Nghiên cứu sự biểu hiện một số OXA β lactamase của acinetobacter baumannii kháng carbapenem phân lập ở khu vực đông nam bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN TUẤN ANH

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN MỘT SỐ OXA
β-lactamase CỦA Acinetobacter baumannii
KHÁNG CARBAPENEM PHÂN LẬP Ở KHU
VỰC ĐÔNG NAM BỘ

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018


Công trình được hoàn thành tại: Công ty TNHH CNSH Khoa
Thương; Bộ môn Di truyền - Đại học Khoa học Tự nhiên,
ĐHQG-HCM; Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford
(OUCRU) – Bệnh viện Bệnh nhiệt đới TP. HCM
Người hướng dẫn khoa học:
1. HDC: PGS. TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương
2. HDP: TS. BS. Nguyễn Văn Vĩnh Châu

Phản biện 1: PGS. TS. Trần Cát Đông
Phản biện 2: TS. Lê Thị Thúy Ái
Phản biện 3: TS. Đặng Thanh Dũng
Phản biện độc lập 1: TS. Nguyễn Đình Thắng
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Thanh Thùy Nhiên

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào tạo
họp tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
vào hồi …… giờ …… ngày …… tháng …… năm 2018
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM
2. Thư viện trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHCM


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn bệnh viện là một thách thức trong lĩnh vực chăm sóc sức
khỏe trên thế giới. Nhiều vi khuẩn có khả năng là nguyên nhân gây nhiễm
khuẩn bệnh viện và ngày càng có nhiều báo cáo về tình trạng kháng thuốc
của các vi khuẩn này. Hiện nay, vi khuẩn Acinetobacter baumannii, do khả
năng kháng với nhiều loại kháng sinh, là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh
viện hàng đầu và là một thách thức lớn cho lĩnh vực y tế toàn cầu. Đối với
Thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng, vi khuẩn Acinetobacter
baumannii được xem như là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến
với nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem của vi khuẩn này ở
mức cao. Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự biểu hiện một số OXA
β-lactamase của Acinetobacter baumannii kháng carbapenem phân lập ở
khu vực Đông Nam Bộ” với những mục tiêu sau:
Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu nhằm tìm hiểu cơ chế kháng carbapenem liên quan đến
sự biểu hiện của một số gene blaOXA có hoạt tính carbapenemase ở một
số chủng A. baumannii lâm sàng thu thập ở khu vực Đông Nam Bộ.
Mục tiêu cụ thể
1. Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng A.
baumannii lâm sàng thu thập từ 3 bệnh viện ở khu vực Đông Nam
Bộ trong khoảng thời gian 2012-2014.

2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng A. baumannii lâm
sàng cũng như sự hiện diện của một số gene blaOXA phổ biến ở vi
khuẩn này.
3. Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ biểu hiện gene blaOXA và tính
kháng imipenem ở một số chủng A. baumannii lâm sàng.

1


Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình kháng kháng sinh hiện nay
1.1.1. Trên thế giới
Tại Hoa Kỳ, tỉ lệ A. baumannii kháng carbapenem đã tăng hơn gấp đôi
qua 6 năm: từ 20,6% năm 2002 lên 49,2% năm 2008 (Hình 1.1). Trong đó
91,2% chủng A. baumannii kháng carbapenem. Ở các nước Châu Âu khác,
tỷ lệ kháng cao nhất được tìm thấy ở Hy Lạp với tỷ lệ A. baumannii kháng
carbapenem lên đến 90% tại một số đơn vị chăm sóc đặc biệt. Năm 2015,
báo cáo nghiên cứu tại Ý cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem đã lên tới 100%.
Châu Mỹ la tinh là một trong những khu vực có tỷ lệ Acinetobacter
baumannii
kháng
với
meropenem,
imipenem,
ceftazidime,
piperacillin/tazobactam, ciprofloxacin hay gentamicin cao nhất thế giới.
Không có quốc gia nào là không xuất hiện các chủng đa kháng. Tại
Australia, ghi nhận sự gia tăng đáng kể tỷ lệ kháng của A. baumannii trước
(27%) và sau tháng 4 năm 2003 (≥ 75%). Tại châu Á, nghiên cứu dịch tễ

học lâm sàng tại các đơn vị chăm sóc đặc biệt ở Ấn Độ cho thấy tỷ lệ A.
baumannii đa kháng đa thuốc là 92%, vượt xa hai đối tượng còn lại là P.
aeruginosa (35%) và E. coli (5%). Ở Đài Loan, A. baumannii là một trong
những tác nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn bệnh viện. Trong đó, tỷ lệ
kháng carbapenem của A. baumannii lên tới 62,5%. Năm 2012, một báo
cáo nghiên cứu khác được thực hiện trên 5 quốc gia khu vực Châu Á –
Thái Bình Dương cho thấy có đến 3 quốc gia có tỷ lệ A. baumannii kháng
carbapenem rất cao, trong đó có Thái Lan (76,3%), Singapore (90,5%) và
Việt Nam (89,5%).
1.1.2. Ở Việt Nam
Các nghiên cứu của Việt Nam về A. baumannii cũng cho thấy kết quả
tương tự so với thế giới về sự phát triển tính kháng và mức độ kháng kháng
sinh. Các kết quả nghiên cứu các năm gần đây đều cho thấy tỷ lệ kháng
carbapenem của A. baumannii cao, từ 80-90% chủng khảo sát.

2


1.2. Nhóm kháng sinh β-lactam
Nhóm kháng sinh β-lactam chiếm khoảng 50% kháng sinh được sử
dụng khắp thế giới, là một trong những nhóm kháng sinh quan trọng nhất
trong việc chống nhiễm khuẩn ở người.
1.2.1. Lịch sử hình thành và phát triển
Penicillin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm β-lactam được phát hiện.
Cephalosporin C là kháng sinh cephalosporin đầu tiên được phát hiện.
Kháng sinh β-lactam đầu tiên được bán tổng hợp là ampicillin. Gần đây
nhất là carbapenem và những kháng sinh β-lactam đơn vòng như
monobactam. Tuy nhiên, số lượng kháng sinh mới được cấp phép đưa vào
sử dụng ngày càng ít đi theo thời gian (Hình 1.2). Ngược lại, ngày càng có
nhiều báo cáo về tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn.

1.2.2. Phân loại
Ngày nay, kháng sinh nhóm β-lactam được phân thành 4 nhóm lớn là
penicillin, cephalosporin, monobactam và carbapenem (Bảng 1.1).
1.2.3. Cơ chế tác động
Nhóm kháng sinh β-lactam hoạt động nhằm kìm hãm sự tổng hợp vách
tế bào vi khuẩn.
1.2.4. Đôi nét về kháng sinh carbapenem
Kháng sinh carbapenem có cấu trúc tương tự như penicillin nhưng
nguyên tố lưu huỳnh được thay bằng nguyên tố cacbon (Hình 1.4).
Carbapenem hoạt động theo cơ chế giống như các β-lactam khác. Yếu tố
ưu việt trong tính kháng khuẩn hiệu quả của carbapenem là khả năng gắn
với nhiều PBP khác nhau.
1.3. Hệ enzyme β-lactamase
Có hơn 1000 loại β-lactamase ở vi khuẩn Gram (-). Sản xuất βlactamase là cơ chế kháng kháng sinh chủ yếu ở vi khuẩn. Các enzyme này
thường tập trung ở vùng chu chất, phân hủy kháng sinh β-lactam, ngăn cản
kháng sinh tiếp cận với PBP. Hệ thống phân loại Ambler chia β-lactamase
thành 4 lớp, đặt tên từ A đến D, dựa trên sự tương đồng về trình tự amino
acid.

