Nhân nhanh In vitro cây củ dền Chioggia

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY CỦ DỀN
CHIOGGIA (BETA VULGARIS L. VAR. RUBRA L.)

Tên sinh viên

: Nguyễn Việt Thương

Ngành

: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh

Hà Nội, 1/2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực
và chưa từng được sử dụng để bảo vệ trong bất kì một báo cáo nào.
Tôi xin cam đoan, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn
gốc.

Sinh viên

Nguyễn Việt Thương

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè, người thân. Với lòng
biết ơn sâu sắc nhất, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả mọi người đã tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy, cô trong Khoa
Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã cùng với tri thức và tâm
huyết của mình truyền đạt cho tôi những kiến thức rất quý báu trong suốt 4 năm học
tập tại trường. Không thể không nhắc tới các thầy, cô giáo ở Bộ môn Công nghệ sinh
học Thực vật - Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt
nghiệp tại Bộ môn.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ths. Nguyễn Thị Thùy
Linh đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và động viên để tôi hoàn thành tốt luận văn này
trong thời gian qua. Nếu không có sự hướng dẫn, dạy bảo của cô thì luận văn này rất
khó có thể hoàn thiện. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô!
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến người thân, bạn bè, những người luôn bên
cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 22 tháng 1 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Việt Thương

ii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................vii
TÓM TẮT.................................................................................................................... viii
PHẦN I: MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Mục đích ............................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 1
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.) ......... 3
2.1.1. Nguồn gốc ...................................................................................................... 3
2.1.2. Vị trí phân loại ............................................................................................... 3
2.1.3. Đặc điểm thực vật học.................................................................................... 3
2.1.4. Công dụng của cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.) .......... 3
2.2. Tình hình nghiên cứu và phát triển các giống cây Beta vulgaris L. ..................... 4
2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus ở cây Beta vulgaris L. .......................................... 4
2.2.2. Các nghiên cứu tạo chồi từ callus ở cây Beta vulgaris L............................... 6
2.2.3. Các nghiên cứu tạo chồi trực tiếp ở cây Beta vulgaris L. .............................. 7
2.2.4. Các nghiên cứu tạo rễ ở cây Beta vulgaris L. ................................................ 9
PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG ............................................................................. 12
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 12
3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................... 12
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 12
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 12
3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 12

3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................................ 12
3.2.1. Giai đoạn tạo callus: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng, chất điều tiết
sinh trưởng đến khả năng tạo callus từ mô lá, cuống lá, đoạn thân ..................... 13
3.2.2. Giai đoạn tạo chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng
đến khả năng tạo chồi ............................................................................................ 15
3.2.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (tạo rễ): Nghiên cứu ảnh hưởng của chất
điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo rễ .............................................................. 17
3.3. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................. 18
iii


3.4. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................... 18
3.4.1. Giai đoạn tạo callus ...................................................................................... 18
3.4.2. Giai đoạn tạo chồi từ callus .......................................................................... 19
3.4.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ....................................................................... 19
3.5. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 19
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 21
4.1. Giai đoạn tạo callus: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng, chất điều tiết sinh
trưởng đến khả năng tạo callus từ mô lá, cuống lá, đoạn thân .................................. 21
4.1.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tạo callus từ lá mầm ...................... 21
4.1.2. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh callus từ lá thật,
cuống lá và đoạn thân ............................................................................................. 23
4.2. Giai đoạn tạo chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến
khả năng tạo chồi ....................................................................................................... 33
4.3. Giai đoạn tạo rễ: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến
khả năng tạo rễ ........................................................................................................... 39
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 42
5.1. Kết luận ............................................................................................................... 42
5.2. Kiến nghị............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 46
Phụ lục 01: Kết quả xử lý số liệu các thí nghiệm ...................................................... 46

iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tạo callus từ lá mầm .......................21
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh callus từ lá thật
(sau 5 tuần).....................................................................................................24
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh callus từ cuống lá
(sau 5 tuần) .....................................................................................................27
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự tái sinh callus từ đoạn thân
(sau 5 tuần).....................................................................................................30
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA đến khả năng tạo chồi từ callus
(sau 5 tuần).....................................................................................................33
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng tạo chồi từ lá thật .......................36
Bảng 4.7. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ
(sau 5 tuần).....................................................................................................38
Bảng 4.8. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ........................40

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tạo callus từ lá mầm .......................23
Hình 4.2. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA tới sự phát sinh callus từ lá thật (sau 5
tuần) ...............................................................................................................26
Hình 4.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA tới sự phát sinh callus từ cuống lá (sau 5
tuần) ...............................................................................................................29

Hình 4.4. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA tới sự tái sinh callus từ đoạn thân ...................32
Hình 4.5. Các loại callus tạo ra từ nuôi cấy in vitro ......................................................35
Hình 4.6. Callus tạo ra từ lá thật, cuống lá trên môi trường có BA và IBA ..................37
Hình 4.7. Ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đoạn thân ...............................39
Hình 4.8. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh (sau 5 tuần) ............41

