Phân lập và định danh một số chỉ tiêu vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm tại viện Pasteur TP. HCM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỈ TIÊU
VI SINH VẬT THƯỜNG GẶP TRONG THỰC
PHẨM TẠI VIỆN PASTEUR TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD : ThS. Nguyễn Thị Nguyệt
SVTH : Hồ Thị Quyên
MSSV : 1453010283
Khóa : 2014-2018

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong cuộc sống, có lẽ chúng ta không thể làm tốt mọi việc nếu thiếu đi sự quan
tâm, giúp đỡ từ người khác và chính vì điều đó em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
ThS. Nguyễn Thị Nguyệt, người chị, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp
đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực tập tốt nghiệp. Em xin chân thành gửi
lời cảm ơn đến các anh, chị trong phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để em có cơ hội học hỏi, trao dồi thêm kiến thức chuyên môn lẫn kinh
nghiệm sống.
Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học
Mở Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu

trong suốt 4 năm đại học vừa qua để cho chúng em có những hành trang vững chắc và
đủ tự tin khi rời khỏi ghế nhà trường.
Cảm ơn những bạn bè đã cùng em thực tập tại phòng thí nghiệm Vi sinh Nước Thực phẩm, Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cùng em trải
qua những lúc khó khăn nhất trong khi thực hiện đề tài.
Cuối cùng con/em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, đặc biệt là
cha mẹ, anh chị, cùng những người thân yêu khác đã luôn ủng hộ, khích lệ và tạo cho
em động lực vượt qua những khó khăn, trở ngại.
Do thời gian làm đề tài thực tập có hạn, không thể tránh khỏi những thiếu sót về
nội dung và trình bày. Kính mong nhận được sự thông cảm và góp ý từ quý thầy cô để
em có thể rút ra được nhiều bài học quý báu cho mình.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày... tháng 01 năm 2018

Hồ Thị Quyên

i


MỤC LỤC






DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT



VSATTP : Vệ sinh An toàn Thực phẩm



VSV

: Vi sinh vật



CFU

: Colony Forming Unit



MPN

: Most probable number



ISO : International Orgazation for Standardization



TCVS

: Tiêu chuẩn vi sinh



QCVN

: Quy chuẩn Việt Nam



PCA

: Plate count agar



EP : Nước muối sinh lí (0,9%)



HEK

: Hektoen Enteric Agar



XLD

: Xylose Lysine Dexycholate Agar



KMTTn

: Muller - Kaufman Tetrathionate - Novobiocin



RVS

: Rappaport Vasillia



KIA: Kligler Iron Agar



TLS: Lactose Tryptone Lautyl Sulphate Broth



EC : Escherichia coli broth



TSC



BP : Baird Parked Agar



BHI: Brain heart infusion broth



TSVSVHK



Sal : Salmonella spp



E. coli



S. aureus : Staphylococcus aureus

Broth

 C. perfringens

: Tryptone Sulfide Cycloserine Agar

: Tổng số vi sinh vật hiếu khí

: Escherichia coli

: Clostridium perfringens

ii






DANH MỤC CÁC BẢNG







iii






Sơ đồ



Biểu đồ

DANH MỤC SƠ ĐỒ/BIỂU ĐỒ








iv




DANH MỤC HÌNH ẢNH





v


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018

 ĐẶT VẤN ĐỀ


Nhu cầu thực phẩm luôn là thiết yếu nhất đối với con người, thế nhưng

khi đời sống ngày một tăng lên thì các vấn đề ăn uống lại không còn được đảm bảo

bởi tình trạng ngộ độc thực phẩm và mắc các bệnh có liên quan đến sử dụng thực
phẩm.


Trên thế giới, theo trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ

(CDC) ước tính hằng năm có khoảng 48 triệu người mắc bệnh, 128.000 người nhập
viện và 3.000 người tử vong do các bệnh liên quan đến thực phẩm mỗi năm tại Hoa
Kỳ. Một trong các nguyên nhân được xác định được là do vi sinh vật gây ra [16].


