SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘ KIT RTLAMP PHÁT HIỆN VIRUS PRRS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN HEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘ KIT RT-LAMP PHÁT HIỆN
VIRUS PRRS GÂY HỘI CHỨNG

L

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: CAO THỊ MỸ HẠNH

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘ KIT RT-LAMP PHÁT HIỆN
VIRUS PRRS GÂY HỘI CHỨNG

L

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

CAO THỊ MỸ HẠNH

KS. VÕ KHÁNH HƢNG

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Trƣớc hết, con xin đƣợc cám ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình luôn
tạo điều kiện và động viên cho con trong suốt quá trình học tập.
Xin chân thành cảm ơn :
Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn công
nghệ sinh học cùng quý thầy cô đã tận tình giúp đỡ và dạy bảo trong suốt thời gian học
tập tại trƣờng
PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên
em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Em chân thành cảm ơn
thầy đã tận tình giải đáp những thắc mắc cho em hiểu rõ, cám ơn vì thầy đã luôn theo

dõi giúp em vƣợt qua khó khăn để hòan thành tốt đề tài.
KS. Võ Khánh Hƣng đã tận tình chỉ dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài
KS. Nguyễn Phan Thành đã tận tình giúp đỡ và động viên trong quá trình nghiên
cứu
Các ơn bạn Thanh hồng, Tấn hùng và Viết Học đã tận tình giúp đỡ, trao đổi kiến
thức trong suốt quá trình thực hiện đề tài cùng nhau.
Các thầy cô và anh chị em tại viện Nghiên Cứu công Nghệ Sinh Học Và Môi
Trƣờng- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em trong suốt quá trình thực tập
Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 2008 và bạn bè đã đã giúp đỡ trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Cuối cùng xin chân thành cảm ơn đến bạn Thùy Dung, Kim Ngân, Thị Hoa và
Hòang Anh đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu và
thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Tp Hồ Chí minh, tháng 7 năm 2012
Cao Thị Mỹ Hạnh

i


TÓM TẮT
Đề tài đƣợc thực hiện với mục đích nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bộ kit RTLAMP phát hiện virút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo PRRSV.
RT-LAMP là kỹ thuật mới ra đời vào năm 2000 nhƣng có nhiều ƣu điểm nhƣ độ
nhạy cao, nhanh và không đòi hỏi trang thiết bị máy móc hiện đại. Do đó, việc nghiên
cứu sản suất thử nghiệm bộ kit RT-LAMP nhằm phát hiện vi-rút PRRS nhanh chóng,
tiện lợi và có hiệu quả cao.
Chèn đoạn gen ORF6 vào plasmid pGEM T Easy xây dựng đối chứng dƣơng cho
bộ kit RT-LAMP. Nghiên cứu khảo sát trên bộ kit RT-LAMP A (bao gồm tất cả các
thành phần hóa chất trộn chung trong 1 tube trừ RNA mẫu ), RT-LAMP B (bao gồm
Master Mix, Enzyme mix, primer mix). Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu, tính ổn

định, thời gian sử dụng và thời gian bảo quản của hai bộ kit.
Quá trình thực hiện đề tài đạt đƣợc kết quả sau: Bộ kit RT-LAMP có độ nhạy rất
cao, phát hiện đƣợc 1 bản sao DNA plasmid trong hỗn hợp phản ứng. Đặc biệt, bộ kit
RT-LAMP rất đặc hiệu trên vùng gen ORF6 của PRRSV. Sau 14 tuần nghiên cứu
khảo sát, bộ kit RT-LAMP cho thấy bộ kit vẫn hoạt động trên RNA mẫu. Tuy nhiên
đối chứng dƣơng (1 bản sao) không cho kết quả dƣơng tính. Không có sự khác biệt
đáng kể về hiệu quả khuếch đại giữa bộ kit RT-LAMP A và RT-LAMP B trong thời
gian khảo sát.

ii


SUMMARY
Thesis title “ Study on the RT-LAMP kit for diagnosing the porcine reproductive
and respiratory syndrome virus “
RT-LAMP was discovered in 2000 which is a highly sensitive, rapid and
inexpensive technique. Therefore, the aim of this study was to produce the RT-LAMP
kit for diagnosing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus.
Plasmid pGMT- PRRSV was used as the positive control of the RT-LAMP kit
for detection the PRRS virus. Two types of the RT-LAMP Kit were studied. The RTLAMP A kit contains Master Mix ( including Enzyme Mix, Primer Mix, Reation Mix)
and the control DNA plasmid. The RT-LAMP B kit included Master Mix , Enzyme
Mix, Primer Mix and the control DNA Plasmid. The sensitivity and specificity of two
Kit were evaluted by detection of 10-fold dilutions of the plasmid pGMT- PRRSV. On
the other hand, evaluation of the duration for the storage and the usage was carried
out .
The results showed that both of RT-LAMP Kit A and B could detect at least
one copy of the ORF6 Plasmid. The RT-LAMP kit amplifies gen ORF6 with high
specificity. After 14 weeks, the RT-LAM A and B still operate normally. There was no
considerable difference of efficacity in detecting ORF6 between the RT-LAMP A Kit
and RT-LAMP B Kit.