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

BA

6- benzylaminopurine

GA

Gibberellic acid

IAA

Axit indol axetic

IBA

Indole-3-butyric acid

Kin

Kinetin

α-NAA

α-naphthaleneacetic acid

TDZ

Thidiazuron

B5

Gamborg’s medium

MS

Murashige and Skoog medium

1/2 MS

Môi trường MS có hàm lượng các muối giảm 1/2

PGo

Negrutiu’s medium

CT

Công thức

ĐC

Đối chứng

TN

Thí nghiệm

LSD0,05

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

vii


TÓM TẮT
Củ dền Chioggia (Beta Vulgaris L. var. rubra L.) là loài rau củ có giá trị dinh
dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe. Tuy nhiên, để cho hệ số nhân giống cao, cây đồng
đều, sạch bệnh thì việc sử dụng phương pháp nhân nhanh in vitro là cần thiết. Chính vì
vậy, đề tài “Nhân nhanh in vitro cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L)”
đã được thực hiện. Với nguồn vật liệu ban đầu khác nhau, đề tài bước đầu thực hiện
nhằm tìm ra các điều kiện thích hợp cho việc nhân nhanh giống cây này. Kết quả
nghiên cứu cho thấy, callus từ lá mầm cho tỉ lệ tạo callus đạt 100% khi nuôi cấy trong
điều kiện sáng tốt nhất là 16h sáng/ngày. Lá thật, cuống lá, đoạn thân cảm ứng tạo
callus tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l 2,4-D + 30 g/l
sucrose + 7 g/l agar, với tỉ lệ tạo callus đạt 100%. Trong đó, cuống lá cho callus có
kích thước cao nhất. Tuy nhiên, những callus hình thành từ cuống lá này sau khi

chuyển sang môi trường MS bổ sung BA và α-NAA thì không có hiện tượng tạo chồi.
Việc nghiên cứu tạo chồi trực tiếp từ lá thật và cuống lá trên môi trường MS bổ sung
BA và IBA cũng cho kết quả không tốt với tỉ lệ tạo chồi là 0%. Khi nuôi cấy đoạn thân
mang mắt ngủ trên môi trường là MS + 0,5 mg/l BA + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar cho
kết quả tạo chồi tốt nhất, với hệ số nhân đạt 3,4 chồi/mẫu. Môi trường thích hợp cho
việc tạo rễ là MS + 2,5 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar, với tỉ lệ tạo rễ đạt 20%
và số rễ trung bình là 4 rễ/cây.

viii


PHẦN I: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Củ dền Chioggia là cây thuộc họ dền (Amaranthaceae) với tên khoa học là Beta
vulgaris L. Var. rubra L. được biết tới là một loại rau củ có giá trị dinh dưỡng cao, có
lợi cho sức khỏe. Chúng có tác dụng làm giảm huyết áp (Coles and Clifton, 2012;
Siervo et al., 2013), tăng lưu lượng máu lên não góp phần làm giảm chứng mất trí nhớ
ở người lớn tuổi (Elkins et al., 2010), nâng cao sức chịu đựng giúp luyện tập thể lực
lâu hơn 16% (University of Exeter, 2009), giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch (Bobek
et al., 2000), ức chế sự phát triển ung thư kết trực tràng (S. Appiah et al., 2012), ngăn
ngừa các bệnh về đường hô hấp và tăng khả năng miễn dịch (Gil et al., 1998). Bên
cạnh đó, ruột củ khi cắt ngang có những vòng tròn đồng tâm màu trắng và đỏ xếp xen
kẽ từ trong ra ngoài rất đẹp mắt. Chính đặc điểm nổi bật này mà củ dền Chioggia hiện
nay rất được ưa chuộng.
Tuy nhiên, cây củ dền Chioggia ở Việt Nam vẫn còn là một giống mới, chủ yếu
phải nhập hạt giống từ nước ngoài về sử dụng với giá thành rất cao. Vì vậy, việc duy
trì nhân nhanh giống cây này bằng phương pháp nhân nhanh in vitro là rất cần thiết.
Phương pháp này có ưu điểm là có hệ số nhân giống cao, cho ra các cá thể tương đối
đồng nhất về mặt di truyền, có thể chủ động kế hoạch sản xuất mà không phụ thuộc
vào thời tiết và các yếu tố ngoại cảnh. Nhưng đến nay nước ta chưa có nghiên cứu nào

về đề tài này.
Từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây củ dền Chioggia
(Beta vulgaris L. var. rubra L.)” đã được thực hiện.

1.2. Mục đích
Nghiên cứu kĩ thuật nhân nhanh in vitro cây củ dền Chioggia.

1.3. Yêu cầu
-

Xác định môi trương tối ưu tạo calllus từ đoạn thân, cuống lá, lá mầm, lá thật cây
củ dền Chioggia..

-

Xác định môi trường tạo chồi phù hợp từ lá thật, cuống lá, đoạn thân mang mắt
ngủ, callus.

-

Xác định môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cây củ dền Chioggia.
1


PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.)
2.1.1. Nguồn gốc
Cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. Var. rubra L) có tổ tiên là cây cải biển
(Beta vulgaris subsp. maritima), là loài thực vật mọc hoang dại dọc bờ biển Địa Trung
Hải và Đại Tây Dương ở châu Âu và Bắc Phi. Củ dền Chioggia có nguồn gốc ở Italia

từ khoảng năm 1840. Tên Chioggia là tên thị trấn đầu tiên trồng giống cây này.

2.1.2. Vị trí phân loại
Loài Beta vulgaris L. thuộc họ dền (Amaranthaceae), với nhiều giống khác nhau.
Củ dền Chioggia thuộc phân loài Beta vulgaris subsp. Vulgaris. Các giống củ cải
đường, củ dền đều thuộc phân loài này.