3


1.3.1. β-lactamase lớp A
β-lactamase lớp A là những serine carbapenemase, có khả năng
giảm sự nhạy cảm của vi khuẩn với tất cả các β-lactam bao gồm penicillin,
cephalosporin, monobactam, cefamycin, ceftazidime, imipenem,
meropenem, ertapenem, cefotaxime và aztreonam.
1.3.2. β-lactamase lớp B
Các β-lactamase lớp B là những metallo-β-lactamase (MBL), có
khả năng ly giải gần như tất cả các kháng sinh nhóm β-lactam ngoại trừ

monobactam và không bị ức chế bởi clavulanic acid, tazobactam và
sulbactam.
1.3.3. β-lactamase lớp C
β-lactamase lớp C, như AmpC β-lactamase có thể có hoạt tính
carbapenemase. Khi AmpC β-lactamase kết hợp với sự giảm nhạy cảm vì
mất porin và hoạt động của bơm đẩy (efflux bump), tính kháng đặc biệt gia
tăng đến mức có ý nghĩa lâm sàng.
1.3.4. β-lactamase lớp D
Nhóm β-lactamase lớp D còn được gọi là oxacillinase (blaOXA).
Chúng có hoạt tính kháng yếu với carbapenem, nhưng biểu hiện gene
blaOXA carbapenemase có thể gia tăng bởi những nhân tố điều hòa biểu
hiện gene ở vùng thượng nguồn.
1.4. Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii hiện diện phổ biến trên toàn cầu và trở
thành một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện,
liên quan đến khả năng kháng nhiều loại kháng sinh. Carbapenem được
xem như là loại thuốc nằm trong phác đồ “cứu vãn” khi điều trị A.
baumannii đa kháng thuốc. Tuy nhiên, tỷ lệ kháng gia tăng đối với
carbapenem ở vi khuẩn A. baumannii đã được báo cáo trên thế giới.
1.4.1. Phân loại, mô tả và tầm quan trọng
Acinetobacter baumannii là vi khuẩn Gram (-) cơ hội, không lên
men đường, thường tìm thấy trong đất và nước, có thể hiện diện trên da
người khỏe mạnh, đặc biệt là ở các nhân viên y tế. Có nhiều loại
Acinetobacter và tất cả chúng đều có khả năng gây bệnh cho người, trong
đó A. baumannii gây nên hơn 80% trường hợp nhiễm. A. baumannii nguy
4


hiểm ở chỗ nó có khả năng kháng lại tất cả các loại kháng sinh hiện nay
như β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem), tetracycline,

aminoglycoside, fluoroquinolone.
1.4.2. Bộ gene của Acinetobacter baumannii
A. baumannii AYE có kích thước bộ gene 3.9 Mb, chứa một “đảo
kháng thuốc” (resistance island) dài 86 kb, là vùng “đảo” lớn nhất phát
hiện từ trước tới nay, chứa 45 gene kháng thuốc liên quan đến nhiều lớp
kháng sinh khác nhau và những gene khác liên quan đến tính ổn định của
bộ gene như integrase, transposase và các trình tự chèn. Điều này cho thấy
tính linh động của vùng “đảo kháng thuốc” và khả năng tiếp thu nhanh
chóng các gene kháng mới ở chủng A. baumannii AYE.
1.4.3. Cơ chế kháng kháng sinh ở Acinetobacter baumannii
Biến đổi kháng sinh như sản xuất enzyme β-lactamase: A.
baumannii có khả năng tiết β-lactamase để kháng lại các kháng sinh nhóm
β-lactam, đặc biệt là các oxacillinase hay OXA carbapenemase.
Carbapenemase là nhóm enzyme β-lactamase quan trọng ở A. baumannii,
giúp chúng trở thành những chủng đa kháng kháng sinh mở rộng (extended
drug resistance, XDR). Sự biểu hiện vượt mức của gene blaOXA liên quan
đến sự hiện diện của trình tự gắn chèn (insertion sequence, IS) và ở các
gene blaOXA khác nhau sẽ phổ biến các trình tự chèn khác nhau. Và các
cơ chế khác như cơ chế tiếp thu gene kháng mới, thay đổi tính thấm của
màng, bơm đẩy kháng sinh, đột biến điểm, biến đổi màng tế bào.
Giữa các cơ chế kháng giúp A. baumannii kháng đa thuốc hoặc đa
thuốc mở rộng thì cơ chế sản xuất enzyme β-lactamase là cơ chế quan
trọng nhất. Trong đó, oxacillinase (OXA) luôn hiện diện ở A. baumannii
và là cơ chế kháng carbapenem phổ biến nhất ở vi khuẩn này. Vì thế,
đây cũng chính là đối tượng nghiên cứu của chúng tôi.
1.4.4. Xu hướng nghiên cứu hiện nay trên thế giới về Acinetobacter
baumannii liên quan đến đề tài
Các nghiên cứu trên thế giới hiện nay có liên quan đến đề tài về A.
baumannii tập trung vào một số hướng điển hình như nghiên cứu dịch tễ
học phân tử các chủng A. baumannii đa kháng thuốc và cơ chế kháng thuốc

của chúng, liên quan đến vai trò của các trình tự chèn trong quá trình điều
hòa biểu hiện của các blaOXA, vai trò của bơm đẩy kháng sinh, …
5


Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1.

Chủng vi khuẩn
Chủng A. baumannii ATCC 19606 và 163 chủng A. baumannii lâm
sàng (Phụ lục 2).

2.1.2.

Môi trường nuôi cấy
Môi trường Luria-Bertani (LB), môi trường Nutrient Agar (NA), môi
trường Mueller-Hinton (MH) Agar.

2.1.3.

Mồi và mẫu dò
Mồi và mẫu dò cho phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu được
trình bày ở Bảng 2.1.
2.1.4.

Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị, dụng cụ và vật liệu tiêu hao dùng trong nghiên cứu phổ
biến trong các phòng thí nghiệm sinh hóa, vi sinh và sinh học phẩn tử.

2.1.5.

Hóa chất
Hóa chất chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: PCR và real-time
PCR, hóa chất điện di, hóa chất giải trình tự gene, hóa chất điện di mao
quản và phân tích đoạn, hóa chất tách chiết protein, hóa chất định lượng
protein, hóa chất định hoạt tính enzyme β-lactamase, que thử E-test cho
kháng sinh imipenem, oxacillin, ...

2.2. Phương pháp
2.2.1.

Phương pháp thu mẫu, bảo quản và tăng sinh vi khuẩn
Thu mẫu: Tổng cộng 163 chủng Acinetobacter baumannii đã được
phân lập từ bệnh phẩm của 3 bệnh viện khu vực phía nam trong khoảng
thời gian 2012 đến 2014 bao gồm bệnh viện Đại học Y Dược (ĐHYD),
bệnh viện Đồng Nai (ĐN) và bệnh viện Thống Nhất Đồng Nai (TNĐN).

6


Bảo quản: Khuẩn lạc đơn được bảo quản trong môi trường LB có
30% glycerol ở -80oC.
Tăng sinh: Khuẩn lạc đơn A. baumannii được chuyển vào ống
nghiệm chứa 5 mL môi trường LB lỏng đã khử trùng, nuôi cấy lắc tăng
sinh ở 37oC, 120 rpm đến khi mật độ đạt 4 đơn vị McFarland chuẩn
(McFarland standard) để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.

Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số

kháng sinh sử dụng
Nồng độ ức chế tối thiểu của imipenem (MICimp) được xác định bằng
phương pháp E-test (bioMerieux) cho tất cả các chủng A. baumannii
nghiên cứu. Chủng A. baumannii có MICimp ≥ 8 μg/mL được xem là chủng
kháng và ≤ 2 μg/mL được xem là nhạy với imipenem (CLSI, 2014).

2.2.3.