Ở nước ta, theo ghi nhận của Bộ Y tế số vụ ngộ độc thực phẩm trong năm

2017 giảm nhưng số trường hợp tử vong lại tăng gấp đôi. Cụ thể, trong năm cả nước
ghi nhận 139 vụ ngộ độc thực phẩm với 3.869 người mắc, giảm 27 vụ và 438 người
mắc so với năm 2016. Số người tử vong do ngộ độc thực phẩm là 24 người, tăng 12
người so với năm 2016 [15].


Đáng chú ý, trên địa bàn các tỉnh phía Nam của nước ta tình hình

ngộ độc thực phẩm gần đây cũng đang diễn biến hết sức phức tạp. Cụ thể vào ngày
17/03/2017, trung tâm Y tế huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang đã tiếp nhận trường
hợp nhập viện do ngộ độc thực phẩm sau khi uống sữa được phát tại trường của 50 học
sinh trường tiểu học Kim Sơn trong tình trạng đau bụng, nôn mửa và sốt cao [13]. Vào
ngày 01/07/2017, xảy ra một vụ ngộ độc thực phẩm tại Công Ty TNHH An Giang
Samho làm cho hơn 500 công nhân bị buồn nôn, đau bụng, tiêu chảy và khó thở phải
nhập viện điều trị khẩn cấp, nguyên nhân xác định là do đặt phải thức ăn tại các cơ sở
nấu nướng bên ngoài không đảm bảo điều kiện VSATTP [14].


Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn tới ngộ độc thực phẩm nhưng

phần lớn các trường hợp là có nguồn gốc từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi sinh vật
gây bệnh hay độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật này [5]. Đáng chú ý trong năm 2017,

SVTH: Hồ Thị Quyên

8


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
khi tiến hành kiểm tra trên gần 10.000 mẫu thực phẩm tại các chợ, các cơ sở giết mổ
thì tỷ lệ vi phạm chỉ tiêu vi sinh chiếm tới 26,7% số mẫu được kiểm tra tăng cao so
với mức



9,35% của năm 2016 [15]. Bởi vì vậy, kiểm soát vi sinh là một yêu cầu tất yếu

đối với bất cứ một sản phẩm thực phẩm nào, các chỉ tiêu vi sinh được kiểm nghiệm
chủ yếu là tổng số vi sinh vật hiếu khí, Salmonella, Clostridium perfringens,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus...


Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số chỉ tiêu vi sinh

vật thường gặp trong thực phẩm tại Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh” để đánh giá
mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong một số nhóm thực phẩm, thống kê tỷ lệ nhiễm của
từng loại vi sinh vật, đồng thời so sánh cùng với các nghiên cứu trước đây để từ đó có

cái nhìn đúng hơn về tình trạng VSATTP hiện nay, cung cấp thêm những kiến thức
giúp người tiêu dùng có sự lựa chọn thông thái để bảo vệ sức khỏe cho bản thân, gia
đình và cộng đồng.

SVTH: Hồ Thị Quyên

9


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018





CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VIỆN PASTEUR TP. HỒ CHÍ MINH


1.1.1. Lịch sử hình thành



Năm 1891,Viện Pasteur Sài Gòn (nay là Viện Pasteur Tp. Hồ Chí

Minh) đã được thành lập dựa theo ý tưởng của nhà khoa học vĩ đại Louis Pasteur
và đây cũng là chi nhánh nước ngoài đầu tiên trên thế giới của Viện Pasteur Paris.


