NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ Ngành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE
THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ

Ngành học :

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện :

NGUYỄN CÔNG PHÁT

Niên khóa :

2008 – 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE

THỦY PHÂN NHAU HEO TẠO PHÂN BÓN LÁ

Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

ThS. VÕ THỊ THÚY HUỆ

NGUYỄN CÔNG PHÁT

KS. NGUYỄN MINH QUANG

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm
Bộ môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt
kiến thức quí báu cho tôi trong suốt thời gian theo học tại trƣờng.
ThS. Võ Thị Thúy Huệ, KS. Nguyễn Minh Quang, ThS. Trƣơng Phƣớc Thiên
Hoàng đã luôn theo sát hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
Anh Nguyễn Văn Út, Phan Hữu Tín, chị Nguyễn Trƣờng Ngọc Tú, Trƣơng Thị
Ngọc Hân tại trại Thực Nghiệm viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và hỗ
trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Các bạn Lê Văn Hiếu, Quách Văn Thiệu, Hồ Đức Quyết, Võ Đức Tuấn và các bạn
trong tập thể lớp DH08SH đã giúp đỡ, động viên và chia sẽ mọi khó khăn, vui buồn trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trƣờng.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ và anh chị đã nuôi nấng, dạy

dỗ con khôn lớn, luôn động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho con trong suốt thời
gian học tập ở Trƣờng đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Công Phát

i


TÓM TẮT
Ngày nay vấn đề an ninh lƣơng thực đang là một thách thức đối với ngành nông
nghiệp của các nƣớc trên thế giới. Trong khi đó, đất nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp,
môi trƣờng bị ô nhiễm, thiên tai, biến đổi khí hậu cho nên yêu cầu bức thiết đƣợc đặt ra là
phải tạo ra các sản phẩm phân bón phục vụ cho trồng trọt nhằm cải thiện năng suất cây
trồng và đặc biệt là phải thân thiện với môi trƣờng. Dựa trên cơ sở đó đề tài “nghiên cứu
ứng dụng enzyme protease thủy phân nhau heo tạo phân bón lá” đã đƣợc thực hiện.
Nội dung bao gồm phân lập vi khuẩn từ các mẫu bùn đáy ao, ruột cá, đất, sau đó sử
dụng các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát khả năng
sinh enzyme protease của vi khuẩn phân lập và các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của
enzyme protease do vi khuẩn sản sinh. Khảo sát các điều kiện tối ƣu nhằm xây dựng quy
trình thủy phân nhau heo để tạo phân bón lá hữu cơ sinh học. Ứng dụng thử nghiệm phân
bón lá trên rau cải bẹ xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm
phân bón lá tự tạo.
Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 5 chủng Bacillus subtilis, trong đó có 2
chủng từ mẫu đất và 3 chủng từ ruột cá. Chủng Ba17 phân lập từ đất có khả năng phân
giải casein tốt nhất và tổng hợp enzyme protease với hoạt độ cao nhất ở điều kiện tối ƣu
500C và pH 7,6 là 31,95 UI/g.
Quy trình tối ƣu cho quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease đƣợc
thiết lập với điều kiện pH 7,6, nồng độ enzyme so với cơ chất là 2 UI/g, lƣợng nƣớc so
với cơ chất là 150%, nhiệt độ thủy phân là 500C và thời gian là 48 giờ.

Nồng độ chế phẩm 8‰ khi sử dụng trên cây cải bẹ xanh cho năng suất 29,214
tấn/ha là nồng độ thích hợp nhất trên cải bẹ xanh.

ii


SUMMARY
Today, the issue of food security is a challenge for the agricultural sector of many
countries in the world. The decreasing of, agricultural land environmental polluted,
natural disasters and climate change has woged the demand of fertilizer products for
farming which can improve both crop yields, especially, friendly to the environment.
Thus, the subject of "applied research protease enzyme hydrolyzed pig placenta fertilizer"
was performed.
Isolation of bacteria from the pond mud, gut fish and soil sample was done. The
biochemical reactions were applied to identify Bacillus subtilis. Study of protease enzyme
synthesis ability of isolated bacteria and other factors affecting the activity of the protease
enzyme produced by bacteria. Examined the optimal conditions for building protocols pig
placenta hydrolyzed bio-organic fertilizer. trials of fertilizer on Brassica juncea were
performed in order to find the most appropriate concentration of fertilizer product.
As a result, 5 strains Bacillus subtilis were isolated, including 2 strains from soil
samples and three strains from fish intestine. The best strain that cuold best resolve casein
and synthesite protease with high activity (31.95 UI/g) at 500C under optimum conditions
and pH 7.6 was Ba17 strain isolated from soil.
Optimization process for the hydrolysis of pig placenta by protease was set to pH
7.6 conditions, 2UI/g enzyme levels compared to the substrate, water content compared to
the substrate 150%, at 500C for 48 hours.
Appropriate concentration for use on Brassica juncea were identified as 8 ‰ to
yield 29.214 tons/ha.
Keywold: pig placenta, Bacillus subtilis, enzyme protease, Brassica juncea.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ............................................................................................................................. i
Tóm tắt ..................................................................................................................................ii
Summary............................................................................................................................. iii
Mục lục ................................................................................................................................ iv
Danh sách các từ viết tắt .....................................................................................................vii
Danh sách các bảng .......................................................................................................... viii
Danh sách các sơ đồ và hình ............................................................................................... ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2
1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................... 3
2.1.1

Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................... 3

2.1.2

Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 3

2.1.3

Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................................... 4

2.1.4

Đặc điểm sinh hoá ................................................................................................... 4

2.1.5

Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................... 4

2.2 Sơ lƣợc về enzyme protease ........................................................................................ 4
2.2.1

Lịch sử phát hiện enzyme protease ......................................................................... 5

2.2.2

Phân loại protease .................................................................................................... 5

2.2.3

Đặc điểm của protease thu nhận từ nguồn vi sinh vật ............................................. 6
iv


2.2.4

Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme protease .................................... 7

2.2.5

Cơ chế thủy phân của enzyme protease .................................................................. 8

2.2.6

Ứng dụng của enzyme protease............................................................................... 8

2.3 Sơ lƣợc về phân bón lá hữu cơ sinh học .................................................................... 10
2.3.1

Xu hƣớng nghiên cứu phân hữu cơ sinh học trong và ngoài nƣớc ....................... 10

2.3.1.1

Các nghiên cứu trong nƣớc ................................................................................. 10

2.3.1.2

Các nghiên cứu ngoài nƣớc ................................................................................. 11

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 13
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 13
3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu .................................. 13
3.3 Nôi dung và phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 13
3.3.1

Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 13

3.3.1.1

Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá .......................... 13

3.3.1.2

Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn phân lập..................................................... 14

3.3.2

Khảo sát các điều kiện thích hợp cho hoạt động của enzyme protease ................ 15

3.3.3

Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân ...................................... 15

3.3.4

Khảo sát nồng độ sử dụng chế phẩm thích hợp trên cây cải bẹ xanh. .................. 17

3.3.5

Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 17

Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 18
4.1 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 18
4.1.1

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nghi nghờ là Bacillus subtilis ................................ 18

4.1.2

Đặc điểm hình thái của 21 khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ...................... 18

4.1.3

Đặc điểm sinh hóa của 14 chủng trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng ..................... 19

4.1.4

Hoạt độ enzyme protease của các chủng đƣợc chọn ............................................. 21

v


4.2 Các điều kiện tối ƣu cho hoạt động của enzyme protease ......................................... 21
4.2.1

Nhiệt độ tối ƣu cho enzyme hoạt động.................................................................. 21

4.2.2

Xác định pH tối ƣu cho enzyme hoạt động của enzyme protease......................... 22

4.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình thủy phân nhau heo bằng enzyme protease ..... 23
4.3.1

Ảnh hƣởng nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân .......................................... 23

4.3.2

Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất đến quá trình thủy phân ........................................... 24

4.3.3

Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình thủy phân ................................................ 25

4.3.4

Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc đến quá trình thủy phân .................................... 26

4.3.5

Hoàn thiện quy trình thủy phân nhau heo ............................................................. 26

4.4 Khảo nghiệm hiệu quả của chế phẩm phân hữu cơ sinh học dạng lỏng .................... 28
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 29
5.1 Kết luận ...................................................................................................................... 30
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 31
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
CRD

Completely Randomized Design

HCSH

Hữu cơ sinh học

IUBMB

International Union of Biochemistry and Molecular Biology

LLL

Lần lặp lại

NA

Nutrient agar

NB

Nutrient Broth

NT

Nghiệm thức

NSLT

Năng suất lý thuyết

NSTT

Năng suất thực tế

NTS

Đạm tổng số

RCBD

Randomized Conpletely Block Design

UI

International Unit

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng sinh hóa của 14 chủng bắt màu Gram dƣơng ................ 19
Bảng 4.2 Kết quả định tính vòng phân giải casein của 6 chủng Bacillus subtilis ............ 20
Bảng 4.3 Kết quả định lƣợng hoạt độ enzyme protease ................................................... 21
Bảng 4.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính protease do chủng Ba17 tổng hợp ........ 22
Bảng 4.5 Ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ protease do chủng Ba17 tổng hợp ................... 23
Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme lên quá trình thủy phân ................................. 24
Bảng 4.7 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân .................................. 24
Bảng 4.8 Ảnh hƣởng của thời gian lên quá trình thủy phân ............................................. 25
Bảng 4.9 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc lên quá trình thủy phân ................................. 26
Bảng 4.10 Thành phần dinh dƣỡng trong nhau heo và dịch thủy phân ............................ 28
Bảng 4.11 Ảnh hƣởng của các nồng độ chế phẩm lên năng suất và các yếu tố cấu thành
năng suất trên cây cải bẹ xanh ........................................................................................... 28

viii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Trang
Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................... 17
Sơ đồ 3.2 Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................... 18
Sơ đồ 3.4 Bố trí thí nghiệm dùng các nồng độ khác nhau của chế phẩm phân bón lá ..... 22
Sơ đồ 4.1 Qui trình thủy phân nhau heo trên hệ thống bioreactor .................................... 30
Hình 2.1 Vi Khuẩn Bacillus subtilis ................................................................................... 3
Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ................................................................. 18
Hình 4. 2: Tiêu bản nhuộm Gram vi khuẩn Bacillus subtilis sau khi cấy 24 giờ ............. 19
Hình 4.3 Vòng phân giải casein của chủng Ba17 ............................................................. 20
Hình 4.3 Phần dịch sau thủy phân .................................................................................... 27
Hình 4.4 Phần bã sau thủy phân ....................................................................................... 29
Hình 4.5 Cây cải đƣợc phun ở các nồng độ phân khác nhau............................................ 29