Phương pháp tách chiết DNA
DNA bộ gene của A. baumannii được tách chiết theo nguyên tắc hấp
phụ đặc hiệu lên pha rắn (màng silica). Chất lượng DNA tách chiết được
được đánh giá dựa trên tỷ số OD260/280 và được pha loãng tới nồng độ 25
ng/μL cho tất cả các mẫu trước khi tiến hành các phản ứng PCR.

2.2.4.

Các phương pháp PCR
Phương pháp real-time PCR phát hiện các gene blaOXA: Các cặp
mồi đặc hiệu cho từng gene blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51,
blaOXA-58 và 16S rRNA (Bảng 2.1) được thiết kế và đánh giá. Hỗn hợp
và chương trình cho phản ứng multiplex real-time PCR sử dụng mẫu dò
Taq-Man được tối ưu hóa để phát hiện blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA58 và 16S rRNA.
Phương pháp PCR xác định sự hiện diện và vị trí một số trình tự
chèn: Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR đặc hiệu với các trình tự
chèn được trình bày ở Bảng 2.1. Đồng thời, vị trí các trình tự chèn (nếu có)
sẽ được xác định tương đối so với gene blaOXA bằng cách dựng bản đồ
sản phẩm PCR (PCR mapping)
Phương pháp duplex real-time PCR: cho phép nhân bản đồng thời
cDNA gene mục tiêu (blaOXA-23, blaOXA-51 hoặc blaOXA-58) và gene
đối chứng (16S rRNA) trong một phản ứng duy nhất sử dụng 2 bộ

mồi/mẫu dò đặc hiệu cho mỗi tác nhân đích, không có sự cạnh tranh (ức
chế lẫn nhau) giữa các bộ mồi/mẫu dò. Mức độ biểu hiện tương đối của
7


các gene blaOXA-23/-51/-58 được tính toán dựa trên sự biểu hiện của
gene 16S rRNA bằng phương pháp 2-ΔΔCt.
2.2.5.

Phương pháp giải trình tự gene
Phương pháp giải trình tự gene được sử dụng để khẳng định trình tự
các gene blaOXA đang nghiên cứu, vị trí thượng nguồn của các trình tự
chèn hiện diện so với gene blaOXA tương ứng, xác định số đơn vị lặp lại
của các gene trong phương pháp MLVA và xác định trình tự đặc trưng của
các gene giữ nhà trong phương pháp MLST.

2.2.6.

Phương pháp tách chiết RNA và phản ứng phiên mã ngược
RNA được tách chiết theo nguyên tắc dựa trên sự hòa tan khác nhau
của RNA, DNA và protein trong dung môi hữu cơ (phenol, chloroform) và
nước. Sau đó, RNA được xử lý với enzyme DNase I để loại bỏ hoàn toàn
DNA, tiếp tục được đánh giá chất lượng dựa trên tỷ số OD260/280. Tình
trạng sạch hoàn toàn DNA bộ gene được khẳng định bằng phản ứng realtime PCR nhân bản gene blaOXA-51 và 16S rRNA trên mẫu RNA đã xử
lý và chưa qua phản ứng phiên mã ngược. RNA tinh sạch được phiên mã
ngược thành cDNA, dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng duplex real-time
PCR sau này.
Phương pháp định lượng tương đối 2-ΔΔCt
Phương pháp định lượng tương đối cho phép định lượng mức độ
biểu hiện của gene mục tiêu giữa các mẫu khác nhau so với mẫu hiệu

chuẩn thông qua trung gian là gene đối chứng, được tính bằng công thức 2ΔΔCt
. Trong đó: ∆∆C = ∆Ct ụ ê − ∆Ct ệ
ẩ . Ở mẫu khảo sát (cảm
ứng): ∆Ctmục tiêu = CtblaOXA – Ct16S rRNA. Ở mẫu hiệu chuẩn (không cảm
ứng): ∆Cthiệu chuẩn = CtblaOXA – Ct16S rRNA.

2.2.7.

2.2.8.

Phương pháp tách chiết và định lượng nồng độ protein
Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng protein theo
Bradford (1976) được ứng dụng để xác định hàm lượng protein tổng sau
khi tách chiết từ dịch nổi hay chu chất của mẫu vi khuẩn A. baumannii
nuôi cấy. Phần dịch nổi (phân đoạn ngoại bào) được thu nhận sau khi ly
tâm dịch nuôi cấy vi khuẩn và tủa với ethanol tuyệt đối. Phân đoạn chu
chất được thu hồi từ cặn tế bào sau khi phá màng tế bào với chloroform.

8


2.2.9.

Phương pháp định lượng hoạt tính β-lactamase
Trong nghiên cứu này, hoạt tính β-lactamase được xác định dựa trên
hoạt động thủy giải cơ chất nitrocefin của enzyme β-lactamase (nếu có
trong mẫu khảo sát). Nitrocefin là một cephalosporin có màu vàng, bị phân
cắt thành sản phẩm có màu đỏ với cực đại hấp thu ở giá trị OD 490 nm, tỷ
lệ trực tiếp với hoạt tính của β-lactamase. Một đơn vị hoạt tính β-lactamase
được định nghĩa là lượng enzyme thủy phân 1 µmol nitrocefin trong 1 phút

ở pH 7.0 và 37oC. Hoạt tính riêng của enzyme β-lactamase được tính toán
với đơn vị mU/mg protein dựa vào thương số giữa hoạt tính β-lactamase
(mU/mL) và nồng độ protein (mg/mL).
2.2.10. Phương pháp MLVA
Phương pháp MLVA (Multiple Loci VNTR1 Analysis) dựa trên
nguyên tắc sử dụng các cặp mồi đánh dấu huỳnh quang để thực hiện phản
ứng PCR nhân bản các đoạn gene chứa các trình tự lặp lại khác nhau tại
các locus khác nhau trên bộ gene của vi khuẩn A. baumannii. Quy trình
được thiết kế để phân biệt các chủng A. baumannii về mặt di truyền dựa
trên số lượng các trình tự lặp lại tại 8 locus (0826, 0845, 1988, 2240, 2396,
3002, 3468, 3530) có khả năng phân biệt cao giữa các chủng A. baumannii.
Kích thước các sản phẩm nhân bản được phân biệt chính xác khi điện di
mao quản. Tổ hợp mồi cho các phản ứng multiplex PCR thể hiện ở Bảng
2.2.
2.2.11. Phương pháp MLST
Multilocus Sequence Typing (MLST) là kỹ thuật phân loại nhiều
locus cùng lúc dựa trên trình tự đặc trưng của một số gene giữ nhà
(housekeeping gene). Trong nghiên cứu này, MLST được sử dụng để phân
tích kiểu gene của 23 chủng A. baumannii để hiểu sâu hơn về mối liên hệ
di truyền giữa các chủng.
2.2.12. Phương pháp phân tích số liệu
Dữ liệu được phân tích sử dụng phần mềm Excel 2010 và SPSS
20. Kiểm định Fisher, T-test và phân tích phương sai (ANOVA) được sử
dụng. Giá trị p < 0.05 được xem như là có ý nghĩa thống kê.

1

Variable-Number Tandem Repeat

9

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả của đề tài bao gồm hai nội dung chính. Nội dung thứ nhất
liên quan đến việc xây dựng và kiểm tra hiệu quả của các quy trình thực
nghiệm và nội dung thứ hai bao gồm nghiên cứu sự kháng kháng sinh, dịch
tễ học phân tử các gene kháng và cơ chế kháng carbapenem ở vi khuẩn A.
baumannii lâm sàng.
PHẦN 1: XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ HOẠT ĐỘNG
CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
3.1.

Xây dựng quy trình multiplex real-time PCR phát hiện
Acinetobacter baumannii và các gene blaOXA
Phản ứng này được xây dựng nhằm nhân bản và phát hiện đồng
thời các sản phẩm tương ứng của các gene blaOXA trong 1 phản ứng realtime PCR.
3.1.1.

Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR
DNA tổng hợp nhân tạo của 4 đoạn gene tương ứng với 4 nồng độ
như nhau: 2x102, 2x104, 2x106 và 2x108 bản sao/µL được sử dụng. Kết quả
cho thấy phản ứng monoplex real-time PCR tối ưu với từng gene blaOXA
với nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 60,0oC. Đây là điều kiện cơ sở để đánh
giá phản ứng multiplex PCR sau này.
3.1.2.

Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR
Để cho thuận tiện trong việc phát hiện đồng thời các gene blaOXA
của A. baumannii, chúng tôi kết hợp 4 bộ mồi/mẫu dò phát hiện blaOXA23, blaOXA-51, blaOXA-58 và 16S rRNA trong cùng một phản ứng. Kết

quả Bảng 3.7 cho thấy phản ứng multiplex real-time PCR đã đạt điều kiện
tối ưu. Hơn nữa, giá trị Ct tại 4 nồng độ mẫu của phản ứng multiplex realtime PCR gần tương đương với phản ứng monoplex real-time PCR phát
hiện gene tương ứng (Bảng 3.1và Bảng 3.2). Vì thế, phản ứng multiplex
real-time PCR được cho là đã tối ưu thành công để phát hiện đồng thời các
gene blaOXA của A. baumannii trong cùng một phản ứng.

10


3.1.3.

Độ đặc hiệu kỹ thuật
Quy trình được xây dựng đặc hiệu với các gene blaOXA và 16S
rRNA của A. baumannii.
3.1.4.

Độ nhạy kỹ thuật
Quy trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA-23,
blaOXA-51, blaOXA-58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy (4-6 bản
sao/phản ứng).
3.2.

Kiểm tra hiệu quả hoạt động của phương pháp MLVA
Phương pháp MLVA được đánh giá lại trong điều kiện phòng thí
nghiệm. Kết quả cho thấy để nhân bản 8 locus MLVA, tức 8 vùng gene
khác nhau, chỉ cần dùng 3 phản ứng multiplex PCR, thay vì bình thường
phải dùng 8 phản ứng monoplex PCR. Sản phẩm của các phản ứng
multiplex PCR này từ các chủng A. baumannii lâm sàng, được điện di mao
quản (Hình 3.7) để xác định kích thước chính xác và giải trình tự để xác
định số lần lặp lại của các đoạn gene tương ứng với từng locus (Phụ lục

16). Trên cơ sở đó, tương quan kích thước và số lần lặp lại tại các locus của
các chủng còn lại được xác định. Tổ hợp số lần lặp lại tại mỗi locus khác
nhau của từng chủng cho biết đặc điểm di truyền đặc trưng của chủng đó
(Phụ lục 3). Trên cơ sở này, cây phân loài MLVA (Hình 3.15) được xây
dựng để đánh giá mối liên hệ di truyền giữa các chủng A. baumannii đã thu
thập.
3.3.

Kiểm tra hiệu quả hoạt động của phương pháp MLST
Kết quả kiểm tra cho thấy điều kiện phản ứng PCR phù hợp để
nhân bản các gene giữ nhà tại 7 locus. Các sản phẩm nhân bản được giải
trình tự. Kết quả giải trình tự 7 locus của 23 chủng được trình bày ở Phụ
lục 4. Các kiểu allele cho từng locus và tổ hợp MLST của các chủng tương
ứng (Bảng 3.26) được xác định bằng chương trình tích hợp trong cơ sở dữ
liệu MLST (Oxford) của A. baumannii. Từ đó, mối liên hệ di truyền giữa
các chủng A. baumannii được phân tích.
3.4.

Xây dựng phản ứng duplex real-time RT-PCR nghiên cứu sự
biểu hiện gene blaOXA-23/-51/-58
Chúng tôi sử dụng phản ứng duplex real-time RT-PCR để nghiên
cứu sự biểu hiện của gene blaOXA-23/-51/-58. Phản ứng này có hai bước,
bước 1 là phản ứng phiên mã ngược, biến đổi RNA thành cDNA và bước 2
11


là phản ứng duplex real-time PCR, nhân bản cDNA của hai gene 16S
rRNA và blaOXA-51/-23/-58 trong cùng một phản ứng. Kết quả tối ưu
phản ứng duplex real-time PCR được trình bày như sau.
Để kết quả nghiên cứu biểu hiện gene blaOXA được chính xác,

trước khi tiến hành bước 1, RNA tách chiết cần phải được xử lý DNase, để
làm sạch DNA bộ gene. Hơn nữa, phản ứng duplex real-time PCR cần
được chứng minh là phù hợp để nghiên cứu biểu hiện của gene blaOXA23/-51/-58 theo phương pháp 2-∆∆Ct khi hệ số góc của phương trình tương
quan giữa giá trị ∆Ct và log[cDNA] nằm trong khoảng giá trị từ -0,1 đến
0,1 [66].
3.4.1.

Khảo sát lượng enzyme DNase sử dụng
Kết quả Bảng 3.10 cho thấy khi hàm lượng enzyme sử dụng 4
µL/phản ứng xử lý, DNA tồn dư trong mẫu đã bị phân hủy hoàn toàn.
3.4.2. Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR có một cặp mồi/mẫu dò
Phản ứng monoplex real-time PCR phát hiện từng gene blaOXA
được tối ưu để làm cơ sở tối ưu phản ứng duplex real-time PCR sau này.
Kết quả Bảng 3.11 cho thấy phản ứng real-time PCR phát hiện blaOXA23, blaOXA-51 đã đạt điều kiện tối ưu. Kết quả Bảng 3.12 cho thấy thành
phần phản ứng với AptaTaq 1,5X là điều kiện tốt nhất đối với gene 16S
rRNA, và AptaTaq 2X là điều kiện tốt nhất đối với phản ứng nhân bản
gene blaOXA-58.
3.4.2.

Tối ưu hóa phản ứng duplex real-time PCR O23/16S, O51/16S
và O58/16S
Các phản ứng duplex real-time PCR O23/16S, O51/16S và
O58/16S lần lượt được tối ưu. Kết quả cho thấy tại nồng độ enzyme
AptaTaq 2X, phản ứng real-time PCR O23/16S đạt chuẩn (Bảng 3.15) và
phản ứng real-time PCR O51/16S đạt chuẩn (Bảng 3.16). Tại nồng độ
mồi/mẫu dò là 300/150 nM, phản ứng real-time PCR O58/16S đạt chuẩn
(Bảng 3.17).
3.4.3.

Đánh giá phản ứng duplex real-time RT-PCR nghiên cứu biểu

hiện gene blaOXA-23/-51/-58
Chứng minh hiệu phản ứng các duplex real-time PCR đã tối ưu có
thể được sử dụng để tính biểu hiện tương đối gene blaOXA-23/-51/-58
theo phương pháp 2-∆∆Ct, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu cDNA đã xác
12


định nồng độ (từ mẫu vi khuẩn A. baumannii có mang gene blaOXA-23/51/-58) thành 6 nồng độ. Các mẫu pha loãng sẽ được chạy phản ứng duplex
real-time PCR.
Kết quả thu được là phương trình tương quan giữa giá trị ∆Ct (giữa
16S rRNA và blaOXA-23/-51/-58) và giá trị log[cDNA] (Hình 3.9). Kết
quả chi tiết được trình bày ở Phụ lục 17. Phương trình tương quan giữa ∆Ct
(16S rRNA và blaOXA-23; 16S rRNA và blaOXA-51; 16S rRNA và
blaOXA-58) và giá trị Log[cDNA] có giá trị hệ số góc lần lượt là 0,0513;
0,0669 và 0,0623 < 0,1. Như vậy, phản ứng duplex real-time PCR đối với
blaOXA-51/-23/-58 và 16S rRNA có thể được sử dụng để ước lượng sự
biểu hiện tương đối của gen blaOXA-51/-23/-58 bằng phương pháp 2-∆∆Ct.
3.5.

