được sử dụng
trong công nghiệp để nhuộm các sản phẩm như vải, gỗ, giấy... và được dùng để làm
màu sơn quét tường. [27]
Trong quân sự: Auramine O được sử dụng tạo khói màu trong các ứng dụng
quân sự.
Ngoài ra, trước đây Auramine O đã từng bị phát hiện sử dụng để làm thuốc
nhuộm tóc, sử dụng trong tạo màu thực phẩm. [16]
1.1.3. Tác hại của Auramine O
Auramine O là chất gây độc cực kỳ nguy hiểm. Qua tiếp xúc da, nó gây dị
ứng hoặc làm mẩn ngứa da, mắt... Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở,
đau ngực. Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa. Nếu tích tụ dần trong cơ thể nó gây
nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung
thư.

17


1.1.3.1. Ung thư người
Khi Auramine O tích ở trong cơ thể người có thể gây ung thư bàng quang.
Năm 1933, Miller đã phát hiện 2 ca ung thư bàng quang ở công nhân làm việc trong
ngành công nghiệp sản xuất Auramin O. [20]
Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp Auramin O vào nhóm 2B
là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người. [19]
1.1.3.2. Nghiên cứu ở động vật
Các nhà khoa học cũng tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của
Auramine O trên động vật. Kết quả cho thấy, Auramin O làm tổn thương ADN trên
gan, thận, tuỷ xương của chuột, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối ung thư hạch,

ung thư gan ở chuột.
Bảng 1.2: Kết quả nghiên cứu ở động vật
Loài / tài liệu
tham khảo
Chuột [8, 9]

Chế độ nuôi

Tỷ lệ khối u

Ý nghĩa

- Ung thư gan:

- P < 0,05 cả

đực 4/15; cái 3/15.

hai giới tính

- Ung thư hạch

- P < 0,01, F

- Thức ăn chứa 0,1 % AO trong
52 tuần ( 728 mg /chuột).
- 15 chuột đực và 15 chuột cái
- 15 chuột đực và 15 cái: 2
lần /tuần tiêm dưới da

đực 3/15; cái 8/15

Chuột nhắt

- 15 chuột đực và 15 chuột cái

- Ung thư hạch:

và chuột

cho ăn thức ăn có hàm lượng

Chuột đực 4/7,

cống

0,1 % AO trong 52 tuần (1820

chuột cái 3/10.

[29]

mg/chuột)

- Ung thư gan:

- 12 chuột đực và 15 chuột cái

chuột đực 7/12,

ăn thức ăn chứa 0,2 % AO

18

P < 0,05


P < 0.0001
trong 52 tuần (3640 mg/chuột).
- 12 chuột đực ăn thức ăn chứa
Chuột [22]

0,1 % AO trong 87 tuần

- Ung thư gan:
11/12

(10g/con)

Chuột [24]

chuột cái 11/15.

20 chuột đực và 20 chuột cái

- Chuột đực 13/20,

được cho ăn chế độ ăn uống có

8/20, 10/20

chứa AO ở mức 0, 50, 100 và

- Chuột cái 19/20,

200 ppm

18/20, 15/20, 19/20

P < 0.0001

NS

1.1.4. Các quy định về hàm lượng của Auramine O
Ở châu Âu, việc sản xuất Auramine O phải tuân theo các quy định của chỉ thị
2004/37/EC, áp dụng cho các hoạt động mà người lao động phải tiếp xúc với chất
gây ung thư hoặc chất gây đột biến gen. Chỉ thị 2004/93/EC, ngày 21 tháng 9 năm
2004 đã xếp Auramine O và muối của nó không được xuất hiện trong các thành
phần của mỹ phẩm [12, 13]
Ở Việt Nam, bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (NN&PTNT) đã ban
hành thông tư số 26/2012 và thông tư bổ sung số 42/2015 cấm sản xuất, nhập khẩu,
kinh doanh và sử dụng Auramine O và các hợp chất trong thức ăn chăn nuôi gia súc,
gia cầm. [2]
1.2. Các phương pháp xác định Auramine O
Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để xác định Auramine
O như: phương pháp sắc kí, phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC, phương pháp
quang phổ, phương pháp điện di mao quản, phương pháp…
1.2.1. Phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có độ nhạy, độ chọn lọc cao
sử dụng dung môi metanol và axeton nitrin để chiết đồng thời rhodamin B (RB),