Keyword: the RT-LAMP kit, porcine reproductive and respiratory syndrome virus

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. i
TÓM TẮT .....................................................................................................................ii
SUMMARY ................................................................................................................ iii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG.......................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ x
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu-Yêu cầu ............................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................. 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo .................................................. 3
2.2 Đặc điểm virus gây rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo .................................... 4
2.2.1 Phân loại.......................................................................................................... 4
2.2.2 Cấu trúc phân tử của PRRSV .......................................................................... 5
2.2.2.1 Cấu trúc virion.............................................................................................. 5
2.2.2.2 Tổ chứ bọ gen của PRRSV ........................................................................... 6
2.2.3 Phân bố bệnh PRRS ........................................................................................ 8
2.3 Một số phƣơng pháp chẩn đoán PRRSV trong phòng thí nghiệm .................... 10
2.3.1 Chẩn đoán trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào ................................................... 10
2.3.2 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (IMA).............................................. 11
2.3.3 Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp .................................................................... 11
2.3.4 Kỹ thuật PCR ................................................................................................ 11

2.4 Phƣơng pháp RT-LAMP .................................................................................. 11
2.4.1 Khái niệm phƣơng pháp RT-LAMP .............................................................. 11
2.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP .................................................................. 12
2.4.3 Các bƣớc của phản ứng RT-LAMP ............................................................... 13
iv


2.4.4 Nhận biết kết quả phản ứng RT-LAMP......................................................... 15
2.5 Nguyên tắc chế tạo bộ kit ................................................................................. 16
2.5.1 Kit là gì ......................................................................................................... 16
2.5.2 Nguyên tắc chế tạo kit ................................................................................... 16
2.5.3 Kit thực hiện phản ứng RT-LAMP ................................................................ 17
2.5.4 Tình hình sản xuất kit trên thế giới ................................................................ 17
2.5.4.1 Trên thế giới ............................................................................................... 17
2.5.4.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 18
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 19
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 19
3.2 Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 19
3.2.1 Vật liệu .......................................................................................................... 19
3.2.2 Hóa chất ........................................................................................................ 19
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 20
3.3 Phƣơng pháp tiến hành ..................................................................................... 20
3.3.1 Xây dựng đối chứng dƣơng ........................................................................... 20
3.3.1.1 Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại gen ORF6 của PRRSV.............. 22
3.3.1.2 Chèn đoạn ORF6 vào plasmid xây dựng đối chứng dƣơng ........................ 24
3.3.2 Xác định số lƣơng bản sao của plasmid tái tổ hợp......................................... 24
3.3.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm bộ kit RT-LAMP ....................................... 25
3.3.3.1 Trình tự mồi và thành phần hóa chất phản ứng RT-LAMP ........................ 25
3.3.3.2 Nghiên cứu sản xuất bộ kít RT-LAMP ....................................................... 26
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 29

4.1 Xây dựng đối chứng dƣơng cho bộ kit RT-LAMP ........................................... 29
4.1.1 Khuếch đại vùng gen ORF6 của PRRSV bằng RT-PCR ............................... 29
4.1.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn ORF6 ............................................................... 30
4.2 Kết quả nghiên cứu thử nghiệm bộ kit RT-LAMP ........................................... 32
4.2.1 Kết quả khẳng định tính đặc hiệu của bộ kit RT-LAMP ............................... 32
4.2.2 Kết quả khảo sát độ nhạy và tính ổn định của bộ kit RT-LAMP ................... 33
4.2.3 Kết quả khảo sát thời gian sử dụng bộ kit RT-LAMP A, RT-LAMP B......... 36
4.2.4 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản bộ kit RT-LAMP A, RT-LAMP B ....... 38
v


4.2.5 Hiệu quả kinh tế của bộ kit RT-LAMP chẩn đoán PRRSV ........................... 41
4.3 Thảo luận.......................................................................................................... 42
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 43
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 43
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 44
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
5‟NTR

