KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME
AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE
CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: ĐỖ TÔ HOA MAI
Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 7 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME
AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE
CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRƢƠNG PHƢỚC THIÊN HOÀNG

ĐỖ TÔ HOA MAI

Tháng 7 năm 2012


LỜI CÁM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại
Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng.
Cám ơn các thầy cô ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trong và
ngoài trƣờng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt mọi kiến thức quý báu cho tôi trong suốt
quá trình học tại trƣờng.
Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên Hoàng đã tận tình hƣớng
dẫn, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận.
Xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị làm việc tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ
Sinh Học và Môi Trƣờng trƣờng Đại học Nông Lâm đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá
trình thực tập tại Viện.
Cám ơn các anh chị và các bạn cùng thực tập tại Viện Nghiên Cứu Công Nghệ
Sinh Học và Môi Trƣờng trƣờng Đại học Nông Lâm đã khuyến khích, ủng hộ và giúp
đỡ tôi thực hiện tốt khóa luận này.
Gửi lời cám ơn đến các bạn bè thân yêu lớp DH08SH và những ngƣời bạn thân
yêu khác của tôi, các bạn đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ và chia sẻ vui buồn
cùng tôi trong suốt thời gian qua.
Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ và các thành viên trong gia đình đã quan

tâm, chăm sóc, luôn làm chỗ dựa vững chắc cho con vƣợt qua mọi khó khăn.
Sinh viên thực hiện
Đỗ Tô Hoa Mai

i


TÓM TẮT
Ngày nay trên thế giới và trong nƣớc, chế phẩm sinh học đƣợc các ngành chăn nuôi,
trồng trọt quan tâm nhiều, bởi vì chúng giúp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh, tăng
khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ở vật nuôi, giảm bớt một phần thuốc trừ sâu và chất
hóa học sử dụng trong trồng trọt, giúp tận dụng các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp,
và biến đổi chúng thành các sản phẩm có giá trị sử dụng cao. Ngoài ra, chế phẩm sinh học
giúp các nhà sản xuất thu về lợi nhuận cao chỉ với chi phí đầu tƣ thấp, ngƣời nông dân
không cần những kiến thức chuyên sâu về sinh học vẫn có thể dễ dàng sử dụng.
Nhằm đáp ứng những nhu cầu sử dụng ngày càng tăng, đa dạng hóa sản phẩm
chế phẩm sinh học, nâng cao chất lƣợng và tính an toàn của sản phẩm, nghiên cứu
“Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase
của vi khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong
chăn nuôi” đƣợc thực hiện. Các nội dung đƣợc thực hiện trong nghiên cứu là định tính
và định lƣợng enzyme, khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho sự sinh tổng hợp
enzyme của B. subtilis nhƣ thời gian nuôi cấy và mật độ giống nuôi cấy, kiểm tra chất
lƣợng chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.
Ở mỗi enzyme, chủng Bacillus subtilis cho khả năng sinh enzyme cao là chủng Ba
82 (enzyme lipase), chủng Ba 71 (enzyme cellulase), chủng Ba 58 (enzyme protease,
phytase, và protease). Thời gian nuôi cấy tối ƣu là 36 giờ đối với enzyme lipase và
phytase, 42 giờ đối với enzyme cellulase và protease, 66 giờ đối với enzyme amylase.
Mật độ giống nuôi cấy tối ƣu là 108 cfu/g (enzyme lipase, phytase và amylase), 106 cfu/g
(enzyme cellulase), 109 cfu/g (enzyme protease). Trong thí nghiệm nuôi cấy thu nhận
chế phẩm, dạng nuôi cấy 500 g luôn cho hoạt độ enzyme thấp. Thời gian bảo quản 15

ngày quá ngắn, không thấy đƣợc sự thay đổi hoạt độ enzyme và mật số vi khuẩn.

ii


SUMMARY

Currently, bio-products in livestock, crops are very much interested, because they help
limit the use of antibiotics, increasing digestibility and food intake in animals, reduce a
pesticide and chemical use in farming, which make use of waste in agricultural
products and transform them into products with higher value uses.
To meet the demand for increasing diversification of biological products, improving
quality and safety of the product, conduct research project "Survey ability biosynthesis
enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase of Bacillus subtilis and
experimental production of biological products used in animal husbandry ".
Aim of the study were qualitation and quantitation of enzymes from Bacillus subtilis,
surveying the optimal culture conditions for the biosynthesis enzyme of B. subtilis such
as culture time and the bacteria density, quality control and storage for the product.
In each enzyme, Bacillus subtilis strains capable of high enzyme synthesis are strain
Ba 82 (enzyme lipase), strain Ba 71 (cellulase enzyme), strain Ba 58 (protease
enzyme, phytase, and protease), optimal culture time was 36 h for lipase and phytase
enzyme, 42 h for cellulase and protease enzyme, 66 hours for the enzyme amylase.
Density of optimal bacterial culture is 108 CFU/g (enzyme lipase, phytase, and
amylase), 106 CFU/g (enzyme cellulase), 109 CFU/g (protease). Type culture pilot (500
g) always has low enzyme activity. Shelf life of products in 15 days is too short, do not
affect enzyme activity and bacterial density.