Xây dựng quy trình cảm ứng biểu hiện gene blaOXA
Chúng tôi nghiên cứu biểu hiện gene blaOXA-23/-51/-58 trong
điều kiện cảm ứng kháng sinh oxacillin, là cơ chất của enzyme oxacillinase
do các gene này mã hóa.
3.5.2.
Khảo sát đường cong tăng trưởng của A. baumannii
Để xác định thời điểm cảm ứng (giữa pha log) trong điều kiện của
phòng thí nghiệm, đường cong tăng trưởng của A. baumannii được khảo
sát. Dựa vào kết quả Hình 3.10 chúng tôi chọn thời điểm cảm ứng kháng
sinh ở giá trị 2 McFarland chuẩn (giữa pha log) và thời điểm thu nhận sinh
khối tế bào ở giá trị 4 McFarland chuẩn (cuối pha log).

3.5.3.
Khảo sát nồng độ kháng sinh cảm ứng
Dựa vào kết quả thí nghiệm, chúng tôi đã chọn nồng độ oxacillin 1
µg/mL để quan sát sự biểu hiện của gene blaOXA-51 cũng như những
blaOXA khác trong nghiên cứu.
3.5.4.
Khảo sát nguồn thu nhận protein
Dựa vào kết quả thí nghiệm, chúng tôi quyết định thu nhận protein
từ cả chu chất và dịch nổi cho các thí nghiệm sau này khi đánh giá hoạt
tính β-lactamase của các chủng A. baumannii lâm sàng.
PHẦN 2: CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH
Trong nội dung này, đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng A.
baumannii lâm sàng, sự hiện diện của các yếu tố di truyền liên quan đến
tính kháng kháng sinh, mối liên hệ di truyền giữa các chủng, sự biểu hiện
13


của các gene blaOXA ở các chủng A. baumannii thu thập từ 3 bệnh viện ở
miền Nam và đặc biệt hoạt tính β-lactamase của một số chủng A.
baumannii mang gene blaOXA-58 được phân tích.
3.6.

Thông tin mẫu Acinetobacter baumannii và kháng sinh đồ
163 chủng A. baumannii đã thu thập từ 3 bệnh viện được định danh
lại bằng sự hiện diện của gene 16S rRNA và blaOXA-51, sẽ được sử dụng
tiếp cho những phân tích sâu hơn. Bộ chủng này bao gồm 38 chủng từ bệnh
viện ĐHYD, 45 chủng từ bệnh viện ĐN và 80 chủng từ bệnh viện TNĐN.
Dựa vào định nghĩa, thì trong 163 chủng A. baumannii có 120
chủng là XDR, bao gồm 27/38 (71,1%) từ bệnh viện ĐHYD, 38/45
(84,4%) từ bệnh viện ĐN và 55/80 (68,8%) từ bệnh viện TNĐN. Không có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với tỷ lệ XDR giữa 3 bệnh viện (p =
0,148). Số lượng các chủng kháng imipenem đều cao từ 3 bệnh viện
ĐHYD, ĐN và TNĐN với tỷ lệ lần lượt là 84,2% (32/38), 84,4% (38/45)
và 77,5% (62/80). Tỷ lệ này không khác biệt về mặt thống kê (p = 0,539),
thể hiện ở Bảng 3.22.
Khi so sánh nhóm XDR và không-XDR về tính nhạy/kháng kháng
sinh cho thấy một số đặc tính. Đối với imipenem, hầu hết các chủng XDR
đều kháng, chỉ có 3/120 chủng nhạy (p = 0,318). Còn các chủng KhôngXDR thì 15/43 chủng kháng imipenem, còn lại là nhạy (p = 0,117).
Riêng với tính kháng carbapenem, trong 120 chủng XDR, có 117
(97,5%) kháng imipenem (Bảng 3.23). Ba chủng nhạy với imipenem, thì
kháng meropenem. Tính kháng imipenem cao (> 32 μg/mL) được xác định
ở 109/120 (90,8%) chủng kháng imipenem / XDR. Đối với 43 chủng
không-XDR, 28 (65,1%) chủng nhạy và chỉ có 15 (34,9%) chủng kháng
với imipenem (Bảng 3.23). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê đối với tỷ lệ
XDR và không-XDR ở cả hai mức độ imipenem khảo sát là 8 và 32
µg/mL, đều có p<0,001 (Bảng 3.23).
Kết quả nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của chúng tôi phần
lớn tương đồng với những nghiên cứu trước đó trên các chủng A.
baumannii phân lập từ bệnh viện. Chúng tôi đã phát hiện tỷ lệ kháng
imipenem cao ở cả 3 bệnh viện. Kết quả này củng cố cho kết quả của
những nghiên cứu trước đó cho rằng có một sự gia tăng hằng năm đáng chú
ý ở các chủng Acinetobacter spp. kháng carbapenem ở những bệnh nhân
Việt Nam trong khoảng thời gian từ 2008 đến 2011.
14


Trong một nghiên cứu tiến hành ở hai bệnh viện ở Việt Nam trong
năm 2008 và 2011, tác giả đã cho thấy tỷ lệ kháng cao hơn với amikacin,
gentamicin, ciprofloxacin và piperacillin và tỷ lệ kháng thấp hơn với
ceftazidime, imipenem, meropenem và piperacillin/tazobactam so với kết

quả quan sát trong nghiên cứu này. Sự không phù hợp này có thể được giải
thích bởi sự hiện diện của những quần thể vi khuẩn kháng thuốc khác nhau,
đặc trưng cho từng bệnh viện. Một sự giải thích khác có lẽ nằm ở những vị
trí lấy mẫu các chủng lâm sàng. Phần lớn các chủng trong những nghiên
cứu trước được thu thập từ dịch hút khí quản của bệnh nhân thở máy; mẫu
của chúng tôi được thu thập từ những vị trí khác, hoặc không xác định vị trí
lấy mẫu.
3.7.

Sự hiện diện của các yếu tố di truyền liên quan đến tính
kháng carbapenem của A. baumannii
Sự hiện diện của gene blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-58 và
ISAba1 ở 163 chủng A. baumannii được xác định dựa trên phương pháp
multiplex real-time PCR. Tương quan giữa kiểu gene của blaOXA có và
không có kết hợp ISAba1 với tính kháng carbapenem được thể hiện ở Bảng
3.24.
Phần lớn các chủng nghiên cứu (128/163; 75,8%) mang tổ hợp
“blaOXA-51, ISAba1_blaOXA-23” đều kháng imipenem. Trong tổ hợp
này thì trình tự chèn ISAba1 nằm ở thượng nguồn của gene blaOXA-23. Tỷ
lệ tổ hợp này khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p=0,736) ở 3 bệnh viện.
Phần còn lại, các chủng chỉ mang gene blaOXA-51 (26/163; 16,0%) đều
nhạy với imipenem, chỉ có duy nhất một chủng (1/163; 0,6%) thể hiện tính
kháng imipenem. Mối tương quan giữa tính kháng imipenem và 6 chủng
mang tổ hợp “blaOXA-51, blaOXA-58” chưa thể xác định, với 5 chủng
nhạy và 1 chủng kháng imipenem. Kết quả cũng cho thấy rằng trong
130/163 (79,8%) chủng A. baumannii mang tổ hợp “blaOXA-51, blaOXA23” thì có đến 128/163 (78,5%) chủng mang ISAba1 ở thượng nguồn của
gene blaOXA-23. Các trình tự chèn khác (ISAba2, ISAba3, ISAba4 và
IS18) không được phát hiện ở các chủng này.
Để làm rõ cơ chế kháng imipenem của các chủng A. baumannii
mang tổ hợp “blaOXA-51, blaOXA-58” chúng tôi khảo sát sự hiện diện