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, dân số thế giới đã 7 tỉ ngƣời cùng với tốc độ tăng dân số đáng báo động
và vấn đề môi trƣờng đang ngày càng bị suy thoái, thiên tai, lũ lụt, biến đổi khí hậu đặc
biệt là đất nông nghiệp đang bị thu hẹp một cách nhanh chóng làm cho sản lƣợng lƣơng
thực có nguy cơ bị sụt giảm nghiêm trọng do đó vấn đề an ninh lƣơng thực đang trở nên
cấp thiết hơn bao giờ hết. Trong ngành trồng trọt, để phát triển một nền nông nghiệp bền
vững thì nhiệm vụ cấp bách là phải thay thế dần việc sử dụng phân bón hóa học có nguồn
gốc vô cơ gây ô nhiễm môi trƣờng, làm giảm độ phì nhiêu của đất sang các loại phân bón
vi sinh, hữu cơ vi sinh, compost, phân bón lá. Trong lĩnh vực vi sinh, vi khuẩn Bacillus
subtilis có nhiều tính chất rất ƣu việt để sản xuất các chế phẩm sinh học và đặc biệt là
chúng có khả năng sinh enzyme protease với hoạt độ rất cao. Enzyme protease của vi

khuẩn Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực công nghiệp, y
dƣợc với hàng loạt các sản phẩm phục vụ cho con ngƣời. Trong lĩnh vực nông nghiệp,
enzyme protease với khả năng phân cắt các chuỗi axit amin dài tạo thành những chuỗi
ngắn hoặc các axit amin đơn lẻ sẽ tạo tiền đề cho việc ứng dụng để sản xuất các loại phân
bón lá giúp cho cây trồng dễ dàng hấp thu dinh dƣỡng hơn và sẽ cải thiện đƣợc năng xuất
cây trồng góp phần vào ổn định vấn đề an ninh lƣơng thực.
Nhau thai là một thành phần kỳ diệu trong bào thai, là nơi nuôi dƣỡng và bảo vệ
phôi thai phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Hầu nhƣ nhau thai có chứa tất cả các
chất dinh dƣỡng cần thiết cho phôi thai phát triển nhƣ: các axit amin thiết yếu, các chất
khoáng đa trung vi lƣợng, hormon, chất kích thích tăng trƣởng, các axit nucleotid. Tuy có
chứa một hàm lƣợng dinh dƣỡng cao nhƣ vậy nhƣng nhau thai heo vẫn là một phụ phẩm
trong ngành chăn nuôi heo. Từ thực tế trên nhận thấy khả năng ứng dụng nhau thai heo để
sản sản xuất phân bón lá là rất thực tế và có triển vọng nên đề tài “nghiên cứu ứng dụng
enzyme protease thủy phân nhau thai heo tạo phân bón lá” đƣợc thực hiện.

1


1.2 Yêu cầu của đề tài
Phân lập chủng Bacillus subtilis sản sinh enzyme protease có hoạt tính cao ứng
dụng trong thủy phân nhau heo nhằm tạo đƣợc phân bón lá sử dụng trong trồng trọt cũng
nhƣ ứng dụng trong việc sản xuất chế phẩm sinh học. Xây dựng đƣợc quy trình sản xuất
phân bón lá và điều kiện thủy phân tối ƣu cho nhau heo. Tạo đƣợc chế phẩm phân bón lá
chất lƣợng tốt và khả năng ứng dụng cao.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân lập vi khuẩn từ các mẫu bùn đáy ao, ruột cá, đất. Thử các phản ứng sinh hóa
để định danh vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của vi
khuẩn tự phân lập và các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme protease do vi
khuẩn sản sinh. Khảo sát các điều kiện tối ƣu nhằm xây dựng quy trình thủy phân nhau
heo để tạo phân bón lá hữu cơ sinh học. Ứng dụng thử nghiệm phân bón lá trên rau cải bẹ

xanh nhằm tìm ra nồng độ sử dụng thích hợp nhất của chế phẩm phân bón lá tự tạo.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dƣơng đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho
đến thời điểm hiện nay. Bộ gen của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, khoảng 4 Mbp với
trọng lƣợng của bộ gen khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton. Đặc biệt, trong gen của
Bacillus subtilis có chứa nhiều gen qui định cho khả năng kháng kháng sinh nhƣ gen
kháng

thiostrepton,

streptomycin,

erythromycin,

spectinomycin,

penicilin,

chloramphenicol. Nhờ đó vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng kháng lại các vi sinh vật
gây bệnh khác.
2.1.1 Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Bacillales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

Hình 2.1 Vi Khuẩn Bacillus subtilis
(isciencemag.co.uk)

Bacillus subtilis

2.1.2 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dƣơng có kích thƣớc 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội

bào tử ở trung tâm có kích thƣớc 1,5-1,8 x 0,8µm. Ở điều kiện 1000C, bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis chịu đƣợc 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn,
tác động của hóa chất, tia bức xạ (Kerovuo và cs, 2000).

