NGHIÊN CứU NHÂN NHANH IN VITRO CÂY DƯA HấU (CITRULLUS LANATUS)

Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2010: Tp 8, s 3: 418 - 425 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI


418

NGHIÊN CứU NHÂN NHANH
IN VITRO
CÂY DƯA HấU
(CITRULLUS LANATUS)
Study on Micropropagation of Citrullus Lanatus

Nguyn Th Phng Tho
1
, Ninh Th Tho
1
, V Th H
2
1
Khoa Cụng ngh sinh hc, Trng i hc Nụng nghip H Ni
2
Vin Cõy lng thc v Cõy thc phm
a ch email tỏc gi liờn h:
Ngy gi ng: 04.03.2010; Ngy chp nhn: 16.03.2010
TểM TT
Nghiờn cu tin hnh nhm xõy dng mt quy trỡnh nhõn nhanh in vitro n gin v hiu qu t
chi nh v lỏ mm cõy da hu (Citrullus lanatus). Sau khi gieo 7 - 14 ngy trờn mụi trng MS, ht
da hu ny mm, chi nh v lỏ mm c chuyn sang nuụi cy trờn mụi trng MS cú cha BA v
kinetin cỏc nng khỏc nhau (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 v 2,0 mg/l) trong 4 tun. Phn gn cung lỏ mm cú
kh nng to chi cao hn phn ngn lỏ, t 25% mu t
o chi v 1,3 chi/mu trờn mụi trng b sung
0,5 mg/l BA. H s nhõn chi t chi nh t cao nht (15,5 chi/mu) trờn mụi trng cha 1 mg/l BA.

Cỏc chi cú chiu cao 2 - 5 cm c s dng ra r in vitro. T l chi ra r (100%) v s r/chi (18,4)
t c cao nht trờn mụi trng cha 0,5 mg/l - NAA. Cỏc cõy in vitro hon chnh c a ra
vn m trờn giỏ th cỏt v tru hun vi t l
1:1 (v/v), t l cõy sng sút l 80 - 90%.
T khoỏ: BA, Citrullus lanatus, da hu, kinetin, nhõn ging vụ tớnh in vitro, - NAA.
SUMMARY
This study was conducted in order to establish a simple and effective protocol for rapid
propagation of watermelon (Citrullus lanatus). Cotyledon and shoot tip explants excised from 7 - 14
day old seedlings were cultured on solidified MS media containing different concentration of BA at
0,0; 0,5; 1,0; 1,5 & 2,0 mg/l and kinetin at 0,0; 0,5; 1,0; 1,5 & 2,0 mg/l for 4 weeks. The proximal region
of cotyledon has higher organogenesis ability than the distal region. The rate of regenarated shoots
from proximal segments was 25% and 1.3 shoots/explant on MS medium supplemented with 0.5 mg/l
BA. The optimal medium for shoot proliferation from shoot tips was MS contained 1.0 mg/l BA. On this
medium, the highest rate of shoot propagation was 15.5 shoots/explant after 4 weeks. Adding 0.5 mg/l
- NAA in MS medium promoted the root induction of the shoots with the rooting rate of 100% and
18.4 roots/shoot. Rooted plants were acclimatised in 1:1 (v/v) sand: rice husk substrate and the
frequency of survival was 80 - 90%.
Key words: BA, Citrullus lanatus, kinetin, micropropagation, watermelon, - NAA.
1. ĐặT VấN Đề
Da hấu (Citrullus lanatus) l cây có
hm lợng các chất dinh dỡng v giá trị
kinh tế cao. Lợng đờng tổng số trong thịt
quả da dấu dao động từ 5 - 10%, lợng kali
khoảng 0,22%, natri 0,016%, canxi 0,022%.
Đặc biệt da hấu chứa hm lợng vitamin A,
C rất cao, nhiều hơn 40% so với trong quả c
chua. Mặc dù có giá trị dinh dỡng cũng nh
giá trị kinh tế cao, nhng tình hình sản xuất
da hấu hiện nay ở nớc ta vẫn còn hạn chế
về diện tích trồng v năng suất, cha đáp