Người được giao cho nhiệm vụ thành lập, tổ chức và điều hành viện

đầu tiên là Albert Calmette, một trong những học trò của Louis Pasteur. Ông đã
khởi đầu sự nghiệp với đầy rẫy khó khăn về vật chất, kỹ thuật, từ việc tiếp nhận
một phòng thí nghiệm đơn sơ tại Viện Quân y Grall, đến việc trung chuyển những
dụng cụ chuyên môn, hóa chất từ Pháp sang Việt Nam và sau đó là đào tạo những
nhân viên kỹ thuật đầu tiên để từng bước triển khai công việc. Với khối óc và sự
chăm chỉ của mình, ông đã hoàn thành một khối lượng công việc đồ sộ như xây
dựng cơ sở, cải tiến kỹ thuật, làm một số xét nghiệm chẩn đoán bệnh và sản xuất
được vắc xin đậu mùa, vắc xin chống bệnh dại, nghiên cứu về bệnh lý nhiệt đới,
làm men rượu, sản xuất huyết thanh chống nọc độc rắn hổ mang... Năm 1893, ông
bị bệnh nặng phải về nước, nhưng ông đã mở đường và đặt sự nghiệp Pasteur trên
một nền tảng vững chắc tại Viện Pasteur Sài Gòn. Một thời gian sau, cơ sở đầu tiên
ở Grall quá nhỏ hẹp nên Viện đã được đầu tư xây dựng cơ sở mới ở vị trí hiện nay.


Từ 1905, Viện được đưa vào hệ thống quản lý chung do viện Pasteur

Paris phụ trách. Năm 1918, Nol Bernard được giao nhiệm vụ mở rộng hoạt động
của các phòng cơ sở ở Viện và hiện nay viện trưởng đương nhiệm của viện là PGS.
TS. BS. Phan Trọng Lân.


Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cố gắng hoạt động theo quan điểm y

học dự phòng thông qua các biện pháp chủ động phòng chống để đem lại hiệu quả

SVTH: Hồ Thị Quyên

10

Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
cao và ít tốn kém nhất trong khống chế bệnh tật và bảo vệ sức khỏe cộng đồng
[19].



Hình 1.1. Viện Pasteur Tp. HCM ngày nay

 1.1.2. Chức năng, nhiệm vụ

 Chức năng:

Nghiên cứu khoa học, chỉ đạo chuyên môn tuyến trước, phòng chống

dịch, đào tạo cán bộ chuyên ngành về vi sinh y học, miễn dịch, dịch tễ học, đề xuất với
Bộ Y tế các biện pháp phòng chống dịch bệnh phù hợp với điều kiện phát triển kinh tế
xã hội của các tỉnh khu vực Miền Nam.
 Nhiệm vụ:

- Nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu vi sinh, miễn dịch, dịch tễ học, sinh

học phân tử, các bệnh nhiễm trùng, nghiên cứu vắc xin...

- Chỉ đạo tuyến: Chỉ đạo phòng chống các bệnh dịch nguy hiểm (như tả,
thương hàn, sốt xuất huyết, dịch hạch, viêm não), chỉ đạo thực hiện một số chương
trình mục tiêu quốc gia triển khai ở khu vực phía Nam (như Phòng chống sốt xuất
huyết, Giám sát HIV/AIDS, Tiêm chủng mở rộng).


- Ðào tạo: Ðào tạo tiến sĩ chuyên ngành vi sinh y học, đào tạo nâng cao
kỹ thuật, nghiệp vụ chuyên môn cho cán bộ về các chuyên ngành vi sinh, miễn dịch,
dịch tễ và y học dự phòng.

SVTH: Hồ Thị Quyên

11


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018



- Giáo dục truyền thông: Phối hợp với các cơ quan truyền thông đại

chúng, các bộ, ban ngành của địa phương để tiến hành công tác truyền thông giáo dục
sức khoẻ nhân dân về các bệnh truyền nhiễm gây dịch và các biện pháp phòng chống.

- Hợp tác quốc tế: Nhằm phục vụ việc phát triển các công tác nghiên cứu
khoa học và đào tạo cán bộ chuyên môn.


1.1.3. Thành tựu đạt được



Đây là nơi phát hiện trường hợp nhiễm HIV đầu tiên ở Việt Nam (năm

1990 tại Phòng thí nghiệm HIV) cùng với các phòng thí nghiệm polio, sởi, dengue xuất
huyết, cúm, kháng thuốc... đã góp phần thanh toán dịch bại liệt, loại trừ uốn ván sơ

sinh, khống chế thành công đại dịch SARS, cúm A/H5N1, phòng chống sốt xuất huyết
dengue, chống bệnh tay-chân-miệng do enterovirus và đẩy lùi dịch hạch.