Keyword: Amylase, Bacillus subtilis, cellulase, lipase, phytase, protease.

iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cám ơn ............................................................................................................................... i
Tóm tắt.................................................................................................................................... ii
Summary................................................................................................................................iii
Mục lục .................................................................................................................................. iv
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................... vii
Danh sách các bảng .............................................................................................................viii
Danh sách các hình, biểu đồ ................................................................................................viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1

1.2.

Yêu cầu ................................................................................................................. 1

1.3.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 1

Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 2
2.1.

Sơ lƣợc về Bacillus subtilis .................................................................................. 2

2.1.1.

Lịch sử phát triển .................................................................................................. 2

2.1.2.

Phân loại khoa học và đặc điểm ........................................................................... 2

2.1.2.1

Phân loại khoa học................................................................................................ 2

2.1.2.2

Đặc điểm của Bacillus subtilis.............................................................................. 2

2.2.

Khái quát chung về enzyme.................................................................................. 4

2.2.1.

Enyme amylase ..................................................................................................... 4

2.2.1.1

Nguồn thu nhận enzyme amylase ......................................................................... 4

2.2.1.2

Đăc tính của enzyme amylase .............................................................................. 4

2.2.1.3

Ứng dụng của enzyme amylase ............................................................................ 5

2.2.2.

Enzyme cellulase .................................................................................................. 6

2.2.2.1

Nguồn thu nhận enzyme cellulase ........................................................................ 6

2.2.2.2

Đặc tính của enzyme cellulase.............................................................................. 6

2.2.2.3

Cơ chế tác dụng của celllulase.............................................................................. 7

2.2.2.4

Ứng dụng của enzyme cellulase ........................................................................... 7

2.2.3.

Enzyme protease ................................................................................................... 8

2.2.3.1.

Nguồn thu nhận enzyme protease ......................................................................... 8

2.2.3.2

Đặc điểm của enzyme protease ............................................................................ 8
iv


2.2.3.3.

Ứng dụng của enzyme protease ............................................................................ 8

2.2.4.

Enzyme lipase ....................................................................................................... 9

2.2.4.1

Nguồn thu nhận enzyme lipase ............................................................................. 9

2.2.4.2

Ứng dụng của enzyme lipase ................................................................................ 9

2.2.5.

Enzyme phytase ................................................................................................... 9

2.2.5.1

Nguồn thu nhận enzyme phytase .......................................................................... 9

2.2.5.2

Ứng dụng của enzyme phytase ........................................................................... 10

2.3.

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ........................................................ 10

2.3.1

Nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................................... 10

2.3.2

Nghiên cứu ngoài nƣớc ...................................................................................... 11

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 12
3.1.

Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 12

3.2.

Vật liệu ............................................................................................................... 12

3.2.1

Đối tƣợng khảo sát.............................................................................................. 12

3.2.2

Các môi trƣờng dùng trong thí nghiệm .............................................................. 12

3.2.3

Dụng cụ, thiết bị và hoá chất sử dụng trong thí nghiệm ..................................... 13

3.3

Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 14

3.3.1

Các bƣớc thực hiện thí nghiệm ........................................................................... 14

3.3.2

Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào.................................................................. 15

3.3.3.

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme ............................................................ 15

3.3.3.1

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Anson, 1938) ..................... 15

3.3.3.2

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme α-amylase (Heinkel, 1956) ................ 15

3.3.3.3

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase (Miller, 1959) ..................... 15

3.3.3.4

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme phytase (Fiske và Subbarow, 1925) .. 15

3.3.3.5

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme lipase ................................................. 16

3.3.4

Phƣơng pháp định tính enzyme .......................................................................... 16

3.3.5

Phƣơng pháp chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao .................... 16

3.3.6.

Phƣơng pháp khảo sát một số điều kiện ảnh hƣởng ........................................... 16

3.3.6.1

Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy........................................................ 16

3.3.6.2

Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy ................................... 16

3.3.6

Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis, kiểm tra chất lƣợng chế phẩm ..17

3.3.8

Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................ 17

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 18
4.1.

Định tính enzyme của các chủng Bacillus subtilis ............................................. 18
v


4.2.

Định lƣợng hoạt độ enzyme của các chủng Bacillus subtilis ............................. 19

4.2.1

Định lƣợng hoạt độ enzyme lipase ..................................................................... 19

4.2.2

Định lƣợng hoạt độ enzyme amylase ................................................................. 20

4.2.3

Định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase ................................................................ 20

4.2.4

Định lƣợng hoạt độ enzyme phytase .................................................................. 21

4.2.5

Định lƣợng hoạt độ enzyme protease ................................................................. 21

4.3.

Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp enzyme .... 22

4.3.1.

Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy........................................................ 22

4.3.1.1

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase................. 22

4.3.1.2

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase ............ 23

4.3.1.3

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase............ 24

4.3.1.4

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase.............. 25

4.3.1.5

Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ............ 26

4.3.2.

Khảo sát ảnh hƣởng của mật độ giống cho vào nuôi cấy ................................... 27

4.3.2.1

Ảnh hƣởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme lipase ......... 27

4.3.2.2

Ảnh hƣởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase ..... 28

4.3.2.3

Ảnh hƣởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ..... 28

4.3.2.4

Ảnh hƣởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase ...... 29

4.3.2.5

Ảnh hƣởng của mật độ giống lên khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ..... 29

4.4.

Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau khi sản xuất và sau thời gian bảo quản ....... 30

4.4.1

Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau khi sản xuất ........................................ 31

4.4.2

Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản .............................. 32

Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 33
5.1.

Kết luận .............................................................................................................. 33

5.2.

Đề nghị ............................................................................................................... 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 34
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.subtilis

Bacillus subtilis

DAP

Diammonium phosphate

CMC

Carboxymethyl cellulose

Cfu

Colony forming unit

ctv

Cộng tác viên

TCA

Tricloroacetic acid

Tb

tế bào

UI

Đơn vị hoạt độ quốc tế

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1

Biến thiên đƣờng kính vòng phân giải cơ chất của các enzyme ........... 18

Bảng 4.2

Biến thiên hoạt độ enzyme lipase ......................................................... 19

Bảng 4.3

Biến thiên hoạt độ enzyme amylase ...................................................... 20

Bảng 4.4

Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase ..................................................... 20

Bảng 4.5

Biến thiên hoạt độ enzyme phytase ........................................................... 21

Bảng 4.6

Biến thiên hoạt độ enzyme protease ..................................................... 21

Bảng 4.7

Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo thời gian nuôi cấy.................... 23

Bảng 4.8

Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo thời gian nuôi cấy ................. 23

Bảng 4.9

Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo thời gian nuôi cấy ................. 25

Bảng 4.10 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi cấy ................. 26
Bảng 4.11 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo mật độ giống ........................... 27
Bảng 4.12 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo mật độ giống ........................ 29
Bảng 4.13 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo mật độ giống ....................... 30
Bảng 4.14 Hoạt độ enzyme trong chế phẩm sau khi sản xuất ................................ 31
Bảng 4.15 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm sau khi sản xuất ................................ 31
Bảng 4.16 Hoạt độ enzyme, mật số vi khuẩn trong chế phẩm sau 15 ngày bảo quản ....... 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ
Hình 2.1

Vi khuẩn Bacillus subtilis. ................................................................... 2

Hình 3.1

Sơ đồ thực hiện thí nghiệm ................................................................ 14

Biểu đồ 4.1

Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian nuôi cấy. .......... 24

Biểu đồ 4.2

Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo mật độ giống nuôi cấy. .... 28

Biểu đồ 4.3

Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo mật độ giống nuôi cấy .... 28

viii


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lƣơng thực, thực phẩm luôn là nhu cầu cấp thiết của con ngƣời, do đó các nƣớc trên
thế giới đầu tƣ rất nhiều vào phát triển ngành nông nghiệp nhằm tăng sản lƣợng và nâng
cao chất lƣợng sản phẩm. Bên cạnh việc ứng dụng các tiến bộ khoa học vào phát triển
nông nghiệp, việc lạm dụng các chất hóa học độc hại và kháng sinh trong sản xuất gây
thiệt hại nghiêm trọng đến môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời. Khi nhận thức đƣợc mặt tác
hại đó, con ngƣời bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu của lĩnh vực Công nghệ
sinh học cho phát triển “nền nông nghiệp xanh” nhƣ chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây
trồng, nhân giống in vitro sản xuất cây sạch bệnh, chế phẩm sinh học (probiotic) và một

số các thành tự khác.Trong hàng loạt ứng dụng, chế phẩm sinh học đƣợc các ngành chăn
nuôi, trồng trọt quan tâm nhiều, bởi vì các chế phẩm này giúp hạn chế việc sử dụng thuốc
kháng sinh, tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ở vật nuôi, giảm bớt một phần
thuốc trừ sâu và chất hóa học sử dụng trong trồng trọt, giúp tận dụng các phế phẩm trong
sản xuất nông nghiệp, biến đổi chúng thành các sản phẩm có giá trị sử dụng cao.
Từ những vấn đề trên và những lợi ích của chế phẩm sinh học, đề tài “Khảo sát
khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase của vi
khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn
nuôi” đƣợc thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Xác định đƣợc các điều kiện nuôi cấy tối ƣu của Bacillus subtilis để bƣớc đầu sản
xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi (chăn nuôi gà).
1.3. Nội dung nghiên cứu
Chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh các enzyme: cellulase, amylase,
lipase, phytase, protease tốt nhất. Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hƣởng đến khả
năng sinh tổng hợp các enzyme của các chủng B. subtilis trên môi trƣờng bán rắn. Từ
đó xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Đồng thời, kiểm tra
chất lƣợng chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản.

1


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về Bacillus subtilis
2.1.1.