ứng đợc nhu cầu của thị trờng. Nguyên
nhân dẫn đến tình trạng trên l do da hấu
bị rất nhiều loại bệnh gây hại ảnh hởng đến
sản xuất v chất lợng da. Ngoi ra, việc
cung cấp giống không chủ động khiến các
giống da thơng mại trên thị trờng hiện
nay hầu hết đều l các giống lai F1 nhập từ
nớc ngoi, lm tăng chi phí sản xuất.
Nghiờn cu nhõn nhanh in vitro cõy da hu (Citrullus lanatus)
419
Do vậy một quy trình nhân nhanh in
vitro cây da hấu hon chỉnh sẽ có ý nghĩa
vô cùng quan trọng trong công tác nhân v
chọn tạo giống da hấu. Đây l công cụ đắc
lực để nhân nhanh nguồn vật liệu khởi đầu,
góp phần chủ động cung cấp nguồn giống có
chất lợng cao, sạch bệnh, đồng đều với số
lợng lớn cho sản xuất trên quy mô lớn. Hơn
nữa, nó còn l cơ sở để áp dụng các kỹ thuật
của công nghệ sinh học trong chọn tạo giống
da hấu nh phơng pháp chuyển gen,
phơng pháp gây đột biến in vitro,
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu
xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây
da hấu (Srivastava v cs., 1989; Compton
& Gray, 1993). Quy trình ny gồm 3 giai
đoạn (Dong & Jia, 1991): giai đoạn tái sinh
tạo chồi từ chồi đỉnh, sử dụng môi trờng có
chứa cytokinin (Compton & Gray, 1993); giai
đoạn nhân nhanh các chồi thu đợc trên môi

trờng có nồng độ cytokinin thấp (Dong &
Jia, 1991); v giai đoạn ra rễ, sử dụng môi
trờng có chứa auxin (Compton & Gray,
1994; Dabauza v cs., 1997). Tuy nhiên, ở
Việt Nam phơng pháp nhân giống in vitro
cây da hấu cha đợc quan tâm nghiên cứu
nhiều. Nghiên cứu ny đợc thực hiện với
mục đích xây dựng quy trình nhân nhanh in
vitro cây da hấu thông qua chồi đỉnh v lá
mầm lm cơ sở cho việc nhân nhanh nguồn
vật liệu khởi đầu v
áp dụng trong công tác
chọn tạo giống da hấu bằng các kỹ thuật
của công nghệ sinh học.
2. VậT LIệU V PHƯƠNG PHáP
NGHIÊN CứU
2.1. Đối tợng v vật liệu nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu l giống da hấu
Hắc Mỹ Nhân VL54. Đây l một giống lai
F1, hạt mu đen nâu, quả di, sọc vằn xanh
đậm, ruột đỏ, chất lợng tốt. Giống ny đang
đợc trồng phổ biến ở một số tỉnh thuộc vùng
đồng bằng sông Hồng v rất đợc ngời dân
a chuộng.
Vật liệu nghiên cứu: Hạt giống có nguồn
gốc từ Thái Lan.
2.2. Phơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phơng pháp xử lý v khử trùng hạt
Hạt da hấu đợc khử trùng bề mặt v
ngâm trong nớc sạch 1 giờ. Hạt đợc bóc vỏ