Bước đầu thực hiện thành công nhiệm vụ chỉ đạo giám sát phòng chống

dịch bệnh, thực hiện các chương trình mục tiêu quốc gia, các hoạt động về y tế công
cộng và chỉ đạo đẩy lùi, khống chế các bệnh nhiễm trùng, đưa Việt Nam trở thành một
điểm sáng về y tế dự phòng ở trong khu vực và trên thế giới. Viện đã thực hiện nhiều
đề tài cấp nhà nước, cấp bộ, nhiều đề tài hợp tác quốc tế và đã được đưa vào ứng dụng.
Trong hội chợ Khoa học Công nghệ do Bộ Khoa học Công nghệ và Ủy ban Nhân dân
Tp. Hồ Chí Minh tổ chức, Viện đã được nhận cúp vàng hội chợ TechMart.


Viện Pasteur Tp. HCM còn là đơn vị y tế dự phòng đầu tiên của cả nước

đưa tư duy kinh tế tri thức vào hoạt động thường xuyên của Viện bằng việc thực hiện
các dịch vụ sinh y học kỹ thuật với gần 300 xét nghiệm các loại cho người, thực phẩm,
nước, sản phẩm công nghiệp, một số phòng thí nghiệm dịch vụ tại viện đạt tiêu chuẩn
ISO 17025. Hằng năm, viện sản xuất hàng triệu liều vắc xin BCG phục vụ chương
trình “Tiêm chủng mở rộng” ở trẻ em, viện còn sản xuất các loại vắc xin và sinh phẩm
chẩn đoán sốt xuất huyết, viêm não, lepto, các bệnh đường ruột, phát hiện afetoprotein…


Từ lâu, viện đã là trung tâm huấn luyện, đào tạo thực hành về y tế dự

phòng cho khu vực phía Nam. Hằng năm, có mấy chục khóa huấn luyện về dịch tễ, vi

SVTH: Hồ Thị Quyên

12


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
sinh, miễn dịch, sinh học phân tử… cho các cán bộ y tế dự phòng các tuyến. Nơi đây
còn là cơ sở thực hành làm luận văn, luận án cho sinh viên, cán bộ của các trường Đại
học trong khu vực và cho cả cán bộ ở các viện, trường quốc tế.

SVTH: Hồ Thị Quyên

13


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
 Sơ đồ 1.1. Sơ đồ tổ chức chung của Viện Pasteur Tp. HCM

BAN GIÁM ĐỐC
HỘI ĐỒNG KHOA HỌC

CÁC PHÒNG CHỨC NĂNG

CÁC KHOA CHUYÊN MÔN

ĐƠN VỊ TRỰC THUỘC

Phòng tổ chức cán bộKhoa kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh

Phòng hành chánh quản trị

Khoa vi sinh miễn dịch

Phòng tài chính kế toán Khoa sản xuất Vacxin và sinh phẩm

Phòng vật tư

Khoa kiểm định vacxin và sinh phẩm y tế

Phòng kế hoạch tổng hợp
Khoa động vật và côn trùng y học

Khoa xét nghiệm sinh học lâm sàng



1.1.4. Giới thiệu phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm

SVTH: Hồ Thị Quyên

14

Trung tâm đào tạo


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018



Vào tháng 12/1990, phòng Vi sinh Nước - Thực phẩm thuộc “Khoa Xét

nghiệm Sinh học Lâm sàng” ra đời nhờ dự án hợp tác giữa Viện Pasteur Paris và Viện

Pasteur Tp. Hồ Chí Minh. Nội dung dự án là xây dựng một trung tâm xét nghiệm sinh
học lâm sàng lấy tên là LAM. 91 (Laboratoire’d Analyses Medicales). Nhiều thiết bị,
máy móc, dụng cụ chuyên môn, tạp chí, tài liệu khoa học đã được chuyển sang từ
Pháp, hàng loạt cán bộ của viện được đào tạo trong và ngoài nước dưới sự giúp đỡ của
các chuyên gia Pháp. Dự án LAM. 91 mang lại nhiều kết quả thiết thực, trực tiếp giải
quyết được một phần nhu cầu khám chữa bệnh của nhân dân và mang lại nguồn thu
đáng kể cho Viện trang trải vào các hoạt động nghiên cứu.