Lịch sử phát triển

Bacillus subtilis đƣợc phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ
chức y học Nari của Đức. Lúc đầu, B. subtilis chủ yếu đƣợc sử dụng để phòng bệnh

lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957, Henry và các cộng
sự tách đƣợc các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó, “Subtilistherapy”
có nghĩa là thuốc subtilis ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu
chảy do rối loạn tiêu hóa (www.rense.com).
2.1.2.
2.1.2.1

Phân loại khoa học và đặc điểm
Phân loại khoa học

Theo khóa phân loại của Bergey (2004), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:
Lớp: Bacilli
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.2.2

Đặc điểm của Bacillus subtilis

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis
()

2


Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dƣơng (G +), kích thƣớc
0,5 – 0,8 µm x 1,8 - 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử.
Bacillus subtilis là vi sinh vật hiếu khí nhƣng có khả năng phát triển trong môi
trƣờng thiếu oxy. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng của vi khuẩn là 36 – 50oC, tối
đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt khá cao, pH thích hợp từ 7 - 7,4. Nồng độ muối ăn

làm ngừng sự phát triển của B. subtilis là 10 – 15% (Lƣơng Đức Phẩm, 2000; trích
dẫn bởi Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
Bacillus subtilis thƣờng có mặt trong nƣớc, đất, không khí, xác bã động vật thối
rữa và cả trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Phần lớn chúng cƣ trú trong
đất, thông thƣờng đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g. Đất nghèo dinh
dƣỡng nhƣ vùng sa mạc hay đất hoang, sự hiện diện của B. subtilis rất ít. Nƣớc và
bùn cửa sông cũng nhƣ ở nƣớc biển cũng có mặt bào tử và tế bào B. subtilis (Vũ Thị
Thứ, 1996; trích dẫn bởi Bùi Thị Phi, 2007).
Trên các môi trƣờng nuôi cấy khác nhau, B. subtilis có các hình thái đặc trƣng
khác nhau. Trên môi trƣờng thạch đĩa TSA (Trypcase Soya Agar), B. subtilis cho
khuẩn lạc tròn, rìa răng cƣa không đều, đƣờng kính 3 - 5 mm, màu vàng xám, tâm sẫm
màu. Trên môi trƣờng canh TSB (Trypcase Soya Broth), B. subtilis phát triển làm đục
môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại nhƣ vần mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
Khuẩn lạc B. subtilis phát triển đều, màu vàng hay hồng nâu và có lấm tấm hạt trên
môi trƣờng thạch khoai tây.
Một trong những đặc điểm quan trọng của vi khuẩn B. subtilis là khả năng tạo bào
tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo
chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi. Bào tử B. subtilis
hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào, kích thƣớc bào tử 0,8 – 1,8
µm. Bào tử B. subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid,
có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ, có khả năng chịu đƣợc pH thấp
của dạ dày tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non (Tô Minh Châu, 2000;
trích dẫn bởi Nguyễn Trƣờng Ngọc Tú, 2009). Ngoài ra, Bacillus subtilis có khả năng
tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình sống để thích nghi và tồn tại ở các
điều kiện môi trƣờng khác nhau nhƣ amylase, cellulase, protease, phytase. Hai đặc điểm

3


nổi bật này ở B. subtilis đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhƣ gia tăng, tối ƣu hóa

việc thu nhận enzyme, ứng dụng sản xuất probiotic.
2.2. Khái quát chung về enzyme
Enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học, có bản chất là protein. Chúng có
trong tế bào của mọi sinh vật, thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh
vật. Các loại enzyme đều có những đặc tính sinh học chung nhƣ: đƣợc tạo ra trong tế bào
sinh vật, tham gia phản ứng trong tế bào sống và cả khi đƣợc tách khỏi tế bào sống, tham
gia phản ứng trong nhiệt điều kiện nhiệt độ ôn hòa, chịu sự điều khiển bởi gen và các điều
kiện phản ứng, phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lƣợng rất ít.
2.2.1.

Enzyme amylase

2.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme amylase
Amylase là một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thƣơng mại và lịch sử.
Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, có cả ở thực vật, động vật và vi sinh vật.
Amylase đƣợc tinh sạch từ malt vào năm 1835 bởi Anselme Payen và Jean Persoz.
Enzyme amylase là một trong những loại enzyme đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất trong
công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực khác. Một số hạt thực vật (hạt nảy mầm) và một số
loài vi sinh vật (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) là nguồn thu các chế phẩm enzyme
amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lƣợng lớn các enzyme này trong những
điều kiện xác định. Ngày nay, do có ƣu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành
nguồn thu enzyme chủ đạo.
2.2.1.2 Đặc tính của enzyme amylase
Hiện nay, ngƣời ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase
(hay glucoamylase) thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside của tinh bột, glycogen và các
polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại là dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6glucanhydrolase và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thủy phân các liên kết
α-1,6-glucoside (Nguyễn Đức Lƣợng, 2010).
 α-amylase
α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía
bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu

nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột
mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Dƣới tác dụng của α-amylase, tinh
bột có thể chuyển thành maltotetrose, glucose, maltose và dextrin phân tử thấp.
4