3


2.1.3 Đặc điểm nuôi cấy
Trong môi trường nuôi cấy, Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết
các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm). Màng sinh học giúp cho Bacillus
subtilis có ưu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trường tự nhiên
đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trường giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc
trực tiếp với oxy trong không khí. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng
hình thành bào tử. Bào tử của chúng tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn
năm và phát triển lại thành tế bào sinh dưỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
2.1.4 Đặc điểm sinh hoá
Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), phân giải tinh bột (+), phân
giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên
men không sinh hơi các loại đƣờng như: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose.
2.1.5 Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis
Vi khuẩn Bacillus subtilis được ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau
như amylase, protease đồng thời cũng được ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men
truyền thống natto của Nhật Bản.
Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang được quan tâm để sản xuất ra các
vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gen qui định độc tố thương hàn vào
Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gen này cũng được biểu hiện để sản
xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử.
2.2 Sơ lƣợc về enzyme protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thủy phân các liên kết peptid của
protein hay polypeptide (-CO - NH-) tạo thành các sản phẩm peptide, pepton, tri –

dipeptide, axit amin. Nhiều enzyme protease có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên
kết ester, liên kết amid và các phản ứng chuyển vị gốc axit amin. Phản ứng nhƣ phƣơng
trình sau:
- CH – C – N – CH - + H2O  - CH – C – OH + NH – CHR

O

N

R’

R

4

O

H

R’


2.2.1 Lịch sử phát hiện enzyme protease
Enzyme protease đƣợc nghiên cứu đầu tiên là các enzyme tiêu hóa ở động vật. Từ
đầu thế kỉ 18, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Reomur phát hiện dạ dày chim ăn thịt có khả
năng tiêu hóa thịt. Năm 1836, Swann quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch
vị. Nhƣng mãi đến hơn 20 năm sau (1857), Corvisart mới tách đƣợc trypsin từ dịch tụy.
Đây là protease đầu tiên đƣợc thu nhận dƣới dạng chế phẩm tuy vẫn còn lẫn nhiều
enzyme và protein khác. Đến nữa đầu thế kỉ 20, ngƣời ta mới phát hiện thêm nhiều loại
protease khác nhƣ: bromelin – p có trong các bộ phận cây, catepsin – protease của mô cơ

động vật (Willstatter và cs 1926). Từ 1930 đến nay, sau khi Sumner (1926) kết tinh đƣợc
protease từ đậu tƣơng, hàng loạt các protease khác ra đời. Năm 1950, nhờ sử dụng đƣợc
một số phƣơng pháp mới tinh chế protein, ngƣời ta thu nhận đƣợc chế phẩm protease tinh
khiết hơn và cũng từ đấy các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu protease từ vi sinh. Năm
1971 đánh dấu bƣớc mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở
Bacillus. Horikoshi là ngƣời đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ
bản và tính chất lý hóa của protease kiềm từ Bacillus (Horikoshi, 1971; Markland và cs,
1971). Sang năm 1972, ngƣời ta đã nghiên cứu và đƣa vào sản xuất trên quy mô lớn các
protease kiềm ở một vài loài Bacillus. Đến thập kỷ 80, những nghiên cứu về protease
kiềm của Bacillus tiếp tục mở rộng và đã tạo ra hàng loạt các sản phẩm trên thị trƣờng
thƣơng mại. Các vi khuẩn Bacillus ƣa kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo
“quan điểm công nghiệp (Horikoshi và Akiba, 1982; Horikoshi, 1996). Đến nay protease
đã đƣợc nghiên cứu kỹ hơn và ứng dụng rất nhiều lĩnh vực khác nhau.
2.2.2 Phân loại protease
Dựa vào cơ chế xúc tác. Theo IUBMB “International Union of Biochemistry and
Molecular Biology” peptidase chia thành hai nhóm: Exopeptidase (còn gọi là enzyme
peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch) có khả năng thủy giải liên kết –CO – NH ở đầu
tận cùng chuỗi polypeptide, bao gồm amino – peptidase (xúc tác đầu có gốc amin tự do
gọi là enzyme aminopeptidase), carboxyl – peptidase (xúc tác cắt liên kết – CO – NH ở
đầu có gốc carboxyl tự do gọi là enzyme carboxypeptidase). Endopeptidase (còn gọi

5


proteinase hay enzyme phân cắt nội mạch) có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân liên
kết peptide nằm bên trong chuỗi polupeptidase.
Dựa vào mức hoạt động trong dung dich có trị số pH khác nhau nên protease đƣợc
chia làm ba nhóm: Protease aicid với pHopt trong khoảng 2 – 5 và chúng đƣợc thu nhận từ
các loài nấm mốc đen: A. niger, A. awmori, A. saitoi, và các loài Mucor pusillus,
Rhizopus, Trametes sanguineara. Protease trung tính có pHopt khoảng hẹp 6,0 – 7,5 không

bền ở nhiệt độ cao và mất hoạt tính khi có hiện diện protease kiềm, chúng đƣợc thu nhận
từ những loài nấm mốc khác nhau, nhƣng chủ yếu là các loài nấm mốc vàng nhƣ

A.

oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. tericola. Protease kiềm có pHopt trong khoảng 8 – 11
đƣợc thu nhận từ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn Bacillus subtilis, những protease kiềm
là nhóm đƣợc quan tâm khá nhiều gần đây vì có thể sử dụng chúng nhƣ những chất phụ
gia trong qua trình thuộc da, trong chất giặt tẩy, xử lý chất thải môi trƣờng. Dù có sự phân
biệt protease kiềm tính, trung tính và axit tính nhƣ trên, nhƣng cả ba đều tìm thấy có trong
A. oryzae. Protease trung tính là enzyme có trung tâm hoạt động là kim loại chứa kẽm,
kém bền nhiệt nhất trong ba loại trên. Trái lại, protease axit từ nấm mốc có khả năng bền
nhiệt tốt và pH thấp (Keay, 1971).
Dựa vào đặc điểm cấu tạo của trung tâm hoạt động thì enzyme protease đƣợc chia
làm bốn nhóm chính: Serin – proteinase (EC 3.4.21), cystein – protease (EC 3.4.22),
aspaetic – protease (EC 3.4.23), metallo – protease (EC 3.4.24).
2.2.3 Đặc điểm của protease thu nhận từ nguồn vi sinh vật
Thông thƣờng enzyme protease đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣng
hiện nay đƣợc thu nhận chủ yếu từ vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. Bao
gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyses và một
số loại nấm loại nấm men. Lƣợng protease sản xuất từ vi khuẩn ƣớc tính khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lƣợng enzyme đƣợc sử dụng, protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một
trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai
loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao; chúng có khả năng
phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có
khả năng tổng hợp protease nhƣ: Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus

6

thermopoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium; có thể nói vi khuẩn Bacillus
subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các
vi khuẩn thƣờng tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm
yếu, các protease này có ái lực cao với các amino axit ƣu béo và thơm. Protease của
Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân tử 20.000 – 30.000 dalton.
Ổn định ở khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. Khác với
protease thƣc vật (ficin, papain, bromeline) và động vật (tripsin, pepsin, renin) protease vi
sinh vật là những enzyme ngoại bào có tính đặc hiệu rộng, chúng tổng hợp hai dạng
enzyme có khả năng thủy phân khác nhau nhƣ: protease thủy phân protein thành
polypeptide, pepton và peptidase thủy phân tiếp các hợp chất này thành các axit amin.
2.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme protease
Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất: Trong các phản ứng enzym, sự hoạt hóa cơ chất
đƣợc thực hiện do sự tạo thành phức hợp trung gian enzym - cơ chất. Khi kết hợp với
phân tử enzym do sự chuyển dịch các điện tử và sự biến dạng của các liên kết tham gia
trực tiếp vào phản ứng nên cơ chất trở nên hoạt động và tham gia phản ứng dễ dàng. Cơ
chất càng lớn vận tốc phản ứng càng lớn. Nhƣ thế, khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản
ứng sẽ tăng theo và đạt giá trị cƣc đại sau đó sẽ ổn đinh mặc dù nồng độ cơ chất vẫn tăng.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Vận tốc phản ứng enzym tăng khi nhiệt độ tăng, tuy
nhiên do enzym có bản chất là protein nên không thể bền với tác dụng nhiệt, đa số enzym
bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiệt độ ứng với khả năng hoạt động cao nhất của
enzym đƣợc gọi là nhiệt tối ƣu và phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ nồng độ enzym, nồng
độ cơ chất, đặc biệt là thời gian tác dụng. Thời gian tác dụng càng dài, nhiệt tối ƣu của
enzym càng thấp. Nói chung, enzym ở dạng dung dịch loãng, không có cơ chất thƣờng
kém bền. Trái lại khi có cơ chất, enzym khá bền với nhiệt độ.
Ảnh hƣởng của pH: Enzym rất nhạy đối với sự thay đổi pH của môi trƣờng. Mỗi
enzym chỉ hoạt động mạnh ở một vùng pH xác định gọi là vùng pH tối ƣu của enzym. pH
tối ƣu của đa số enzym nằm trong vùng axit yếu, bazơ yếu hoặc trung tính. Hoạt động của
enzym còn chịu ảnh hƣởng của chất hoạt hóa và chất ức chế.

7

Ảnh hƣởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng là cho
enzym từ trạng thái không hoạt động trở nên hoạt động hoặc từ hoạt động yếu trở thành
họat động mạnh hơn. Các chất hoạt hóa có bản chất rất khác nhau nhƣ các coenzym
NAD+, NADP+, các vitamin làm nhiệm vụ chuyển hyrogen, ADP chuyển phosphate. Có
thể nói chất hoạt hóa có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử enzym, loại bỏ một
vài đoạn peptide và giải phóng nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme
giúp cho enzym trở nên hoạt động mạnh hơn.
Ảnh hƣởng của chất ức chế: chất ức chế là chất có khả năng làm yếu hoặc chấm
dứt hoàn toàn tác dụng của enzym. Các chất ức chế có bản chất hóa học khác nhau có thể
là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ hoặc các protein.
2.2.5 Cơ chế thủy phân của enzyme protease
Việc thủy phân của enzyme protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. hoạt
động của chúng đƣợc chia làm hai loại nhƣ sau: Sự thủy phân giới hạn nghĩa là enzyme
thủy phân có giới hạn đối với một hay một số các liên kết peptide có trong phân tử protein
và tạo thành các peptide có phân tử nhỏ. Sự thủy phân không giới hạn nghĩa là phân tử
protein bị thủy phân thành các axit amin; dƣới tác dụng của protease liên kết peptide
–CO –NH sẽ bị thủy phân thành các axit amin và một ít peptide có phân tử nhỏ.
2.2.6 Ứng dụng của enzyme protease
Protease đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ đời sống đến
sản xuất công nghiệp. Trong đó ứng dụng protease từ nguồn vi sinh vật hiện phát triển rất
mạnh, đạt hiệu quả kinh tế cao và có vai trò thƣơng mại rộng rãi. Vào năm 1987 protease
đƣợc sản xuất với giá trị khoảng 254,6 triệu USD, 75% enzyme đƣợc sử dụng trong sản
xuất chất tẩy, khoảng 10% sản xuất pho mát và các sản phẩm sữa, còn lại dùng trong
thuộc da và sản xuất thực phẩm (bia rƣợu, nƣớc chấm, chao, tƣơng, trà).
Trong công nghiệp thực phẩm: Trong công nghệ sản xuất nƣớc chấm enzyme
protease có vai trò rất quan trọng. Các loại nƣớc chấm lên men nhƣ tƣơng, chao, nƣớc
mắm là sản phẩm của quá trình lên men phân giải nguyên liệu giàu protein động vật, thực
vật nhờ tác dụng của axit, base, hoặc nhờ enzyme xúc tác quá trình lên men. Sản phẩm

tạo thành có hàm lƣợng axit amin rất cao. Phƣơng pháp lên men có những ƣu điểm nhƣ

8


thiết bị đơn giản, dễ chế tạo, vốn đầu tƣ ban đầu không lớn, không gây độc cho ngƣời sản
xuất và môi trƣờng xung quanh. Ứng dụng protease trong chế biến thịt: Trong chế biến
thịt, ngƣời ta bổ sung 0,002% chế phẩm protease tinh khiết và đem ƣớp lạnh, bằng cách
này thịt sẽ giữ màu tự nhiên lâu hơn. Mặt khác, thịt dƣợc xử lý bằng protease có hiệu suất
hấp thụ cao hơn với thịt không xử lý. Ứng dụng trong chế biến sữa: Trong chế biến sữa
(đặc biệt là trong sản xuất phomat) ngƣời ta sử dụng một khối lƣợng rất lớn enzyme đông
tụ sữa. Trƣớc dây, ở các nƣớc châu Âu thƣờng sử dụng các loại protease động vật, đến
nay ngƣời ta sử dụng các loại protease từ nhiều nguồn khác nhau. Chính sự thay thế các
loại enzyme từ vi sinh vật đã làm giảm giá thành sản phẩm chế biển từ sữa (Nguyễn Đức
Lƣợng, 2002).
Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc: Protease phân cắt liên kết peptid
của phân tử protein, giúp tăng khả năng hấp thu lƣợng protein có trong thức ăn. Việc
kết hợp giữa protease với các enzyme khác nhƣ: amylase, phytase, cellulose giúp vật
nuôi tăng trọng nhanh đạt hiệu quả kinh tế cao.
Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa: Từ năm 1913, enzyme đã đƣợc ứng dụng
trong sản xuất chất tẩy rửa tại nhà máy hóa chất Otto Rohm (Đức). Chế phẩm Bio 40 là
enzyme protease từ vi khuẩn và đƣợc ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa từ năm 1959
tại nhà máy Gebruder Schuyder ở Thụy Điển (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong công
nghiệp da: Việc sản xuất da động vật hiện nay hoàn toàn là thủ công. Enzyme protease
có thể đƣợc ứng dụng vào một vài công đoạn của công nghiệp da bằng cách ngâm da
chìm trong dịch chứa enzyme ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10-20 giờ nhằm tách
lông thú ra khỏi da và làm sạch da.
Sản xuất insulin cho ngƣời từ insulin heo: Insulin của ngƣời và heo chỉ khác
nhau một axit amin (threonin hay alanin). Trong công nghiệp sản xuất insulin cho
ngƣời từ insulin từ heo ngƣời ta sử đụng hai loại enzyme là carboxypeptidase A và

trypsine. Các enzyme này tham gia quá trình chuyển hóa axit amin cho thành phần, số
lƣợng và trình tự của chúng giống nhƣ insulin của ngƣời (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002).
Dịch thủy phân vi sinh vật: Ngƣời ta sử dụng phức hợp nhiều enzyme trong đó
có sự tham gia của protease để phá hủy tế bào nhằm giải phóng một số chất có giá trị