của các trình tự chèn khác nhau ở các chủng này. Kết quả cho thấy tất cả
các chủng mang tổ hợp “blaOXA-51, blaOXA-58” đều có ISAba3. Tuy
15


nhiên, chỉ ở chủng DN050 là có sự hiện diện của trình tự chèn ISAba3 ở
thượng nguồn gene blaOXA-58 (Hình 3.14).
Dựa vào kết quả xác định sự hiện diện của các gene blaOXA và
các trình tự chèn, các chủng vi khuẩn A. baumannii (blaOXA-51 dương
tính) đã thu thập được chia thành 3 nhóm chính như sau: (1) nhóm A.
baumannii có blaOXA-23, (2) nhóm A. baumannii có blaOXA-58, (3)
nhóm A. baumannii không có blaOXA-23 và blaOXA-58. Khi kết hợp với
sự hiện diện của các trình tự chèn, kết quả cho thấy 78,5% (128/163) chủng
trong nhóm (1) đều có mang trình tự chèn ISAba1 phía thượng nguồn của
gene blaOXA-23; một tỷ lệ lệ nhỏ (1,2%; 2/163) không có trình tự chèn
ISAba1. Nhóm (2) chiếm tỷ lệ rất nhỏ (3,7%; 6/163), trong đó chỉ có 1
chủng có trình tự chèn ISAba3 ở thượng nguồn của gene blaOXA-58
(0,6%, 1/163). Nhóm (3) có tỷ lệ khoảng 16,6% (27/163) là những chủng
không mang blaOXA-23 và blaOXA-58, với kiểu hình nhạy cảm với nhiều
loại kháng sinh.
Một trong những nội dung chính của nghiên cứu này là tìm hiểu sự
phổ biến của các gene blaOXA trong các chủng A. baumannii phân lập tại
3 bệnh viện. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự phân bố của các tổ hợp
blaOXA và ISAba1 và tỷ lệ kháng imipenem tương ứng khác biệt không có
ý nghĩa thống kê ở cả ba bệnh viện. Cơ chế kháng carbapenem chủ yếu
trong các chủng A. baumannii đã phân lập từ 3 bệnh viện là sự hiện diện
của blaOXA-23 và trình tự chèn ISAba1 ở thượng nguồn của gene này.
Khoảng 78,5% các chủng kháng imipenem mang tổ hợp gene “blaOXA51, ISAba1_blaOXA-23”. Kết quả này phù hợp với những quan sát trước
đó về mối liên quan giữa ISAba1 và blaOXA-23 khi blaOXA-51 và
blaOXA-23 cùng hiện diện. Tính phổ biến của tổ hợp gene “blaOXA-51,

ISAba1_blaOXA-23” trong những chủng kháng imipenem ở nghiên cứu
này xác định tính lan truyền và sự tồn tại dai dẳng của gene mã hóa
enzyme carbapenemase này.
Tất cả các chủng mang gene blaOXA-51 như là gene
carbapenemase chủ yếu, ngoại trừ 1 chủng duy nhất, đều nhạy với
imipenem. Chúng tôi cũng phát hiện 6 chủng mang gene blaOXA-58: một
chủng kháng imipenem, còn lại 5 chủng nhạy với imipenem. Điều này có
thể giải thích bằng sự hiện hiện diện hoặc không của một trình tự chèn
khác, như trình tự chèn ISAba3. Chúng tôi đã phân tích những trình tự chèn
liên quan khác mà A. baumannii có thể mang, với khả năng hiệp đồng cùng
blaOXA-58 để có thể giúp chủng A. baumannii đạt tới mức độ kháng có ý
16


nghĩa lâm sàng nghiêm trọng. Sự không hiện diện của những chủng mang
blaOXA-24 trong nghiên cứu này có lẽ vì cỡ mẫu nghiên cứu nhỏ; sự kém
phổ biến của gene blaOXA-24 ở Việt Nam.
3.8.

Mối liên hệ di truyền của các chủng A. baumannii
Hiểu rõ bản chất di truyền của các chủng A. baumannii và sự liên
hệ với tính kháng kháng sinh có thể giúp dự đoán các chủng có nguy cơ
gây nhiễm khuẩn bệnh viện, cũng như con đường lây truyền trong bệnh
viện khi sàng lọc bằng các phương pháp dịch tễ học phân tử. Vì thế, chúng
tôi đánh giá mối liên hệ di truyền của 163 chủng A. baumannii bằng
MLVA và đã phát hiện 107 kiểu tổ hợp MLVA khác nhau (Phụ lục 3). Các
tổ hợp này được gộp lại thành 5 nhóm lớn bằng phần mềm Phyloviz với
thuật toán goeBURST để xây dựng cây phân loài, được thể hiện trong Hình
3.15A và B. Sử dụng chương trình Phyloviz với thuật toán goeBURST có
thể phân chia tiếp tục 107 tổ hợp MLVA trong 5 nhóm lớn trên thành 32

nhóm đơn (singleton) và 8 nhóm phức (clonal complex) mà chúng tôi đánh
tên từ (a) đến (h) (Hình 3.15C và D).
Chúng tôi tiếp tục chọn 23 chủng trong quần thể cho phân tích
MLST. Kết quả đã phát hiện 16 kiểu trình tự (sequence type, ST). Các
chủng YD046 (ST1311), YD047 (ST1310), YD131 (ST1322) và DN008
(ST1323) được xác định là những kiểu ST mới, phát hiện được trong
nghiên cứu này (Bảng 3.26). Cuối cùng, chúng tôi kết hợp dữ liệu MLVA
và MLST với nhau, nhằm hiểu rõ hơn mối liên hệ di truyền giữa các chủng
hiện có, và các chủng trước đây đã được công bố bởi những nghiên cứu
trước, điển hình là ST136.
Phần lớn các kiểu ST chúng tôi đã phát hiện trong nghiên cứu này
phù hợp với các kiểu MLVA. Một vài biến thể của một số locus trong tổ
hợp các kiểu MLVA quan sát thấy ở các chủng thuộc ST136 có lẽ bắt
nguồn từ sự đột biến xuất hiện trong quá trình tồn tại của ST này ở bệnh
viện tương ứng. Dữ liệu nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng MLVA có
khả năng phân biệt cao hơn MLST trong một khoảng thời gian ngắn, vì
cùng số lượng chủng khảo sát, số tổ hợp MVLA nhiều hơn số tổ hợp
MLST; điều này cũng được cho thấy ở các vi sinh vật khác.
Tổng cộng có 107 kiểu MLVA từ 163 chủng đã phân lập được
phản ánh sự đa dạng về mặt di truyền của các chủng A. baumannii thu thập
ở Việt Nam. Điều này cũng rõ ràng thậm chí ở những chủng có quan hệ
gần gũi, thuộc về cùng một nhóm phức, CC (clonal complex). Sự hiện diện
17


của 3 nhóm phụ, đặc biệt bao gồm các chủng kháng imipenem, phân lập
được từ 3 bệnh viện khác nhau, nằm trong cùng một nhóm chính lớn nhất,
xác định sự tồn tại lâu dài và ổn định của những dòng đã được “định cư”
tốt. Sự phân bố của những chủng nhạy và kháng imipenem từ 3 bệnh viện
vào 4 nhóm kém phổ biến hơn có nghĩa là khả năng tiềm tàng cho sự trỗi

dậy của các biến thể kháng imipenem khác. Các chủng kháng imipenem
phân lập từ 3 bệnh viện khác nhau những lại có cùng một kiểu MLVA và
ST [CC(c) và CC(d)] cho thấy khả năng lan truyền các chủng này giữa các
bệnh viện. Đặc biệt, ST136, bao gồm 6 chủng A. baumannii từ bệnh viện
ĐHYD, đã lưu hành ở một bệnh viện trong khu vực Thành phố Hồ Chí
Minh từ năm 2011. ST136 là một dòng có tính phổ biến rất cao ở Châu Á
và là dòng phân bố rộng nhất trên thế giới.
3.9.