Thông thƣờng, α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không bắt màu với iodine và một ít maltose.
α-amylase dễ tan trong nƣớc, trong các dung dịch muối và rƣợu loãng. α-amylase
bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các
kim loại nặng nhƣ Cu2+, Ag+, Hg2+. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn
khác nhau thƣờng không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ
nấm sợi là 4,5 – 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 – 5,8), của đại mạch nảy
mầm và thóc nảy mầm là 5,3 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,7 – 5,4), vi
khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 – 7,0).
Độ bền của α-amylase bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ và pH. Độ bền với acid của α-amylase
malt kém hơn so với độ bền của α-amylase nấm mốc. Nhiệt độ tối thích của α-amylase là
50oC. α-amylase của thóc mầm và malt bền nhiệt hơn, hoạt động tối thích ở 58 – 60oC.
Amylase của vi khuẩn có thể chịu đƣợc nhiệt độ 92oC, còn amylase của nấm sợi bị vô hoạt ở
70oC. Tình bền nhiệt của amylase vi khuẩn là một ƣu điểm lớn, do đó amylase vi khuẩn đƣợc
sử dụng để sử lý nguyên liệu ở các công đoạn dùng nhiệt độ cao.
 β-amylase
β-amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm; vi khuẩn không có
β-amylase. β-amylase cúc tác sự thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và
polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch. β-amylase hầu
nhƣ không thủy phân các hạt tinh bột nguyên vẹn nhƣng thủy phân hồ tinh bột mạnh.
 Glucoamylase
Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong polysaccharide, tách tuần tự
từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase có khả năng xúc tác
thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucan. Chúng có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh

bột, glucgen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose.
2.2.1.3 Ứng dụng của enzyme amylase


Trong sản xuất bánh mì
Ngƣời ta sử dụng β-amylase, α-amylase để thủy phân tinh bột thành đƣờng. Nhờ

đó, nấm mem Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2,
làm tăng thể tích của bánh, tạo màu sắc và hƣơng vị tốt cho bánh. Nguồn enzyme
amylase sử dụng trong sản xuất bánh mì thƣờng là malt. Nhƣng trong những năm gần
đây, nguồn malt dần thay thế bằng nguồn nguyên liệu từ nấm sợi.
5




Trong sản xuất rƣợu, bia, cồn
Vài chục năm trở lại đây, chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae,

Asp. awamori) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) thay thế malt
làm tác nhân đƣờng hóa tinh bột trong sản xuất rƣợu, bia, cồn từ nguyên liệu tinh bột.


Trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa
Các enzyme amylase của vi khuẩn sẽ làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do

carbohydrate trong quần áo. Amylase vi khuẩn đƣợc bao lại và phối trộn với các thành
phần khác của chất tấy rửa. Enzyme này thƣờng chịu đƣợc nhiệt độ cao và pH kiềm.


Trong công nghiệp dệt
Ngƣời ta dùng amylase để thủy phân nhanh lƣợng tinh bột thừa trong quá trình

xử lý vải bản đầu. Quá trình sử dụng enzyme amylase này còn đƣợc gọi là quá trình rũ
hồ vải. Trƣớc đây, ngƣời ta sử dụng enzyme α-amylase của malt hay pancreatic
amylase, sau đó thay thế bằng amylase của vi khuẩn.


Một số ứng dụng khác của enzyme amylase
Ngoài những ứng dụng trên, enzyme amylase còn có nhiều ứng dụng trong y học,

chăn nuôi. Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, B. subtilis
thêm vào thức ăn giàu tinh bột của động vật (nhất là động vật còn non) làm tăng khả
năng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng. (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
2.2.2. Enzyme cellulase
2.2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện
hiếu khí và yếm khí. Cellulose đƣợc phân hủy bởi vi sinh vật theo thứ tự, tạo sản phẩm
cuối cùng là glucose. Số lƣợng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme
cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi
khuẩn và một số trƣờng hợp có cả nấm men; một số vi sinh vật đƣợc các nhà khoa học
nghiên cứu kỹ là Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Fusarium culmorum,
Trichoderma roseum, Altenaria tenuis, Penicillium spp.
2.2.2.2 Đặc tính của enzyme cellulase
Theo Nguyễn Đức Lƣợng (2010), enzyme tham gia thủy phân hủy cellulose đƣợc
phân làm ba nhóm chủ yếu là 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase, 1,4 β-D-glucan 4
glucanohydrolase, β-D glucoside glucohydrolase.

6

1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase là enzyme cắt đầu không khử của chuỗi
cellulose để tạo thành cellobiose. Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose
dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme
endocellulase phân giải chúng. Enzyme này còn có một loạt các tên khác nhƣ:
cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase.
1,4 β-D-glucan 4 glucanohydrolase là enzyme tham gia phân giải liên kết β-1,4
glucoside trong cellulose, lichenin và β-Dglucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là
cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzyme này còn có một loạt các tên khác nhƣ:
endoglucanase, endo 1,4 β-glucanase, C-cellulase.
β-D glucoside glucohydrolase là enzyme tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành
glucose. Chúng không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu
khoa học, chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase.
2.2.2.3 Cơ chế tác dụng của enzyme cellulase
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzyme
cellulase nhƣ endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Một trong ba loại enyme
trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose. Mỗi loại enzyme chỉ tham gia
thủy phân một phần nào đó trong cellulose. Trong thiên nhiên, những loài vi sinh vật
chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme trong hệ enzyme cellulase, do đó một
loại vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy cellulose
bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật (nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, lƣợng ezyme), yếu
tố hết sức quan trọng khác là tính đồng bộ của hệ enzyme từ nhiều nguồn vi sinh vật khác
nhau. Quá trình thủy phân cellulose chỉ có thể đƣợc tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi
sử dụng đồng bộ ba loại enzyme cellulase (Nguyễn Đức Lƣợng, 2010).
2.2.2.4 Ứng dụng của enzyme cellulase
Các enyme cellulase đƣợc sử dụng rộng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ công
nghiệp giấy và sản xuất bột giấy (xử lý bột giấy), công nghiệp dệt (giữ màu vải, làm
mềm vải jean), xử lý môi trƣờng, công nghiệp thực phẩm (trong sản xuất nƣớc giải khát,
bia), công nghiệp chất tẩy rửa và sản xuất cồn, trong chăn nuôi (bổ sung vào thức ăn)

