Phân tích cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐAI HOC THÁI NGUYÊN
TRƯƠNG ĐAI HOC KHOA HOC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU
ĐƯỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

LUÂN VĂN THAC SI HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


ĐAI HOC THÁI NGUYÊN
TRƯƠNG ĐAI HOC KHOA HOC
–––––––––––––––––––

TRẦN THỊ BÍCH HẢO

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG CỦA THUỐC ĐIỀU TRỊ TIỂU
ĐƯỜNG
TYP II METFORMIN HYDROCHLORIDE BẰNG
CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI
Chuyên nganh: Hoá Phân Tích
Ma số: 60 44 0118

LUÂN VĂN THAC SI HÓA HOC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HOC: TS. PHẠM THỊ THẮM

THÁI NGUYÊN - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tới TS. Phạm
Thị Thắm - nguyên giảng viên Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên nay là giảng viên
Đại học Thủy Lợi đã tin tưởng giao đề tài, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và
tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn thạc sỹ này.
Tôi xin gửi lời trân trọng cảm tới TS Dương Nghĩa Bang, TS. Phạm Thế Chính cùng
các thầy cô khoa Hóa học, Trường ĐH Khoa học- ĐH Thái Nguyên đa tao điêu kiên ,
giúp đơ tôi trong quá trình tri ển khai nghiên cứu, thực hiện đề tài.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các thầy, cô, cán bộ, kĩ thuật viên
Phòng Hóa dược, thuộc Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tận tnh chỉ dạy và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, thực nghiệm và thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè lớp Cao học khóa
2014- 2016 đã giúp đơ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập
và làm luận văn.
Tác giả luận văn

Trần Thị Bích Hảo

a

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... a MỤC LỤC
......................................................................................................... b DANH MỤC CHỮ VIẾT
TẮT

........................................................................

.................................................................................

e

DANH
g

MỤC

CÁC

MỞ

.......................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ..................................... 2
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR).......................................................... 2
1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ................................ 3
1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) ........................................................ 5
1.2. Phương pháp xác định hàm lượng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........ 7

1.2.1. Khái niệm ................................................................................................ 7
1.2.2. Phân loại .................................................................................................. 8
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ................................................................. 8
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo................................................................ 9
1.2.5. Detector dad .......................................................................................... 10
1.2.6. Detector ms ........................................................................................... 11
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đường .................................................................. 13
1.3.1. Phân loại bệnh tểu đường..................................................................... 13
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết ............................................ 14
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường............................. 15
1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tểu đường .......................................... 15
1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đường metformine hydrochloride ........................ 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ........................................................ 17
Chương 2: THỰC NGHIỆM........................................................................ 20
b

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

HÌNH
ĐẦU


2.1. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 20
2.1.1. Hóa chất và dung môi ........................................................................... 20
2.1.2. Thiết bị xác định và phân tích cấu trúc ................................................. 20
2.1.3. Phân tích xác định cấu trúc, định tnh phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các
sản phẩm tổng hợp được ........................................................... 21
2.2. Tổng hợp và phân tích cấu trúc của metformine hydrochloride .............. 21
2.2.1. Quy trình tổng hợp metformin hydrochloride....................................... 21

2.2.2. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ IR ............. 22
2.2.3. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ NMR ......... 22
2.2.4. Phân tích cấu trúc của metformin hydrochoride bằng phổ MS ............ 22
2.3. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride...................................... 23
2.3.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton .................. 23
2.3.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH .................. 23
2.3.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH .................... 23
2.4. Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp
(HPLC) ............................................................................................................ 24
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 26
3.1. Tổng hợp và phân tích cấu trúc metformine hydrochloride .................... 27
3.1.1. Tổng hợp metformin hydrochloride ...................................................... 27
3.1.2. Phân tch cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phương pháp IR .... 27
3.1.3. Phân tch cấu trú c của metformin hydrochloride bằng phương pháp NMR
...................................................................................................... 28
3.1.4. Phân tch cấu trúc của metformin hydrochloride bằng phương pháp MS . 30
3.2. Phân tích tm kiếm các phương pháp kết tinh metformine
hydrochloride để thu được độ sạch cao nhất................................................... 31
3.3. Hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp hplc .............. 31
KẾT LUẬN .................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 35
PHỤ LỤC
c