Sự biểu hiện của các gene blaOXA
Sự biểu hiện của các gene blaOXA có liên quan đến tính kháng
kháng sinh, đặc biệt là carbapenem ở A. baumannii. Chính vì thế, chúng tôi
đã thực hiện một số thí nghiệm đánh giá biểu hiện của các gene blaOXA
của một số chủng A. baumannii lâm sàng đại diện cho 3 nhóm chủng đã
phân loại ở trên (Mục 3.7).
3.9.2.

Biểu hiện gene blaOXA-51 của một số chủng A.
baumannii lâm sàng
Kết quả (Hình 3.16 và Phụ lục 5) cho thấy các chủng A. baumannii
lâm sàng chỉ mang gene blaOXA-51, khi cảm ứng với kháng sinh oxacillin
không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p=0,055) về giá trị Ct giữa
chủng lâm sàng so với chủng ATCC 19606. Giá trị biểu hiện thấp nhất là
1,5 lần (TN040) và cao nhất là 5,7 lần (TN065).
Kết quả cảm ứng kháng sinh oxacillin ở các chủng A. baumannii
lâm sàng chỉ mang gene blaOXA-51, không có sự hiện diện của các gene
blaOXA khác và nếu có sự hiện diện của trình tự chèn ISAba1 (nhưng
không nằm trước blaOXA-51 như DN038, DN053, TN040 và YD046), cho
thấy biểu hiện gene blaOXA-51 không khác nhau và thấp. Điều này phù
hợp với kiểu hình nhạy với nhiều loại kháng sinh của chúng. Riêng chủng

TN065 cho thấy kiểu hình kháng imipenem, nhưng chúng tôi khảo sát thấy
không có sự hiện diện của trình tự chèn ISAba1 cũng như các trình tự chèn
khác được đánh giá trong nghiên cứu này. Điều này gợi ý cơ chế kháng
imipenem của TN065 có thể liên quan đến các gene kháng carpapenem
18


khác, không phải blaOXA-51 và có thể liên quan đến các trình tự chèn mới
chưa được phát hiện.
3.9.3.

Biểu hiện gene blaOXA-51/-23 của một số chủng A.
baumannii lâm sàng
Kết quả phân tích cho thấy các chủng A. baumannii lâm sàng được
cảm ứng với kháng sinh oxacillin cho thấy biểu hiện của gene blaOXA-51
và blaOXA-23 khác biệt có ý nghĩa thống kê, khi so với chủng ATCC
19606. Hơn nữa, trong khi giá trị biểu hiện của blaOXA-51 có thể thấy
tương đương với các chủng lâm sàng chỉ mang blaOXA-51; thì giá trị biểu
hiện của blaOXA-23 rất cao, Điều này chứng tỏ sự biểu hiện gene
blaOXA-23 có vai trò quan trọng hơn gene blaOXA-51 trong tính kháng
kháng sinh ở những chủng này.
Kết quả nghiên cứu biểu hiện gene blaOXA-51 và blaOXA-23 trên
một số chủng A. baumannii lâm sàng cho thấy biểu hiện của blaOXA-51
có sự khác biệt nhưng không đáng kể; trong khi sự tăng biểu hiện blaOXA23 khác biệt có ý nghĩa thống kê khi cảm ứng bằng oxacillin. Trong nghóm
này, các chủng A. baumannii lâm sàng được nghiên cứu đều có trình tự
ISAba1 ở thượng nguồn của gene blaOXA-23. Điều này giải thích cho sự
biểu hiện vượt mức của blaOXA-23, do tác động của trình tự chèn ISAba1,
đóng vai trò như một promoter mạnh, như các nghiên cứu trên thế giới đã
đề cập đến. Sự biểu hiện cao của gene blaOXA-23 phù hợp với tính đa
kháng kháng sinh của những chủng nghiên cứu tương ứng.

3.9.4.

Biểu hiện gene blaOXA-51/-58 của một số chủng A.
baumannii lâm sàng
Kết quả phân tích cho thấy biểu hiện gene blaOXA-51 và
blaOXA-58 giữa các chủng lâm sàng mang gene blaOXA-51 và blaOXA58 có sự khác biệt, khi so sánh với chủng ATCC 19606. Tất cả các chủng
đều biểu hiện blaOXA-51 thấp hơn blaOXA-58 (Hình 3.18). Sự biểu hiện
gene blaOXA-58 ở chủng DN050 cao hơn rất nhiều và có ý nghĩa thống kê
so với các chủng còn lại. Bên cạnh đó, trong nội bộ chủng DN050 mức độ
biểu hiện blaOXA-58 cũng cao hơn rất nhiều so với blaOXA-51 (gấp hơn
25 lần). Sự biểu hiện vượt mức blaOXA-58 trong chủng DN050, được
chứng minh là do sự hiện diện của trình tự chèn ISAba3 ở vị trí thượng
nguồn của blaOXA-58 đóng vai trò như một promoter làm tăng cường biểu
hiện gene ở chủng này.
19


Mặc dù các chủng A. baumanii lâm sàng có mang gene blaOXA58 chỉ hiện diện với số lượng ít trong nhóm mẫu nghiên cứu nhưng chúng
tôi vẫn chọn các đối tượng này để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng
carbapenem của chúng vì một số lý do như đặc điểm dịch tễ học khác biệt
của blaOXA-58 ở Việt Nam so với thế giới và vì blaOXA-23 đã rất phổ
biến trên thế giới và được rất nhiều nghiên cứu đề cập đến. Chúng tôi sử
dụng chủng DN050 có biểu hiện vượt mức gene blaOXA-58 cho nội dung
nghiên cứu này và tiến hành khảo sát hoạt tính β-lactamase và phân tích di
truyền vùng gene điều hòa biểu hiện ở thượng nguồn của gene blaOXA-58.
3.9.4.1. Hoạt tính β-lactamase của một số chủng A. baumannii lâm
sàng mang gene blaOXA-51/-58
Hoạt tính β-lactamase của chủng DN050 và các chủng A.
baumannii sở hữu gene blaOXA-58 khác được xác định cho phân đoạn
protein tách chiết từ chu chất và ngoại bào.

Hoạt tính riêng của enzyme β-lactamase giữa protein chu chất và
protein ngoại bào ở các chủng khảo sát cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê và hoạt tính enzyme β-lactamase của chu chất cao hơn ngoại bào
(p=0,016). Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây cho thấy ở vi khuẩn
Gram âm, enzyme β-lactamase được tiết vào chu chất. Hoạt tính βlactamase của protein chu chất giữa các chủng biểu hiện khác nhau, với
hoạt tính cao nhất thuộc về chủng DN050. Kết quả này phù hợp với kết
quả định lượng tương đối biểu hiện mRNA của blaOXA-58 ở chủng này.
Chủng TN341 và TN345 biểu hiện hoạt tính β-lactamase cao trong phân
đoạn chu chất, mặc dù blaOXA-58 của hai chủng này biểu hiện thấp, có
thể do sự hiện diện của các β-lactamase khác ở hai chủng này.
3.9.4.2.

Phân tích di truyền vùng gene điều hòa biểu hiện của
blaOXA-58
Nghiên cứu được tiến hành trên 5 chủng A. baumannii mang gene
blaOXA-58 (Mục 3.7). Ba trong năm chủng (DN050, TN341, TN345) là
những chủng đa kháng thuốc mở rộng (XDR), hầu như kháng với tất cả
kháng sinh được khảo sát. Tất cả các chủng này đều mang tổ hợp gene
“blaOXA-51, blaOXA-58”. Phân tích các trình tự chèn (Hình 3.14) cho
thấy ISAba3 được phát hiện ở tất cả các chủng. Tuy nhiên, chỉ có chủng
XDR DN050 mới sở hữu gene blaOXA-58, được bao 2 đầu bởi 2 trình tự
ISAba3 (Hình 3.20). ISAba3 nằm thượng nguồn gene blaOXA-58 là một
trình tự chèn toàn vẹn, không bị “cụt” bởi quá trình chèn của các trình tự
20


khác như được Poirel và cs công bố (2006). Phân tích trình tự gene
blaOXA-58 của các chủng này cho thấy sự kém đa dạng của gene này, có
lẽ vì A. baumannii mới thu nhận gene này từ những chủng vi khuẩn khác.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi nhấn mạnh mối nguy hiểm của những

nguồn nhiễm chưa được xác định chứa các nhân tố kháng carbapenem, vì
sự thu nhận những trình tự chèn bởi một chủng có blaOXA-58 nhạy
imipenem có thể dẫn đến 1 kiểu hình kháng sau đó.
Phân tích hoạt tính enzyme β-lactamase ở vùng ngoại bào và chu
chất cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các chủng khảo sát.
Phân đoạn chu chất có hoạt tính enzyme cao hơn phân đoạn ngoại bào. Kết
quả này phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới cho thấy enzyme βlactamase tập trung nhiều ở vùng chu chất.
Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hoạt tính β-lactamase cao nhất
thuộc về chủng DN050, phù hợp với sự biểu hiện vượt mức mRNA của
blaOXA-58. Trong khi hai chủng TN341 và TN345 biểu hiện hoạt tính βlactamase cao ở vùng chu chất mặc dù gene blaOXA-58 được biểu hiện
thấp. Hoạt tính enzyme cao như vậy có lẽ liên quan đến các β-lactamase
khác chịu trách nhiệm cho kiểu hình đa kháng thuốc mở rộng của hai
chủng này. Sự hiện diện của các β-lactamase khác có thể giải thích cho
hoạt tính enzyme cao trong phân đoạn chu chất ở 4 chủng còn lại của
chúng tôi.
3.10. Giới hạn và tính mới của nghiên cứu
Nghiên cứu của chúng tôi có một số giới hạn:
1. Chúng tôi không có khả năng tiếp cận được thông tin bệnh nhân
một cách đầy đủ.
2. Chúng tôi cũng không phân tích các cơ chế kháng khác của A.
baumannii liên quan đến tính kháng carbapenem.
Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi có hai điểm mới:
1. Đã phát hiện 4 kiểu di truyền (ST) mới trong quần thể vi khuẩn
A. baumannii đa kháng thuốc ở Đông Nam Bộ - Việt Nam,
đóng góp vào cơ sở dữ liệu MLST của thế giới.
2. Đã cung cấp bằng chứng sự hiện diện của ISAba3 ở thượng
nguồn của gene blaOXA-58 gây nên sự biểu hiện vượt mức
của gene này trên chủng lâm sàng, là cơ chế kháng tồn tại ở vi
khuẩn A. baumannii đa kháng thuốc mở rộng. Cơ chế này
trước đây được tiến hành trên chủng biến nạp chủ động.

21


Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Mục tiêu 1: Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng A.
baumannii lâm sàng thu thập từ 3 bệnh viện ở khu vực Đông Nam Bộ trong
khoảng thời gian 2012-2014.
Nghiên cứu đã xác định tần suất rất cao của các chủng A.
baumannii kháng đa thuốc, gây nhiễm trùng rất nguy hiểm ở 3 bệnh viện
thuộc khu vực Đông Nam Bộ. Hơn 70% các chủng kháng với tất cả các
loại kháng sinh khảo sát. Tỷ lệ kháng các loại kháng sinh khi so sánh 3
bệnh viện là tương tự nhau.
Mục tiêu 2: Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng A. baumannii
lâm sàng cũng như sự hiện diện của một số gene blaOXA phổ biến ở vi
khuẩn này
Phát hiện 107 kiểu tổ hợp MLVA khác nhau, được gộp lại thành 5
nhóm lớn. Mỗi nhóm đều có sự hiện diện của các chủng từ cả 3 bệnh viện.
Khi phân tích sâu hơn, các tổ hợp MLVA có thể được phân thành 32 nhóm
đơn và 8 nhóm phức. Mỗi nhóm phức có kiểu hình kháng kháng sinh đặc
trưng.
23 chủng được phân tích MLST, 16 kiểu trình tự (sequence type,
ST) được phát hiện, có 4 kiểu ST mới so với thế giới được phát hiện trong
nghiên cứu này.
78,5% chủng mang tổ hợp gene “blaOXA-51, ISAba1_blaOXA23”, đều biểu hiện tính kháng imipenem. 6 chủng mang tổ hợp gene
“blaOXA-51, blaOXA-58”, với 5 chủng nhạy và 1 chủng kháng imipenem.
Trong đó chỉ có chủng kháng imipenem có trình tự chèn ISAba3 ở thượng
nguồn gene blaOXA-58. 16,0% chủng chỉ mang gene blaOXA-51 đều
nhạy với imipenem và nhiều loại kháng sinh khác.

Mục tiêu 3: Đánh giá mối liên hệ giữa mức độ biểu hiện gene blaOXA và
tính kháng imipenem ở một số chủng A. baumannii lâm sàng
Các chủng A. baumannii lâm sàng chỉ mang gene blaOXA-51
không cho thấy sự khác biệt trong biểu hiện của blaOXA-51. Các chủng A.
baumannii lâm sàng mang gene blaOXA-51 và blaOXA-23/-58 cho thấy
biểu hiện của gene blaOXA-23/-58 khác biệt và cao hơn blaOXA-51.
22


Hoạt tính β-lactamase của phân đoạn protein chu chất cao hơn
phân đoạn protein ngoại bào.
Trình tự chèn ISAba3 được phát hiện ở tất cả các chủng mang gene
blaOXA-58 khảo sát. Chỉ có chủng XDR có biểu hiện kháng imipenem
mới có sự hiện diện của trình tự chèn ISAba3 ở thượng nguồn gene
blaOXA-58. Trình tự chèn ISAba3 này là một trình tự chèn toàn vẹn,
không bị “cụt” bởi quá trình chèn của các trình tự khác.
4.2. Kiến nghị
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi có một số kiến nghị như sau:
1. Tìm hiểu thêm những cơ chế kháng carbapenem khác của A.
baumannii tồn tại trong quần thể mẫu nghiên cứu như sự hiện diện
của các metallo-β-lactamase và biểu hiện vượt mức của các bơm
đẩy kháng sinh.
2. Mở rộng nghiên cứu đến các bệnh viện khác để có thể đánh giá
được sự lây lan của các chủng A. baumannii kháng đa thuốc (mở
rộng) từ đó có chính sách phù hợp trong kiểm soát nhiễm khuẩn
giữa các bệnh viện và trong cộng đồng.
3. Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để nghiên cứu
bộ gene của các chủng A. baumannii kháng thuốc và kháng thuốc
mở rộng, so sánh với các chủng nhạy, từ đó có nhận định về các
gene, trình tự gene có vai trò quan trọng trong tính kháng đa thuốc

của vi khuẩn này.
4. Phát triển các kháng thể đơn dòng đặc trưng cho từng protein
blaOXA-51/-23/-58 để kiểm tra mức độ biểu hiện của các gene này
bằng Western Blot, để có cơ sở đối chiếu với kết quả định lượng
tương đối biểu hiện mRNA tương ứng của các gene này. Từ đó, có
thể hiểu rõ hơn cơ chế biểu hiện và thể hiện hoạt tính của chúng.

23