5‟Nontranslated Region

aa

Acid amin

AMV

Avian Myeloblastosis Virus

BIP

Backward Inner Primer

cDNA

Complementary deoxyribonucleotide acid

Ct

Threshold cycle

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EU

European

F

Forward

FA

Fluorescent Assay

FIP

Forward Inner Primer

FMDV

Foot Mouth Disease Virus

GP

Glycoprotein

IFA

Indirect Immunoflourescence Assay

IPMA

Immunoperoxidase monolayer assay

KD

Kilo Dalton

LOD

Limit of Detection

M protein

MembranE protein

MSD

Mystery Swine Disease

N protein

Nucleocapside protein

NA

North American

Nsp

Non-structural protein

ORF

Open Reading Frame

PAMs

Porcine alveolar macrophage

PCR

Polymerase Chain Reaction

PPV

Porcine Parvovirus
vii


PRRS

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus

PRV

Pseudorabies Virus

R

Reverse

RNA

Ribonucleotide acid

RT-LAMP

ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermalAmplification

RT-PCR

Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris EDTA

TGEV

Replication of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus

UTR

Untranlated region

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1Trình tự các đoạn mồi trong phản ứng RT-PCR ............................................... 23
Bảng 3.2 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR .......................................................... 23
Bảng 3.3 Quy trình nhiệt của phản ứng RT-PCR ............................................................ 24
Bảng 3.4 Trình tự đọan mồi trong bộ kít RT-LAMP phát hiện PRRSV .......................... 26
Bảng 3.5 Thành phần của bộ kit RT-LAMP A 50 phản ứng ........................................... 27
Bảng 3.6 Thành phần của bộ kit RT-LAMP AB 50 phản ứng......................................... 27
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát tính ổn định của bộ kit RT-LAMP ........................................ 35
Bảng 4.2 Kết quả khảo sát thời gian sử dụng của bộ kit RT-LAMP ............................... 37
Bảng 4.3 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản của bộ kit RT-LAMP.............................. 38
Bảng 4.4 Chi phí sản xuất bộ kit RT-LAMP 50 phản ứng phát hiện PRRSV ................. 41

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hình dạng bên ngoài PRRSV ....................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc virion PRRSV ................................................................................ 5
Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PRRS virus ................................................................. 8
Hình 2.4 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nƣớc trên thế giới ................................. 10

Hình 2.5 Bƣớc 1 trong phản ứng RT-LAMP ............................................................ 13
Hình 2.6 Bƣớc 2 trong phản ứng RT-LAMP ............................................................ 13
Hình 2.7 Bƣớc 3 trong phản ứng RT-LAMP ............................................................ 13
Hình 2.8 Bƣớc 4 trong phản ứng RT-LAMP ............................................................ 13
Hình 2.9 Bƣớc 5 trong phản ứng RT-LAMP ............................................................ 14
Hình 2.10 Bƣớc 6 trong phản ứng RT-LAMP........................................................... 14
Hình 2.11 Bƣớc 7 trong phản ứng RT-LAMP........................................................... 14
Hình 2.12 Bƣớc 8-12 trong phản ứng RT-LAMP ..................................................... 14
Hình 2.13 Sản phẩm của phản ứng RT-LAMP trên gel điện di với thuốc nhuộm
SYBR Green .............................................................................................................. 15
Hình 2.14 Độ đục của sản phẩm của phản ứng RT-LAMP và với thuốc nhuộm
SYBR Green dƣới UV ............................................................................................... 16
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tạo DNA tái tổ hợp trong xây dựng đối chứng dƣơng ....... 21
Hình 4.1 Kết quả sản phẩm phản ứng RT-PCR trên khung đọc mở ORF6.................... 29
Hình 4.2 Kết quả kiểm tra plasmid chèn đoạn ORF6 ..................................................... 30
Hình 4.3 Kết quả blast trình tự đoạn gen ORF6 trên NCBI ............................................ 31
Hình 4.4 Kết quả giải trình tự sản phảm PCR của plasmid chèn ORF6 ......................... 32
Hình 4.5 Kết quả khẳng định tính đặc hiệu của bộ kit RT-LAMP ................................. 33
Hình 4.6 Kết quả khảo sát độ nhạy của bộ kit RT-LAMP lần 1, 2 và 3 .................... 34
Hình 4.7 Kết quả khảo sát thời gian sử dụng bộ kit A và B lần 1, 2, 3, 4, 5 và 6 ...... 36
Hình 4.8 Kết quả khảo sát thời gian sử dụng bộ kit A và B lần 7 ............................. 37
Hình 4.9 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản bộ kit A và B lần 1, 2, 3, 4, 5 và 6 .... 39
Hình 4.10 Kết quả khảo sát thời gian bảo quản bộ kit A và B lần 7 .......................... 40
x