2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Cây củ dền là loài cây hai năm. Năm đầu tiên cây phát triển lá và củ. Đến năm
thứ hai cây sử dụng chất dự trữ trong củ để ra hoa và tạo quả. Rễ là cơ quan dự trữ của
cây. Phần phình ra thành củ là từ phần rễ và phần trụ dưới lá mầm. Củ dền Chioggia
có dạng hình cầu hơi dẹt,vỏ ngoài màu đỏ thẫm, ruột củ khi cắt ngang có những vòng
tròn đồng tâm màu trắng và đỏ xếp xen kẽ từ trong ra ngoài. Các lá của cây mọc xếp
xoắn so le kiểu cánh hoa hồng. Những lá già bên ngoài, lá mới phát triển phía bên
trong. Chúng có cuống rất phát triển; phiến lá hình trứng hoặc hình tam giác, màu
xanh đậm, có mép lượn sóng. Hoa màu lục nhạt, mọc thành bông khá dài, thường cao
khoảng 50 – 150 cm. Quả bế hợp sinh ở đầu gần với bao hoa. Hạt giống thường để
gieo trồng thực chất là quả, chúng được kết hợp từ 2 quả thật trở lên, có đường kính từ
3 – 7 mm. Vì vậy, khi gieo trồng sẽ có nhiều cây nảy mầm từ một hạt giống. Hạt có
hình cầu hơi thuôn; màu nâu đen, bóng, rời khỏi vỏ quả; có đường kính khoảng 1,4
mm (Nottingham, 2004).

2.1.4. Công dụng của cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.)
Củ dền có rất nhiều công dụng tốt cho sức khỏe con người mà ít ai biết đến như:
giảm huyết áp (Coles and Clifton, 2012; Siervo et al., 2013), tăng lưu lượng máu lên
não góp phần làm giảm chứng mất trí nhớ ở người lớn tuổi (Elkins et al., 2010), nâng
cao sức chịu đựng giúp luyện tập thể lực lâu hơn 16% (University of Exeter, 2009),
3

giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch (Bobek et al., 2000), ức chế sự phát triển ung thư
kết trực tràng (S. Appiah et al., 2012), ngăn ngừa các bệnh về đường hô hấp và tăng
khả năng miễn dịch (Gil et al., 1998). Vì vậy, củ dền được xem là một loại thực phẩm
có giá trị cao.

2.2. Tình hình nghiên cứu và phát triển các giống cây Beta vulgaris L.
2.2.1. Các nghiên cứu tạo callus ở cây Beta vulgaris L.
Việc tạo callus ở cây Beta vulgaris L. được được thực hiện trong nhiều nghiên
cứu sử dụng các nguồn vật liệu ban đầu khác nhau. Nguồn vật liệu được nghiên cứu
đầu tiên là mô lá thật. Greef et al. năm 1978 lần đầu tiên tiến hành nghiên cứu sự hình
thành callus từ mô lá cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Môi trường cơ bản để tạo
callus từ lá là PGo (Negrutiu et al., 1975) bổ sung 10 mg/l H3BO3 và 3% sucrose +
auxin (IAA hoặc 2,4–D) + cytokinin (kinetin hoặc BA). Sau 5 tuần nuôi trong tối, tỉ lệ
tạo callus cao nhất khi nuôi trên môi trường 1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4–D (De Greef et
al., 1978). Ghosh et al. năm 2013 cũng đã sử dụng mô lá cây củ cải đường (Beta
vulgaris L.) để tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh callus. Các mẫu lá được cắt từ
những cây con nuôi trong điều kiện in vitro. Sau đó mẫu lá sẽ được nuôi trên môi
trường để theo dõi khả năng hình thành callus là MS (Murashige and Skoog, 1968) có
bổ sung 80 ml/l nước dừa và IAA, BA với nồng độ khác nhau. Kết quả thu được hai
loại callus trên hai loại môi trường. Callus màu trắng xốp (loại I) hình thành ở môi
trường MS + 1 mg/l BA + 5 mg/l IAA. Callus màu xanh, cứng (loại II) phát triển trên
môi trường MS + 4 mg/l BA + 1 mg/l IAA (Ghosh et al., 2013). Từ đó, ta có thể kết
luận mô lá khi nuôi cấy trên các loại môi trường khác nhau sẽ cho các loại callus khác
nhau.
Việc tái sinh callus từ cuống lá ở các giống khác nhau thuộc loài củ cải đường
(Beta vulgaris L.) cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Saunders and Doley vào
năm 1986 đã kết luận các callus xuất hiện từ cuống lá sau một vài tuần khi nuôi cấy
trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA ở 31 ºC trong tối. Tỉ lệ tạo callus từ 27,8%
đến 64,8%, phụ thuộc vào các giống khác nhau (Saunders and Doley, 1986). Tetu et
al. năm 1987 cũng đã nghiên cứu sự hình thành callus từ cuống lá của cây Beta

vulgaris L. Các mẫu cấy được đặt trên môi trường MS với 2% sucrose và bổ sung các
chất điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin khác nhau. Kết quả cho thấy tỉ lệ mẫu tạo
4


callus cao nhất từ cuống lá là 84% trên môi trường MS + 1 mg/l α-NAA + 5 mg/l BA
(Tetu et al., 1987). Cuống lá cũng tạo callus thành công trên các loại môi trường khác
nhau ở cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Các cuống lá cắt từ những chồi nuôi trên
đĩa được cấy trên môi trường B5 (Gamborg et al., 1968) và 4 loại môi trường MS có
nồng độ các muối vô cơ khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường phù hợp
nhất cho sự phát triển của callus có thành phần gồm: các muối vô cơ của MS + 0,4
mg/l BA + 0,1 mg/l IAA + 10 loại vitamin + 6 loại amino acid với tỉ lệ tạo callus từ
30% - 40% tùy dòng cây (Freytag et al., 1988).
Lá mầm cũng được nghiên cứu khả năng hình thành callus trên các loại môi
trường khác nhau. Mẫu lá mầm của cây con sẽ được nuôi trên hai loại môi trường là
MS và RVIM (Freytag et al, 1988). Mỗi loại môi trường đều bổ sung 1 µg/ml BA. Dựa
vào kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mẫu tạo callus khác nhau tùy thuộc vào dòng
cây, dòng USDA 8787 cho kết quả cao ở cả hai loại môi trường với tỉ lệ tạo callus là
100% (Catlin et al., 1990).
Trụ dưới lá mầm cây củ cải đường (Beta vulgaris L.) cũng được Jacq et al.
nghiên cứu khả năng tạo callus bằng cách nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,3
mg/l BA, 0,1 mg/l α-NAA, 50 mg/l adenine, 0,5% (w/v) fructose, 0,5% (w/v) sucrose
và 0,5% (w/v) glucose để tái sinh tạo callus với tỉ lệ tạo callus từ 2,3% - 46,5% tùy
giống (Jacq et al., 1992).
Trong một số các nghiên cứu, việc so sánh khả năng tạo callus ở các nguồn vật
liệu khác nhau cũng được thực hiện. Kerns et al. (1989) đã tiến hành nghiên cứu sự
hình thành callus khác nhau giữa lá thật, cuống lá thật, trụ dưới lá mầm, lá mầm ở cây
củ cải đường (Beta vulgaris L.). Hạt giống được nuôi trong điều kiện in vitro để tạo
nguồn vật liệu ban đầu. Cây con in vitro 6 tuần tuổi được cắt lấy lá thật, cuống lá thật,
trụ dưới lá mầm, lá mầm, sau đó mẫu cấy sẽ được nuôi trên môi trường 1/2 MS hoặc

PGo có bổ sung 2,4–D và BA với nồng độ khác nhau. Sau 37 ngày, tỉ lệ mẫu tạo callus
cao nhất là từ cuống lá trên môi trường PGo + 0,05 mg/l 2,4–D + 0,1 mg/l BA (Krens
et al., 1989). Gurel et al. năm 2001 cũng đã so sánh khả năng tạo callus từ các nguồn
vật liệu khác nhau của cây Beta vulgaris L. Kết quả cho thấy lá mầm, trụ dưới lá mầm
có khả năng tạo callus cao hơn lá thật, cuống lá thật. Môi trường tối ưu cho sự hình
5


thành callus là MS bổ sung 1 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l 2,4-D. Có hai loại callus
được tạo ra là loại trắng, xốp, có các tế bào lớn (loại I) và loại callus xanh, cứng, gồm
các tế bào nhỏ hơn (loại II) (Gurel et al., 2001). Sự ảnh hưởng của ánh sáng và nồng
độ đường đến khả năng hình thành callus từ lá mầm, trụ dưới lá mầm cây củ cải đường
(Beta vulgaris L.) cũng được nghiên cứu bởi Dovzhenko and Koop. Lá mầm và trụ
dưới lá mầm được cắt từ những cây con in vitro và được nuôi trên môi trường MS + 2
mg/l BA + 30g/l sucrose và môi trường MS + 2 mg/l BA + 15 g/l sucrose nuôi trong
tối. Sau khi xuất hiện những callus nhỏ, mẫu cấy sẽ được chuyển sang môi trường MS
+ 2 mg/l BA + 15g/l sucrose (trong tối hoặc ngoài sáng). Kết quả cho thấy ánh sáng
không ảnh hưởng nhiều đến khả năng hình thành callus. Việc giảm nồng độ đường có
lợi cho sự phát triển của callus, môi trường MS + 2mg/l BA + 15 mg/l sucrose có tỉ lệ
tạo callus cao gấp 2 lần (21% - 43%) (Dovzhenko and Koop, 2003).

2.2.2. Các nghiên cứu tạo chồi từ callus ở cây Beta vulgaris L.
Khả năng tái sinh chồi từ callus ở các giống của cây củ cải đường (Beta vulgaris
L.) chịu sự ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng. Trong một số nghiên cứu đã
chỉ ra môi trường có bổ sung BA có ảnh hưởng tới khả năng tạo chồi từ callus. Kết quả
cho thấy một số giống tạo chồi từ callus ngay trên môi trường hình thành callus (MS +
1 mg/l BA) mà không cần chuyển môi trường mới. Ở một số dòng, tỉ lệ tạo chồi cao từ
15,8% đến 97,1%. Các dòng còn lại có tỉ lệ tạo chồi thấp (0% - 3,2%) khi nuôi trên
môi trường tạo callus MS + 1 mg/l BA (Saunders and Doley, 1986). Catlin et al.
(1990) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của BA trên các môi trường khác nhau đến sự

tái sinh chồi từ callus ở các dòng của cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Các callus
hình thành từ lá mầm trên môi trường MS + 1 µg/ml BA, RVIM + 1 µg/ml BA sau 4 –
6 tuần nuôi cấy sẽ xuất hiện các chồi nhỏ trên bề mặt. Những chồi này sẽ được chuyển
sang môi trường 1/4 MS + 1% sucrose để chồi phát triển. Kết quả cho thấy tỉ lệ tạo
chồi cao ở tất cả các giống khi nuôi trên môi trường RVIM + 1 µg/ml BA (Catlin et
al., 1990).
Krens et al. đã kết hợp BA với 2,4-D để nghiên cứu khả năng tạo chồi từ callus
từ cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Những chồi sẽ hình thành trực tiếp sau khi
callus phát triển trên môi trường 1/2 MS hoặc PGo có bổ sung 2,4–D và BA với nồng
6


độ khác nhau. Tuy nhiên, việc tạo chồi có tỉ lệ rất thấp, môi trường có nồng độ 2,4–D
càng cao, tỉ lệ tạo chồi càng thấp. Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung 2 mg/l BA
cho tỉ lệ chồi cao hơn các môi trường khác (1,6% - 4,6%) (Krens et al., 1989).
Năm 1987, Tetu et al. đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA
đến khả năng tạo chồi từ callus cây Beta vulgaris L. Các callus màu xanh, cứng hình
thành sau 4 tuần nuôi cấy sẽ được chuyển sang môi trường tái sinh MS + 1 mg/l αNAA + 0,5 mg/l BA. Ở môi trường này, các callus dần xốp và sau 4 - 6 tuần nuôi cấy
sẽ xuất hiện 1 đến 2 mầm chồi trên một mẫu. Những mầm này sẽ phát triển thành chồi
và callus sẽ dần hóa nâu. Callus hình thành từ môi trường MS + 1 mg/l α-NAA + 0,5
mg/l BA cho tỉ lệ tạo chồi cao nhất là 12%. Những mẫu có chồi cao 1 cm sẽ chuyển
sang môi trường nhân nhanh MS + 0,5 mg/l BA. Sau 3 tuần, 4 - 5 chồi mới được hình
thành trên môi trường này (Tetu et al., 1987).
Việc nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ hay BA kết hợp với IAA đến khả năng tạo
chồi từ callus được Gurel et al. thực hiện vào năm 2001. Callus màu trắng xốp được
nuôi trên môi trường MS chứa 2,5 mg/l TDZ hoặc 1 mg/l BA kết hợp với 0,3 mg/l
IAA, tất cả đều có hoặc không xử lí lạnh ở 4 ºC trong 2 tuần. Kết quả thu được cho
thấy chồi phát triển tốt trên môi trường 1 mg/l BA kết hợp 0,3 mg/l IAA có xử lí lạnh
ở 4 ºC trong 2 tuần (Gurel et al., 2001).

2.2.3. Các nghiên cứu tạo chồi trực tiếp ở cây Beta vulgaris L.
Trong một số đề tài, BA cũng được sử dụng nhiều trong nghiên cứu tạo chồi trực
tiếp từ lá, cuống lá của cây Beta vulgaris L. Năm 1989, Mikami et al. đã nuôi cấy
thành công các mô lá trên môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/l BA để hình thành
chồi. Sau 40 ngày, kết quả thu được tỉ lệ mẫu tạo chồi là 25%. Những mẫu lá tạo chồi
không thấy xuất hiện callus, còn các mẫu lá còn lại hình thành callus cứng, xanh mà
không tạo chồi (Mikami et al., 1989). Sự ảnh hưởng của BA và nhiệt độ tới khả năng
hình thành chồi từ cuống lá cũng được Grive et al. nghiên cứu vào năm 1997. Những
cây con in vitro 8 - 11 tuần tuổi sẽ được cắt cuống lá (1,5 cm) và nuôi trên môi trường
MS bổ sung 0; 0,25; 0,5; 1 mg/l BA ở 25ºC hoặc 30ºC. Kết quả thu được môi trường

7


MS có bổ sung 0,5 mg/l BA ở 30 ºC có tỉ lệ tạo chồi cao nhất (48,6%) (Grieve et al.,
1997).
Việc nghiên cứu ảnh hưởng của một số cytokinin như BA hay kinetin đến sự
hình thành chồi bất định từ cuống lá cây củ cải đường (Beta vulgaris L.) được thực
hiện bởi Zong et al. Trước khi cắt cuống lá từ cây in vitro, những cây này sẽ được nuôi
cấy trên môi trường MS có bổ sung BAP kết hợp với GA3 hoặc MS bổ sung kinetin, αNAA, GA3 trong 8 tuần. Sau đó, cuống lá sẽ được nuôi trên môi trường MS + 1 mg/l
BA, MS + 1 mg/l kinetin. Kết quả cho thấy cuống lá nuôi trên môi trường MS + 1 mg/l
BA cho tỉ lệ tạo chồi cao hơn MS + 1 mg/l kinetin (Zhong et al., 1993). Shawky et al.
đã nuôi cấy mẫu lá thật được cắt từ cây con in vitro trên môi trường MS bổ sung auxin
và cytokinin với nồng độ khác nhau. Mẫu lá được nhân nhanh tạo chồi trực tiếp khi
nuôi trên môi trường có bổ sung nhiều loại cytokinin khác nhau kết hợp với adenine
sulfate (AS). Kết quả cho thấy mặc dù số lượng chồi tăng nhanh trên môi trường MS +
1 mg/l BA + 50 mg/l AS nhưng chiều cao chồi cao nhất đạt 4 cm khi nuôi cấy trên môi
trường 1 mg/l kinetin + 50 mg/l AS (Shawky et al., 2008).
Một số đề tài đã nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với IAA đến khả năng
tạo chồi từ cuống lá của cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Các cuống lá của mỗi

dòng được cắt từ cây con in vitro sẽ nuôi trên năm loại môi trường khác nhau. Kết quả
cho thấy môi trường phù hợp cho sự phát triển của chồi bất định là môi trường có
thành phần gồm: các muối vô cơ của MS + 0,4 mg/l BA + 0,1 mg/l IAA + 10 loại
vitamin + 6 loại amino acid. Số chồi hình thành từ cuống lá khác nhau giữa các dòng,
một số dòng có hơn 30 chồi một mẫu, trong khi đó một số dòng thì không tạo chồi
(Freytag et al., 1988).
Ngoài ra, môi trường BA kết hợp với α-NAA cũng được nghiên cứu khả năng tạo
chồi trực tiếp từ cuống lá. Detrez et al. (1988) đã nuôi cấy in vitro cuống lá Beta
vulgaris L. để phát sinh chồi trực tiếp. Muốn tạo nguồn vật liệu ban đầu (cuống lá),
các hạt giống sẽ nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS + 3 mg/l BA + 3 mg/l α-NAA + 0,1
mg/l TIBA. Cây con được 8 ngày tuổi sẽ được cắt cuống lá và nuôi cấy trên môi
trường tạo chồi. Kết quả cho thấy tỉ lệ tái sinh tạo chồi có thể lên tới 80% khi nuôi cấy
cuống lá ở môi trường MS bổ sung 3 mg/l α-NAA và 3 mg/l BA (Detrez et al., 1988).
8


Năm 1998, cuống lá cũng được Jianfeng et al. nghiên cứu về khả năng tái sinh chồi
trực tiếp. Kết quả cho thấy các chồi sẽ hình thành từ cuống lá trong môi trường MS có
bổ sung nồng độ BA và α-NAA phù hợp. Tỉ lệ tạo chồi cao từ 18,3% - 47,5%, thay đổi
tùy kiểu gen (Jianfeng et al., 1998). Gurel et al. năm 2003 đã cải thiện môi trường tái
sinh chồi trực tiếp từ cuống lá cây củ cải đường (Beta vulgaris L.). Để tạo nguồn vật
liệu ban đầu, hạt giống được khử trùng và nuôi trong điều kiện in vitro trong 5 tuần.
Sau đó, cuống lá được tiền xử lý để tạo chồi trực tiếp khi nuôi trên môi trường MS có
bổ sung BA với nồng độ 1, 3 hoặc 5 mg/l trong 5 tuần. Những chồi được hình thành sẽ
đặt trên hai loại môi trường là: SM + 0.5 mg/l BA + 0.1 mg/l α-NAA (RGL) hoặc MS
+ 1 mg/l BA + 0.3 mg/l α-NAA (RGH). Kết quả cho thấy môi trường tiền xử lí tốt
nhất là MS + 1 mg/l BA với trung bình 0,91 chồi/mẫu. Sau khi bổ sung môi trường
RGL và RGH, số chồi trung bình ở môi trường RGL là 0,60 – 0,92 (tùy dòng cây) cao
hơn trên môi trường RGH (0,24 – 0,58 chồi/mẫu) (Gürel et al., 2003). Năm 2010,
cuống lá của dòng KWS-9103 cây củ cải đường (Beta vulgaris L.) được Yanwei et al.

sử dụng để nghiên cứu khả năng tái sinh để tạo chồi trực tiếp. Hạt giống được khử
trùng và nuôi trên môi trường MS + 0,5 mg/l BA + 0,05 mg/l α-NAA. Các cuống lá
được cắt từ cây con in vitro ở môi trường trên. Sau đó, sẽ nuôi trên môi trường tái sinh
chồi MS + 0,5 mg/l BA + 0,05 mg/l α-NAA. Kết quả thu được tỉ lệ tái sinh chồi trên
50% (Yanwei and Benchun, 2010).
Gurel et al. năm 2011 đã nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp IBA đến khả
năng tái sinh chồi từ các vật liệu khác nhau ở cây củ cải đường (Beta vulgaris L.).
Phiến lá và cuống lá được tách từ cây con in vitro được nuôi trên năm loại môi trường
tái sinh chồi khác nhau. Kết quả cho thấy cuống lá tạo từ 2,1 đến 2,7 chồi một mẫu
nhiều hơn phiến lá chỉ tạo 1,5 – 2,2 chồi một mẫu. Trong môi trường nuôi cấy, môi
trường tái sinh chồi cho kết quả tốt nhất khi bổ sung 0,25 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA
(Gurel et al., 2011).

2.2.4. Các nghiên cứu tạo rễ ở cây Beta vulgaris L.
Trong các nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh, IBA được các nhà khoa học sử
dụng rất nhiều. Năm 1989, Mikami et al. đã nghiên cứu tái sinh rễ từ những chồi hình
thành trên các mô lá. Những chồi con sau 6 tuần sẽ được chuyển sang môi trường tạo
rễ là MS bổ sung 0,2 mg/l IBA. Trên môi trường này, 13% số chồi sẽ phát triển rễ sau
14 ngày (Mikami et al., 1989). Năm 2010, Yanwei et al. đã bổ sung IBA có nồng độ
9


cao hơn để nghiên cứu sự hình thành rễ từ chồi cây củ cải đường. Các chồi hình thành
từ cuống lá sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ là MS + 2 mg/l IBA. Kết quả cho
thấy tỉ lệ ra rễ trên 90% và tỉ lệ sống sót sau khi cấy chuyển là 95% (Yanwei and
Benchun, 2010). Gurel et al. cũng đã nghiên cứu môi trường ra rễ tối ưu khi bổ sung
IBA vào môi trường nuôi cấy. Các chồi phát triển tốt từ callus sẽ được chuyển sang
môi trường tạo rễ là MS bổ sung 3 mg/l IBA. Kết quả thu được tỉ lệ hình thành rễ từ
chồi rất cao, trên 90% (Gurel et al., 2001).
Bên cạnh đó, IBA cũng được kết hợp với than hoạt tính trong môi tường nghiên