19


auramine O (AO), pararosalin (PA) trong 6 mẫu thực phẩm: cà ri, gà nướng, tương
ớt, tương cà chua, bột tôm và súp bột. [11]
Bảng 1.3: Kết quả nghiên cứu xác định AO, PA, RB bằng phương pháp HPLC
Chất
Rhodamin B

Auramine O

Pararosalin

0,05 đến 100

0,05 đến 100

0,05 đến 50

Đánh giá phương pháp

LOD = 0,0125

LOD = 0,05

LOD = 0,0125

(µg/ml)

LOQ = 0,05

LOQ = 0,125

LOQ = 0,05

Độ thu hồi (%)

91 - 99

76 - 92

88 - 102

Thông số
hoặc điều kiện đo
Khoảng tuyến tính (µg/ml)
R2 = 0,999

Độ thu hồi khi thêm chuẩn

70,2% đến 102,8%

0,5 µg/ml
Độ lệch chuẩn khi thêm

0,8 % đến 8,0 %

chuẩn 0,5 µg/ml (RSD)

Phương pháp HPLC còn xác định được đồng thời chrysoidine, AO và
safranine T trong 6 mẫu thực phẩm. Mẫu được chiết lần 1 bằng amoniac - metanol
(1:50, v/v) và chiết lần 2 với dung môi CH 2Cl2, rửa giải trong axit formic - metanol
(1:50, v/v), làm sạch bằng n - hexan, cuối cùng hòa tan bằng metanol bão hòa.
Khoảng tuyến tính của phương pháp của ba chất là 0,05 - 2,5 g/ml, hệ số tương
quan đều cao hơn 0,9998. Hiệu suất thu hồi của 6 thực phẩm dao động trong khoảng
72,3 - 96,5 % và độ lệch chuẩn là 0,3 - 8,8 % (n = 6). Giới hạn phát hiện (LOD) của
phương pháp là khoảng 0,02 mg/kg cho chrysoidine; 0,03 mg/kg cho Auramine O
và 0,004 mg/kg cho safranine T. [32]
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detecter khối phổ
phân tích: α - Naphatol, β - Naphatol và AO trong sản phẩm đậu. Thành phần pha
động: ACN và H2O (7 : 3), khoảng tuyến tính từ 0,1 đến 20,0 μg/mL với hệ số

20


tương quan là 0,9999. Độ thu hồi của α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O
trong khoảng 5,0 đến 15,0 mg/kg dao động từ 88,8 % đến 93,0 % với RSD từ 0,67
% đến 1,66 % (n = 6). Giới hạn phát hiện của α - Naphatol, β - Naphatol và
Auramine O: 0,05 mg/kg. Với độ thu hồi cao, LOD thấp, phương pháp này thích
hợp cho việc xác định α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O trong sản phẩm
đậu. [26]
1.2.3. Phương pháp quang phổ
Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – Vis xác định AO dựa trên sự tạo phức
của AO với Albumin (huyết thanh bò). Các điều kiện đo: đệm B – R có pH = 7,
bước sóng tại 339 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,16 µm đến 50 µM với LOD
là 0,05 µM. [30]
Phương pháp phát quang hoá học (CL) được sử dụng để xác định Auramine
O dựa trên xúc tác của các hạt cacbon rỗng với phản ứng phát quang hóa học giữa
H2O2 và Na2CO3. Cường độ CL tỷ lệ thuận với nồng độ của AO trong khoảng tuyến

tính từ 10−7 M đến 10−5 M, và giới hạn phát hiện là 3,5.10 −8 M. Phương pháp này
xác định AO trong cá hổi và bồ hoàng (1 loại thuốc chữa bệnh) có độ thu hồi từ
95% tới 105%. Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) nhỏ hơn 3,1 % (đo lặp lại 7 lần ở
10−6 M). [25]
Phương pháp quang phổ bức xạ kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến
(2DCOS - PLSR) xác định AO trong thảo mộc và thực phẩm với R c = 0,9978,
RMSEC = 0,554 %, RPD = 15,38; RP = 0,9962; RMSEP = 0,7527 %. [31]
1.2.4. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản xác định AO trong cá lù đù vàng (loài cá nhỏ
ở biển Đông, tây - bắc Thái Bình Dương). Điều kiện đo: đệm axit lactic có pH =
3,29; điện thế 1,8 kV, thời gian tách 1 s. Khoảng tuyến tính từ 5.0 mmol/L đến
100,0 mmol/L, giới hạn phát hiện 0,2 mg/kg (S/N = 3). [17]