trớc khi đa vo khử trùng trong buồng cấy
vô trùng. Sau đó ngâm phôi hạt trong các
dung dịch khử trùng (NaClO, HgCl
2
) với
nồng độ v thời gian thích hợp. Rửa lại phôi
hạt 3 lần bằng nớc cất vô trùng v cấy vo
môi trờng MS. Hạt nảy mầm sau 7-14
ngy, các lá mầm v chồi đỉnh tạo ra đợc sử
dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Phơng pháp cắt v nuôi cấy lá mầm
Trớc hết dùng dao sắc cắt 2 lá mầm ra
khỏi cây con. Sau đó cắt viền xung quanh lá,
khía nhẹ bề mặt lá v cắt lá mầm thnh 4
phần chia đôi theo chiều ngang v chiều dọc
lá sẽ đợc 2 phần ngọn lá v 2 phần gần
cuống lá. Cấy các phần ny vo môi trờng
có chứa BA v kinetin ở các nồng độ khác
nhau (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 v 2,0 mg/l) để cảm
ứng tạo chồi.
2.2.3. Phơng pháp tách v nuôi cấy chồi đỉnh
Sau khi cắt lá mầm v phần thân giả
phía dới chỉ để lại thân giả di 1 - 1,5 cm, đó
chính l chồi đỉnh. Chồi đỉnh sẽ đợc cấy vo
môi trờng chứa BA để nhân nhanh chồi.
2.2.4. Tiêu chuẩn chồi để ra rễ in vitro
Các chồi thu đợc từ nuôi cấy lá mầm v
nhân nhanh chồi đỉnh cao 2 - 5 cm, thân
mập, lá xanh tốt sẽ đợc chuyển qua môi
trờng ra rễ chứa -NAA v than hoạt tính.

Tất cả các thí nghiệm đều sử dụng môi
trờng cơ bản MS bổ sung 30g/l saccarose,
6,5g/l agar v các chất điều tiết sinh trởng,
pH môi trờng đợc chỉnh về 5,7 trớc khi
đợc hấp vô trùng ở 121
0
C, 1,5 atm trong 20
phút. Quá trình nuôi cấy đợc tiến hnh ở
nhiệt độ 242
0
C, cờng độ ánh sáng 2000lux,
thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngy.
Nguyn Th Phng Tho, Ninh Th Tho, V Th H


420
Các thí nghiệm đợc bố trí hon ton
ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần,
mỗi lần 21 mẫu.
Các chỉ tiêu theo dõi định kỳ 5 - 7 ngy/
lần tuỳ từng thí nghiệm, bao gồm tỷ lệ hạt
sạch (%), tỷ lệ hạt nảy mầm (%), tỷ lệ hạt
hình thnh cây hon chỉnh (%), tỷ lệ mẫu tạo
chồi (%), số chồi/ mẫu (chồi), hệ số nhân chồi
(chồi/mẫu), chiều cao chồi (cm), tỷ lệ ra rễ (%),
số rễ trung bình (rễ), chiều di rễ (cm).
Các số liệu thu đợc đợc xử lý bằng
chơng trình thống kê sinh học IRRISTAT
5.0 v Excel.
3. KếT QUả V THảO LUậN

3.1. ảnh hởng của chế độ khử trùng
đến tỷ lệ hạt nảy mầm
Có thể thấy, NaOCl v HgCl
2
đều cho
hiệu quả khử trùng hạt da hấu cao, cho tỷ
lệ hạt sạch dao động từ 76,9% đến 100%. Khi
khử trùng bằng HgCl
2
0,1% trong 20 phút, tỷ
lệ hạt sạch đạt cao nhất (100%), nhng chỉ
có 75,7% hạt nảy mầm v chỉ 35% hạt nảy
mầm hình thnh cây hon chỉnh. Trong khi
đó, đây l 2 chỉ tiêu có ý nghĩa nhất trong
việc tạo vật liệu khởi đầu. Do vậy trong 4 chế
độ khử trùng, nghiên cứu ny lựa chọn chế
độ khử trùng bằng NaClO 1% trong 20 phút
khi có tới 90,5% hạt sạch nảy mầm v tạo
cây hon chỉnh, đạt chất lợng tốt phục vụ
cho các thí nghiệm tiếp theo (Bảng 1).
3.2. Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi
bất định từ lá mầm
Với mục đích nhân nhanh để tạo ra một
số lợng lớn chồi, ngoi chồi đỉnh, nghiên
cứu đã sử dụng lá mầm để cảm ứng tạo chồi
nhằm tận dụng nguồn vật liệu sẵn có.
Quan sát mẫu cấy cho thấy, sau 1 tuần
nuôi cấy mẫu bắt đầu phồng to, dy ra do có
sự hấp thụ nớc. Sau 1 tuần nuôi cấy, callus
v những cấu trúc tròn nhỏ, xuất hiện đều