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Thế
nhƣng gần đây các nhà chăn nuôi đang phải đối mặt với rất nhiều nguy cơ, đặc biệt là

các dịch bệnh do vi-rút và vi khuẩn gây ra. Một trong những vấn đề nổi lên trong thời
gian vừa qua và gây ảnh hƣởng không nhỏ đến ngành chăn nuôi

syndrome - PRRS).
Việc chẩn đoán PRRSV vẫn còn nhiều khó khăn là do đặc điểm khó nuôi cấy virút trên môi trƣờng tế bào. Một số kỹ thuật chẩn đoán PRRSV có độ nhạy cao, không
cần nuôi cấy tế bào đƣợc sử dụng và phát triển nhƣ miễn dịch huỳnh quang, hóa mô
miễn dịch, lai in situ, RT-PCR, nested-PCR. Tuy nhiên, việc chẩn đoán bằng những
phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian, chi phí và không đáp ứng đƣợc nhu cầu chẩn
đoán bệnh nhanh và trên diện rộng nhằm phục vụ yêu cầu lớn và cấp thiết của xã hội
trong việc phòng chống bệnh hiện nay. Gần đây phƣơng pháp RT-LAMP (Reverse
Transcription Loop mediated Isothermal Amplification) đƣợc phát triển với các ƣu
điểm nhƣ đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm thời gian lẫn chi phí so với những kỹ thuật
chẩn đoán khác. Đặc biệt phƣơng pháp RT-LAMP không đòi hỏi trang thiết bị máy
móc hiện đại, chỉ cần bồn ủ n

-

giúp tiết kiệm thời gian trong phát hiện, hạn chế nghi cơ ngoại nhiễm, dễ bảo quản,
vận chuyển, hạn chế các lỗi do thao tác pipet nhiều lần, nhanh, tiện lợi.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, khóa luận “
heo” đƣợc thực hiện.

1


1.2. Mục đích-yêu cầu
Mục đích
Sản xuất thử nghiệm bộ kit RT-LAMP chẩn đoán phát hiện vi-rút PRRS
Yêu cầu
Bộ kit RT-LAMP đáp ứng đƣợc các tiêu chí là nhanh, tiện lợi, tiết kiệm thời

gian, ổn định và độ nhạy cao.
1.3 Nội dung thực hiện
-

Xây dựng đối chứng dƣơng cho bộ kit RT-LAMP

-

Xác định số lƣợng bản sao plasmid

-

Nghiên cứu thiết lập bộ kit RT-LAMP
+ Khẳng định tính đặc hiệu của bộ kít RT-LAMP
+ Xác định độ nhạy của bộ kit RT-LAMP
+ Khảo sát tính ổn định về độ nhạy của bộ kit RT-LAMP
+ Khảo sát thời gian sử dụng của bộ kit RT-LAMP A (Master Mix bao gồm tất
cả thành phần phản ứng trừ RNA mẫu, đối chứng dƣơng), bộ kit RT-LAMP B
(Master Mix, Enzyme Mix, Primer Mix và đối chứng dƣơng)
+ Khảo sát thời gian bảo quản bộ kit RT-LAMP A, bộ kit RT-LAMP B

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
hô hấp trên heo (PRRS)
Hội chứng

hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên heo do vi-rút

RNA sợi dƣơng có vỏ envelope thuộc họ Arteviridae, giống Artevirus gây nên. Với
đặc điểm gây sẩy thai ở heo
(Christianse

heo sơ sinh và heo choai
Vào năm 1987, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ và

nhanh chóng bệnh lan sang Canada năm1988. Sau đó, các nƣớc vùng châu Âu cũng
xuất hiện bệnh nhƣ ở Đức vào năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và
1992 ở Pháp. Năm 1998, bệnh đƣợc phát hiện ở châu Á nhƣ Hàn Quốc, Nhật Bản. Từ
năm 2005 trở lại đây, 25 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới
đều có dịch PRRS lƣu hành trừ châu Úc và New Zealand.
Lúc đầu do chƣa biết rõ nguyên nhân gây bệnh nên ngƣời ta gọi bệnh này là
“bệnh thần bí trên heo” (mystery swine disease - MSD). Sau đó, bệnh lây lan rộng trên
toàn thế giới và đƣợc gọi bằng nhiều tên: hội chứng hô hấp và vô sinh của heo (swine
infertility and respiratory disease - SIRS), bệnh bí hiểm ở heo (MSD), hội chứng hô
hấp và sẩy thai ở heo (porcine epidemic abortion and respiratory syndrome-PEARS),
hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo (PRRS), bệnh tai xanh (blue-eared pig disease).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này đã nhất trí dùng tên PRRS (porcine
reproductive and respiratory syndrome) và đƣợc Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công
nhận. Năm 2006, đại dịch PRRS đã xảy ra ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc
bệnh. Trong trận dịch này đã phát hiện sự biến chủng của vi-rút thành chủng độc lực
cao, có khả năng lây lan và gây chết rất nhanh trên heo. Cho đến nay, hội chứng PRRS
đã xảy ra hầu hết các nƣớc có nền chăn nuôi heo công nghiệp phát triển trên thế giới.
Gần đây các ổ dịch xảy ra tại Thụy Điển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc và Việt Nam
diễn biến ngày càng phức tạp (FAO, 2007).
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1997 bằng kiểm tra huyết
thanh học trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dƣơng tính). Năm 1999
một khảo sát của Cơ quan Thú Y Vùng 6 ở một số trại giống tại các tỉnh phía Nam cho
thấy tỉ lệ heo có huyết thanh dƣơng tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới

68,29%.
3


Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dƣơng, chỉ trong vòng 1
tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận nhƣ Hƣng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái
Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh (Trần Thị Bích Liên, 2008). Từ đó đến nay dịch vẫn
tiếp tục xảy ra ở một số địa phƣơng trong cả nƣớc. Tháng 7 năm 2007 tại Long An
cũng xác định có dịch với 91 heo mắc bệnh và 8 con chết, điều đó có nghĩa là bệnh đã
xuất hiện ở Đồng bằng sông Cửu Long. Theo đánh giá không chính thức, hiện nay hội
chứng PRRS có thể đã chuyển sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có bệnh
(Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2008). Kết quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm trên
heo cho thấy chủng PRRSV tại Việt Nam hiện nay có mức độ tƣơng đồng cao về di
truyền so với PRRSV chủng độc lực cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và ctv,
2008).
2.2 Đặc điểm vi-rút gây

hô hấp trên heo (PRRSV)

2.2.1 Phân loại vi-rút PRRS
Vi-rút PRRS gây bệnh đƣợc phân lập vào năm 1991 tại Lelystad, Hà Lan. Tuy
nhiên việc phân lập đƣợc vi-rút trong các mẫu máu heo heo trữ cho thấy vi-rút đã hiện
diện trong đàn heo từ năm 1979.

Hình 2.1 Hình dạng bên ngoài PRRSV ( www.agraroldal.hu).
PRRSV thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades. Ba đặc tính
quan trọng đáng lƣu ý của giống Arterivirus nói chung và PRRSV nói riêng là gây
nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng, nhân lên trong các đại thực bào
và có khả năng biến đổi gen vất lớn.
Hiện nay, PRRSV đã đƣợc định với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc từ

châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) (Meulenberg v
4

tv, 1993).


Ngoài ra, trong mỗi kiểu gen còn có nhiều chủng khác nhau đã đƣợc phân lập. Việc so
gen đã thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa hai nhóm này. Ở Bắc

sánh

Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù

o cáo đã cô lập đƣợc kiểu gen

EU (Ropp, 2004). Ở châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và cho đến năm 1998 vẫn chƣa
có chủng nào thuộc kiểu gen NA đƣợc xác lập ở phía Tây châu Âu (Madsen và ctv,
1998). Ở châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã đƣợc xác định.
2.2.2 Cấu trúc phân tử của PRRSV
của PRRSV

2.2.2.1.

-rút RNA dạng sợi đơn, thẳng,

PRRSV

. Hạt PRRSV có dạng hình

cầu với đƣờng kính khoảng 45 đến 65 nm đối với chủng PRRSV châu Âu (Wensvoort

và ctv, 1991) và từ 48 đến 83 nm đối với chủng Bắc Mỹ (Benfield và ctv, 1992; Dea
và ctv, 1992)

.
vỏ capsid

ong

bộ gen

phức hợp protein

(Conzelmannl và ctv;
tạo

rotein xuyêm
-

quanh nhân. Hai glycoprotein chính

ng M (integral membrane protein

GP5 (major viral glycoprotein-GP5) xung
-

hiện diện ít

ctv, 1995

PRRSV

Lelytad, trong khi PRRSV
ctv, 1998).

Hình 2.2 Cấu trúc virion PRRSV (www.porcilis-prrs.com)

5

hâu Âu


2.2.2.2. B

PRRSV

Chuỗi hệ gen đầy đủ của PRRSV đƣợc xác lập vào năm 1993, có kích thƣớc
khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 9

hai đầu và hai
ở 2 đầu,

i đầu

2.4). Gần đây, một protein cấu trúc non-

glycosylated đƣợc xác định và biểu hiện từ ORF2b

. Một khung

đọc mở nhỏ ORF2b nằm bao trọn trong ORF2a (Wu và ctv, 2001)

-UTR, chúng chiếm giữ kh
chuyển ribosomal. Vùng overlap ORF1a/ORF1b chứa những tín hiệu thúc đẩy khung
dịch chuyển này. ORF 2 protein cấu trúc

-UTR, mã hóa một loạt các

vi-rút nhƣ: protein vỏ ngoài (E) (Envelop protein) và protein
ctv, 1995). Chiều dài của „5UTR

nhân capsid (N) (Nucleocapside protein)

là 190 nucleotide cho PRRSV chủng Bắc Mỹ (Nelson và ctv, 1999) và 221 nucleotide
cho PRRSV chủng châu Âu (Meulenberg và ctv, 1995). Vùng 3‟UTR chủng Bắc Mỹ
và chủng PRRSV châu Âu lần lƣợt là 150 và 120 base (Meng và ctv, 1994).

; GP3 (ORF3);
(ORF5);

protein vỏ

M (ORF6); protein

ngoài, E (ORF2b) (H

)

-

protein N (14 - 15 kDa), M (18 -

-

;

Rowland, 2003).
nucleocapsid, N (14 –
l

-

128 aa

(Mardassi
V Bắc

1996). P

c

aa
ctv, 1998; Wootton

, 1998). Protein N
-

sal

6

,

P
trong sự sao chép (Rowland, 2003).
Protein GP5 (~ 26 kDa), do gen ORF5
– 19 kDa)
“heterodimer”
V,
“dimer”
-rút (Lee
PRRSV

gây ra

PRRSV

-specific proliferation

responses) (Bautista, 1999).
PRRSV ngƣ

V Bắc

-

V châu

c

aa

-

–
30 kDa), GP3 (41 –

–
“multimeric”
-

ctv

(ORF2b
-

gen
c
7

-


c
xit amin

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PRRS vi-rút (www.porcilis-prrs.com)
2.2.3 Phân bố bệnh PRRS
Hội chứng PRRS đã xuất hiện ở Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan rộng
khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to lớn cho ngành chăn nuôi heo của nƣớc này (Chen
và ctv, 2006). Gần đây, chủng PRRSV Trung Quốc độc lực cao đã đƣợc nhắc đến
nhiều do khả năng gây bệnh và chết với tỷ lệ cao. Nhiều công trình đã cung cấp những

thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV này với các chủng vi-rút trên thế
giới, đồng thời lập những giả thuyết cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các chủng virút động lực cao nhƣ hiện nay (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và ctv, 2007;
Tian và ctv, 2007; Feng và ctv, 2009). Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn bùng nổ ở
Trung Quốc gây tỷ lệ chết lớn và chủ yếu ảnh hƣởng đến heo nái và heo trƣởng thành.
Theo Tian và ctv (2007) vi-rút gây bệnh vẫn là PRRSV nhƣng với độc lực cao hơn
nhiều với đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở acid amin (aa) 482 và đột biến
thứ hai là mất liên tục 29 aa, từ aa thứ 534 đến aa thứ 562. Từ các kết quả này, Tian và
ctv (2007) đã xây dựng nên những giả thuyết ban đầu về sự tiến hóa của các chủng
PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với vùng tiến
hóa của các chủng vi-rút Bắc Mỹ lƣu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hƣởng về mặt địa
lý hay môi trƣờng nhƣ nhiệt độ và ẩm độ cao vào mùa hè hay sự nhiễm các vi khuẩn
thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng vi-rút độc lực.

8


Hiện nay, chủng HV-PRRSV đã lây sang vùng Đông Nam Á. Trong năm 2007,
Việt Nam và Philipin đều phát hiện vi-rút này. Tại Thái Lan chủng vi-rút độc lực cao
đựợc tìm thấy năm 2008 nhƣng tình hình dịch bệnh bùng phát chậm (năm 2008 phát
hiện 25 trƣờng hợp còn 2009 tăng nhẹ thành 33). Kết quả nghiên cứu của Youjun Feng
và cộng sự năm 2007 đã khẳng định chủng PRRSV tại Việt Nam và Trung Quốc tƣơng
đồng với nhau, đều là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của vi-rút: bị mất 30
acid amin trong vùng NSP2. Tại Việt Nam, toàn bộ chuỗi gen M của chủng vi-rút gây
bệnh ”tai xanh” phân lập từ heo bệnh tại Quảng Nam (Việt Nam) năm 2007, ký hiệu
TXMT1 (VN), có độ dài 525 bp đã đƣợc thu nhận và giải trình tự. Thành phần
nucleotide, acid amin biểu hiện từ gen M của chủng TXMT1 đƣợc sử dụng để phân
tích và so sánh đồng nhất về nucleotide và tƣơng đồng về acid amin giữa chủng này
với một số chủng của Trung Quốc phân lập trong các năm 2006 - 2008 và thế giới.
Chủng TXMT1 (Việt Nam) đƣợc xác định thuộc vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản
và hô hấp ở heo (PRRSV), type II (chủng Bắc Mỹ), có tỷ lệ đồng nhất (identity) về

thành phần nucleotide và tỷ lệ tƣơng đồng (homology) về acid amin rất cao (99 100%) với các chủng của Trung Quốc; thấp hơn (94% nucleotide; 96% acid amin) so
với chủng VR2332 và rất thấp (69% nucleotide; 79% acid amin) so với chủng
Lelystad. Chủng TXMT1 chỉ có 2 - 3 vị trí nucleotide khác biệt so với các chủng
Trung Quốc, trong khi đó có đến 28 vị trí khác so với chủng VR2332 (type II, chủng
Bắc Mỹ) và rất nhiều so với các chủng châu Âu (type I). Khác biệt V (valine)/I
(isoleucine) ở vị trí 24 của chuỗi polypeptide M là nét đặc trƣng giữa chủng TXMT1
với tất cả các chủng thuộc chủng Bắc Mỹ và châu Âu. Đặc tính gen M cho thấy, chủng
TXMT1 của Việt Nam có biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh
cùng với các chủng PRRSV của Trung Quốc, dẫn đến suy đoán, tác nhân gây PRRS
cƣờng độc cao này có tại Việt Nam rất có thể là do từ Trung Quốc vào (Lê Thanh Hòa
và ctv , 2009).

9


Hình 2.4 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nƣớc trên thế giới

(Tổ chức dịch tể thế giới OIE, 2007).
2.3 Một số phƣơng pháp chẩn đoán PRRSV trong phòng thí nghiệm
2.3.1 Chẩn đoán PRRSV trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Việc phân lập PRRSV vẫn còn nhiều khó khăn vì do đặc điểm khó nuôi cấy trên
môi trƣờng tế bào. Vir-rút PRRS chỉ phát triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào
túi phổi heo (porcine alveolar macrophage- PAMs) và một số dòng tế bào thận khỉ
châu Phi (African monkey kidney cell). Tuy nhiên hiện nay ngƣời ta chƣa thành công
trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy nhân tạo. Các dòng tế bào thận
khỉ thƣờng không nhạy cảm cho tất cả chủng virus PRRS, nhất là đối với các chùng
PRRSV dòng châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.3.2

(Immunoperoxidase Monolayer Assay IMA)

Kỹ thuật này thực hiện bằng cách nuôi cấy tế bào đại thực bào túi phổi một lớp

trên các đĩa. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ đƣợc gây nhiễm PRRSV với liều 105
TCID và đƣợc ủ ở 37 oC trong 24 giờ. Tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc cố định và cho
tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1giờ ở 37 oC và đƣợc cho tác dụng tiếp tục
với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO. Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể
kháng PRRSV, 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm

10


sớm, ngƣời ta thƣờng sử sụng kỹ thuật IPMA do độ nhạy của IPMA cao hơn ELISA
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Indirect Immunoflourescence assay – IFA)

2.3.3

Giống nhƣ trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Tùy
dòng vi-rút cần chẩn đoán mà sử dụng loại tế bào khác nhau. Để xét nghiệm vi-rút
dòng châu Mỹ ngƣời ta thƣờng sử dụng tế bào MARC-145. Quá trình thực hiện kỹ
thuật IFA cũng gần giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không
cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC. Sự hiện diện màu
huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng vi-rút (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007). Ƣu điểm của phƣơng pháp này là hiệu giá kháng thể có thể đƣợc xác
định trong giới hạn rộng và hữu dụng trong các trƣờng hợp mới nhiễm hay cấp tính.
Nhƣợc điểm là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn.
2.3.4 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reation)
Kỹ thuật RT-PCR không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần
thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn. Vì thế RT-PCR đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong
chẩn đoán phát hiện PRRSV. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV có thể sử

dụng kỹ thuật nested-RT-PCR (RT-nPCR). RT-PCR đƣợc thực hiện với các cặp mồi
khác nahu cho phép phát hiện gen của ORF7, ORF6 hay ORF1b của PRRSV. PRRSV
có 2 kiểu gen : châu Âu và châu Mỹ. Hai chủng này có độ tƣơng đồng về gen khoảng
52 đến 81%. Dựa trên cơ sở đó nhiều cặp mồi đã đƣợc thiết kế để phát hiện PRRSV
nói chung và để phân biệt dòng PRRSV Bắc Mỹ với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải,
2007).
2.4 Phƣơng pháp RT-LAMP (Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal
Amplification)
2.4.1 Khái niệm RT-LAMP
Phƣơng pháp RT-LAMP (reverse transcriptase loop-mediated isothermal
amplification) là phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt trình tự RNA. Phƣơng pháp này
hoạt động dựa trên sự bắt cặp của 4 loại mồi vào 6 vị trí đặc biệt trên gen mục tiêu.
Dƣới tác dụng của enzyme reverse transcriptase, cDNA đƣợc tổng hợp từ khuôn mẫu
RNA có trong mẫu. Tiếp theo, DNA polymerase có hoạt tính thay mạch (DNA

11


polymerase bị bất hoạt hoạt tính exo nên chỉ có khả năng kéo dài một đoạn DNA rất
dài) tổng hợp và kéo dài trình tự DNA mạch đôi trên khuôn mẫu cDNA.
2.4.2 Thành phần phản ứng và vai trò của chúng trong phản ứng RT-LAMP
Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng RT-LAMP bao gồm:
+ RNA mẫu: trong mẫu bệnh phẩm có vai trò làm khuôn cho phản ứng RT-LAMP.
+ Buffer (thƣờng là thermopol buffer): tạo môi trƣờng thuận lợi cho enzyme và
các thành phần phản ứng khác hoạt động.
+ Betain: có vai trò trong việc tách mạch đôi cDNA ở điều kiện nhiệt độ 60 – 65
o

C. Betain làm cho cầu nối Hydro trong mạch đôi của cDNA trở nên lỏng lẻo và dễ

dàng tách ra ở nhiệt độ thấp 60 – 65 oC. Đây chính là yếu tố giúp phản ứng RT-LAMP
có thể thực hiện đƣợc ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiều so với phản ứng PCR thông
thƣờng khi nhiệt độ biến tính là khoảng 90 – 95 oC.
+ Mg2+ (thƣờng là MgSO4): giúp cho enzyme hoạt động tốt. Ở phản ứng LAMP
và RT-LAMP thƣờng sử dụng MgSO4 vì gốc SO42- sẽ kết hợp với gốc PO32+ ở đầu 5‟
của các dNTP đƣợc giải phóng ra dung dịch sau phản ứng. Khi kết hợp lại chúng tạo ra
phức hợp kết tủa (P2(SO4)3) làm cho dung dịch sau phản ứng bị đục và giúp nhận diện
phản ứng bằng mắt thƣờng.
+ dNTP: nguyên liệu cho quá trình tổng hợp cDNA và DNA trên khuôn mẫu
RNA.
+ Mồi (4 - 6 mồi) gồm 2 outer mồi (B3, F3), 2 inner mồi (FIP và BIP) và 2 loop
mồi (LF và LB): thành phần quan trọng giúp phản ứng xảy ra và đặc hiệu cho khuôn
mẫu RNA. Trong đó FIP và BIP có khả năng đóng vòng (loop) giúp cho phản ứng RTLAMP xảy ra liên tục và tổng hợp sợi DNA có kích thƣớc lớn.
+ Reverse transcriptase enzyme: enzyme giúp tổng hợp cDNA từ khuôn mẫu
RNA.
+ DNA polymerase có hoạt tính thay mạch (thƣờng là bst polymerase): có nhiệt
độ tối ƣu ở 60 – 65 oC. Enzyme này là một enzyme DNA polymerase đã bị khử hoạt
tính exo do đó giúp cho phản ứng tổng hợp sợi đôi DNA xảy ra liên tục, kéo dài một
đoạn DNA có kích thƣớc lớn.
+ Nuclear free water: dung môi giúp cân bằng nồng độ các thành phần phản ứng.
12


2.4.3 Các bƣớc trong phản ứng RT-LAMP
Bƣớc 1: mồi BIP chứa trình tự B2 bổ sung vào mạch RNA ở vị trí B2c.

Hình 2.5 Bƣớc 1 trong phản ứng RT-LAMP ()
Bƣớc 2: enzyme reverse transcriptase kéo dài sợi DNA mới từ mồi BIP tạo nên
sợi cDNA.

Hình 2.6 Bƣớc 2 trong phản ứng RT-LAMP ()
Bƣớc 3: mồi B3 bổ sung với sợi RNA tại vị trí B3c và tách sợi DNA mới tổng
hợp ở bƣớc 2 bởi mồi BIP ra khỏi mạch đôi của cDNA. Sợi đơn DNA bị đẩy ra này
đóng vòng tại vị trí B1 và B1c. Tiếp theo, mồi FIP chứa trình tự F2 bổ sung với sợi
đơn này tại vị trí F2c.

Hình 2.7 Bƣớc 3 trong phản ứng RT-LAMP ()
Bƣớc 4: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi DNA mới từ mồi FIP.

Hình 2.8 Bƣớc 4 trong phản ứng RT-LAMP()

13