9


bên trong tế bào. Với việc phân giải vách tế bào nấm men giải phóng dịch chiết nấm
men là nguyên liệu để sản xuất cao nấm men và một số sản phẩm có giá trị.
2.3 Sơ lƣợc về phân bón lá hữu cơ sinh học
Phân hữu cơ sinh học (HCSH) là loại phân đƣợc chế biến từ các nguyên liệu có
nguồn gốc hữu cơ với quy trình chế biến đƣợc áp dụng bằng các tác nhân hoặc bằng các
kỹ thuật công nghệ sinh học nhằm nâng cao chất lƣợng và hiệu lực của phân thƣơng
phẩm (Nguyễn Đăng Nghĩa, 2007).
Phân bón lá là loại phân bón đƣợc tƣới hoặc phun trực tiếp vào lá hoặc thân để
cung cấp chất dinh dƣỡng cho cây trồng thông qua thân lá. Phân bón lá có tác dụng cung
cấp dinh dƣỡng cho cây trồng một cách trực tiếp nhờ khả năng hấp thu các chất dinh
dƣỡng qua lá của cây trồng ( 90 – 95%) so với việc hấp thu chất dinh dƣỡng qua rễ (thấp
hơn 10%). Do đó phân bón lá có khả năng cải thiện đáng kể năng suất cây trồng và đặc
biệt quan trọng trong những trƣờng hợp cây trồng bị thiếu hụt dinh dƣỡng nặng và cần
phải cung cấp một cách nhanh chóng cho cây. Thông thƣờng sau khi bón phân thì sau
khoảng 60 phút là cây đã bắt đầu hấp thu các chất dinh dƣỡng trên lá nhờ đó phân bón lá
giúp giảm đáng kể lƣợng phân bón cho đất khoảng 30%. Ngoài ra, phân bón lá còn chứa
đầy đủ các chất dinh dƣỡng từ đa lƣợng cho đến vi lƣợng và các hormon tăng trƣởng.
2.3.1 Xu hƣớng nghiên cứu phân hữu cơ sinh học trong và ngoài nƣớc
2.3.1.1 Các nghiên cứu trong nƣớc
Trong những năm gần đây, đã có rất nhiều những nghiên cứu về hiệu lực của phân
bón lá đƣợc sản xuất trong nƣớc cũng nhƣ nƣớc ngoài trên các đối tƣợng nhƣ cây bắp, các
loại hoa, các loại rau và trên cây công nghiệp đã đem lại lợi ích kinh tế rất cao. Việc sử

dụng các loại phân bón lá để thử nghiệm trên cây bắp, rau xà lách, hành, cây hoa cúc và
hoa vạn thọ của đã cho năng suất cao hơn nghiệm thức đối chứng (NTĐC) từ 5% đến
20,9% (Nguyễn Thị Kim Thanh, 2008). Bên cạnh đó, việc phối trộn các phế thải nông
nghiệp với các chế phẩm sinh học để sản xuất phân bón gốc cũng mang lại những lợi ích
to lớn trong sản xuất nông nghiêp nhƣ hàm lƣợng dinh dƣỡng đƣợc tăng cao, giảm thiểu
sự ô nhiễm môi trƣờng, sản phẩm tạo ra không có mùi hôi và giúp cây hấp thụ tốt. Theo
kết quả nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học E.I.P để ủ phân chuồng và khảo sát ảnh

10


hƣởng của phân bón lá đƣợc điều chế trên cơ sở phân ủ lên sinh trƣởng phát triển và năng
suất của cải bẹ xanh (Brassica juncea L). Kết quả nghiên cứu đề tài cho thấy sử dụng
phân bò tƣơi + tro trấu + 1/20 liều lƣợng chế phẩm EIP cho phân hoai nhanh hơn 25 ngày
và cho trọng lƣợng cải cao hơn (Nguyễn Lê Thanh, 2005).
Sử dụng các phế thải từ nông nghiệp nhƣ xác vỏ tiêu, bánh dầu đậu phộng, bánh
dầu đậu nành, xác cá chết, bột thịt để sản xuất phân bón lá đã mang lại những thành tựu to
lớn. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Minh Đức (2006) cho thấy việc sử dụng chế phẩm
ENT ủ bã vỏ tiêu với nồng độ 0,1% đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 25 ngày, vỏ tiêu
không còn mùi hôi.
2.3.1.2 Các nghiên cứu ngoài nƣớc
Các báo cáo của công ty Enviromental Choise cho thấy ở Costa Rica đã có nhiều
thí nghiệm về ủ phân nhƣ: “Ủ phân trùng và Encoenzyme”, “Ủ vỏ quả cà phê và
zymplex” , “Ủ phân gà dùng chất độn mạc cƣa và Encoenxzyme”. Kết quả cho thấy thời
gian ủ phân đƣợc rút ngắn, hàm lƣợng dinh dƣỡng bảo toàn và mùi giảm một cách đáng
kể. Cũng theo nguồn này, ở Zambia, Tây phi cũng có thí nghiệm về ủ phân nhƣ “Ủ phân
bò khô với Enchoice dùng chất độn vỏ đậu phộng nghiền nhỏ”.
Theo mô hình nghiên cứu phƣơng pháp sản xuất phân bón hữu cơ bằng cách sử
dụng đầu cá ngừ làm nguyên liệu thô. Nghiên cứu này đã sử dụng enzyme từ vi khuẩn và
thử nghiệm bổ sung phân hữu cơ này trong môi trƣờng nuôi hạt phấn cây trà. Kết quả thí

nghiệm cho thấy phân này đã làm tăng tốc độ lăng trƣởng 180% so với hạt phấn cây trà
trong môi trƣờng nuôi cấy đối chứng (Iizuka, 1995).
Quá trình nghiên cứu việc chuyển đổi các chất thải hữu cơ từ cá và các loại thực
vật ở biển và động vật thành dạng bột ổn định mà không sử dụng nhiệt độ cao. Chất thải
từ cá tƣơi đƣợc nghiền và sau đó đƣợc thủy phân để tạo thành một dịch thủy phân. Dịch
thủy phân đƣợc ấn định bằng cách thêm axit và đƣợc đun để tách dầu mỡ và nƣớc để tạo
thành một bánh sản phẩm. Bánh này đƣợc chuyển sang một máy trộn nhằm trộn dinh
dƣỡng tạo thành một sản phẩm thô. Sản phẩm thô này đƣợc sấy khô trong một máy sấy
khô vận tốc cao (Connell, 2006). Bên cạnh đó, Lee và Lian (2006) đã xây dựng quy trình

11


sản xuất sinh học dịch thủy phân từ các phụ phẩm trong quá trình chế biến mực để làm
phân bón hữu cơ mà không sử dụng hóa chất mà chỉ sử dụng enzyme nội sinh.
Theo nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ từ chất thải rắn và sử dụng nó trong sản
xuất rau hữu cơ của Nenita và ctv năm 2008 cho thấy kết quả nghiên cứu việc áp dụng
phân bón hữu cơ này cung cấp đủ các dƣỡng chất cho các loại rau nhƣ cà chua, rau diếp.
Sử dụng phƣơng pháp thủy canh để sản xuất cây con thuốc lá theo hƣớng hữu cơ
bằng cách sử dụng phân cá hòa tan hoặc các sản phẩm từ rong biển và một số vật liệu
thích hợp khác thay cho việc sử dụng các loại phân bón vô cơ (George Kuepper và
Raeven Thomas, 2008).
Nhƣ vậy, với những tổng hợp về tình hình sản xuất và ứng dụng phân bón lá thì đã
có hàng loạt các nghiên cứu về sản xuất thử nghiệm phân bón lá hữu cơ sinh học đa số
các nghiên cứu đều cho thấy hiệu quả của phân bón lá là rất tốt cho cây trồng. Việc sử
dụng các nguồn nguyên liệu mới nhƣ nhau heo là rất cần thiết để đa dạng nguồn nguyên
liệu cho sản phẩm phân bón lá. Từ đó, sản xuất phân bón đƣợc dễ dàng, hứa hẹn phân bón
lá sẽ đƣợc ứng dụng rộng rãi và phổ biến trong tƣơng lai gần.

12

Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 1/2012 đến thàng 6/2012 tại trại thực nghiệm Công
nghệ Sinh học và Môi trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh; Viện Công
nghệ Sinh học và Môi trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis tự phân lập và enzyme protease tự thu nhận, nhau
heo đƣợc lấy ở một trại heo Đồng Nai, chế phẩm phân bón lá.
Các hóa chất sử dụng: Hóa chất dùng để pha thuốc thử và môi trƣờng phản ứng
sinh hóa (Trung Quốc): D- glucose, peptone, agar, NaCl, CaCO3, DAP, NaOH, K2SO4,
KH2PO4, CuSO4, NaCO3, TCA, casein, albumin, tyrosine, trisodim citrate, thuốc thử
Folin, Lugol, Safranine, napthol, methylred, phenolphthalein. Hóa chất dùng để xác định
đạm tổng số (Đức): H2SO4 đâm đặc, CuSO4, K2SO4, parafin, NaOH, H3BO3, HCl.
Các thiết bị nhƣ: tủ sấy, nồi hấp áp suất (autoclave), tủ lạnh, cân tiểu li và cân phân
tích, máy lắc, tủ sấy, tủ định ôn, hệ thống máy Kjeldahl, máy đo OD, lò vi sóng, kính hiển
vi, tủ cấy, … cùng với tất cả các dụng cụ cơ bản đƣợc sử dụng trong phòng thí nghiệm.
3.3 Nôi dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập và thử các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus subtilis
3.3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu bùn, đất và ruột cá
Mẫu bùn sau khi lấy về dùng muỗng gạn bỏ phần nƣớc, trộn đều rồi cân 10 g mẫu
cho vào 90 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và lắc đều, tƣơng tự mẫu ruột cá rửa nƣớc sơ
qua rồi sau đó cân 10 g mẫu và dùng kéo cắt nhỏ ra rồi cho vào 90 ml nƣớc muối sinh lý,
mẫu đất cân 10 g cho vào 90 ml nƣớc rồi đun sôi đƣợc nồng độ pha loãng 10-1. Chuẩn bị
4 ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng
micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu cần phân lập có nồng độ pha loãng 10-1
cho vào ống nghiệm 1 và trộn đều bằng micropipete, đƣợc nồng độ pha loãng 10-2, tiếp
tục làm nhƣ vậy cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng
độ pha loãng 10-3,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên

13


đĩa môi trƣờng nutrient agar (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần) và trang đều bằng que trang vô
trùng, sau đó cho những đĩa NA này vào tủ ấm ủ ở 370C/24 giờ. Sau đó quan sát khuẩn
lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis,
dùng que cấy vòng làm thuần và cấy giữ giống lại trên môi trƣờng NA nghiêng.
Mẫu bùn, đất và ruột cá
Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1g mẫu + 9 ml
dung dịch NaCl 9 0/00

Dung dịch pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3…

Hút 0,1ml từ mỗi ống, cho vào đĩa pettri chứa môi trƣờng NA
Trang đều dich vi khuẩn, ủ ở 370C trong
thời gian 24 giờ
Chọn khuẩn lạc điển hình, làm thuần, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa

Giữ giống trên môi trƣơng thạch nghiêng (cấy chuyển hàng tuần)

Sơ đồ 3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis sử dụng trong nghiên cứu
3.3.1.2 Khảo sát các đặc điểm của vi khuẩn phân lập
Quan sát hình thái vi khuẩn dƣới kính hiển vi bằng cách lấy một ít sinh khối vi
khuẩn từ ống NA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dƣới kính hiển vi, độ phóng đại
1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn,
có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dƣới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù
hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (nhƣ: là trực khuẩn, hai đầu tròn,
G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh
bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản
ứng sinh hoá để khẳng định.

14