trên mép lá. Sau 2 tuần thì chồi bắt đầu
hình thnh từ các cấu trúc tròn nhỏ m
không phải từ callus v sau 3 - 4 tuần cụm
chồi hình thnh. Nh vậy các cấu trúc tròn
nhỏ chính l các thể tiền chồi. Tỷ lệ mẫu tạo
callus dao động từ 95,8 - 100%, kích thớc
các callus tăng mạnh từ tuần thứ hai trở đi
v phần lớn l callus vng, xốp v bở.
Kết quả ở bảng 1 cho thấy, BA có ảnh
hởng quyết định đến sự tạo chồi từ lá mầm.
Khi không bổ sung BA vo môi trờng nuôi
cấy, mặc dù 100% mẫu lá vẫn xanh nhng
lại không có mẫu no phản ứng tạo chồi v
callus. ảnh hởng của BA đến sự tạo chồi
của phần gần cuống lá v phần ngọn lá mầm
l hon ton khác nhau. Đối với mẫu cấy l
phần gần cuống lá mầm, tỷ lệ mẫu tạo chồi
dao động từ 12,5 - 15%, trong khi đó gần nh
không có sự sai khác về số chồi/mẫu v chiều
cao chồi giữa các công thức. Với mục đích
nhân nhanh, tạo ra số chồi lớn thì nồng độ
0,5 mg/l BA l thích hợp hơn cả để cảm ứng
tạo chồi từ phần gần cuống lá mầm, với 25%
mẫu tạo chồi v đạt 1,3 chồi/mẫu. Trên phần
ngọn lá mầm, BA cũng có ảnh hởng với xu
hớng tơng tự. Tỷ lệ mẫu tạo chồi đạt cao
nhất (12,5%) trên môi trờng có chứa 2 mg/l
BA. ở nồng độ 1,5 mg/l BA, 100% mẫu ngọn
lá mầm tạo callus m không tạo chồi. Điều
ny có thể giải thích do khi bổ sung BA ở

nồng độ 1,5 mg/l lm cho tỷ lệ giữa cytokinin
v auxin (nội sinh v ngoại sinh) đạt mức
cân bằng thích hợp cho việc tạo callus.
ảnh hởng của BA đến sự phát sinh chồi
bất định từ lá mầm cây da hấu đã đợc
chứng minh ở nhiều nghiên cứu trớc đó.
Han v cs., (2004) cho rằng, BA l nhân tố
quan trọng nhất quyết định đến sự hình
thnh chồi bất định từ lá mầm họ bầu bí.
Kết luận tơng tự cũng đợc Sarowa v cs.,
(2003) đa ra sau khi lm thí nghiệm trên
giống da hấu Cucurbita. Vedat Pirinc v
cs., (2003) cảm ứng tạo chồi từ lá mầm
Citrullus lanatus cv. "Surme trên môi
trờng bổ sung BA v kinetin thì số
chồi/mẫu cấy tạo ra trên môi tr
ờng chứa BA
cao gấp 1,5 lần so với trên môi trờng chứa
Kinetin. Trong nghiên cứu của Tarek v cs.,
(2008) trên hai giống da hấu nhị bội
SA100 v SA101, số chồi/mẫu thu đợc cao
nhất (5 chồi) từ lá mầm trên môi trờng
chứa 10 M BA.
Nghiờn cu nhõn nhanh in vitro cõy da hu (Citrullus lanatus)
421
Bảng 1. ảnh hởng của chế độ khử trùng đến tỷ lệ hạt nảy mầm
Cht kh trựng
Nng
(%)
Thi gian