7


2.2.3. Enzyme protease
2.2.3.1 Nguồn thu nhận enzyme protease
Cũng nhƣ enzyme amylase, enzyme protease có thể đƣợc thu nhận từ nhiều
nguồn khác nhau nhƣ động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, sự phân bố của
chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau. Tên gọi của enzyme
protease có thể thay đổi tùy vào nguồn thu nhận và vị trí thu nhận.
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở
trong tế bào hoặc đƣợc tiết vào môi trƣờng nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã sản
xuất quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp,
trong nông nghiệp và trong y học. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh
protease nhƣ B. cereus, B. subtilis, xạ khuẩn (Str. griseus, Str. fradiae), nấm mốc (Asp.
oryzae, Mucor, B. pusillus, Rh. nodous).
2.2.3.2 Đặc điểm của enzyme protease
Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp, các nhà khoa học đã phân các
protease vi sinh vật thành bốn nhóm: protease-xerin, protease-thiol, protease-kim loại,
protease-acid. Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của
chúng: protease-kiềm, protease-trung tính, protease-acid. Trong bốn nhóm protease kể trên,
các protease-xerin và protease-thiol có khả năng phân giải liên kết ester và liên kết amide
của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngƣợc lại, các protease kim loại, protease acid
thƣờng không có hoạt tính esterase amidase đối với các dẫn xuất của amino acid.
Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu tƣơng đối kỹ về cấu tạo
phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lƣợng
phân tử của các enzyme này tƣơng đối bé, nhất là các protease – xerin. Các protease-xerin có
trọng lƣợng phân tử vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton, trọng lƣợng phân tử của protease
kim loại lớn hơn so với protease-xerin. Protease-thiol và nhiều protease acid cũng có trọng
lƣợng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton (Nguyễn Đức Lƣợng, 2010).

2.2.3.3 Ứng dụng của enzyme protease
Trong công nghiệp, protease đƣợc sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực
phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ nhƣ: ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm
bánh mì, nƣớc giải khát, thuộc da, dệt, phim ảnh. Ngoài ra protease còn đƣợc sử dụng bổ
sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng và kem bôi mặt. Chúng có tác dụng loại bỏ
lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi.
8


Trong công nghiệp dƣợc phẩm và y học, protease đƣợc sử dụng để sản xuất các
thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những ngƣời bị bệnh tiêu hóa kém do dạ
dày, tụy tạng hoạt động không bình thƣờng, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh
mạch. Protease cũng đƣợc dùng làm tiêu mủ ở các vết thƣơng, các ổ viêm, làm thông
đƣờng hô hấp và thủy phân sơ bộ protein làm môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật.
Trong chăn nuôi, sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm
tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thủy phân giàu đạm bổ
sung vào thức ăn của lợn và gia cầm (Bùi Thị Phi, 2007).
2.2.4. Enzyme lipase
2.2.4.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase
Lipase là enzyme carboxylesterase tham gia thủy phân gluceride. Lipase đƣợc
phân bố rộng trong các loài động vật, thực vật và vi sinh vật. Tùy thuộc vào nguồn gốc
thu nhận và tính chất, ngƣời ta chia enzyme này ra những loại sau: pancreatic lipase,
pregastric lipase và lipase từ vi sinh vật.
Pancreatic lipase là enzyme đƣợc thu nhận từ tuyến tụy của heo, tham gia phân hủy
triglyceride tự nhiên, dầu, chất béo, acid béo đơn giản và aryl ester. Pregastric lipase
đƣợc sản xuất từ nguồn động vật (cừu, dê), tham gia quá trình thủy phân acid béo chuỗi
ngắn trong chất béo của sữa, đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất phomai. Nhiều nƣớc
trên thế giới sản xuất lipase từ vi sinh vật bằng phƣơng pháp lên men. Vi sinh vật sử
dụng để sản xuất lipase theo quy mô công nghiệp là nấm sợi và vi khuẩn. Các chế
phẩm thƣơng mại này thƣờng chứa lipase và estease (Nguyễn Đức Lƣợng, 2010).