Khoa Xét nghiệm Sinh học Lâm sàng nói chung và Phòng vi sinh Nước -

Thực phẩm nói riêng đảm nhiệm công tác kiểm nghiệm: phân lập và định danh vi
khuẩn chỉ điểm vệ sinh và vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm, nước và mỹ phẩm.
Phương pháp thử nghiệm áp dụng theo TCVN - Bô Y tế, ISO và AFNOR. Phòng cũng
đã đưa các kỹ thuật sinh học phân tử vào chuẩn đoán phát hiện nhanh một số vi khuẩn
có thời gian nuôi cấy lâu và vi khuân khó phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền
thống, đáp ứng được yêu cầu của khách hàng.


 Nước - Thực phẩm
Hình 1.2. Phòng vi sinh

SVTH: Hồ Thị Quyên

15


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018



1.2. PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH, KIỂM NGHIỆM
VSV


2.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật



Còn gọi là phương pháp tạo khuẩn lạc đơn, đây là quá trình tách riêng

các loài vi sinh vật từ quần xã ban đầu và đưa về dạng thuần khiết để khảo sát và định
loại, vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban
đầu. Hầu hết các phương pháp phân lập đều được dựa trên một số kỹ thuật như: cấy ria,
cấy trang hoặc đổ đĩa... kết hợp với nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường chọn lọc
nhằm ưu tiên sự phát triển của một loại vi sinh vật quan tâm.


Kỹ thuật cấy ria là phương pháp phân lập hữu hiệu và dễ thực hiện nhất,

hỗn hợp vi sinh vật được ria trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri sao cho các tế
bào riêng biệt được tách nhau ra và tạo được khuẩn lạc đơn.


Kỹ thuật cấy trang và đổ đĩa là pha loãng dịch chứa vi sinh vật thành các

mức độ pha loãng khác nhau (bậc 10) và chuyển chúng vào môi trường nuôi cấy nhờ
trải đều dịch khuẩn lên bề mặt môi trường rắn (cấy trang) hoặc đổ môi trường đã đun
chảy vào đĩa petri đã có sẵn dịch mẫu (đổ đĩa).

SVTH: Hồ Thị Quyên

16


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
 Bảng 1.1. So sánh kỹ thuật cấy trang và đổ đĩa


 Cấy trang

 Ư

 - Định lượng được vi
sinh vật nhạy nhiệt.

u
đi
ể
m

 Đổ đĩa
 - Cấy được thể tích mẫu lớn.

 - Nhận dạng được dạng
khuẩn lạc đặc trưng.

 - Phù hợp với các vi sinh vật
cần dinh dưỡng tiếp xúc từ
nhiều phía.

 - Dễ làm thuần vi sinh
vật.

 - Đếm được mật độ vi sinh vật
cao (150 - 300 khuẩn lạc).

 - Cấy được thể tích mẫu

 - Không định lượng được

 N
h
ư

nhỏ.

những vi sinh vật nhạy nhiệt.

ợc

 - Chỉ cho phép đếm

 - Khó làm thuần một dòng vi

đi

được số lượng khuẩn lạc

sinh vật và khó xác định được

ể

thấp.

hình dạng khuẩn lạc điển hình.

m

SVTH: Hồ Thị Quyên

17


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018



2.2.2. Phương pháp định danh vi sinh vật



Sau khi thu được các khuẩn lạc đơn, thuần khiết bằng kỹ thuật phân lập

trên các môi trường chọn lọc, chủng thuần là yêu cầu cần cho việc định danh vi sinh
vật. Việc định danh này được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là
các phản ứng sinh hóa được thực hiện do chính vi sinh vật.
Có nhiều cách để định danh vi sinh vật như: định danh theo phương pháp



truyền thống (sau bước phân lập chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm gram đánh giá hình
thái, thực hiện các thử nghiệm sinh hóa), sử dụng bộ Kit (giống như phương pháp
truyền thống chỉ khác thử nghiệm sinh hóa được thay thế bằng Kit thương mại) và
dùng các thiết bị định danh hiện đại.
2.2.2.1. Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng



 Thử nghiệm Indol
 Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có khả năng oxy hóa Tryptophan trong môi

trường (nhờ có enzyme Tryptophanase) thành các dạng của Indol. Nhân pyrol
của indol phản ứng với gốc aldehyde của Para-dimethylamino-benzaldehyd
(DMABA) trong thuốc thử Kovacs qua 2 giai đoạn tạo thành phức chất dạng
Quinine có màu đỏ.