21


Qua tổng quan tài liệu, chúng tôi thấy có nhiều phương pháp đã xác định và
định lượng được Auramine O trong mẫu thực phẩm nhưng chưa có một công trình
nào nghiên cứu xác định Auramine O bằng phương pháp von – ampe được công bố.
Vì vậy ở luận văn này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu xác định đặc tính điện hóa
và định lượng Auramine O trong mẫu thịt gà và dưa bằng phương pháp von – ampe
hòa tan hấp phụ.
1.3. Giới thiệu phương pháp von - ampe vòng (CV)
Đường von ampe vòng (CV) là cơ sở để nghiên cứu tính chất điện hóa của
một chất mới, và lựa chọn điều kiện thích hợp cho các phương pháp phân tích điện
hóa. Qua đường CV cho chúng ta thông tin về các đặc tính điện hóa của đối tượng
nghiên cứu như tính oxi hóa khử, tính thuận nghịch, khả năng làm giàu và làm cơ sở
để tính toán các thông số động học của đối tượng nghiên cứu.
Nguyên tắc của phương pháp CV sử dụng hệ 3 điện cực: điện cực làm việc
(điện cực đĩa quay), điện cực so sánh (điện cực Ag/AgCl/Cl -1), điện cực phụ trợ (Pt).

Đặt thế bắt đầu ở thế thích hợp (0 V), quét thế phân cực với tốc độ không đổi theo
một chiều xác định (âm dần tới một thế xác định 0 đến - 1,5 V) rồi cho phân cực trở
lại đồng thời ghi đường von - ampe thu được ta rút ra kết luận về tính chất điện hóa
của hệ nghiên cứu. [1, 3]
1.4. Giới thiệu về phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ
Để tiến hành phân tích bằng phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ, người
ta dùng bộ thiết bị gồm một máy cực phổ tự ghi và một bình điện phân cho hệ 3
điện cực: điện cực làm việc là điện cực giọt thủy ngân tĩnh hoặc điện cực rắn
(glassy carbon, paste carbon…), điện cực so sánh có thế không đổi thường là điện
cực calomen (Hg, Hg2Cl2 | KCl ||) hoặc điện cực bạc clorua (Ag, AgCl | KCl ||) có bề
mặt lớn và điện cực phụ trợ Pt. Nắp bình điện phân còn có một đường dẫn luồng khí
trơ (N2, Ar,…) vào bình dung dịch phân tích để loại bỏ Oxi hòa tan trong dung dịch.

22


1.4.1. Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích
Kỹ thuật xung vi phân (DDP)
Kỹ thuật Von - Ampe xung vi phân được dùng phổ biến nhất để ghi đường
Von - Ampe hòa tan. Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau
khoảng 10  100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng 30  100 ms được đặt
chồng lên mỗi bước thế.
Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2),
khoảng thời gian đo dòng thông thường là 10  30 ms.
Ở thời điểm t1: I1 = Ikt1 + Ic1
Ở thời điểm t2: I2 = Ikt2 + Ic2
Với I1, I2, Ikt1, Ikt2 , Ic1, Ic2 lần lượt là dòng ghi được, dòng khuếch tán và dòng
tụ điện ở hai thời điểm t1 và t2.
Dòng thu được là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc I P= f(EWE) và có giá
trị là hiệu của hai giá trị dòng đó (IP = I2  I1).

Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng
dòng Faraday (IF) và dòng tụ điện (Ic). Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với
dòn Faraday, vì:
IC  IC0 . e- t/RC*
Ở đây, t: thời gian, R: điện trở, C*: điện dung vi phân của lớp kép.
Theo cách ghi dòng như trên, dòng tụ điện ghi được trước lúc nạp xung và
trước lúc ngắt xung là gần như nhau và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là
dòng Faraday. Như vậy, kỹ thuật von – ampe xung vi phân cho phép loại trừ tối đa
ảnh hưởng của dòng tụ điện. Các tính chất kỹ thuật của kỹ thuật DP: Đối với các
quá trình điện hóa hay các cặp oxi hóa / khử thuận nghịch thì píc đối xứng và píc
bất đối xứng đối với quá trình không thuận nghịch. Thế đỉnh hòa tan được xác định
qua:

Ep = E1/2 - ∆E

23


Dòng đỉnh Ip tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích C A trong các phản ứng
thuận nghịch. [1, 3]
Kỹ thuật sóng vuông (SqW)
Theo kỹ thuật này, những xung sóng vuông đối xứng có biên độ nhỏ và
không đổi (khoảng 50 mV) được đặt chồng lên mỗi bước thế. Điện cực được phân
cực bởi một điện áp xoay chiều dạng vuông góc có tần số khoảng từ 10 ÷ 200 Hz và
biên độ có thế thay đổi từ 1 ÷ 50 mV được đặt chồng lên mỗi bước thế. Trong mỗi
chu kỳ xung, dòng được đo ở 2 thời điểm: thời điểm 1 (dòng dương I 1) và thời điểm
2 (dòng âm I2) trong một thời gian rất ngắn khoảng 10 ms.
Ở thời điểm t1: I1 = Ikt1 + Ic1
Ở thời điểm t2: I2 = Ikt2 + Ic2
Dòng thu được là hiệu của hai giá trị dòng đó (IP = I1 – I2) và IP được ghi là

hàm của thế đặt lên điện cực làm việc. Theo cách ghi dòng như vậy, kỹ thuật này
loại trừ tối đa ảnh hưởng của dòng tụ điện. Trong một số trường hợp, kỹ thuật sóng
vuông có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật xung vi phân.
1.4.2. Nguyên tắc của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ:
Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ giai đoạn làm giàu chất phân
tích là dựa trên sự hấp phụ của bản thân chất cần phân tích ( hợp chất hữu cơ) hoặc
1 lượng chất của ion kim loại với một thuốc thử tạo phức bền với nó. Quá trình hấp
phụ làm giàu thường diễn ra tương đối nhanh so với quá trình điện phân làm giàu.
Trong quá trình hấp phụ làm giàu điện cực làm việc được giữ ở một thế chọn trước
không tương ứng với dòng giới hạn. Quá trình này không liên quan tới sự trao đổi e
trên điện cực.
Bản chất hấp phụ ở đây có thể là sự hấp phụ hóa học hoặc hấp phụ điện hóa
trong 1 số trường hợp là tổng của 2 quá trình. Kết quả phân tích thường ổn định nếu
hấp phụ là đơn lớp.
Phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ gồm ba giai đoạn:

24


+ Giai đoạn 1 - làm giàu: Trong giai đoạn làm giàu, xảy ra hai quá trình là
quá trình tạo phức chất và quá trình hấp phụ. Phức chất giữa ion kim loại và phối tử
tạo phức hình thành trong dung dịch phân tích và được hấp phụ lên bề mặt điện cực,
do vậy chất phân tích được làm giàu. Hai quá trình đó có thể xảy ra gần như đồng
thời hoặc một trong hai quá trình sẽ xảy ra trước. Trong giai đoạn này, thế trên điện
cực được giữ cố định trong một thời gian thích hợp và dung dịch được khuấy trộn
đều với tốc độ không đổi.
+ Giai đoạn 2 - cân bằng: kết thúc thời gian làm giàu, ngừng khuấy dung
dịch (hoặc ngừng quay điện cực) để chất hấp phụ trên bề mặt điện cực được phân
bố đều.
+ Giai đoạn 3 - hòa tan: Trong giai đoạn hòa tan, tiến hành quét thế theo

chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử các tiểu phần điện hoạt trên bề mặt điện
cực, có thể là phức chất của ion kim loại với phối tử tạo phức hoặc kim loại cần
phân tích hoặc phối tử và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật vonampe nào đó, chẳng hạn: von-ampe xung vi phân (Differential Pulse - DP), khi đó
phương pháp được gọi là von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân (DP - AdSV)
hoặc von - ampe sóng vuông (Square Wave - SW), khi đó phương pháp được gọi là
von - ampe hòa tan hấp phụ sóng vuông (SW - AdSV).
Các kết tủa làm giàu trên điện cực làm việc trong phương pháp AdSV là:
- Chất hữu cơ có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực
- Hòa tan phức chất khó tan của các ion kim loại với thuốc thử được thêm
vào dung dịch chất phân tích. [1, 3]
1.5. Điện cực làm việc
1.5.1. Điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE)
Điện cực HMDE là điện cực được dùng phổ biến trong phương pháp von ampe hòa tan. Giọt Hg được treo ở cuối một capilar nhỏ, đường kính giọt trong
khoảng 0.15-0.5mm. Ở lỗ mao quản của cực có phủ một lớp chất kỵ nước để Hg

25