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

13

C- NMR

13
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ( C Nuclear Magnetic
Resonance)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

1
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( H Nuclear Magnetc
Resonance)

H- NMR

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS

Phổ khối lượng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass
Spectrometry)

H, C

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm

Phần triệu (parts per million)

s

singlet

dd

Double doulet

CHCl3

Clorofrom

EtOH

Ethanol

MW

Microwave

MeOH

Methanol

OMe

Methoxy

SOCl2

Sulfonylchlorua

e
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid................................................ 16
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine. .......................................... 16
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ............................... 17
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro.......... 18
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi...... 18
Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin ........................................ 18
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 18
Sơ đồ 3.1: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride ................................ 27

f
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol ..................................................... 3
Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat ................................ 5
Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit............................................................ 7
Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS. ...................................................................... 9
Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang........................................................ 10
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector ........................... 11
Hình 2.2: Biểu đồ đường chuẩn. ..................................................................... 25
Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất metformin hydrochloride .............................. 27
1
Hình 3.2: Phổ H-NMR của chất metformin hydrochloride ........................... 29
Hình 3.3: Phổ

13

C-NMR của chất metformin hydrochloride .......................... 29

Hình 3.4: Phổ MS của metformin hydrochloride............................................ 30
Hình 3.5: Biểu đồ đường chuẩn định lượng.................................................... 32
Hình 3.6: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride .............................. 33

g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

MỞ ĐẦU
Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tnh hạ đường huyết và
năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được FDA cho
phép lưu hành để chữa bệnh tiểu đường Typ 2 ở Mỹ. Metformin là một thuốc chống
đái tháo đường nhóm biguanid, có cơ chế tác dụng khác với các thuốc chống đái tháo
đường nhóm sulfonylure.
Trước đây, để xác định được cấu trúc phân tử một hợp chất hữu cơ đặc biệt là cấu
trúc và độ sạch của các hợp chất ứng dụng trong dược phẩm không hề đơn giản; có thể
mất đến hàng năm hoặc vài năm. Để xây dựng được têu chuẩn của hợp chất chính trong
dược phẩm là một công việc cực kì khó khăn và tốn kém. Ngày nay, với các công cụ là các
phương pháp phân tch hóa lý hiện đại, việc phân tch cấu trúc các hợp chất hữu cơ đã trở
thành đơn giản, có khi chỉ tốn thời gian tính bằng giờ. Việc xác định hàm lượng và độ sạch
của các loại thuốc cũng nhanh hơn nhiều lần do có phương pháp HPLC.
Vì vậy, việc phân tch cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tiểu đường typ II
metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại là công việc rất quan
trọng, là cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn của sản phẩm và là tiêu chí để đánh giá chất lượng
giá thành của thuốc.
Do đó đề tài nghiên cứu phân tch cấu trúc, hàm lượng của thuốc điều trị tểu
đường typ II metformin hydrochloride bằng các phương pháp hóa lý hiện đại là có ý nghĩa
khoa học và thực tễn.

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc
1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều
thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất.
Bức xạ hồng ngoại bao gồm một phần của phổ điện từ, đó là vùng bước sóng
khoảng 10

-4

đến 10

-6

m. Nó nằm giữa vi sóng và ánh sáng khả kiến. Phần của vùng

hồng ngoại được sử dụng nhiều nhất để xác định cấu trúc nằm trong giữa 2,5x10
16x10

-6

-4

và

-1
m. Đại lượng được sử dụng nhiều trong phổ hồng ngoại là số sóng (cm ), ưu

điểm của việc dùng số sóng là là chun
́ g tỷ lệ thuận với năng lượng [3].
Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ
kích thích phân tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn. Có 2 lại
dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν)

là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay
đổi góc liên kết.
Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại
được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động
đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định, (Hình 1.1).

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của benzyl ancol
Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các
liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể
có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác
nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ
hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau [3].
Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là
xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic nằm trong vùng từ
4000 - 1600 cm

-1

thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ

của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng
phổ từ 1300 - 626 cm

-1

phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử

hơn là để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất
này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm

-1

được gọi là vùng vân ngón tay [3].