Vi khuẩn

L-Tryptophan (Môi trường)
H2O

+

Indole

+ Pyruvic acid+ NH3

Tryptophanase

Indole

+

Kovacs

RED COLOR

 Môi trường và thuốc thử


Môi trường: canh Tryptone

SVTH: Hồ Thị Quyên

18


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018



Thuốc thử: Kovacs

 Thực hiện: Cấy sinh khối vi sinh vật vào môi trường canh Tryptone, ủ ở

44ºC/24h-48h, sau đó nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovac’s vào mỗi ống nghiệm.
Quan sát sự đổi màu.
 Kết quả


Indol (+): lớp trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ.



Indol (-): lớp trên bề mặt môi trường có màu vàng chanh của thuốc thử.




Hình 1.3. Kết quả thử nghiệm Indol

 Thử nghiệm Coaglase
 Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có sinh Coagulase, coagulase có tác dụng làm

ngưng kết các thành phần của huyết tương tạo thành các khối đông huyết tương.

SVTH: Hồ Thị Quyên

19


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018


Fibrinogen
(Huyết tương)

Coagulase

Fibrin
(Khối đông tụ huyết tương)

 Môi trường và thuốc thử: Bộ thử Staphytect - Plus
 Thực hiện: Lần lượt nhỏ một giọt thuốc thử chứa huyết tương và một giọt thuốc

thử không chứa huyết tương (dùng làm chứng âm) lên phiếu phản ứng có sẵn
trong bộ thử (có thể thay thế bằng lam kính). Lấy sinh khối vi khuẩn khếch đều
lên hai giọt thuốc thử rồi quan sát xem có hay không hiện tượng đông tụ.
 Kết quả


Dương tính: có sự đông tụ với giọt thuốc thử chứa huyết tương và không

có sự đông tụ với giọt thuốc thử không chứa huyết tương.


Âm tính: không có sự đông tụ ở giọt thuốc thử chứa huyết tương hoặc có

sự đông tụ ở giọt thuốc thử không chứa huyết tương (giọt chứng âm).


 Hình 1.4. Kết quả thử nghiệm Coagulase
 Thử nghiệm Urease

SVTH: Hồ Thị Quyên

20

Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
 Nguyên tắc: Phát hiên vi sinh vật có sinh Urease, có khả năng phân giải Urea

thành ammonia (NH3) và CO2 làm kiềm hóa môi trường và có thể theo dõi thông
qua sự đổi màu của chất chỉ thị Phenol red.


(NH2)2CO +
(Urea)

Urease

2H2O

2NH3 + CO2 +

H2O

Phenol red

 Môi trường và thuốc thử:



Urea Broth và Chiristensen Urea (thạch nghiêng)
Chỉ thị màu Phenol red, pH 7,2

 Thực hiện: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi trường rồi ủ 37ºC/24h. Đọc kết quả.
 Kết quả


Urea (+): môi trường trở nên đục, từ màu vàng chuyển sang màu hồng.



Urea (-): môi trường không đổi màu.




