Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase (2)

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguồn phân lập
Nguồn mẫu phân lập: đất mùn, đất ruộng, đất thịt, phân trùng quế thu nhận ở
nhiều địa điểm khác nhau Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long
An, Tây Ninh, Đồng Nai, Thành Phố Hồ Chí Minh (phụ lục 1).
2.1.2. Thiết bị dụng cụ
2.1.2.1. Thiết bị thông dụng
Bể ổn nhiệt Cole Parmer BT-15

Máy Votex Scientific Industries

Bộ điện di Protein Biorad

Máy li tâm Hettich EBA 20

Bộ điện di DNA Cole Pamer

Máy li tâm Hettich Mikro 20

Bếp Microwave

Máy nước cất Aquatron

Cân phân tích A&D HR-200

Máy đo OD Cole Parmer 1100 RS

Spectrophotometer

Đèn soi UV UVitec

Máy PCR Thermocycler

Kính hiển vi Nikon eclipse 80i

Máy khuấy từ Cole Palmer

Nồi hấp vô trùng Hirayama HVA-85

Máy đo pH

Tủ ấm Sanyo Incubator MIR-162

Tủ sấy

Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710 ATS
Pipepman, đầu tip, eppendorf, cốc thủy tinh, đèn cồn, quả bóp cao su, que tạo
giếng thạch.
2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí
Ống nghiệm kị khí Hungate, parafin lỏng, cysteine hydrochloride, chất chỉ thị
thế oxy hóa-khử resazurin
Bộ thiết bị kị khí: bình khí hydrogen, bình hỗn hợp khí 80% N2 và 20% CO2,
bộ điều khiển luồng khí Sanshin GR-8, thiết bị quay roll tube, bộ đầu kim thổi khí

29

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2.1.2.3. Môi trường
Môi trường phân lập CT (DSMZ 122)
(NH4)2SO4

1.3g

MgCl2.6H2O

2.6g

KH2PO4

1.43g

CaCl2.2H2O

0.13g

NaCO3

5g

FeSO4.7H2O

1.1mg

Cysteine hydrochloride

1.5g

Yeast extract

4.5g

Resazurin 0.1%

1ml

Cellulose tinh thể

10g

Nước cất

1000ml

pH

7.0 - 7.2

Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử
trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường CT agar cải biên
(NH4)2SO4

1.3g

MgCl2.6H2O

2.6g

KH2PO4

1.43g

CaCl2.2H2O

0.13g

NaCO3

5g

FeSO4.7H2O

1.1mg

Cysteine hydrochloride

1.5g

Yeast extract

4.5g

Resazurin 0.1%

1ml

Glucose

10g

Nước cất

1000ml

pH

7.0 - 7.2

30


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử
trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường khảo sát hoạt tính cellulase PCS
Trypton

5g

Yeast extract

1g

NaCl

5g

CaCO3

5g

Giấy lọc 1x6mm (50mg)

20 miếng

Rơm rạ xay nhuyễn

10g

Cysteine hydrochloride

1.5g

Resazurin 0.1%

1ml

Nước cất

1000ml

pH

7.0 - 7.2

Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử
trùng 121oC, 15 phút [42].
CMC agar 1%
CMC

1g

Agar

17g

Nước cất

1000ml

Hấp khử trùng 121oC, 15 phút.
2.1.2.4. Dung Dịch Hóa Chất
Dung dịch ly giải cellulosome (cellulosome lysis buffer): đệm Natri
acetate 50 mM (pH 5.0), DTT 10 mM, EDTA 10 mM và SDS 0.2% [11]
Dung dịch đệm PBS buffer: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g,
KH2PO4 0.24g hòa tan trong khoảng 800ml nước cất, điều chỉnh pH 7.4 với HCl
và NaOH, thêm nước cho tới 1 lít
Thuốc nhuộm congo red 0.1%: congo red 1g, pH 7.6±0.2, nước cất
1lít
Thuốc nhuộm Gram

31


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Dung dịch crystal violet: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20ml ethanol
95%, 0,8g ammon oxalat hòa tan trong 80ml nước cất. Trộn hai dịch nói
trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối [8].
o Dung dịch iod: Hoà tan 1g iod trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI
khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối [8].
o Dung dịch safranin: nghiền 0.25g safranin trong cối sứ với 10ml
ethanol 95%, rửa bằng nước cất và thu gộp nước rửa vào ống đong. Bổ sung
nước cất cho đủ 100ml [8].
Thuốc nhuộm bào tử
o Dung dịch lục malachite bão hoà 7,6% [8]
o Dung dịch safranin 0,5% [8]
Thuốc thử Bradford
o Thuốc thử coomassie blue G250: 5mg coomassie, 22.5g ethanol,
43.5g H3PO4, 500 ml nước cất [3], [4]
o Dung dịch albumin gốc: 10mg/ml, pha dãy nồng độ albumin chuẩn
từ dung dịch gốc với nồng độ từ 10-90 µg/ml [3], [4]
Hóa chất xác định hoạt tính cellulase tổng số
o Thuốc thử DNS: hòa tan 10.6g DNS và 9.8g NaOH trong 1416ml
nước cất. Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm 306g sodium potassium tartrate,
7.6ml phenol (500C), và 8.3g sodium metabisulfite, trộn đều [44].
o Đệm citrate 1M, pH 4.5: hòa tan 210g citric acid monohydrate trong
750ml nước cất, thêm 10-60g NaOH cho đến pH 4.3. Hòa tan hỗn hợp đến

gần 1000ml và kiểm tra pH cuối, dùng NaOH điều chính pH đến 4.5 [44].
o Đệm citrate 50mM, pH 5: hòa tan đệm citrate 1M pH 4.5 bằng 19 lần
nước cất [44].
o Giấy lọc: 50mg/miếng, 1x6mm [44]
o Dung dịch glucose chuẩn: 10g/l [44]
Hóa chất điện di SDS – PAGE
Hóa chất điện di
o Tris-HCl 2M, pH 8.8: Tris 24.2g, thêm 50ml nước cất, thêm HCl
đậm đặc chính pH về 8.8 sau đó thêm nước cho đủ 100ml [3], [4], [36], [10]

32


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Tris-HCl 1M, pH 6.8: Tris 12.1g, thêm 50ml nước cất, thêm HCl
đậm đặc chính pH về 6.8 sau đó thêm nước cho đủ 100ml [3], [4], [36], [10]
o Ammonium persulfate 10%: ammonium persulfate 1g, nước cất 10ml
[3], [4], [36], [10]
o Electrophoresis buffer: Tris 3g, glycine 14.4g, SDS 1g, thêm nước
cất cho tới 1 lít [3], [4], [36], [10]
o Separating gel 9%: acrylamide stock 30% 3ml, Tris-HCl 2M pH 8.8
2.5ml, TEMED 5µl, nước khử ion 4.945ml, ammonium persulfalt 10% 50µl
[3], [4], [36], [10]
o Stacking gel 5%: acrylamide stock 30% 0.67ml, Tris-HCl 1M pH 6.8
1ml, TEMED 4µl, nước khử ion 2.3ml, ammonium persulfalt 10% 20µl [3],
[4], [36], [10]
Hóa chất nạp mẫu protein

o 5x sample buffer: Tris-HCl 1M 0.6 ml, glycerol 50% 5ml, SDS 10%
2ml, 2-mercaptoethanol 0.5ml, bromophenol blue 1% 1ml, nước cất 0.9ml
[3], [4], [36], [10]
Hóa chất nhuộm và giải nhộm protein
o Thuốc nhuộm coomassie blue: coomassie blue R-250 1g, methanol
450ml, glacial acetic acid 100ml, nước cất 450ml [3], [4], [36], [10]
o Thuốc giải nhuộm gel coomassie blue: methanol 100ml, glacial
acetic acid 100ml, nước cất 800ml [3], [4], [36], [10]
Hóa chất hồi tính và nhộm CMC
o Hóa chất hồi tính protein sau khi điện di SDS-PAGE: Tris-HCl
buffer 0.0625 M pH 6.8, sodium acetate buffer pH 4.8 [36]
o CMC ( 1 % ): CMC 1g, 100ml đệm sodium acetate, pH 5 [36]
Thang chuẩn protein (161-0304, Low range Biorad)
Protein

Trọng lượng phân tử (Daltons)

Phosphorylase b

97.400

Serum albumin

66.200

Ovalbumin

45.000

33

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Carbonic anhydrase

31.000

Trypsin inhibitor

21.500

Lysozyme

14.000

Dung dịch đệm Citrate buffer (pH 3-6.2)
o Dung dịch Citric acid 0.1M: 21.01g, nước cất 1 lít [2]
o Dung dịch Trinatri Citrate 0.1M: 29.41g, nước cất 1 lít [2]
Giá trị pH

4

5

6

Dung dịch Citric acid 0.1M (ml)

33

20.5

9.5

Dung dịch Citrate trinatri 0.1M (ml)

17

29.5

40.5

Dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7-9)
o Dung dịch Tris 0.2M: 24.24g, nước cất 1 lít [2]
o Dung dịch HCl 0.2M: 16.8ml HCl 37%, nước cất 1 lít [2]
Giá trị pH

7

8

9

Dung dịch Tris 0.2M (ml)

50

50

50

Dung dịch HCl 0.2M (ml)

44.2

26.8

5

Hóa chất phản ứng PCR
o Thành phần phản ứng PCR: DNA khuôn mẫu, dNTP 2.5mM, mồi
xuôi 10mM, mồi ngược 10mM, MgCl2 50mM, 10X amonium buffer, Tag
polymerase, nước khử ion
o Hóa chất tách DNA trực tiếp: DNAzol® Direct
o Trình tự mồi được sử dụng: [20], [32]
Primer

Trình tự

Vị trí

Chuyên biệt

27F

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

8-27

16S rDNA

1492R

5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

1492-1533

16S rDNA

Primer

Trình tự (5’-3’)

Vị trí

Chuyên biệt

S-G-Clos-0586-S-21

CTCAACTTGGGTGCTGCATTT

586 - 607

Clostridium

S-G-Clos-1205-A-21

ATTGTAGTACGTGTGTAGCCC

1205 - 1226

Clostridium

34


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Hóa chất điện di DNA
o Agarose Sigma
o Ethidium Bromide: 10mg/ml
o TAE buffer 50X: tris 242g. acetic acid 57.1ml, EDTA 0.5M pH 8,
100ml, thêm nước cất cho đủ 1000ml. Từ dung dịch mẹ pha loãng thành
TAE buffer 1X
o 10X loading buffer: 0.25% bromophenol blue, 40% glycerol trong
TAE buffer 1X
o Thang chuẩn D0428 Sigma (Kb): 10, 8, 6, 5 ,4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5
Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR
The illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit: cột GFX,
Capture buffer, Washing buffer, và colection buffer (Tris-HCl và nước cất).
2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng
o E. coli DH5α
o C. saccharobutylicum
2.2. Phương pháp thực hiện
2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí

Mục đích
Loại bỏ oxy chuẩn bị môi truờng cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí. Môi trường
được đun nóng và sục hỗn hợp khí N2 và CO2 đẩy oxy ra khỏi môi trường cho đến
khi chất chỉ thị resazurin chuyển từ màu hồng sang không màu.
Trong môi trường nuôi cấy, tác nhân khử (cysteine hydrochloride hoặc Lglutathione) được thêm vào để làm giảm thế oxy hoá-khử của môi trường. pH của
môi trường khi thanh trùng vào khoảng 7.0±0.2. Để giữ pH mong muốn ổn định
khi thanh trùng nên chỉnh pH cao hơn 0.1-0.2 đơn vị trên pH mong muốn. Những
ống môi trường nào có màu hồng sau khi thanh trùng đều bị loại bỏ.
Phương pháp thực hiện
o Cân trọng lượng thành phần môi trường cần pha

35


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Hoà tan thành phần môi trường vào erlen nước cất sao cho thể tích
môi trường gần bằng với thể tích erlen
o Chỉnh pH môi trường về giá trị mong muốn
o Đậy kín bình erlen bằng giấy bạc và cho ống sục khí N2 và CO2 qua
miếng giấy bạc
o Tiến hành vừa sục khí vừa khuấy bằng máy khuấy từ tại nhiệt độ
60oC cho đến khi môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu
o Làm lạnh môi trường đến khoảng nhiệt độ phòng và thêm tác nhân
khử được vào môi trường
o Tiếp tục sục khí và khuấy bằng máy khuấy từ tại nhiệt độ 60oC cho
đến khi môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu
o Phân phối môi trường vào ống nghiệm Hungate trong khi vẫn sục khí

vào ống nghiệm để tạo môi trường kị khí
o Nhẹ nhàng đậy kín nắp ống Hungate và đem hấp khử trùng ở 121oC
trong 15 phút
o Môi trường được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng và sử dụng
trước khi resazurin chuyển sang màu hồng
Kết quả
Môi trường trong ống nghiệm kị khí không màu
2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase
Mục đích
Sử dụng phương pháp ống roll tube (1950, Hungate) và môi trường phân
lập có cellulase tinh thể (CT agar) cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí, sinh cellulase.
Trong ống roll tube, môi trường hình thành một lớp màng mỏng môi trường trên
thành ống Hungate. Sau khi ủ với thời gian thích hợp sẽ hình thành vòng phân giải
cellulose tinh thể trong ống roll tube. Tiến hành thu nhận các khuẩn lạc và làm
thuần trên môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên.
Cách thực hiện
o Cân 1g mẫu và tiến hành pha loãng trong 10ml môi trường CT lỏng
trong điều kiện kị khí đến độ pha loãng 10-3
36


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Cấy 0.5ml dịch pha loãng vào ống nghiệm Hungate có 7.5ml môi
trường CT agar đã được làm tan chảy và để nguội ở nhiệt độ khoảng 6070oC
o Xoay tròn ống nghiệm trên dụng cụ xoay tròn với tốc độ 60
vòng/phút trong nước lạnh cho đến khi agar đông
o Nuôi cấy trong thời gian 7-10 ngày tại nhiệt độ 60oC

o Quan sát khả năng tạo vòng phân giải cellulase tinh thể trong ống
roll tube và cấy truyền sang môi trường thạch nghiêng
Kết quả
Thu nhận khuẩn lạc trong ống roll tube có vòng phân giải cellulase tinh thể
2.2.2. Đặc điểm sinh lí hình thái vi khuẩn
2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Mục đích
Ghi nhận sự hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc sau 10 ngày nuôi
cấy trên môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên.
Cách tiến hành
o Cấy ria chủng vi khuẩn phân giải cellulose tinh thể trên môi trường
CT agar cải biên
o Nuôi cấy ở nhiệt độ 60oC trong 10 ngày
o Quan sát khả năng hình thành khuẩn lạc trong 7-10 ngày
Kết quả
Ghi nhận sự hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram
Mục đích
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Hucker cải tiến [8].
Nhuộm Gram là một phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2
nhóm: Gram dương và Gram âm, dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Vi
khuẩn Gram dương có thành tế bào dầy, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất

37


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể iod. Trong khi đó, lớp thành tế bào
peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp
màng lipopolysaccharide bên ngoài [8].
Nhuộm Gram dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với
thuốc nhuộm tím kết tinh và lugol. Dựa vào phản ứng này vi khuẩn Gram dương
bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng [8].
Ngoài ra nhuộm Gram còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dáng,
cấu tạo, cách phân bố của các vi khuẩn khác nhau [8].
Cách thực hiện
o Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường CT cải biên lỏng trong 10
ngày
o Hút 0.1ml môi trường và cố định tế bào trên lam kính sạch
o Nhuộm tế bào vi khuẩn bằng crystal violet trong 20 giây, dùng nước
cất vô trùng rửa vết nhuộm
o Nhuộm lại bằng dung dịch iodine trong 1 phút. Đổ thuốc nhuộm
iodine, và tẩy màu với alcohol 95% trong 10-20 giây. Ngừng rửa khi vết
nhuộm đã bị mất màu, rửa bằng nước sạch trong 5 giây.
o Nhuộm dung dịch safranin trong 2-3 phút, dùng nước cất vô trùng
rửa trong vài giây, thấm nước với giấy thấm và để khô tự nhiên
o Xem mẫu vật dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X
Kết quả
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử
Mục đích
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Schaeffer-Fulton [8].
Nội bào tử được tạo ra bởi nhiều loài vi khuẩn, trong đó đáng chú ý là hai
giống Clostridium và Bacillus. Những cấu trúc bảo vệ này được hình thành để đáp
ứng với điều kiện khắc nghiệt của môi trường như: nhiệt độ, khan nước, chất hóa
học, sự thay đổi pH và thiếu chất dinh dưỡng. Khi tồn tại ở hình thức bào tử, vi
khuẩn không biến dưỡng cũng như sinh sản, chúng tồn tại ở dạng không hoạt

38


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

động. Khi điều kiện môi trường trở nên thích hợp, nội bào tử sẽ “nảy mầm” và trở
lại hình thức hoạt động của vi khuẩn.
Những kĩ thuật nhuộm thông thường như nhuộm Gram, không nhuộm được
những cấu trúc cứng và bền. Để nhuộm bào tử, malachite green được dùng để
nhuộm bào tử ở nhiệt độ cao. Phương pháp Schaeffer-Fulton dùng malachite green
nhuộm bào tử và safranin nhuộm phần sinh dưỡng của tế bào [8].
Cách thực hiện
o Vi khuẩn kị khí sinh cellulase được nuôi trong môi trường CT cải
biên lỏng trong 30 ngày
o Dùng pipepman đưa 100µl dịch nuôi cấy lên lam kính
o Phủ lên trên một mảnh giấy thấm nhỏ và thấm ướt với malachite
green. Xông hơi trên nước sôi trong khoảng 5-10 phút cho đến khi vết
nhuộm malachite khô.
o Sau khi miếng lam đã được làm nguội loại bỏ giấy thấm và rửa sạch
với nước trong 30 giây
o Nhuộm với safranin khoảng 20 giây, rửa sạch nhanh với nước cất để
loại bỏ safranin
o Làm khô vết trải với giấy thấm và kiểm tra khả năng tạo bào tử dưới
kinh hiển vi
Kết quả
Nội bào tử sẽ có màu xanh và tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng
2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS
Mục đích

Điều kiện phát triển ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính thủy giải cellulose của
vi khuẩn. Để vi sinh vật tổng hợp cellulase thì trong môi trường nuôi cấy phải có
cellulose vừa là nguồn carbon vừa là chất cảm ứng. C. thermocellum điều hòa sản
xuất cellulase phụ thuộc vào nguồn carbon và nguồn năng lượng có sẵn. Mức độ
sản xuất enzyme c a o khi nguồn carbon và năng lượng có sẵn bị giới hạn và
có sự hiện diện cellulose tinh thể. Các nguồn carbon thường dùng trong nuôi cấy
tổng hợp cellulase là giấy lọc, giấy báo… và các phế thải công nông nghiệp là
39


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

rơm rạ, bã mía…
Nhiều loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase có phạm vi rộng trong
việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau: cellulose tinh thể, hemicellulose,
pectin, tinh bột, lignin. Trong môi trường nuôi cấy có những nguồn cơ chất giới
hạn chúng sẽ biểu hiện những enzym mà có khả năng sử dụng các nguồn carbon
duy nhất này. Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
trên môi trường chỉ có rơm rạ và giấy lọc là nguồn carbon duy nhất.
Sơ đồ thí nghiệm:
Dịch nuôi cấy sau 20 ngày

Xử lý Cellulosome lysis buffer
Lọc qua giấy lọc

Lọc qua giấy lọc

Ly tâm

Ly tâm

Bã rơm rạ và giấy lọc

Tủa protein

Dịch lọc

Cân, xác định trọng lượng

Dịch tủa protein (A)

Dịch tủa protein (B)

Cách tiến hành
Các chủng được nuôi cấy trong môi trường PCS và quan sát khả năng sử
dụng giấy lọc và rơm rạ trong quá trình nuôi cấy.
Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc. Phần dịch được ly tâm
5000 vòng/ phút trong 2 phút, loại bỏ tủa thu dịch lỏng. Dịch lỏng được tủa với
cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tủa và
hòa tan trong 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein A).
Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy được xử lý dung dịch cellulosome lysis buffer
trong 30 phút, lắc nhẹ trên máy lắc và lọc qua giấy lọc. Phần dịch được ly tâm

40


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

5000 vòng/ phút trong 2 phút loại bỏ tủa, thu dịch lỏng. Phần dịch được tủa với
cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tủa và
hòa tan trong 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein B).
Phần cặn sấy khô ở 60oC, cân trọng lượng giấy lọc và rơm rạ. Xác định
phần trăm trọng lượng giấy lọc và rơm rạ bị giảm đi so với đối chứng không.
Dung dịch protein A và B được sử dụng để:
o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số
o Định lượng cellulase ngoại bào
o Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC
o Xác định vạch phân giải CMC trên SDS-PAGE
o Xác định hoạt tính cellulase tối ưu
2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc
Mục đích
Xác định % giấy lọc được tiêu thụ sau 20 ngày nuôi cấy
Cách thực hiện
Phần giấy lọc được sấy khô 60oC, cân trọng lượng giấy lọc còn lại và xác
định phần trăm trọng lượng giấy lọc bị giảm đi so với đối chứng không.
Kết quả
Xác định % giấy lọc được tiêu thụ
2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ
Mục đích
Xác định % rơm rạ được tiêu thụ sau 20 ngày nuôi cấy
Cách thực hiện
Phần rơm rạ được sấy khô 60oC, cân trọng lượng rơm rạ còn lại và xác định
phần trăm trọng lượng giấy lọc bị giảm đi so với đối chứng không.
Kết quả
Xác định % rơm rạ được tiêu thụ

41


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào
Mục đích
Nguyên tắc dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm coomassie blue G250 khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang
tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực
đại 465nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng
595nm. Độ hấp ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ
protein. Phương pháp này thực hiện đơn giản, nhanh chóng và chính xác hơn
phương pháp Lowry [3].
Xác định hàm lượng protein ngoại bào được sinh ra sau khi nuôi cấy trên
môi trường PCS medium. So sánh lượng protein A và B thu được.
Cách thực hiện
o Chuẩn bị mẫu protein: dung dịch protein A và B thu nhận như trên
được sử dụng cho định lượng protein ngoại bào. Các mẫu enzym này được
pha loãng 50 lần cho định lượng.
o Dựng đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn protein với nồng độ từ
10-90µg/ml. Dùng micropipet hút 1ml dung dịch albumin chuẩn với các
nồng độ trên cho vào các ống nghiệm. Thêm vào mỗi ống nghiệm chứa
albumin 2ml dung dịch thuốc thử coomassie, trộn đều và đo độ hấp thu trên
máy đo OD Cole Parmer 1100 RS Spectrophotometer ở bước sóng 595nm.
Ống blank được tiến hành song song, thay 1ml dung dịch albumin bằng
1ml nước cất.
o Tiến hành phản ứng: Hút 1ml mẫu đã được pha loãng 50 lần cho

vào ống nghiệm. Thêm 2ml thuốc thử coomassie blue, lắc đều. Đo độ hấp
thu trên máy quang phổ ở bước sóng 595nm.
Kết quả
Hàm lượng protein (µg/ml) được xác định trong 1ml dịch nuôi cấy.
Hàm lượng protein =A*n*V (µg/ml dịch nuôi cấy)
Trong đó: + A: Lượng protein trong mẫu xác định từ đường chuẩn (µg/ml)
+ V: thể tích pha loãng mẫu (ml)
+ n: 5
42


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số
Mục đích
Hệ thống cellulase tổng số bao gồm hoạt tính ba loại enzym:
endoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase. Hoạt tính cellulase tổng số luôn
được đo bằng cơ chất không hòa tan bao gồm các loại cơ chất cellulose tinh khiết:
giấy lọc Whatman No.1, cellulose tinh thể, cellulose vi khuẩn, cellulose tảo cũng
như cơ chất chứa cellulose: α- cellulose, lignocellulose được tiền xử lý [44].
Thử nghiệm giấy lọc (FPA) là thử nghiệm hoạt tính cellulase tổng số được
sử dụng bởi IUPAC. Thử nghiệm này dựa trên mức độ chuyển đổi cơ chất giấy lọc
thành đường khử (được xác định dựa trên đường khử tạo ra được đo bởi thuốc thử
DNS) phóng thích từ 50mg giấy lọc trong một thời gian cố định 60 phút [44].
Hoạt tính cellulase tổng số được tính theo đơn vị FPU/ml của dung dịch
enzym ban đầu. Ưu điểm của phương pháp này là nguồn cơ chất sử dụng phong
phú. Tuy nhiên thử nghiệm giấy lọc phức tạp và có sai số lớn [44].
Cách thực hiện

o Đặt cuộn giấy lọc cuộn tròn vào mỗi ống nghiệm
o Thêm 1ml dung dịch đệm citrate 50mM (pH 4.8) vào ống nghiệm,
cuộn giấy lọc phải được ngập hết trong dung dịch đệm
o Chuẩn bị dịch enzym: dịch nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường PCS
sau 20 ngày, dung dịch protein A và B được sử dụng để xác định hoạt tính
enzym. Cả hai dung dịch này được pha loãng 10 lần cho xác định hoạt tính
enzym cellulase.
o Dung dịch glucose chuẩn (GSs) với nồng độ từ 100-900 µg/ml
o Chuẩn bị ống Blank và ống control
Reagent blank (RB): 1.5ml đệm citrate 50mM
Enzym controls (EC): 1ml đệm citrate 50mM + 0.5ml enzym
Substrate controls (SC): 1.5ml đệm citrate 50mM + mảnh giấy lọc
o Dung dịch enzym E, RB, EC, SC được cân bằng ở nhiệt độ 50oC
o Thêm 0.5ml dung dịch enzym vào ống nghiệm có cơ chất giấy lọc E,
và 0.5ml dung dịch enzym vào ống nghiệm không có cơ chất giấy lọc EC

43


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Ủ các ống E, GSs, RB, EC, và SC trong bể điều nhiệt ở 50oC trong
60 phút để thực hiện phản ứng
o Thêm 3ml DNS reagent để ngừng phản ứng và trộn đều
o Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút
o Chuyển các ống nghiệm vào nước lạnh để làm nguội
o Hút 0.5ml dung dịch thí nghiệm vào effendorf 1.5ml và ly tâm 10000
vòng/ phút trong 3 phút

o Sau khi ly tâm, hút 0.2ml dung dịch nổi phía trên vào trong một ống
nghiệm khác và thêm 2.5ml nước cất và trộn đều
o Đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 540nm và RB được sử dụng làm
ống blank
Kết quả
Dựng đường chuẩn glucose (trục x: hàm lượng glucose, trục y: OD540)
Tính OD540nm của ∆E = E - [(EC) + (SC)]
Tính nồng độ glucose được giải phóng dựa theo đường chuẩn glucose
Tính FPA của dung dịch enzym gốc ban đầu theo đơn vị FPU/ml
FPU = lượng glucose phóng thích ra x 0.185
1mg glucose = 1mg/(0.18mg/µmol)x0.5mlx60min = 0.185 µmol/min/ml
2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase
Mục đích
Hoạt tính endoglucanase có thể bán định lượng trên đĩa thạch chứa CMC.
Các phân tử polysaccharide dài có thể hấp thụ một số loại thuốc nhuộm trong đó
có congo red. Trên đĩa thạch chứa CMC, đĩa thạch được congo red nhuộm màu
đỏ. Khi CMC bị thủy phân bởi hoạt tính endoglucanase, thuốc nhuộm congo
red được giải phóng và tạo vòng phân giải trên đĩa thạch. Hoạt tính
endoglucanase càng mạnh khi vòng phân giải càng lớn [44].
Bán định lượng hoạt tính endoglucanase phân giải CMC trên đĩa thạch, so
sánh hoạt tính endoglucanase của dung dịch protein A và protein B
Cách thực hiện
o Tạo lỗ nhỏ khoảng 4mm trên đĩa thạch CMC
44


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Hút lượng dung dịch protein A và protein B sao cho lượng protein
trong mỗi giếng 30 µg
o Ủ ở nhiệt độ 50oC trong 24 giờ
o Nhuộm đĩa thạch với 20ml thuốc nhuộm congo red 1% trong 30
phút, rửa đĩa thạch bằng nước cất
o Rửa giải thuốc nhuộm congo red trên thạch bằng dung dịch giải
nhuộm NaCl 1M trong 30 phút
Kết quả
Ghi nhận và so sánh vòng phân giải dung dịch protein A và B trên đĩa thạch
2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel
polyacrylamide
Vi khuẩn kị khí sinh cellulase sản xuất enzym phụ thuộc vào nguồn carbon
và nguồn năng lượng có sẵn. Mức độ sản xuất enzyme c a o khi nguồn carbon
và năng lượng có sẵn bị giới hạn và có sự hiện diện cellulose tinh thể. Sự biểu
hiện gen trong điều kiện giới hạn carbon cao hơn dưới điều kiện dưới hạn
nitrogen, cho thấy tác động lớn của nguồn carbon trên sự biểu hiện gen. Trong
môi trường PCS có nguồn carbon duy nhất là giấy lọc và rơm rạ sẽ cho các chủng
vi khuẩn biểu hiện nhiều enzym cho việc sử dụng nguồn carbon này. Vì vậy, thực
hiện điện di SDS- PAGE và thủy phân CMC trên gel với các mục đích:
o Xác định hàm lượng protein tối ưu thủy phân CMC trên gel
polyacrylamide
o Xác định sự khác biệt giữa dung dịch protein A và Protein B
o Xác định khả năng thủy phân CMC trên gel polyacrylamide của 6
chủng khảo sát
SDS-PAGE, là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh hóa để phân tách
protein tùy theo trọng lượng phân tử. SDS liên kết với phần kị nước của protein,
cùng với 2-mercaptoethanol phá vỡ cấu trúc và cho phép chúng tồn tại bền vững ở
dạng thẳng. Đồng thời, SDS còn gắn vào phân tử protein làm chúng tích điện âm.
Kết quả là protein tồn tại ở dạng thẳng của cấu trúc bậc 1 và tích điện âm. Chúng

45


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

sẽ di chuyển về phía cực dương khi đặt trong điện trường [2], [3].
Dưới tác dụng của điện trường, protein được đặt trong môi trường đặc biệt
cho phép chúng di chuyển theo tỷ lệ khác nhau tùy theo trọng lượng của chúng.
Môi trường thường sử dụng là gel polyacrylamide, là polymer được tạo nên bởi
các đơn phân acrylamide. Trong gel polyacrylamide, chúng hình thành nên một hệ
thống các kênh có các kích thước khác nhau mà cho phép các phân tử protein có
kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và những phân tử protein có kích
thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn. Kết quả là hình thành nên các vạch protein có
kích thước khác nhau trên bản gel và được phát hiện theo nhiều phương pháp khác
nhau [2], [3].
Để đưa các phân tử trong mẫu về cùng vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt, người ta thường dùng phương pháp điện di không liên tục. Theo
phương pháp này gel thường có 2 lớp [2], [3]:
o Lớp gel gom (stacking gel): các protein trong mẫu được dồn lại và
tạo thành một băng mỏng
o Lớp gel phân tách (separating gel): tạo ra các băng protein có trọng
lượng phân tử, kích thước khác nhau từ hỗn hợp protein xuất phát ban đầu
Phân tử lượng của protein được xác định khi so sánh với một thang phân tử
lượng protein chuẩn, là một hỗn hợp các protein có phân tử lượng đã biết. Lượng
protein trong mẫu điện di tối ưu nằm trong khoảng 20-40µg [2], [3].
Điện di SDS-PAGE có thể phân tách các thành phần protein và phát hiện
hoạt tính endoglucanase trên gel polyacrylamide. Khi SDS-PAGE được sử dụng,
hoạt tính endoglucanase được phát hiện sau khi đã loại bỏ SDS và làm hồi

tính protein bằng dung dịch đệm hồi tính protein. Khả năng phân giải
CMC trên gel polyacrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hoạt tính enzym,
nồng độ enzym và thời gian thủy phân CMC.

46


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC
o Thực hiện điện di SDS-PAGE với mẫu protein B của chủng TQ1-2
được pha loãng 1, 2, 4, 8 lần bằng đệm PBS buffer
o Hồi tính protein bằng các buffer hồi tính và thủy giải CMC trên gel
o Xác định vạch phân giải CMC trên gel
o Kết luận hàm lượng protein tối ưu cho khả năng phân giải CMC trên
gel polyacrylamide (xem thêm phụ lục 3)
2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B
o Thực hiện điện di SDS-PAGE sử dụng dung dịch Protein A và
protein B của các chủng khảo sát. Các dung dịch enzym được pha loãng
theo hàm lượng đã được xác định ở phần 2.2.3.6.1 bằng đệm PBS buffer.
o Nhuộm gel polyacrylamide bằng thuốc nhuộm coomassie blue
o Xác định kích thước các vạch protein trên gel polyacrylamide (xem
thêm phụ lục 3)
2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng
o Thực hiện điện di SDS-PAGE sử dụng mẫu protein A và mẫu
protein B của các chủng khảo sát. Các dung dịch protein mẫu được tính
toán sao cho lượng protein đã được xác định ở phần 2.2.3.6.1 lần bằng đệm
PBS buffer.

o Sau khi điện di, hồi tính protein bằng các buffer hồi tính và thủy giải
CMC trên gel
o Xác định vạch phân giải trên gel
o Đối chiếu với thang chuẩn đã được xây dựng từ đó xác định vạch
phân giải CMC trên gel (xem thêm phụ lục 3)

47


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase
o Nuôi cấy các chủng vi khuẩn khảo sát trên môi trường PCS
o Tại các thời điểm 4, 8, 12, 16, 20 ngày thu nhận 5ml dịch nuôi cấy
o Xử lý với Cellulosome lysis buffer và tủa protein
o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số các chủng khảo sát bằng
phương pháp DNS tại các thời điểm nuôi cấy 4, 8, 12, 16, 20 ngày (cách
thực hiện theo mục 2.2.3.4)
o Phản ứng enzym được thực hiện tại nhiệt độ 50oC
o Sử dụng dung dịch đệm citrate 50mM, pH 5
o Xác định thời gian nuôi cấy tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase.

2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính enzym cellulase
Các emzym cellulase thu được từ những nguồn khác nhau sẽ có những điều
kiện phản ứng tối ưu khác nhau. Nhiệt độ, pH là hai yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến
hoạt tính của cellulase. Do đó, các điều kiện tối ưu cho hoạt tính cellulase cần
được xác định. Trong các thí nghiệm này dung dịch protein B được sử dụng.
2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase

o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số các chủng khảo sát bằng
phương pháp DNS tại các nhiệt độ phản ứng khác nhau 30oC, 40oC, 50oC,
60oC, 70oC, 80oC (cách thực hiện theo mục 2.2.3.4)
o Sử dụng dung dịch đệm citrate 50mM, pH 5
o Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase.
2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase
o Định lượng hoạt tính cellulase tổng số các chủng khảo sát bằng
phương pháp DNS tại các dung dịch đệm có pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
(cách thực hiện theo mục 2.2.3.4)

48


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

o Sử dụng dung dịch đệm Citrate buffer pH 3, 4, 5, 6 và dung dịch
đệm Tris-HCl pH 7, 8, 9
o Phản ứng enzym được thực hiện tại nhiệt độ 50oC
o Xác định pH tối ưu cho hoạt tính enzym cellulase.
2.2.4. Định danh vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn có nhiều nhu cầu dinh dưỡng và sự tăng trưởng tương
tự nhau vì thế rất khó cho việc định danh theo các phương pháp truyền thống dựa
vào các đặc điểm sinh lý hình thái, sinh hóa. Hiện nay việc ứng dụng sinh học
phân tử nhằm phân biệt các loài vi sinh vật nói chung và các loài vi khuẩn nói
riêng ngày càng nên phổ biến. Do tính bảo tồn cao của vùng gen DNA ribosome
mã hóa cho các tiểu phần 16S nên đoạn gen trong vùng này thường được dùng làm
công cụ cho việc định danh. Hai cặp mồi universal và cặp mồi S-G-Clos-0586-S21 và S-G-Clos-1205-A-21 được sử dụng cho việc định danh trong khóa luận này.
Sơ đồ thí nghiệm:

Chủng vi khuẩn

Phản ứng PCR S-G-Clos-0586-

Phản ứng PCR 27f và 1492r

S-21 và S-G-Clos-1205-A-21
Kiểm tra kết quả PCR trên gel agerose

Kiểm tra kết quả PCR trên gel agerose

Tinh sạch sản phẩm PCR

Kết luận vi khuẩn thuộc giống Clostridium

Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

Phản ứng PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử để khuếch đại một trình tự
DNA tạo ra hàng ngàn trình tự DNA mục tiêu. Trong phản ứng PCR, DNA
polymerase có khả năng tổng hợp mạch mới từ khuôn mẫu DNA trong điều kiện
invitro. Khi enzym này hoạt động chúng sẽ tổng hợp mạch mới theo khuôn mẫu
bắt đầu từ một đoạn oligonucleotide mồi theo chiều 3’-5’. Mồi là một đoạn
49