1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu
1
cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ H-NMR và
13

1
13
C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử H và C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ

trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều
với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2
[2].
1
Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân H và
13

1
13
C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân H và C

1

trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân H thì:

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN



x
6
  TMS
.10 ( ppm)
o
Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân
mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa
một các tổng quát như sau:


chuan x
6
.10 ( ppm)
o

Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt
nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ.
Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt
1
13
nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân H và C trong phân tử khác
nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn

σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó
proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [1].
Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất
được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng
1
13
phần triệu (ppm). Đối với H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với C-NMR thì δ có
giá trị từ 0-230 ppm.

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Hình 1.2: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat
Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương
đương sẽ thể hiện bởi một cụm tn hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một
hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp
phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua
các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết
và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [1].
Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần
của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí
trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [2].
1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS)
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vơ phân tử trung hòa
thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion
này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định
phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu [3,4].

5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Để phá vơ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron
(EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh
(FAB)… Dùng dòng eclectron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp
hay được sử dụng nhất. Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành
các ion phân tử mang điện tích dương
hoặc bị phá vơ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

ABC

ABC

e

ABC
ABC

(1) > 95%

2e
2

3e (2)

-

Sự hình thành các ion mang điện tch +1 chiếm hơn 95%, còn lại là các ion mang
điện tích +2 và điện tch âm (-). Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân tử

khoảng 10 eV. Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vơ thành các mảnh
ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc, hoặc phân tử trung hòa nhỏ hơn, nên người ta
thường thực hiện bắn phá các phân
tử ở mức năng lượng 70 eV [3].
ABC

A

ABC

AB

AB

A

BC
B
B

Sự phá vơ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng
lượng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa.
Các ion ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e
được gọi là số khối z. Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau và
xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác
suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình
1.3).

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Hình 1.3: Phổ khối lượng của benzamit (C6H5CONH2).
Như vậy, khi phân tch phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của
chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử
và tm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết
chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp
phổ với nhau.
1.2. Phương pháp xác định hàm lượng - sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.2.1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia
tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân
chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất
mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này
ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả
năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng , như phân tích các hợp chât
thuốc trừ sâu , thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm,
dược phẩm, môi trường…

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.2.2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC
thành 4 loại:


Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).



Sắc ký phân bố (parttion chromatography).



Sắc ký ion (ion chromatography).



Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh
và pha động: sắc ký pha thường - SKPT (normal phase chromatography) và sắc
ký pha đảo - SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong đo, sắc ký pha đảo được sử dụng nhiều hơn cả.
1.2.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên
chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:


Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý →
sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography).

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase
chromatography).
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có
nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị
mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất
phân tích.
o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta
không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần
lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít
phân cực. Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n- octadecyl) còn gọi là ODS
(octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl,
phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các
alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng
nhiều nhất.

Hình 1.4: Cấu trúc của cột ODS.
1.2.4. Pha động trong sắc ký pha đảo
Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:
 Hòa tan mẫu phân tích.
 Phù hợp với đầu dò.
 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh.
 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao.
 Tinh khiết dùng cho sắc ký.
Trong săc ky pha đao , dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết
chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy nước,
methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất.

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Trong đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng
rửa giải.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tch và pha
động phụ thuộc rất nhiều vào moment lương cực, tính acid hoặc tính base của dung môi.
Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách
của sắc ký.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc
dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong
nước.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ
isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình
gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
1.2.5. Detector dad
Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay
có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tnh
khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là
0,0015 - 0,050 mm.

Hình 1.5. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ thống được

điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện được tch - 5V. Khi bức
xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện. Sự nạp điện lại được
tiếp tục ở chu kỳ tếp theo. Kết quả là dòng
điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ.