kh trựng
(phỳt)
T l
ht sch
(%)
T l
ht ny mm
(%)
T l ht hỡnh thnh
cõy hon chnh
(%)
Chiu cao
cõy
(cm)
Javen (NaClO) 1 20 95,1 90,5 100,0 4,1
Javen (NaClO) 3 10 76,9 85,6 95,0 3,9
HgCl
2
0,1 10 95,7 80,0 55,0 2,2
HgCl
2
0,1 20 100,0 75,7 35,0 1,7
CV (%) 5,8
LSD
0,05
0,3
Chỳ thớch: + Cõy hon chnh l cõy cú thõn gi v nh sinh trng vn cao, lỏ mm tri, cú mu xanh.
+ Cõy khụng hon chnh l cõy ch hỡnh thnh 2 lỏ mm mộo mú, lỏ mu xanh vng, thõn gi v nh
sinh trng khụng phỏt trin, cõy khụng cú r.
Bảng 2. ảnh hởng của BA tới sự phát sinh chồi bất định từ phần gần cuống lá mầm

v phần ngọn lá mầm sau 4 tuần nuôi cấy
Loi mu
BA
(ppm)
T l mu to callus
(%)
T l mu to chi
(%)
S chi/mu
(chi)
Chiu cao chi
(cm)
0 0,0 0,0 - -
0,5 100,0 25,0 1,3 2,5
1,0 95,8 25,0 1,2 3,0
1,5 100,0 12,5 1,3 2,5
Phn gn cung lỏ mm
2,0 100,0 16,7 1,2 2,0
0 0,0 0,0 - -
0,5 100,0 4,2 1,0 2,3
1,0 95,8 8,3 1,0 2,8
1,5 100,0 0,0 - -
Phn ngn lỏ mm
2,0 100,0 12,5 1,0 2,0

Nh đã trình by ở trên, khả năng tạo
chồi bất định của lá mầm da hấu có sự khác
nhau giữa phần ngọn v phần gần cuống lá
trên cùng một lá. Bảng 2 v hình 1 sẽ cho
thấy rõ điều ny hơn.

Trong quá trình nuôi cấy, chúng tôi
nhận thấy, ở phần ngọn lá có ít cấu trúc tròn
nhỏ (thể tiền chồi) xuất hiện v xuất hiện
chậm hơn so với phần gần cuống lá. Điều
ny chứng tỏ, tuy trên cùng một lá nhng ở
những vị trí khác nhau có thể cho những
phản ứng khác nhau trên cùng một môi
trờng v điều kiện nuôi cấy. Đối với phần
ngọn lá mầm chỉ 6,3% mẫu tạo chồi v đạt
0,8 chồi/mẫu. Trong khi đó, phần gần cuống
lá cho tỷ lệ mẫu tạo chồi cao hơn gấp 3 lần
(19,8%) v số chồi/mẫu cao hơn 1,5 lần (1,3
chồi/mẫu).
Theo kết quả nghiên cứu của Choi v cs.
(1994); Compton (2000); Ananthakrishman
v cs. (2003), các tế bo khả biến cho sự hình
thnh chồi bất định ở lá mầm họ bầu bí
thờng tập trung ở một vùng nhất định. Đối
với da hấu, các tế bo ny tập trung chủ
yếu ở phần gần cuống lá mầm (Compton &
Gray, 1993), do vậy hầu hết các chồi bất
định đều hình thnh ở phần gần cuống lá
(Compton, 2000). Maria Graziela Zagatto
Krug v cs. (2003) đã chứng minh sự tạo chồi
bất định của mẫu lá giống da hấu Crimson
Sweet từ phần gần cuống lá cao hơn từ phần
ngọn lá rất nhiều.
Qua kết quả thí nghiệm trên, có thể kết
luận rằng sự phát sinh chồi da hấu từ lá l
rất phân cực, chồi phát sinh chủ yếu từ phần

gần cuống lá.
Nguyn Th Phng Tho, Ninh Th Tho, V Th H


422







Hình 1. Sự phát sinh chồi bất định từ phần gần cuống lá mầm trên môi trờng MS +
0,5 mg/l BA (a) v từ phần ngọn lá mầm trên môi trờng MS + 2 mg/l BA (b)
sau 4 tuần nuôi cấy
3.3. Sự nhân chồi từ chồi đỉnh
Kết quả về ảnh hởng của BA tới sự
nhân nhanh chồi từ chồi đỉnh da hấu sau 4
tuần nuôi cấy đợc thể hiện trong bảng 3.
Sự có mặt của BA trong môi trờng nuôi
cấy đã lm tăng tỷ lệ mẫu tạo chồi v hệ số
nhân chồi. Tất cả các công thức có bổ sung
BA đều cho tỷ lệ mẫu bật chồi l 100%, trong
khi tỷ lệ ny ở công thức đối chứng l 90%.
Quan trọng hơn cả l BA đã lm tăng đáng
kể hệ số nhân chồi v chất lợng chồi. Trên
môi trờng MS, hệ số nhân chỉ đạt đợc 3,8
chồi/mẫu, các chồi tạo ra mảnh v quá cao,
không thuận lợi cho quá trình nhân về sau.
Trên môi trờng chứa BA, hệ số nhân dao

động từ 6,4 - 15,5 chồi/mẫu (cao hơn đối
chứng từ 1,7 4,1 lần). Các chồi tạo ra phát
triển mạnh, chồi mập v cao vừa phải, có
mu xanh tự nhiên, đáp ứng đợc yêu cầu
chất lợng cho quá trình nhân nhanh cũng
nh tạo cây in vitro hon chỉnh. Trong các
công thức trên, công thức bổ sung 1mg/l BA
cho hiệu quả nhân nhanh cao nhất, với hệ số
nhân 15,5 chồi/mẫu.
Bên cạnh BA, kinetin cũng l một
cytokinin đợc sử dụng khá phổ biến để nhân
nhanh chồi da hấu (Michael v cs., 1993;
Vedat v cs., 2003) (Bảng 4).
Kinetin cũng có tác dụng nhân nhanh
chồi, tuy nhiên sự sai khác giữa các công
thức l không rõ rng. Hệ số nhân chồi đạt
đợc cao nhất trên môi trờng chứa 1 mg/l
(5,4 chồi/mẫu). Hệ số ny thấp hơn 3 lần so
với hệ số đạt đợc khi sử dụng BA để nhân
nhanh (15,5 chồi/mẫu). Do vậy môi trờng
chứa 1 mg/l BA l môi trờng nhân nhanh
thích hợp nhất đối với chồi đỉnh da hấu.
Kết quả m nghiên cứu ny thu đợc
cũng hon ton phù hợp với kết quả của các
nghiên cứu trớc đó. Năm 1993, Michael v
cs., sử dụng BA, kinetin v TDZ để cảm ứng
nhân nhanh chồi từ chồi đỉnh một số giống
da hấu nhị bội v tứ bội. Hệ số nhân đạt
đợc cao nhất ở nồng độ 1M BA, hệ số ny
dao động từ 2,7 - 11,7 chồi/mẫu sau 4 tuần

nuôi cấy tùy thuộc vo từng giống. Mặt
khác, hệ số nhân ở nồng độ 1M BA cao gấp
1,5 - 2,8 lần so với công thức chứa kinetin
v TDZ tốt nhất. Theo kết quả của Tarek v
cs. (2008), hệ số nhân từ chồi đỉnh của 2
giống da hấu nhị bội SA100 v SA101 đạt
đợc cao nhất khi bổ sung vo môi trờng
10uM BA (đối với giống SA100) v 4,4uM
BA (giống SA101) với hệ số nhân đạt đợc
lần lợt l 28 v 23 chồi/mẫu sau 3 tuần
nuôi cấy.
a)
b)