2.2.4.2 Ứng dụng của enzyme lipase
Ứng dụng enzyme lipase để thủy phân lipid không chỉ trong y học mà còn phát triển
mạnh trong công nghiệp thực phẩm nhƣ sản xuất phomai (tạo hƣơng vị đặc trƣng) và chế
biến nƣớc mắm, trong chế biến dầu và chất béo, trong công nghệ da (xử lý thành phần
lipid trong da động vật), trong sản xuất chất tẩy rửa (phân hủy các vết bẩn từ dầu mỡ).
2.2.5. Enzyme phytase
2.2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme phytase


Phytase từ thực vật
Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc nhƣ lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các

loại đậu nhƣ đậu nành, đậu trắng. Phytase cũng đƣợc tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ
cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998). Trong hạt đang nảy mầm
9


hoặc trong hạt phấn, phytase có vai trò phân giải phytin (Greene và ctv, 1975). Suzuki và
ctv (1907) là những ngƣời đầu tiên sản xuất chế phẩm phytase từ cám gạo và lúa mì.


Phytase từ động vật
Collum và Hart (1908) đã phát hiện thấy phytase từ thận và máu dê, phytase cũng

phát hiện trong máu các động vật có xƣơng sống bậc thấp hơn nhƣ chim, bò sát, cá,
rùa biển (Rapoport và ctv, 1914). Phytate hoạt động nhƣ một nguyên tố kháng dƣỡng
trong cơ thể động vật nên các nhà khoa học đã quan tâm và khảo sát hoạt động của
phytase trong đƣờng tiêu hóa của nhiều loài động vật.


Phytase từ vi sinh vật
Những vi sinh vật sản xuất phytase có từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ đất, động vật

dạ cỏ, bột đậu, nƣớc biển, hạt thực vật. Điều này cho thấy khả năng thủy phân của phytase
có thể đƣợc đóng góp một cách rộng rãi trong hệ sinh thái. Đƣợc biết là những vi sinh vật
sản xuất phytase bao gồm cả những vi khuẩn hiếu khí (Pseudomonas spp., Bacillus
subtilis, Klebsiella spp.), vi khuẩn kị khí (Escherichia coli, Mitsuokella spp.), nấm
(Aspergillus spp., Penicillum spp.) (uv-vietnam.com.vn).
2.2.5.2 Ứng dụng của enzyme phytase

Enzyme phytase có nhiều tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ chăn
nuôi và nuôi trồng thủy sản, giúp làm tăng dinh dƣỡng trong thức ăn, giảm thiểu ô
nhiễm; trong công nghiệp thực phẩm nhƣ làm tăng dinh dƣỡng thực phẩm; trong
trồng trọt giúp tăng hàm lƣợng phospho trong rễ cây.
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
2.3.1 Nghiên cứu trong nƣớc
Ở nƣớc ta hiện nay, nhiều nghiên cứu về enzyme từ Bacillus subtilis và hƣớng ứng dụng
của nó đã đƣợc công bố. Qua những tài liệu tìm đƣợc, nghiên cứu về enzyme của Bacillus
subtilis chủ yếu là gia tăng hoạt độ enzyme thu nhận thông qua việc tối ƣu hóa điều kiện nuôi
cấy và tách chiết enzyme, ứng dụng enzyme trong sản xuất các sản phẩm trung gian (dextrin),
thủy phân các phụ phẩm nông nghiệp, bƣớc đầu thử nghiệm sản xuất probiotic.
Các đề tài nghiên cứu khảo sát hệ enzyme của Bacillus subtilis, bƣớc đầu thử nghiệm
sản xuất chế phẩm sinh học. Nguyễn Dức Duy Anh (2005), xác định môi trƣờng tối ƣu để
thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus. Thử nghiệm sản xuất
chế phẩm sinh học. Bùi Thị Phi (2007), phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu
khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh
10


học. Huỳnh Minh Thƣ (2008), khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase, protease từ các

chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học.
Nghiên cứu ứng dụng enzyme ứng dụng enzyme trong sản xuất các sản phẩm trung
gian (dextrin), thủy phân các phụ phẩm nông nghiệp. Nguyễn Thanh Thủy (2007), nuôi cấy
Bacillus subtilis thu nhận α-amylase và ứng dụng trong sản xuất dextrin. Nguyễn
Trƣờng Ngọc Tú (2009), nghiên cứu thu nhận enzyme protease từ Bacillus subtilis và
ứng dụng trong thủy phân phụ phẩm các tra. Trần Thị Hồng Nghi (2009), tận thu phụ
phẩm cá tra bằng enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
2.3.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc
Singh Manoj và ctv (2010), sản xuất lipase từ Bacillus subtilis OCR – 4 trong lên men bán
rắn sử dụng bánh dầu lạc làm chất nền.
Nimkar Mukesh D. và ctv (2010), sản xuất α–amylase từ Bacillus subtilis và Aspergillus
niger bằng cách lên men bán rắn sử dụng phụ phẩm nông nghiệp.
Geethanjali S. và ctv (2011), tối ƣu hóa việc sản xuất protease bởi Bacillus subtilis phân
lập từ ruột giữa của cá chép nƣớc ngọt (Labeo rohita).
Bai Saraswati và ctv (2012), sản xuất cellulase bằng Bacillus subtilis phân lập từ phân bò.
Shamna K.S. và ctv (2012), sản xuất phytase ngoại bào bằng một số chủng
Bacillus subtilis bản địa.