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần.
Hình 1.6. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector
(cải tiến flowcell)
1.2.6. Detector ms
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tch chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự
chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trường hoặc từ trường
nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển
động này của ion. Nếu biết được điện tch của ion thì ta dễ dàng xác định được khối
lượng của ion đó.
Do qua trinh phân tich vơi đâu do MS đoi hoi mưc đô ch ân không cao, nhiêt đô
cao , các chất khảo sát phải ở trạng thái khí , vân tôc dong chay nho ; trong khi hê thông
LC lai hoat đông ơ ap suât cao vơi môt lương dung môi tương đôi lơn , nhiêt đô tương đôi
thâp , các chất phân tí ch ơ thê long . Điều này gây rât nhiêu kho khăn trong viêc tim cach
giai quyêt đươc sư tương thich giưa hê thông săc ky long va đâu do khôi phô.

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Đê khăc phuc nhưng kho khăn trên, cân phai co môt ky thuât trung gian gọi là giao
diện. Rât nhiêu ky thuât giao diên (interface technology) như chum ta hat (FB), băn pha
nguyên tư nhanh dong liên tuc

(CF-FAB),… đa đươc nghiên cưu va ưng dung , nhưng mai

cho đên cuôi thâp nhiên 80, mơi co sư đôt pha t hât sư vơi ky thuât ion hoa tai ap suât
khi quyên

(Atmospheric Pressure Ionization - API).

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay
trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho
LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (contnuous flow- fast atom
bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một
thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (sof ionizaton), không phá vơ cấu trúc của
hợp chất cần phân tch nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử

. Ngoài ra , với kỹ

thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vơ ion phân tử để tạo ra những
ion con tùy theo yêu cầu phân tch.
Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:
* Ion hóa tia điện (electrospray ionization - ESI).
* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization
- APCI).
* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photoionization - APPI).
Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI , đăc biêt la ESI được sử dụng nhiều hơn cả.
***Các loại đầu dò khôi phô
Có các loại tổng quát sau:
* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetc field deflection).

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing
magnetc sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp.
- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn cong nhờ
từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao.
* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)
- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter).
- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap).
* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (tme of flight mass spectrometry).
* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier
(Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS).
Trong đo , Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay;
máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđược sử dụng
nhiều hơn cả.
1.3. Khái quát về bệnh tiểu đường
1.3.1. Phân loại bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:
Tiểu đường tuýp 1: Tiểu đường typ 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ thống miễn
dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ. Sự thiếu
hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các biến chứng mãn tính.
Tiểu đường typ 2: Bệnh tiểu đường typ 2 được đặc trưng bởi kháng insulin và
giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường.
Các typ tăng đường huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đường thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào .
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.

1313
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.3.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tểu đường được chia
thành 3 nhóm chính như sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn.
a) Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong
cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thể. Insulin là một trong những hormon quan trọng
của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng lượng và phát triển cơ thể, mà
còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà
ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protd.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin.
Các sulfonylurea.
Năm 1942, Janbon đã tnh cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn suất
sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thương hàn. Từ phát hiện này,
nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các sulfonylurea đã được tến hành. Các
nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm
sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các
thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh.
b) Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:

1414
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin. Chính các
synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
R-NH-C-NH-C-NH2
NH

NH

(4)
Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và buformin.
Hiện nay metformin là thuốc đang được sử dụng phổ biến nhất, vì ít gây tăng axit lactic
trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng đường huyết, không gây hạ đường
huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ, không có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ
bài tiết insulin.
c) Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase).
Acarbose:
Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột. Do tác
dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và
các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng đường huyết sau ăn. Thuốc có tác
dụng tốt cho cả 2 typ bệnh.
1.3.3. Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tểu đường
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng
chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.3.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tểu đường chủ yếu là các thuốc có nguồn gốc
từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch, Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia
rebaudiana, Asteraceae), mướp đắng (Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ
(Astragalus membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,

Scrophulariaceae)...

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.4. Thuốc chữa bệnh tiểu đường metormine hydrochloride
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cho đến nay, ở trong nước có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng hợp
metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp được được tến hành qua 3
bước [5]:
* Bước 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid.
Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ
phản ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo
2 giai đoạn:
o
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300 C.
o
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750 C.
*Bước 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine:
Từ calci cyanamide đã được tổng hợp trong bước 1, đem đun nóng trong dung môi
H2O nhận được 1-cyanoguanidin được mô tả trong sơ đồ sau:

1-cyanoguanidine.
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine.
Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ
o
70 C trong khoảng thời gian 30 phut́ . Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó

16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN