Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase (1)

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose
1.1.1. Cấu trúc của cellulose
Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết
bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn
carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100
đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm
cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh
thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43].
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi
là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành
những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như
liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi
cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23].
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị
trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn
ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước.
Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn
đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn
có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ
trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc
của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không
đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi
trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym
thủy phân cellulose [23].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự
phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25oC. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học

thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43].

1


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật
Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh
quyển. Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm
khoảng 200 tỷ tấn [29]. Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn
vị đường chứa 5, 6 carbon [27]. Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu
trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật. Sợi cellulose được
liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền
cho vách tế bào. Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết 1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-),
xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose
với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-),
và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose
và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau. Bộ khung cellulose và
hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên
kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23].
Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài
thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô
thực vật. Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi
sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm
khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật [23].
Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng
vách tế bào thực vật. Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác

nhau. Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các
polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6].

2


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật [46]
Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết
không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của
tế bào thực vật. Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức. Một số
loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các
enzym thủy giải polysaccharide [23].
Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với
hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình
thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử và hai liên kết liên phân tử.
Do đó, trước khi thủy giải với enzym, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện
tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá
vỡ cấu trúc tinh thể và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể [11].
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase
1.2.1. Nấm mốc
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài vi
sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [27]. Các sinh vật phân
hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuất
3

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có
sự hiện diện trên bề mặt tế bào. Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng
cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển. Nhiều loài nấm nguyên thủy, như
lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột
của động vật nhai lại. Khả năng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều
loài nấm kị khí khác [23].
Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống
Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose. Trái lại, ngành nấm Ascomycete,
Basidiomycete và Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh
cellulose. Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải
cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus,
Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete); và Aspergillus,
Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium
và Trichoderma (Deuteromycete) [23].
Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được
số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công
nghiệp. Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase
nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số
lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ßglucanase [27].
Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn
cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát triển
của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc
nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và không khí
môi trường xung quanh [34].
Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể
như là nguồn carbon duy nhất. Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong

đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide. Hoạt
tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất
endoglucanase ưa nhiệt và acid [13].

4


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai
bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc điểm sinh lí,
vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]:
o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và
Caldicellulosiruptor)
o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)
o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)
Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải
cellulose. Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy,
nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên. Việc phân loại các vi khuẩn
kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn
không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome
không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium
acetobutylicum [33].
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose [23]
Tiêu
thụ
oxy

Hiếu
Khí

Giống

Loài tiêu biểu

Gram Kiểu
hình

To tối
ưu

Tạo
bào tử

Di động

Hệ thống
cellulase

Acidothermus

A. cellulolyticus

+

Que

-

-

Bacillus

B. pumilis

+

Que

C. cellovorans

+

Que

Nội
bào tử
-

Flagellar

Caldibacillus
Cellulomonasc

+

Que

-

Flagellar

-

Flagellar

-

Que
cong
Que

-

Cytophaga

C. flavigena, C.
uda
C. fulvus, C.
gilvus
C. hutchinsonii

-

Gliding

Erwinia

C. carotovora

-

Que

-

Flagellar

Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp
Không phức
hợp

Micromonospora

M. chalcae

+

Bào tử

-

Pseudomonas

-

Sporocytophaga

P. fluorescens var. cellulosa
S. myxococcoides -

que

Flagellar Không phức
hợp
Gliding Không phức
hợp

Rhodothermus

R. marinus

que

Ưa
nhiệt
Trung

bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt

Cellvibrio

Que
sợi
que

5

Bào tử

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Kị
Khí

Hoàng Nguyên

Streptomyces

S. reticuli

+

Thermobifida

T. fusca

+

Acetivibrio

D. cellulolyticus

-

Anaerocellum

D. thermophilum

+

Butyrivibrio

B. fibrisolvens

+

Caldicellulosiruptor C.
saccharolyticum
Clostridium
C. thermocellum,
C. cellulolyticum

Que
sợi
Que
sợi
Que
cong
Que

-

Que
cong
Que

+

Que

Eubacterium

E. cellulosolvens

+

Que

Fervidobacterium

F. islandicum

-

Que

Fibrobacter

F. succinogenes

-

Que

Halocella

H. cellulolytica

-

Que

Ruminococcus

+

Cầu

Spirochaeta

R. albus, R.
flavefaciens
S. thermophila

+

Xoắn

Thermotoga

T. neapolitana

-

Que

Trung
bình

Ưa
nhiệt
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt,
trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Trung
bình
Trung
bình
Trung
bình
Ưa
nhiệt
Ưa
nhiệt

Bào tử

-

Bào tử

-

-

-

-

Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Không phức
hợp
Flagellar Phức hợp

Nội
bào tử

Không phức
hợp
Không phức
hợp
Phức hợp

-

-

-

Que

-

-

-

Flagellar Không phức
hợp
Phức hợp

-

Phức hợp

Không phức
hợp

Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy
giải cellulose. Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống
cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium
thermocellum [33].
Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là

giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase. Các vi khuẩn
thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus,
Micromonospora và Thermobifida [23].
Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra
một vài loại cellulase bền nhiệt. Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại
endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này
vẫn còn đến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút. Chủng vi khuẩn này cho thấy có

6


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt
độ cao [27].
Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp. JXL có khả
năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose,
glucose và xylose. Enzym của Brevibacillus sp. JXL có khả năng bền nhiệt rất cao,
vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ.
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase
1.3.1. Đặc điểm chung
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên
Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus
và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển
trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển
trên đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác
glucose. C. thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả C.
thermocellum và R. albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose. Một vài loài

vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng xylan [23].
Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose
(Anaerocellum thermophilum, C. saccharolyticus và Halocella cellulolytica) có
phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với các hợp chất
tinh bột, đường đơn, đường đa. Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của
những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng
đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin. Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần
các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [23].
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM)
Sự biến dưỡng cellulose bắt đầu từ sự thủy phân cellulose thành các loại
đường đơn hoặc đôi và sau đó sử dụng các sản phẩm thủy giải này. Có 2 cách thủy
giải cellulose [23]:

7


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay
gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm
thủy phân thành CO2 và nước.
o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme
cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành
các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men khác nhau.
Yêu cầu đầu tiên cho sự thủy giải cellulose là sự liên kết enzym vào
cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hoặc hình thành phức hợp CEM
[23]. Chủng đột biến C. thermocellum và F. succinogenes không có sự kết dính
này giảm khả năng thủy phân cellulose. Do đó, sự gắn kết phức hợp CEM là một

yêu cầu quan trọng cho sự sử dụng cellulose giữa các vi khuẩn kị khí, là tác nhân
quan trọng cho thủy giải cellulose [23].
Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hơn trong hoạt tính thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy: tập trung enzym trên bề mặt cellulose, cho phép vi sinh
vật thủy giải cellulose tiếp xúc với các sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn dưới
tác động của bacteriophage và các enzym thủy giải protease trong môi trường.
Nhìn chung, việc tạo các yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích trong việc tiết
kiệm phí tổn năng lượng cho vi khuẩn [23].
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose
Sự hấp thu glucose và cellodextrin được tìm thấy ở nhiều loài thủy giải
cellulose. C. thermocellum cho thấy sự hấp thu [14C]cellobiose và cellodextrin bởi
hệ thống phụ thuộc ATP trong khi đó glucose cũng được hấp thụ theo cơ chế riêng
biệt và phụ thuộc ATP. Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose và cellodextrin nhanh
chóng khi giảm nồng độ ATP nội bào.

8


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum [35]
Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vô
cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK,
hexokinase; PGM, phosphoglucomutase.

Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli sản xuất protein
ABC (ATP-binding cassette protein) có khả năng hỗ trợ vận chuyển cellobiose,
cellotriose và cellodextrin. Trái lại, F. succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho sự

hấp thu glucose và cellobiose. Sự yêu cầu Na+ cho sự phát triển trên cellulose cho
thấy rằng Na+ cũng là động lực cho sự hấp thụ cellodextrin [26].
Nồng độ cellodextrin và các cơ chất khác như cellulose hoặc cellobiose
quyết định con đường biến dưỡng cellodextrin cũng như sự phân cắt thủy giải
phosphoryl hóa hay sự thủy giải không phosphoryl hóa. Sự điều hòa dòng cơ chất
thông qua hai con đường biến dưỡng có lẽ cung cấp một phương cách để điều
chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với các yếu tố môi trường. Sinh khối tế bào gia tăng
cùng với sự gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào trên cellulose
cao hơn trên cellobiose [26].

9


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng
Đối với Clostridium và R. albus, ethanol và H2 là sản phẩm biến dưỡng cuối
cùng và acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ra ethanol và
acetate [14]. Sự sản xuất ethanol trong nuôi cấy mẻ của C. thermocellum được gia
tăng khi cho thêm acetate và lactate và sụt giảm khi cho thêm ethanol [23]. Chủng
Anaerocellum thermophilum là chủng duy nhất trong số vi khuẩn kị khí thủy giải
cellulose, tạo ra lactate là sản phẩm chính của sự lên men cellulose [38].
Sản phẩm cuối cùng được điều hòa ở vài mức độ: nồng độ các chất trung
gian, sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính và sự tổng hợp enzym.
Chủng F. succinogenes S85, R. albus 7, và R. flavefaciens FD-1 ít thay đổi sản
phẩm lên men khi thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate trong tự nhiên.
C. cellulolyticum và C. thermocellum có sự gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành
acetate và thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau cùng khi có sự hiện diện của dịch chiết nấm

men trong môi trường [23].
Hầu hết các vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu khi tiếp xúc
trực tiếp với cơ chất, một vài loài sự tiếp xúc này là bắt buộc. Giống như các vi
khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp,
phần lớn cơ chất được chuyển thành các sản phẩm lên men khác nhau: ethanol,
acid hữu cơ, CO2 và H2 [23].
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
Clostridium thermocellum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải
cellulose và có khả năng sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp cơ chất cellulose thành
ethanol. Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua một phức hợp cellulase lớn
gọi là cellulosome. Đây là một phức hợp protein rất phức tạp bao gồm khoảng 20
loại enzym có hoạt tính xúc tác khác nhau có trọng lượng từ 40-180 KDa.
Cellulosome của C. thermocellum được nghiên cứu nhiều và được dùng như là
kiểu mẫu trong nghiên cứu cellulosome ở các loài khác. Enzym thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy C. thermocellum được phân bố trong cả dịch lỏng và
trên bề mặt tế bào [23].

10


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

C. thermocellum

Hoàng Nguyên

Anaerocellum thermophilum

C. saccharolyticus

Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
C. thermocellum thủy phân cellulose tạo thành sản phẩm trung gian
cellobiose và cellodextrin, sau đó tiếp tục được biến dưỡng và tạo thành sản phẩm
cuối cùng là ethanol, acetic acid, lactic acid, hydrogen và carbon dioxide [23].
C. thermocellum được quan tâm nghiên cứu nhiều bởi vì: chúng có thể sử
dụng chất thải thực vật và tạo ra ethanol, gián tiếp thủy giải vật liệu chứa lignin
như các loại gỗ cứng thay thế cách tiền xử lý bởi acid, giảm chi phí cung cấp oxy,
giảm tạp nhiễm và chi phí làm mát trong quá trình lên men, dễ dàng hơn trong quá
trình thu nhận ethanol, vi sinh vật ưa nhiệt có sức sống mạnh và hệ enzym bền
vững, sinh khối tế bào thấp nên cơ chất chuyển thành ethanol sẽ nhiều hơn [11].
Anaerocellum thermophilum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, phát triển tối
ưu tại 75°C, không tạo bào tử, Gram dương được phân lập ở suối nước nóng
Kamchatka, Russia. Chúng phát triển nhanh chóng tại 75°C.
Anaerocellum thermophilum dùng nhiều loại polysaccharide, bao gồm
cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột và sinh khối thực vật chưa được
tiền xử lý. Chúng tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu như lactate, acetate, CO2 và H2.
Anaerocellum thermophilum có trình tự bộ gen dài 2.97 Mb, bao gồm một
chromosome và hai plasmid (8.3 và 3.6 Kb). Bộ gen mã hóa nhiều loại enzym thủy
giải cellulose, vận chuyển, biến dưỡng đường đơn và có cấu trúc giống như loài ưa
nhiệt kị khí khác Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 [21].
Caldicellulosiruptor saccharolyticus: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, Gram
dương lên men sinh khối thực vật chứa cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành
acetate, CO2 và hydrogen. Chúng sử dụng nhiều loại cơ chất, khả năng tạo

11


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

hydrogen cao và xử dụng được cả đường glucose và xylose. Bộ gen của C.
saccharolyticus có kích thước 2,970,275 bp mã hóa cho khoảng 2,679 protein.
Phân tích trình tự gen của C. saccharolyticus cho thấy chúng có nhiều gen
mã hóa cho enzym thủy giải polysaccharide, cellulose, hemicellulose, pectin, và
tinh b� thay đổi trong khả năng xâm nhập vào phân tử cellulose của enzym từ
sự thủy phân cơ chất [43]. Hoạt động phối hợp của endoglucanase và
exoglucanase làm thay đổi bề mặt cellulose qua thời gian làm cho thay đổi tỷ lệ
thủy phân [23].
Endoglucanase hoạt động trên vùng cellulose vô định hình và hoạt tính của
chúng có thể được thử nghiệm bằng cơ chất cellulose hòa tan như
carboxymethylcellulose. Tuy nhiên, một vài cellulases cho thấy cả hai hoạt tính
endo- và exo-. Chúng có sự phối hợp rất cao giữa hai hoạt tính endo- và exo- cần
thiết cho sự thủy phân cellulose hiệu quả [23].
1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase
Công nghiệp dệt nhuộm: cellulase là một trong ba nhóm enzym được
ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp dệt. Chúng giúp cho vải bông mềm và
sáng màu hơn thay thế cho đá bột được dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo
hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi [3], [4].
Công nghiệp tẩy rửa: cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI, thông
thường được dùng làm sạch vải sợi. Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm
mốc: T.reesei, T. viride, T.Harzianum, H.Insolens… hoạt động trong môi trường
kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa. Chúng thường được
dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy [3], [4].
Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc: trong công nghiệp thực
phẩm cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong
dịch chiết dầu oliu. Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch nha trong sản
xuất bia rượu. Cellulase cũng được dùng trong dịch chiết carotenoid cho sản xuất
chất màu thực phẩm. Sự điều chế phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và
pectinase cải thiện chất lượng dinh dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi [3], [4].

Công nghiệp sản xuất giấy: cellulase và hemicellulase đã được sử dụng
chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ

14


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

thống thoát nước trong các nhà máy bột gỗ. Chúng cũng được dùng sản xuất bột
giấy mềm làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh [3], [4].
Sản xuất nhiên liệu sinh học: có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của
cellulase hiện nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật.
Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật thành đường glucose và các đường
khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng như là nguồn cơ chất sản
xuất ethanol và protein đơn bào. Hiện nay, sản xuất ethanol từ sinh khối thực vật
trải qua quá trính gồm nhiều bước: tiền xử lý loại bỏ lignin, thủy giải cellulose
thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 500C và cuối
cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol. Tuy nhiên, quá trình này lại chưa hiệu
quả về mặt kinh tế [3], [4], [37], [22].
1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp
Nấm sợi sản xuất lượng lớn cellulase ngoại bào. Các loại enzym này không
hình thành phức hợp phân tử có trọng lượng lớn nên thường được gọi là “Hệ thống
cellulase không phức hợp”. Hệ thống cellulase của T. reesei được tập trung nghiên
cứu trong hơn 50 năm qua và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. T. reesei tạo
ra hai loại exoglucanase (CBHI và CBHII), năm loại endoglucanase (EGI, EGII,
EGIII, EGIV, và EGV) và hai loại ß-glucosidase (BGLI và BGLII) [23].
Hai loại exoglucanase chuyên biệt cho hoạt tính phân cắt từ đầu đường khử
CBHI và đầu không khử CBHII chiếm tương ứng 60 và 20% hệ thống cellulase T.

reesei. Mô hình tinh thể đã giải thích cấu trúc của hai loại exoglucanase này. CBHI
có bốn vòng trên bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 50 Å, CBHII có hai vòng trên
bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 20 Å. Cấu trúc ống cần thiết cho quá trình
phân cắt cellulose từ đầu khử và không khử. Tuy nhiên, hoạt tính cả hai loại
cellobiohydrolase giảm khi mức độ polymer hóa của cellulose giảm. Cellobiose,
sản phẩm chính của hoạt tính thủy giải CBHI và CHBII, sẽ kìm hãm hoạt tính
cellobiohydrolase và endoglucanase [23].
Cấu trúc EGI bao gồm nhiều vòng ngắn tạo ra một đường rãnh. Các rãnh
cho phép cellulose đi vào và thủy giải. EGIII có cấu trúc tương tự EGI, đây là
endoglucanase thiếu vùng CBD [23]. Tuy nhiên, các endoglucanase của T. reesei
15


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

chiếm vai trò không lớn trong quá trình thủy giải cellulose, chúng chiếm không tới
20% tổng số cellulase [40].
T. reesei tạo ra ít nhất hai loại ß-glucosidase tham gia thủy giải cellobiose
và các oligosaccharide thành glucose. Cả hai loại BGLI và BGLII thu nhận được
trong dịch nuôi cấy và cũng được gắn lên vách tế bào. ß-glucosidase trên vách tế
bào làm giảm khả năng mất glucose vào môi trường khi thủy phân cellobiose. T.
reesei sản xuất ß-glucosidase thấp hơn những loại nấm khác như Aspergillus Sp.
Hơn nữa, ß-glucosidase của T. reesei bị kìm hãm mạnh bởi glucose so với
Aspergillus. Trong công nghiệp hiện nay, cellulase của T. reesei được bổ sung với
ß-glucosidase của Aspergillus làm tăng khả năng đường hóa của chúng [31].
Loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium được dùng cho nghiên cứu
phân hủy lignocellulose. Chúng tạo ra nhiều phức hợp enzym phân hủy cellulose,
hemicellulose, và lignin là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Sự phân

hủy cellulose và hemicellulose thường được xảy ra trước, trong khi sự biến dưỡng
lignin xảy ra sau khi có sự giới hạn nguồn carbon, nitrogen, hoặc sulfur [23].
1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp
1.4.5.1.

Đặc điểm chung

Những vi khuẩn kị khí thiếu khả năng xâm nhập vào bên trong vật liệu
cellulose và do đó chúng phải tìm ra một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy
cellulose khi có sự hiện diện cạnh tranh của nhiều vi sinh vật khác và bị giới hạn
bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase. Điều này đã dẫn đến sự phát triển của “Hệ
thống cellulase phức hợp”, gọi là cellulosome, thường được tìm thấy ở các loài
Clostridia và Ruminococcus [23].
Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome và được
gắn lên vách tế bào có đường kính 60-200 nm. Mỗi polycellulosome chứa đựng
vài trăm cellulosome [7]. Cellulosome là phức hợp ngoại bào lớn và tương đối bền
vững, trọng lượng phân tử từ 2-16 MDa đối với cellulosome và có thể đạt đến trọng
lượng 100 MDa đối với polycellulosome [12], [33].
Cellulosome được phát hiện lần đầu bởi Bayer và Lamed khi quan sát

16


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

thấy những khối u trên bề mặt tế bào C. thermocellum và phức hợp này chứa
protein không có hoạt tính xúc tác có chức năng gắn liên kết các tiểu đơn
vị enzym. Cellulosome không chỉ phân hủy cellulose tinh thể, mà c òn p hâ n

hủ y hemicellulose, chitin, thậm chí cả pectin [12].
Cellulosome có khả năng phối hợp hoạt tính các enzym trong không gian
gần với vách tế bào vi khuẩn và có khả năng phối hợp hoạt tính giữa các cellulase
hiện diện bên trong cellulosome. Cellulosome thường chứa 6 đến 13%
carbohydrate, có vai trò bảo vệ khỏi hoạt tính của protease và cũng có thể có vai
trò quan trọng trong sự nhận diện các cohensin [23]. Các sản phẩm thủy giải
cellulose cũng được tế bào hấp thu tốt hơn do có sự tiếp xúc với vách tế bào [34].
Cellulosome gắn kết rất linh hoạt với cellulose tinh thể [12].
Cellulosome được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn: C. cellulovoran, C.
cellulolyticum,

C.

josui,

C.

acetobutylicum,

Acetovibrio

cellulolyticus,

Bacteroides cellulosolvens, R. albus, R. flavefaciens, Vibrio sp. và nhóm nấm kị
khí Neocallimastix, Piromyces và Orpinomyces [11], [23].
Thành phần quan trọng của cellulosome là protein scaffoldin không có hoạt
tính xúc tác, có chức năng tập hợp các tiểu đơn vị cellulase. Các tiểu đơn vị
xúc tác chứa những vùng dockerin khác nhau có trách nhiệm gắn vào scaffoldin.
Mối quan hệ này được thể hiện v ù n g cohesin trên scaffoldin, gắn kết với vùng,
dockerin trên enzyme và CBD trên scaffoldin liên kết phức hợp với cellulose [11].

Có ít nhất tám gen scaffoldin từ vi khuẩn thủy giải cellulose đã được giải trình tự.
Chúng bao gồm cipA của C. thermocellum, cbpA của C. cellulovoran, cipC của C.
cellulolyticum, cipA của C. josui, cipA của C. acetobutylicum , scaB của R.
flavefacien, cipBc của B. cellulosolven và cipV của A. cellulolyticus. Phức hợp
cellulosome của C. thermocellum tương tự như những loài vi khuẩn ưa nhiệt
trung bình C. cellulovoran và C. cellulolyticum [11].
Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome [12]
Chủng vi khuẩn

Nhiệt độ tối ưu

Nguồn phân lập

Acetivibrio cellulolyticus

M

Sewage

Bacteroides cellulosolvens

M

Sewage

Butyrivibrio fibrisolvens

M

Rumen

17


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Clostridium acetobutylicum

M

Soil

Clostridium cellulovorans

M

Wood fermenter

Clostridium cellobioparum

M

Rumen

Clostridium cellulolyticum

M

Compost

Clostridium josui

M

Compost

Clostridium papyrosolvens

M

Paper mill

Clostridium thermocellum

T

Sewage soil

Ruminococcus albus

M

Rumen

Ruminococcus flavefaciens

M

Rumen

Ruminococcus succinogenes

M

Rumen

M, mesophilic; T, thermophilic (trên 50°C)

Mặc dù, C. acetobutylicum không thủy phân cellulose, p h â n t í c h trình tự
genome cho thấy có sự hiện diện của nhóm gen mã hóa cho cellulosome. Nhóm
gen này bao gồm gen mã hóa protein scaffolding CipA, endocellulase Cel48A,
vài endoglucanase nhóm 5 và 9, mannanase Man5G và protein kị nước, OrfXp.
Tổ chức gen này tương đồng với của C. cellulolyticum [11], [6].
1.4.5.2.

Cấu trúc cellulosome

Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum [12]
18


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Scaffolding protein (scaffoldin)
Cellulosome bao gồm protein scaffolding, kết hợp với nhiều loại enzym
trong cellulosome. Protein scaffolding, cũng được gọi là “scaffoldin”, đây là

protein không có hoạt tính xúc tác gồm nhiều cohesin và vùng CBD, vùng ưa
nước, vùng dockerin II, vùng có hoạt tính enzym và nhiều vùng chức năng chưa
được xác định trên scaffoldin [6], [12].
Cohesin và Dockerin
Các cohesin hiện diện trong scaffoldin và có vị trí liên kết với vùng
dockerin của enzym trên cellulosome. Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò
quan trọng trong sự xắp xếp của cellulosome. Số lượng cohesin có trong
scaffoldin khác nhau giữa các loài. Có sự tương đồng trong trình tự amino
acid giữa cohesin từ những loài khác nhau. Tuy nhiên, các cohesin có sự
chuyên biệt trong tương tác với các dockerin, cohesin của C. thermocellum
không tương tác với dockerin của C. cellulolyticum và ngược lại [6], [12].
Có hai loại cohesin: cohesin loại I gắn chuyên biệt với dockerin loại I trên
tiểu đơn vị xúc tác, và cohesin loại II trên protein bề mặt tế bào gắn kết dockerin
loại II của scaffoldin vào vách tế bào. Tất cả enzyme thuộc cellulosome chứa
vùng dockerin. Nếu enzyme không chứa dockerin, chúng không phải là thành
phần của cellulosome [11].
Ở loài C. thermocellum, trình tự genome cho thấy có ít nhất 72 protein
chứa dockerin nhưng chỉ có chín cohesin trên phân tử scaffoldin. Cohesin có độ
tương đồng cao và năm trong số đó có sự tương đồng hơn 90%. Cohesin của một
chủng nhận biết gần như tất cả các dockerin của chủng đó [9]. CelD là
endoglucanase hoạt động nhất, scaffoldin gia tăng hoạt tính của CelD ít nhất 10
lần trên avicel nhưng không có hoạt tính khi CelD thiếu dockerin [11].
Calcium là kim loại chính của cellulosome, tương tác giữa dockerin và
cohesin yêu cầu Ca2+ ở nhiều loài như C. thermocellum và C. cellulolyticum. Do
đó, cellulosome có thể bị phân rã bởi nồng độ EDTA trung bình. EDTA kìm hãm
hoạt tính của cellulosome do chúng có khả năng gắn kết với Ca2+ [15].
Endoglucanase D có ba vị trí gắn Ca2+ và một vị trí gắn kết kẽm. Ca2+ cũng
gia tăng tính bền nhiệt cho exoglucanase CelS, enzyme nhiều nhất của

19

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

cellulosome. Sự gấp cuộn của protein tạo thành dockerin phụ thuộc Ca2+, giải
thích tại sao Ca2+ cần thiết cho tương tác cohesin-dockerin và khả năng bền
vững của cellulosome [25].
Các thành phần của cellulosome bị phân rã khi xử lý với SDS-EDTADTT. Cellulosome bị phân rã dưới điều kiện không biến tính khi ủ tại nhiệt độ
60°C có sự diện của EDTA và cellulose tinh thể. Trong quá trình phân tách,
scaffoldin vẫn gắn vào cellulose nhưng các tiểu đơn vị bị phóng thích [11].
Cellulosome cũng có thể bị phân rã mà không mất hoạt tính thủy giải
cellulose tinh thể khi dùng đ ệ m 50 mM Na acetate (pH 5.0) chứa 10 mM DTT,
10 mM EDTA và 0.2% SDS tại 30°C trong 25 phút [9].
Cellulose-Binding Domain
Vùng liên kết carbohydrate (CBD) của scaffoldin liên kết chặt chẽ
cellulosome với cơ chất cellulose. CBD liên kết cellulosome với cellulose tinh
thể hiệu quả hơn đối với cellulose vô định hình [12].
Sự tương tác CelS, CelD và endoglucanase trên scaffoldin với cơ chất
cellulose thông qua cấu trúc CBD. Các CBD khác nhau gắn trên những vị trí khác
nhau trên cellulose tinh thể. S o s á n h g i ữ a CBD của CipA ở loài C.
thermocellum với hai loại ở T.reesei và một ở Cellulomonas fimi, CBD của CipA
có nhiều vị trí kết hợp với phân tử cellulose hơn [11].
CBD của CipA ở loài C. thermocellum đã được tạo dòng, biểu hiện trong
E. coli, và cấu trúc của chúng đã được xác định. CBD cũng gắn kết với Ca2+ mà
chức năng chưa được biết đến. Cấu trúc CBD của CipC ở loài C. cellulolyticum
cũng đã được xác định. Chúng bao gồm vị trí gắn kết bề mặt gắn kết cellulose và
một rãnh cạn với chức năng chưa được biết đến [11].
1.4.5.3.

Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào

Vùng HLD hay S-layer homology (SLH) của C. cellulovoran có vai trò
quan trọng trong sự liên kết cellulosome với bề mặt của tế bào [31]. Cellulosome
gắn vào tế bào trong suốt pha lag, được phóng thích vào môi trường trong pha tăng
trưởng, và tồn tại tự do trong môi trường hoặc gắn vào cellulose trong pha ổn
định. Tất cả các protein của cellulosome được tiết ra ngoại bào và được gắn kết
20


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

trên bề mặt tế bào. Sự gấp cuộn protein của dockerin phụ thuộc Ca2+, sự xắp xếp
cấu trúc cellulosome dễ dàng khi có sự hiện diện Ca2+ bên ngoài tế bào [12].

Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào thông qua tương tác
cohesion-dockerin loại II với protein chứa vùng SLH, SdbA, Orf2p và OlpB [11]
Đầu cuối gen cipA của gen loài C. thermocellum là ba khung đọc mở
(ORF) mã hóa cho protein trên bề mặt tế bào. Vùng SLH hiện diện trong
polypeptide liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn và hình thành liên kết không cộng
hóa trị với peptidoglycan của vách tế bào. Ba gen mã hóa được gọi là olpA, olpB,
và orf2p. Gen thứ tư, sdbA, mã hóa cho protein trên bề mặt tế bào khác, là phần
khác hiện diện trong genome [11].
Protein OlpA đã được định vị trên bề mặt tế bào của C. thermocellum. Do
đó, có giả thuyết cho rằng vùng này chịu trách nhiệm gắn cellulosome vào bề mặt
tế bào. OlpA có vùng cohesin loại I gắn kết với enzym cellulosome thông qua
dockerin loại I. Gene olpB mã hóa OlpB, cũng định vị trên bề mặt tế bào [11].

Protein SdbA của C. thermocellum có một vùng cohesin loại II gắn chuyên
biệt vào dockerin loại II của CipA. SdbA được gắn thông qua vùng SLH của chúng
21


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

với lớp S-layer của tế bào, liên kết trực tiếp với lớp peptidoglycan của vách tế bào.
Thực vậy, sự gắn kết giữa CipA và bề mặt tế bào xảy ra giữa vùng dockerin của
CipA và vùng cohesin loại II của OlpB, ORF2p và SdbA. SdbA có một vùng
cohesin, Orf2p có hai vùng cohesin, và OlpB có bốn cohesin, liên kết với một, hai
và bốn phân tử của scaffoldin, tương ứng [11].
Một vài enzyme không thuộc cellulosome ở loài C. thermocellum, có thể
liên kết trực tiếp với bề mặt tế bào, e.g., xylanase XynX, không có vùng dockerin
nhưng có nhiều đoạn SLH [11], [6].
1.4.5.4.

Sự sắp xếp của cellulosome

Cấu trúc không gian ba chiều của hai cohesin loại I của C. thermocellum và
C. cellulolyticum đã được làm sáng tỏ bởi phân tích cấu trúc tinh thể bằng X-ray.
Cohesin loại II của CipA của C. thermocellum hình thành một hình thể cuộn tròn
bao gồm 9 tấm β-sheet [11].
Vùng cohesin C. cellulolyticum có sự gấp cuộn tương đồng với cohensin
của C. thermocellum. Cấu trúc của cohesin cho thấy tất cả các cohesin có thể
tương tự nhau trong sự gấp cuộn hình thể. Tương tác cohesin-dockerin loại I rất
mạnh khi có sự hiện diện của Ca2+. Ái lực cao này giải thích sự bền vững cấu trúc
bậc bốn của cellulosome trong môi trường ngoại bào [11].

CelS là protein thuộc cellulosome với cấu trúc bậc ba của vùng dockerin và
vùng xúc tác đ ã được xác định. Phân tích phổ NMR, cho thấy Ca2+ kích thích sự
gấp cuộn của vùng dockerin thành cấu trúc bậc 3. Sự gấp cuộn phụ thuộc Ca2+ có lẽ
là cơ chế ngăn ngừa CelS gấp cuộn thành hình thức hoạt động trong tế bào chất,
nơi mà nồng độ Ca2+ chỉ khoảng 1mM. Sự thiếu Ca2+ có thể chống lại sự gắn
kết tiểu đơn vị xúc tác với scaffoldin trước khi tiết ra ngoại bào [11].
Vùng dockerin được chuyên biệt bởi hai vị trí liên kết Ca2+ với trình tự
giống trình tự xoắn-vòng-xoắn (EF-hand motif). Cấu trúc này bao gồm hai xoắnvòng gắn kết với Ca2+ được gắn kết với một linker; xoắn E trong mỗi vòng của
motif EF-hand cổ điển không có trong vùng dockerin. Mỗi tiểu vùng liên kết
dockerin với Ca2+ được ổn định bởi một nhóm chuỗi kị nước sâu bên trong [11].
Dockerin có cấu trúc đối xứng. Tương tác cohesin-dockerin loại I hình
22


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

thành một phức hợp 1:1. Chứng tỏ một trong hai dockerin đối xứng được dùng để
gắn kết với cohesin. Trong khi cấu trúc cohesin không thay đổi trong phức
hợp, dockerin trải qua sự thay đổi hình thể và cấu trúc hòa tan cho thấy sự đối
xứng gần như hoàn toàn của chúng. Trong một số trường hợp, cohesin gắn kết
ưu tiên đoạn thứ hai của dockerin, cho thấy đoạn thứ nhất của dockerin có lẽ
cung cấp vị trí gắn kết thứ 2, có khả năng hình thành phức hợp 1:2 (1 dockerin
với 2 cohesin), một thứ bậc cao hơn trong cấu trúc cellulosome [11].

Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum [5]
Chú thích: Cohesin loại II màu xanh dương, vùng dockerin loại II màu xanh lá cây và
vùng X màu xám. Các chuỗi β của vùng X và cohesin loại II được đánh số màu vàng. Đầu
N và C-termini được đánh dấu phù hợp và Ca2+ được mô tả trong vùng màu cam

Sự nhận biết tương tác cohesin-dockerin được trung gian bởi tương tác kị
nước giữa một mặt của cohesin và vòng xoắn dockerin. Năm liên kết hydrogen
giữa hai protein được tìm thấy, mà chủ yếu là cặp amino acid Ser-Thr (vị trí 10
và 11 của vòng liên kết với Ca2+). Đặc biệt, cặp Ser-Thr được bảo tồn một cách
giới hạn trong dockerin của C. thermocellum nhưng không ở C. cellulolyticum.
Những gốc amino acid khác hình thành trực tiếp liên kết hydrogen với cohesin,
như là Arg (hoặc Lys) và Leu (hoặc Ile), cũng được bảo tồn cao[11].

23


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon
Điều kiện phát triển ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính thủy giải cellulose của
C. thermocellum cũng như các thành phần của cellulosome. Hoạt tính cellulase
tổng cao hơn ở tế bào nuôi cấy trên cellulose hơn tế bào nuôi cấy trên cellobiose.
C. thermocellum điều hòa sản xuất cellulase phụ thuộc vào nguồn carbon và
nguồn năng lượng có sẵn. Mức độ sản xuất enzyme c a o khi nguồn carbon và
năng lượng có sẵn bị giới hạn và có sự hiện diện cellulose tinh thể [11].
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng mRNA CelS được kiểm soát bởi tốc độ
tăng trưởng trong điều kiện hạn chế của carbon hoặc nguồn nitơ. Sự biểu hiện
trong điều kiện giới hạn carbon cao hơn dưới điều kiện dưới hạn nitrogen, cho
thấy tác động của nguồn carbon trên sự phiên mã. Sự phiên mã tỷ lệ nghịch với
tốc độ tăng trưởng. Biểu hiện của gen CelS gấp ba lần cao hơn trong giữa giai
đoạn tăng trưởng mũ trên cellulose so với cellobiose [11].
Trong loài ưa nhiệt trung bình C. cellulovoran, tinh thể cellulose thúc đẩy

sự xắp xếp cellulosome. Khi phát triển trên cellobiose, protein thuộc cellulosome
không được tổ chức nhưng cũng hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Khi cho
thêm cellulose tinh thể đối với dịch nuôi cấy ngoại bào, cellulosome được hình
thành. Bổ sung carbohydrate hòa tan vào môi trường có tế bào phát triển trên
cellulose dẫn đến biến mất nhanh chóng của khối u trong vài phút. Cellulosome
của C. cellulovoran chứa không chỉ những enzym cho phân hủy cellulose mà còn
cho sự phân hủy xylan, lichenan, pectin và mannan, giống như cellulosome của
C. thermocellum [11].
Một nghiên cứu gần đây bằng cách sử dụng kỹ thuật Northern dot blot
nhằm bán định lượng biểu hiện của các gen cellulase, hemicellulase và pectinase
khác nhau cho thấy xylan, cellulose hoặc pectin, khi được sử dụng như là nguồn
cacbon, đã làm gia tăng mức độ biểu hiện hầu hết các gen. Những kết quả này
cung cấp bằng chứng về sự phối hợp biểu hiện của gen cellulase và hemicellulase,
sự tồn tại của sự kìm hãm dị hóa, và ảnh hưởng của hemicellulose trên sự phân
hủy cellulose. Sự biểu hiện proteome của cellulosome bị tác động nhiều hơn bởi
nguồn carbon hơn là các enzym không được tổ chức cellulosome [11].

24


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase
Theo truyền thống, mối quan hệ vi khuẩn với oxy được phân loại theo
nhiều cấp độ: hiếu khí, hiếu khí tùy ý, kị khí tùy ý, kị khí (kị khí trung bình, kị khí
giới hạn và kị khí tuyệt đối). Tuy nhiên, sự phân loại theo cách này chưa phân loại
chính xác mức độ kị khí của vi khuẩn. Thế oxy hóa khử có thể là một chỉ số kị khí
chính xác hơn và cung cấp mức độ liên tục mối quan hệ với oxy của vi khuẩn [17].

Mức độ oxy hóa hoặc khử của các chất hóa học có thể được định nghĩa
bằng thế oxy hóa khử. Vi khuẩn hiếu khí có nhiều hệ thống làm giảm thế oxy hóa
khử và không bị ảnh hưởng nhiều trong môi trường có thế oxy hóa-khử cao. Trong
khi đó, vi khuẩn kị khí bị tác động mạnh khi trong môi trường nuôi có thế oxy hóakhử cao [17].
Trong tự nhiên oxy là một trong những chất có thế oxy hóa khử rất cao
(O2/2O2- có thế oxy hóa – khử là +0.81V). Oxy có thể tác động tế bào vi khuẩn
thông qua phản ứng hóa học với các thành phần của môi trường và tế bào. Do đó,
oxy phân tử cần được loại bỏ trong môi trường nuôi cấy kị khí để tạo nên một thế
khử thấp. Một số vi khuẩn kị khí giới hạn và kị khí tuyệt đối chỉ phát triển được
trên môi trường có thế khử rất thấp (ví dụ: vi khuẩn kị khí sinh methane chỉ có thể
phát triển trong môi trường khi có thế oxy hóa khử thấp hơn -0.33V). Thế oxy hóakhử bền vững trong môi trường nuôi cấy được cân bằng bởi tác nhân khử và tác
nhân oxy hóa: khi tác nhân oxy hóa được thêm vào thế oxy-khử sẽ tăng, ngược lại
khi thêm tác nhân khử thế oxy-khử sẽ giảm [17].
Do đó, để nuôi cấy các vi khuẩn kị khí giới hạn, chúng ta sẽ gặp nhiều
khó khăn khi thiết lập môi trường có thế khử thấp và giới hạn oxy. Để thực hiện
điều này, môi trường trong quá trình chuẩn bị phải loại bỏ oxy và các tác nhân khử
sẽ được thêm vào môi trường nuôi cấy. Các tác nhân khử nên được cho vào cuối
cùng khi chuẩn bị môi trường và nồng độ của các chất khử phải được tính toán
thích hợp để tránh gây độc cho vi khuẩn [17].
Phương pháp phân lập vi khuẩn trên đĩa petri truyền thống không phù hợp
cho việc phân lập các vi khuẩn kị khí giới hạn. Nhiều phương pháp phân lập vi
khuẩn kị khí đã được đưa ra nhưng việc phân lập các vi khuẩn kị khí đạt hiệu quả
cao và thực hiên đơn giản dựa trên phương pháp roll tube của Hungate (Hungate,
25