cứu tạo rễ. Catlin et al. năm 1990 đã tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh rễ từ chồi
ở các giống cây củ cải đường (Beta vulgaris L.) trên môi trường có sự kết hợp này.
Những chồi cao 2 – 3 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ là B5 + 1% sucrose +
3 µg/ml IBA + 200 µg/ml than hoạt tính. Kết quả sau 1 – 2 tuần các chồi sẽ hình thành
rễ (Catlin et al., 1990).
Freytag et al. cũng đã nghiên cứu môi trường giúp chồi ra rễ tốt nhất khi bổ sung
IAA. Chồi hình thành từ cuống lá cao khoảng 1 cm sẽ được chuyển sang đĩa môi
trường B5 với 5 mg/l IAA. Quá trình hình thành rễ từ 4 đến 6 tuần với tỉ lệ tạo rễ
khoảng 70% (Freytag et al., 1988).
Ở mội số nghiên cứu, α-NAA cũng được sử dụng trong môi trường tạo rễ của cây
của cải đường (Beta vulgaris L.). Jianfeng et al. đã tiến hành nuôi cấy các chồi phát
triển từ cuống lá để nghiên cứu khả năng hình thành rễ từ các chồi này. Kết quả thu
được rễ được tạo ra trên môi trường 1/2 MS và bổ sung nồng độ α-NAA thích hợp. Tỉ
lệ tạo rễ 80% và những cây còn sống sau khi chuyển sang môi trường mới thì tỉ lệ sống
cao, đạt 100% (Jianfeng et al., 1998). Gurel et al. năm 2003 cũng đã nghiên cứu khả
năng tạo rễ từ những chồi phát triển từ cuống lá cây củ cải đường (Beta vulgaris L.).
Những chồi cao 3 - 4 cm sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ là MS bổ sung 1 hoặc
3 mg/l α-NAA. Tỉ lệ ra rễ của chồi trên môi trường bổ sung 3 mg/l α-NAA là 21,1%
cao hơn trên trên môi trường 1 mg/l α-NAA (4,1%) (Gürel et al., 2003).
Việc so sánh kết quả khi bổ sung một trong các chất IBA, IAA hay α-NAA vào
môi trường ra rễ cũng được thực hiện. Harms et al. năm 1983 đã tiến hành nghiên cứu
khả năng tạo rễ từ các chồi bất định cây củ dền đỏ (Beta vulgaris L.) khi bổ sung IBA
hay α-NAA với nồng độ khác nhau. Các chồi phát triển từ quá trình nuôi cấy chồi đỉnh
10


sau khi có 8 – 12 lá sẽ được chuyển sang môi trường nền là 1/5 MS chứa 2 g/l sucrose
và 0,4 mg/l thiamine, có hoặc không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Kết quả cho
thấy có 77% số cây phát triển rễ sau 4 tuần trên môi trường có bổ sung 3 mg/l IBA +
0,1 mg/l GA. Trên môi trường chứa 0,5 mg/l α-NAA rễ phát triển nhanh, khỏe hơn với

tỉ lệ ra rễ là 67% (Harms, Baktir et al., 1983). Sự ảnh hưởng của nồng độ các chất điều
tiết sinh trưởng và nồng độ đường đến khả năng hình thành rễ từ các chồi bất định
cũng được Zong et al. tiến hành nghiên cứu. Những chồi phát triển từ cuống lá sau khi
cao 2 cm, có 5 - 6 lá thật sẽ được tách và chuyển sang sáu loại môi trường để so sánh
khả năng tạo rễ. Các môi trường này là MS hoặc 1/2 MS bổ sung 3% hoặc 2% sucrose,
có hoặc không thêm chất điều tiết sinh trưởng, 1 mg/l α-NAA hay 5 mg/l IBA. Kết quả
cho thấy tỉ lệ chồi tạo rễ cao nhất khi sử dụng môi trường 1/2 MS với 3% sucrose bổ
sung 1 mg/l α-NAA với tỉ lệ trên 70% (Zhong et al., 1993). Việc tái sinh tạo cây hoàn
chỉnh cây Beta vulgaris L. cũng được Shawky et al. nghiên cứu năm 2008. Sau khi lá
thật hình thành chồi, các chồi cao 3 cm sẽ được tách chuyển sang môi trường tạo rễ
MS + 0,03% than hoạt tính + IBA hoặc IAA, α-NAA với nồng độ khác nhau. Kết quả
cho thấy tỉ lệ tạo rễ cao nhất trên môi trường MS + 0,03% sucrose + 2 mg/l IBA
(85%), với số rễ trung bình là 4,60 rễ trên một cây. Tuy nhiên, chiều dài rễ trung bình
cao nhất (3,1 cm) khi nuôi trên môi trường MS + 0,03 % than hoạt tính + 2 mg/l αNAA (Shawky et al., 2008).
Các thí nghiệm ra rễ từ những chồi phát triển trên callus ở môi trường có bổ sung
IAA kết hợp với BA được Ghosh et al. nghiên cứu. Các chồi sẽ phát triển trực tiếp từ
lá hay từ callus. Những chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ là MS có bổ sung
80 mg/l nước dừa kết hợp với 2 mg/l IAA và 0,5 mg/l BA. Kết quả tỉ lệ hình thành rễ
cao trên 88% (Ghosh et al., 2013).
Việc nghiên cứu nhân nhanh in vitro các giống cây Beta vulgaris L. trên thế giới
đã được nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, loài Beta vulgaris L. rất đa dạng về giống, các
nghiên cứu chưa thể tiến hành trên tất cả các giống của một loài. Trong đó, giống cây
dủ dền Chioggia là một ví dụ. Giống cây này có nhiều đặc điểm đăc trưng nhưng chưa
có nghiên cứu nào trên giống cây này. Đó là lý do đề tài nhân nhanh in vitro cây củ
dền Chioggia ra đời.

11


PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
-

Sử dụng hạt giống cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.) có
nguồn gốc từ công ty Seed Kingdom (Mỹ) nuôi cấy in vitro để tạo vật liệu khởi
đầu.

3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
-

Lá mầm cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.) cắt từ cây con 12
- 14 ngày tuổi nuôi trong điều kiện in vitro.

-

Lá, cuống lá, đoạn thân cây củ dền Chioggia (Beta vulgaris L. var. rubra L.) cắt
từ cây 25 - 30 ngày tuổi nuôi trong điều kiện in vitro và khi có 3 - 4 lá thật.

3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
-

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm tại bộ môn Công nghệ sinh học thực
vật - khoa Công nghệ sinh học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam.

-

Thời gian nghiên cứu: 6/2017 – 1/2018.