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

oligonucleotide có khả năng bắt cặp với mạch khuôn. Khi cung cấp hai cặp mồi

(mồi xuôi và mồi ngược) có khả năng bắt cặp chuyên biệt với hai đầu của trình tự
DNA, phản ứng PCR có thể nhân bản trình tự giữa hai mồi đó.
Phản ứng PCR gồm 3 bước: biến tính, bắt cặp và kéo dài, ba bước nêu trên
hình thành một chu kì PCR. Để tạo thành một lượng lớn DNA cần lặp lại nhiều
chu kì và kết quả tạo được một lượng lớn trình tự bản sao của khuôn mẫu.
DNAzol® Direct là hóa chất được sử dụng rộng rãi cho phản ứng PCR mà
không cần phân tách DNA. Quá trình này được thực hiện đơn giản, ít tốn thời gian,
công sức và có thể khuếch đai đoạn DNA lên đến 8 Kb.
Sản phẩm PCR được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Vị trí
của DNA trên bản gel sẽ được phát hiện bằng thuốc nhuộm ethidium bromide, chất
này có khả năng gắn vào DNA phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Để biết kích
thước các trình tự DNA người ta sử dụng thang chuẩn, đó là tập hợp nhiều trình tự
DNA có kích thước đã biết.
Trước khi giải trình tự, sản phẩm PCR cần được tinh sạch. Bộ kit The
illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit được sử dụng cho mục
đích tinh sạch DNA nhanh chóng. Bộ kit có thể tinh sạch đoạn DNA có kích thước
từ 50bp đến 40Kb từ phản ứng PCR hoặc trên gel agarose.
2.2.4.1. Định danh nhanh vi khuẩn bằng phản ứng PCR với cặp mồi
đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium
Mục đích
Đối với các vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase, phần lớn chúng thuộc
bộ Clostridiales có quan hệ gần với giống Clostridium . Cặp mồi S-G-Clos-0586S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 có khả năng khuếch đại từ base 586 - 1205 trên
rDNA 16S tạo sản phẩm dài 619 base đặc hiệu cho giống Clostridium. Cặp mồi
này được Menaja và các cộng sự (1996) sử dụng để xác định các loài thuộc giống
Clostridium. Dùng phản ứng PCR với cặp mồi khuếch đại gen 16S rDNA của
giống Clostridium để xác định 6 chủng vi khuẩn được khảo sát. Cặp mồi này cho
phép khuếch đại đoạn DNA có kích thước 619 bp. Chủng vi khuẩn C.Sbu được

50

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

dùng làm chủng đối chứng dương và chủng vi khuẩn E.coli làm chủng đối chứng
âm cho phản ứng PCR [32].
Cách thực hiện
o Thực hiện PCR với cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205A-21
o Quy trình thực hiện PCR cho cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-GClos-1205-A-21 được thiết lập như sau: 95°C trong 3 phút để phân tách
hoàn toàn DNA; 30 chu trình kế tiếp 95°C trong 30 giây, 54°C trong 30
giây, và 72°C trong 60 giây và chu trình cuối cùng 72°C trong 10 phút
o Điện di sản phẩm PCR trên gel Agarose 1% với hiệu điện thế 115
volt trong 45 phút
o Quan sát kết quả dưới tia UV, đối chiều với thang chuẩn để xác định
kích thước của sản phẩm PCR (xem thêm phụ lục 3)
Kết quả
Kết quả dương tính đối với những chủng thuộc giống Clostridium và âm
tính với những chủng không thuộc giống Clostridium
2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân
loại
Mục đích
Cặp mồi universal cho phép khuếch đại hầu như toàn bộ đoạn gen 16S
rRNA từ những nhiều loài vi khuẩn, đã được dùng trong nghiên cứu hầu hết các
loài vi khuẩn trong môi trường. Cặp mồi này tạo ra một đoạn sản phẩm PCR dài
khoảng 1526 bp. Chủng vi khuẩn E.Coli được dùng làm chủng đối chứng dương
[20], [32].
Phương pháp giải trình tự đoạn gen được khuếch đại bởi 2 cặp mồi
universal và xây dựng cây phát sinh chủng loài hiện nay trở nên khá phổ biến
trong định danh vi khuẩn. Cây phân loại loài được xây dựng dựa trên sự kết hợp

giữa sinh học phân tử với các phần mềm phân tích trên máy tính. Dựa vào các
phân tích, mối liên hệ tiến hóa giữa các chủng khảo sát và các chủng trong ngân
hàng dữ liệu được xác định.
51


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Cách thực hiện
o Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal với quy trình thực
hiện PCR được thiết lập như sau: 95°C trong 3 phút để phân tách hoàn toàn
DNA; 30 chu trình kế tiếp 95°C trong 30 giây, 55°C trong 60 giây và 72°C
trong 2 phút và chu trình cuối cùng 72°C trong 10 phút.
o Điện di sản phẩm PCR trên agarose 1% với hiệu điện thế 115 volt
trong 45 phút
o Quan sát kết quả dưới tia UV, đối chiếu với thang chuẩn để xác định
kích thước của sản phẩm PCR
o So sánh với kết quả với đối chứng dương và ghi nhận kết quả
o Sản phẩm phản ứng PCR với cặp mồi universal được tinh sạch với
bộ Kit The illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit và
được gửi đi giải trình tự tại công ty Nam Khoa BIOTEK.
o Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh với những trình tự trong ngân
hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST trong trang chủ
NCBI. Ghi nhận những loài có số trình tự tương đồng cao nhất.
o Sử dụng phần mềm ClustalX để xắp xếp hàng và Treeview để xây
dựng cây phát sinh chủng loài của cặp mồi universal (xem thêm phụ lục 3)
Kết quả
Dựa vào kết quả BLAST và cây phân loại, xác định mối quan hệ tiến hóa

giữa các loài trong cây phân loại
950C

720C

550C

Hình 2.1. Quy trình phản ứng PCR với cặp mồi universal

52