Hình 1.5. Kết quả thử nghiệm Urease

 Thử nghiệm KIA

SVTH: Hồ Thị Quyên

21


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
 Nguyên tắc: Xác định đồng thời khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate khác

nhau (glucose và lactose) của vi sinh vật nhận biết nhờ sự thay pH môi trường
dẫn đến đổi màu chất chỉ thị phenol red. Đồng thời, xác định cả khả năng sinh
hydrogen sulfide (H2S) và khả năng sinh hơi.
 Bảng 1.2. Khả năng sử dụng nguồn Cacbon ở vi sinh vật
 Không
 Trườ

 Sử dụng Lactose và

 Sử dụng Glucose

ng

Glucose

hợp

dùng
cả
Gluco
se và
Lactos
e
 GĐ1:
không

GĐ1: Glucose (0,1%) → CO2


 Mặt

nghiê
ng
(hiếu
khí)

(ít)

+ H2O + ATP

 GĐ1: Lactose (1%)→

Glucose
 Glucose (0,1%)→ CO2



NH3 (nhiều)

 GĐ2: VSV đủ năng

được

tới pepton (nuôi cấy quá

pepton trong điều kiện hiếu
khí)

sử
dụng

lượng không cần dùng

 ( VSV chỉ sử dụng được

không

+ H2O+ ATP

(ít)

 GĐ2: Pepton (dị hóa)→

có do

đường
 GĐ2:

24h VSV sẽ sử dụng

Pepto

pepton gây sai kết quả)

n→
NH3
(kiềm)

 Mặt

 GĐ1: Glucose (lên men kị

 GĐ1: Glucose→ acid

sâu
(kị
khí)
 Kết

khí)
 → acid hữu cơ + ATP
 GĐ2: Không có

hữu cơ
 GĐ2: Không có do
không dùng pepton
 Vàng/ Vàng



SVTH: Hồ Thị Quyên

Đỏ / Vàng

22

 Khôn

g có
 Đỏ /


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018

quả
•

Đỏ

Khả năng sinh hydrogen sulfide (H2S):
VI KHUẨN (Thiosulfate reductase)
Sodium thiosulfate (môi trường)

+

H2S

•

+

Fe 2+
(ferric ammonium citrate)

H2S ↑
FeS↓ (màu đen)

Khả năng sinh hơi:


Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí thì sẽ kết tụ thành bọt khí trong

ống nghiệm hay làm vỡ thạch.
 Môi trường và thuốc thử:


Kligler Iron Agar (KIA): chứa 0,1% glucose, 1% lactose



Chất chỉ thị pH: phenol red

 Thực hiện: Cấy ria sinh khối vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng sau đó

cấy đâm sâu vào ống nghiệm nhưng tránh chạm vào đáy ống. Ủ 37º C trong 18 24h.


Hình 1.6. Kết quả thử nghiệm KIA
SVTH: Hồ Thị Quyên

23


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018
 Thử nghiệm Lysine
 Nguyên tắc:
 Phát hiện các vi khuẩn sinh Decarboxylase, xúc tác phản ứng phân cắt

nhóm carboxyl (-COOH) ở một số acide amin, tạo thành amine hoặc diamine và
CO2 làm kiềm hóa môi trường và làm chỉ thị màu Bromocresol purple (5,2 vàng
-6,8 tím) vẫn giữ màu tím.
 Trong các enzyme decarboxylase, có Lysine decarboxylase (LDC) giúp

vi khuẩn sử dụng lysine (acide amin) có trong môi trường như một nguồn carbon,
tạo CO2 làm pH tăng, vẫn giữ màu tím ở môi trường.


khuẩn
R-CH-NH2-COOH (Amino Vi

acid)
Decarboxylase

R-CH2-NH2 (amine)
+ CO2
hoặc 2HN-R-NH2 (diamine)

Kiềm hóa (Chỉ thị Bromocresol pu
L- Lysine

Vi khuẩn

Cadaverine (diamine) CO2
+
Lysine decarboxylase

 Môi trường thuốc thử:


Môi trường Lysine Decarboxylase Broth.



Chỉ thị pH: Bromocresol purple.

 Thực hiện: Cấy sinh khối vi khuẩn vào môi

trường, sau đó ủ 37ºC/24h.
 Kết quả:

SVTH: Hồ Thị Quyên

24


Báo cáo thực tập tốt nghiệp năm học 2017-2018

Dương tính: vẫn giữ màu tím (sinh
 cadaverine)
Âm tính: chuyển màu vàng sáng,
trong (chỉ glucose được lên men)
Hình 1.7. Kết quả thử nghiệm Lysine

SVTH: Hồ Thị Quyên

25