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

1950). Trong ống roll tube môi trường agar được phân bố một lớp mỏng mặt trong
của ống nghiệm trong điều kiện không có oxy. Kỹ thuật này đã có nhiều thay đổi
và cải tiến khi bắt đầu xuất hiện [17].
Trong ống Hungate, môi trường nuôi cấy và vi khuẩn được đặt dưới điều
kiện của khí không chứa oxy như: carbon dioxide, hydrogen, nitrogen hoặc những
hỗn hợp các chất khí này. Carbon dioxide là chất khí thường được sử dụng bởi vì
chúng nặng hơn không khí, rẻ tiền và có thể đóng vai trò là chất đệm [17].
Hơn nữa, việc phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase còn đòi hỏi
có thể nhận biết vi khuẩn sinh cellulase ngay trên môi trường nuôi cấy. Vì thế, môi
trường nuôi cấy có chứa cellulose tinh thể được sử dụng cho phân lập. Trong môi
trường này, vi khuẩn sinh cellulase có khả năng tạo vòng phân giải cellulose tinh
thể sau một khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp .
Các chủng vi khuẩn ưa nhiệt, kị khí sinh cellulase thường có khoảng nhiệt độ
sống tương đối rộng 40-85oC. Việc phân lập các chủng ưa nhiệt được nuôi cấy ở
nhiệt độ 60oC. Trong ống roll tube, các chủng phát triển và tạo vòng phân giải
cellulose tinh thể sau khoảng 7 -10 ngày nuôi cấy tại nhiệt độ 600C. Các khuẩn lạc
thường có màu trắng và có kích thước tương đối nhỏ.
1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử
Phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm di truyền là một
phương pháp hiện đại cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn, thao tác đơn
giản. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt
tiền và được ứng dụng trên một số kỹ thuật như [1]:
Sử dụng mẫu dò (nucleic acid probes): mẫu dò là một trình tự nucleic acid
được sử dụng để xác định sự hiện diện một trình tự nucleotide đặc trưng của một
chủng vi sinh vật đã được biết tới. Mẫu dò có thể là một mạch đơn của nucleic
acid, thông thường là DNA, được gắn với một nhân tố nhận biết (có thể là phóng
xạ). Tuy nhiên, trong một vài trường hợp kỹ thuật này cho độ nhạy không cao.
Một số vi sinh vật có thể sử dụng kỹ thuật mẫu dò như: Campylobacter sp.,
Enterococcus sp., Haemophilus influenza [1].

26


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu nhờ PCR: kỹ thuật PCR được sử
dụng để khuếch đại một trình tự đặc hiệu ở bất kỳ môi trường nào (đất, nước, thực
phẩm, cơ thể sinh vật). Kỹ thuật này cho phép định danh được các vi sinh vật
không thể nuôi cấy hiện diện rất ít ở trong mẫu. Kỹ thuật này rất được ưa chuộng
vì đơn giản, thời gian phát hiện ngắn. Tuy nhiên, kỹ thuật này cần thiết phải có
thông tin đầy đủ về trình tự DNA của các loài vi sinh vật, nhằm thiết lập cặp mồi
đặc hiệu cho từng loài hay từng giống vi khuẩn [1].
Giải trình tự gen mã hóa cho tiểu phần RNA 16S của ribosome: từ năm
1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là: “tài liệu
của lịch sử tiến hóa, là thước đo tiến hóa”, để là một thước đo tiến hóa, phân tử
được chọn phải có các đặc điểm sau [1]:
o Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát
o Phân tử không được di truyền qua lại giữa các loài
o Trình tự của sinh vật này có độ bảo tồn và biến động thích hợp
o Phân tử phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin.
Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong sinh tổng hợp
protein và ba loại phân tử rRNA (5S, 16S và 23S). Bởi vì rRNA đóng vai trò quan
trọng đảm nhận một chức năng duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao
trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide
khác biệt giữa các loài và đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được
xem là một thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng chính là công cụ hữu ích cho phân
loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà dựa vào
trình tự rDNA (trình tự mã hóa rRNA), vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính

bền cao hơn RNA. Trong các loại trình tự rRNA thì phân tử rRNA 16S thích hợp
nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước vừa phải của chúng (khoảng 1500
ribonucleotide). Trong khi đó, phân tử 5S (khoảng 120 ribonucleotide) chứa quá ít
thông tin và phân tử 23S (khoảng 3000 ribonucleotide) lại quá dài gây khó khăn
cho việc giải trình tự [1].
Khi một trình tự rDNA 16S được giải mã hoàn toàn ta có thể định danh loài
vi sinh vật mục tiêu nhờ so sánh với trình tự rDNA 16S của loài vi sinh vật đang
quan tâm với tất cả các trình tự rDNA 16S của các loài vi sinh vật lưu trữ trong

27