3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật hiện hành. Sử
dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murahige and Skoog,
1962), pH môi trường 5,8, thể tích môi trường mỗi bình nuôi cấy là 30 - 35 ml. Môi
trường được khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), mỗi công thức gồm 10 mẫu
với 3 lần nhắc lại.

12


3.2.1. Giai đoạn tạo callus: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng, chất điều
tiết sinh trưởng đến khả năng tạo callus từ mô lá, cuống lá, đoạn thân
Lá mầm được cắt với kích thước 0,5 x 0,5 cm từ cây con đã nuôi trong điều kiện
in vitro có 12 – 14 ngày tuổi. Các mô lá, cuống lá, đoạn thân từ cây đã nuôi trong điều
kiện in vitro và 25 - 30 ngày cũng được cắt với kích thước 0,5 x 0,5 cm tuổi. Sau đó,
mẫu lá mầm được chuyển sang môi trường có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l 2,4 – D và
nuôi trong tối hay ngoài sáng theo công thức khác nhau. Với mẫu lá thật, cuống lá,
đoạn thân được chuyển sang môi trường có bổ sung BA và 2,4-D với nồng độ khác
nhau để xác định khả năng tái sinh tạo callus từ mô lá, cuống lá, đoạn thân. Sau đó, kết
quả được theo dõi từ tuần 2 đến tuần 5, sử dụng số liệu tuần thứ 5 để xử lý. Giai đoạn
này gồm 4 thí nghiệm sau:
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tạo callus từ lá
mầm
Môi trường nuôi cấy:
MS + 1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4 – D + 3% sucrose + 0,7% agar pH 5,8
Công thức
CT1

CT2

CT3

Thời gian chiếu sáng
Đặt mẫu trong tối hoàn toàn sau 5 tuần theo dõi kết quả.
Đặt mẫu trong tối 3 tuần, sau đó nuôi ngoài sáng 2 tuần với
quang chu kì 16h/ ngày.
Đặt mẫu ngoài sáng với quang chu kì 16h/ ngày sau 5 tuần
theo dõi kết quả.

13


Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh
callus từ lá thật
Môi trường nền: MS + 3% sucrose + 0,7% agar pH 5,8
Nồng độ

Nồng độ

BA (mg/l)

2,4 – D (mg/l)

CT1

1

0

CT2

1

0,5

CT3

1

1

CT4

1

1,5

CT5

1

2

Công thức

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự phát sinh
callus từ cuống lá
Môi trường nền: MS + 3% sucrose + 0,7% agar pH 5,8
Nồng độ

Nồng độ

BA (mg/l)

2,4 – D (mg/l)

CT1

1

0

CT2

1

0,5

CT3

1

1

CT4

1

1,5

CT5

1

2

Công thức

14


Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA tới sự tái sinh
callus từ đoạn thân
Môi trường nền: MS + 3% sucrose + 0,7% agar pH 5,8
Nồng độ

Nồng độ

BA (mg/l)

2,4 – D (mg/l)

CT1

1

0

CT2

1

0,5

CT3

1

1

CT4

1

1,5

CT5

1

2

Công thức

3.2.2. Giai đoạn tạo chồi: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh
trưởng đến khả năng tạo chồi
Đối với thí nghiệm tạo chồi trực tiếp: mô lá thật, cuống lá, đoạn thân mang mắt
ngủ được cắt với kích thước 0,5 - 1 cm từ cây củ dền nuôi trong điều kiện in vitro 25 30 ngày tuổi. Sau đó, mẫu lá, cuống lá, đoạn thân mang mắt ngủ được nuôi trong môi
trường tạo chồi có bổ sung BA, IBA với nồng độ khác nhau.

 Theo dõi kết quả mỗi tuần một lần, thu số liệu ở tuần thứ 5 để xử lý.
Đối với thí nghiệm tạo chồi từ callus: callus được hình thành từ cuống lá trên môi
trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 0,5 mg/l 2,4-D sau 4 - 8 tuần được chuyển sang môi
trường ra chồi có bổ sung các chất điểu tiết sinh trưởng như BA + α-NAA với nồng độ
khác nhau để xác định môi trường tối ưu nhân nhanh chồi.
 Số liệu được ghi lại để xử lý sau 5 tuần nuôi cấy.
Môi trường nền: MS + 3% sucrose + 0,7% agar pH 5,8.
Giai đoạn này gồm 3 thí nghiệm sau:

15


Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với α-NAA đến khả năng
tái sinh chồi từ callus
Nồng độ

Nồng độ

BA (mg/l)

α-NAA (mg/l)

CT1 ( ĐC)

0

0

CT2

0,5

0

CT3

0,5

0,1

CT4

1

0

CT5

1

0,1

CT6

1,5

0

CT7

1,5

0,1

Công thức

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với IBA đến khả năng tạo
chồi từ lá thật, cuống lá
Nồng độ

Nồng độ

IBA (mg/l)

BA (mg/l)

CT1 (ĐC)

0

0

CT2

0,1

0,25

CT3

0,1

0,5

CT4

0,1

1

Công thức

16


Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tạo chồi từ đoạn thân
mang mắt ngủ
Nồng độ

Công thức

BA (mg/l)
CT1 (ĐC)

0

CT2

0,125

CT3

0,25

CT4

0,5

CT5

1

3.2.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (tạo rễ): Nghiên cứu ảnh hưởng của chất
điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo rễ
Các chồi cao 1 - 3 cm hình thành từ đoạn thân mang mắt ngủ được chuyển vào
môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường nền có bổ sung
IBA với nồng độ khác nhau. Môi trường nền có thành phần gồm: MS + 30 g/l sucrose
+ 0,7% agar pH 5,8.
 Ghi lại kết quả để xử lý số liệu sau 5 tuần nuôi cấy.

17