11


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1/2012 đến tháng 6/2012 tại Viện Công Nghệ Sinh
Học và Môi trƣờng, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1 Đối tƣợng khảo sát
Các chủng Bacillus subtilis đƣợc cung cấp bởi Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi
trƣờng, trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2.2 Các môi trƣờng dùng trong thí nghiệm

 Môi trƣờng giữ giống Bacillus subtilis
Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton agar (MT1)
Giá đậu

200

g

Pepton

10

g

Glucose

50

g

Agar

20

g

Nƣớc vừa đủ

1000 ml

 Môi trƣờng nhân giống Bacillus subtilis
Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu đƣờng pepton (MT2)



Giá đậu

100

g

Pepton

10

g

Glucose

50

g

Nƣớc vừa đủ

1000 ml

Môi trƣờng cảm ứng tổng hợp các enzyme cellulase, amylase, lipase, phytase,

protease (Nguyễn Trƣờng Ngọc Tú, 2009).

Cơ chất cảm ứng: CMC (cellulase), tinh bột tan (amylase), dầu oliu (lipase),
acid phytic (phytase), casein (protease).

12


Cơ chất

5,0 g

(NH4)2SO4

1,4 g

MgSO4

0,3 g

CaCl2

0,3 g

Agar

20,0 g

Nƣớc vừa đủ

1000 ml

pH = 7


Môi trƣờng sinh tổng hợp các enzyme cellulase, amylase, lipase, phytase,

protease.
Cơ chất 1

500 g

Cơ chất 2

500 g

NaCl

4,5 g

CaCO3

7,5 g

DAP

6,25 g

Nƣớc

60 %

Thành phần cơ chất sinh tổng hợp enzyme:
Cellulase: bã mía, bã mì.
Amylase: cám bắp, cám gạo.
Phytase: cám gạo, bột đậu nành.
Protease: cám bắp, bã đậu nành nấu sữa.
Lipase: cám gạo, bánh dầu đậu phộng.
3.2.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Các dụng cụ thông thƣờng trong phòng thí nghiệm: đĩa petri, pipette thủy tinh,
micropipette, erlen, becher, ống đong, bình định mức.
Một số thiết bị: nồi hấp tiệt trùng (Tomy, Nhật), tủ sấy (Memmert, Đức), máy
lắc, lò viba (LG, Việt Nam), máy đo OD (Biorad, Mỹ), tủ cấy, tủ mát (Sanyo), cân
điện tử (Thụy Sỹ), máy đo pH (Thermo, Mỹ), bồn ủ nhiệt (Memmert, Đức).
 Hóa chất thí nghiệm
D-glucose (Trung Quốc), pepton (Trung Quốc), agar, (NH4)2SO4, MgSO4, CaCl2,
CMC, casein (Ấn Độ), tyrosine, thuốc thử Folin, thuốc thử Lugol, TCA (Trung Quốc).

13


3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Các bƣớc thực hiện thí nghiệm

10 chủng B. subtilis

5 chủng B. subtilis
Định tính enzyme

Định lƣợng enzyme
Chủng cho hoạt độ

enzyme cao nhất

Thời gian
Khảo sát điều kiện
nuôi cấy
Mật độ

Nuôi cấy thu nhận chế
phẩm ở thời gian – mật độ
tối ƣu

Sấy khô và nghiền nhỏ

Chế phẩm enzyme thô

Bảo quản, kiểm tra

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện thí nghiệm

14


Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc

3.3.2

Đếm số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch đĩa sau thời gian cấy
vi sinh vật cần đếm, trên cơ sở mỗi một khuẩn lạc đƣợc hình thành từ một tế
bào duy nhất (Lê Thanh Mai, 2009).
3.3.3.

Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme

3.3.3.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Anson,1938)
Casein bị phân giải trong môi trƣờng kiềm dƣới tác dụng của protease tạo sản
phẩm là các đoạn peptide ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác định lƣợng
Tyrosine và Tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.
3.3.3.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme α-amylase (Heinkel, 1956)
Xác định lƣợng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cƣờng
độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod.
3.3.3.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase (Miller,1959)
Ở đây xác định hoạt tính cellulase bằng cách xác định hoạt tính của các enzyme C1 và
Cx thông qua việc xác định lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp Miller. Cho enzyme tác dụng
với cơ chất thích hợp trong điều kiện nhất định và xác định lƣợng đƣờng khử tạo thành.
3.3.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme phytase (Fiske và Subbarow, 1925)
Khi cho phosphate tác dụng với ammonium molybdat sẽ tạo ra phosphomolybdat
có màu vàng. Khi khử phosphomolybdat, màu vàng sẽ chuyển thành màu xanh
molybdat. Độ đậm của màu sắc tỉ lệ với hàm lƣợng phospho mẫu.
Phản ứng đƣợc minh họa nhƣ sau:
2(MoO2.4MoO3) + H3PO4 + 4H2O  (MoO2.4MoO3)2 . H3PO4 . 4H2O
Các chất khử thƣờng sử dụng là SnCl2, hydrazin, acid ascobic, FeSO4, quinon, oxalat,
sulfit. Các chất khử có thể sử dụng đơn độc hay phối hợp với nhau. Ví dụ: phối hợp giữa
sulfit và quinon. Khi cho phytase tác dụng với cơ chất phytate sẽ giải phóng ra phosphate.
Dựa vào hàm lƣợng phosphate sinh ra này để đánh giá hoạt tính của enzyme phytase.

15