Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase (3)

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase
Mục đích của việc phân lập nhằm thu nhận những chủng vi khuẩn kị khí ưa
nhiệt sinh cellulase, do vậy nguồn phân lập được thu nhận là nơi có nhiều sinh
khối cellulose đang phân hủy: đất mùn, đất ruộng, đất thịt, phân trùng quế (xem
phụ lục 1). Mẫu phân lập được nuôi cấy trong môi trường CT agar trong ống roll
tube sẽ phát triển và tạo vòng phân giải cellulose sau 10 ngày nuôi cấy.

Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 trong ống roll tube
Sau quá trình phân lập, một tập hợp 11 chủng thuần đã được thu nhận. Các
nguồn phân lập có khả năng tạo vòng phân giải tốt như: DM5, DM7, DM8, DR3,
DR5, DT2, TQ2. Các vòng phân giải của các chủng có kích thước khác nhau.
Nhiều vòng phân giải có kích thước lớn như chủng DM7-1 (~10mm) nhưng cũng
có chủng có vòng phân giải tương đối nhỏ như chủng DR5-1. Các khuẩn lạc tạo
vòng phân giải sẽ được tiến hành làm thuần cấy ria trên môi trường CT agar cải
biên trong ống thạch nghiêng. Các chủng này sẽ được tiếp tục nuôi cấy trong môi
trường CT lỏng. Chọn 6 chủng DM5-1, DM7-1, DM8-1, DR5-1, DT2-1, TQ1-2
thuộc 6 mẫu khác nhau tiếp tục khảo sát cho những thí nghiệm tiếp theo.

53


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase

3.2.1. Các đặc điểm về khuẩn lạc
Các chủng vi khuẩn tạo vòng phân giải cellulose được cấy ria và làm thuần
trên môi trường CT agar cải biên. Trong quá trình nuôi cấy tiến hành quan sát các
đặc điểm hình thái sự hình thành, kích thước và màu sắc khuẩn lạc. Kết quả khảo
sát các đặc điểm khuẩn lạc các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1, DM8-1, DT2-1 và
TQ1-2 được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.2:
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Chủng vi

DM5-1

khuẩn

Màu

Màu sắc

trắng

Đường kính
Hình dạng

<1mm
Tròn

Vòng phân
giải cellulose

5mm

DM7-1

DR5-1

Màu trắng nhạt

Màu trắng sữa

<1mm
Phẳng, rất khó
thấy
8mm

DM8-1

DT2-1

TQ1-2

Màu

Màu

Màu trắng

trắng

trắng

nhạt

1-2mm

<1mm

1-2mm

<1mm

Tròn, hơi lồi

Tròn

Tròn

Tròn

2mm

4mm

6mm

5mm

Hình 3.2. Khuẩn lạc DR5-1 trên thạch nghiêng CT agar cải biên
Kết quả cho thấy khuẩn lạc của 6 chủng vi khuẩn có đặc điểm tương đối
giống nhau. Chúng đều là những vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng, hình thành
khuẩn lạc sau 7-10 ngày nuôi cấy, kích thước khuẩn lạc nhỏ, khó nhận biết. Hình
dạng khuẩn lạc tròn và tạo vòng phân giải cellulose tinh thể xung quanh khuẩn lạc.

Các khuẩn lạc trong môi trường có kích thước nhỏ và khó thấy.

54


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.2.2. Nhuộm Gram
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường CT cải biên 10 ngày,
thực hiện nhuộm Gram (với đối chứng âm là chủng E.Coli DH5α và chủng đối
chứng dương C. Sbu) và quan sát dưới kính hiển vi. Ghi nhận hình dạng, kích
thước, cấu tạo, cách phân bố của các tế bào vi khuẩn. Kết quả nhuộm Gram được
trình bày trong bảng 3.2. và trong hình 3.3.:
Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào
Chủng vi khuẩn

DM5-1

Nhuộm Gram

+

DM7-1

DR5-1

+

Kích thước (dài x 2-8 x 1

DM8-1

+

DT2-1

TQ1-2

+

+

+

2-8 x 1

2-8 x 1

2-8 x 1

1-4 x 1

dài, Que dài

Que dài

Que dài

Que

4-6 x 1

rộng, µm)
Hình dạng

Que

không đều

dài, Sợi mảnh,

không đều

kết chuỗi

Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2
Kết quả nhuộm Gram cho thấy tất cả các chủng khảo sát có màu tím hoặc
đỏ tím giống đối chứng dương và so với màu hồng nhạt của đối chứng âm. Do đó,
chúng đều có đặc tính nhuộm Gram dương tính. Đồng thời, nhuộm Gram còn cho
thấy đặc điểm hình thái tế bào của các chủng. Chúng đều có hình que dài, kích
thước tế bào không đều nhau với chiều dài từ 2-8µm và chiều rộng khoảng 1µm.
Chủng TQ1-2 có cấu trúc sợi mảnh kết thành chuỗi dài.
55


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.2.3. Nhuộm bào tử
Trong điều kiện không thuận lợi nhiều loài vi khuẩn có khả năng hình thành
nội bào tử để tồn tại. Khi các chất dinh dưỡng bị cạn kiệt hay nồng độ các chất
biến dưỡng trong môi trường nuôi cấy gia tăng theo thời gian nhiều chủng vi
khuẩn sẽ hình thành bào tử. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm kị khí, ưa nhiệt sinh
cellulase cũng có khả năng này.
Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường CT lỏng 30
ngày, thực hiện nhuộm bào tử các chủng thu được (với đối chứng âm là chủng
E.Coli DH5α và chủng đối chứng dương C. Sbu) và quan sát dưới kính hiển vi.
Năm chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1, DM8-1, và TQ1-2 có khả năng hình thành
bào tử, riêng chủng DT2-1 không xác định được khả năng hình thành bào tử. Kết
quả nhuộm bào tử các chủng DR5-1 đã được trình bày trong hình 3.4.:

Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1
Kết luận: Từ những khảo sát về đặc điểm hình thái cho chúng ta thấy chúng
có nhiều đặc điểm tương đồng với nhiều chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh
cellulase đã được báo cáo: Clostridium thermocellum (Paul H. S. Reynolds và
cộng sự, 1986), Anaerocellum thermophilum (Irina A. Kataeva và cộng sự, 2009).

56


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS
Khả năng tổng hợp enzyme không chỉ phụ thuộc loài vi khuẩn mà còn phụ
thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Đa số enzyme thủy phân

do vi khuẩn tổng hợp đều là enzyme cảm ứng. Khi môi trường nuôi cấy có cơ chất
khó đồng hóa, vi khuẩn muốn sinh trưởng và phát triển phải tiết ra môi trường
những enzyme tương ứng thủy phân cơ chất đó để sử dụng.
Để vi khuẩn tổng hợp cellulase người ta thường bổ sung cellulose tự nhiên
hay dẫn xuất vào môi trường nuôi cấy những chất cảm ứng tổng hợp cellulose.
Môi trường PCS với hai nguồn carbon là giấy lọc và rơm rạ được sử dụng làm chất
cảm ứng cho tổng hợp cellulase.
3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc
Để đánh giá khả năng sử dụng giấy lọc và rơm rạ các chủng được nuôi trên
50 ml môi trường PCS có chứa miếng giấy lọc 50mg và 500mg rơm rạ là nguồn cơ
chất duy nhất. Sau thời gian nuôi cấy 20 ngày, xác định % trọng lượng giấy lọc
tiêu thụ bằng cách cân trọng lượng còn lại và so sánh với mẫu đối chứng không.
Kết quả được trình bày trong biểu đồ 3.1.:
Khả Năng Tiêu Hủy Giấy Lọc
120

% Giấy Lọc Tiêu Thụ

100
80
60
40
20
0
C.Sbu

DM5-1

DM7-1

DR5-1

DM8-1

DT2-1

TQ1-2

Chủng Vi Khuẩn

Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc
Kết quả cho thấy các chủng có khả năng sử dụng giấy lọc là khác nhau. Hai
chủng DR5-1 và TQ1-2 có khả năng tiêu thụ 100% giấy lọc nhanh nhất. Chủng
TQ1-2 tiêu thụ 100% giấy lọc trong môi trường PCS sau chỉ 10 ngày nuôi cấy, còn

57


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

chủng DR5-1 tiêu thụ giấy lọc sau 13 ngày nuôi cấy. Các chủng còn lại có khả
năng tiêu thụ từ 20-85% giấy lọc. Chủng DT2-1 có khả năng sử dụng giấy lọc thấp
nhất. Chủng đối chứng âm C. Sbu không cho thấy khả năng tiêu thụ giấy lọc.
3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ
Tương tự như khả năng sử dụng giấy lọc, kết quả cho thấy các chủng có khả
năng sử dụng rơm rạ cũng khác nhau sau thời gian nuôi cấy 20 ngày. Kết quả được
trình bày trong biểu đồ 3.2.:
Khả Năng Tiêu Hủy Rơm Rạ

30

% Rơm Rạ Tiêu Thụ

25
20
15
10
5
0
C.Sbu

DM5-1

DM7-1

DR5-1

DM8-1

DT2-1

TQ1-2

Chủng Vi Khuẩn

Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ
Các chủng khảo sát có khả năng tiêu thụ từ 8-28% rơm rạ trong môi trường
nuôi cấy. Hai chủng DR5-1 và TQ1-2 có khả năng tiêu thụ rơm rạ cao nhất 28.5%
và 22.7 % tương tứng. Các chủng còn lại có khả năng tiêu thụ từ 7.8-12.9% rơm

rạ. Chủng đối chứng âm C. Sbu không cho thấy khả năng tiêu thụ rơm rạ.
Kết luận: Hai chủng DR5-1 và TQ1-2 có khả năng sử dụng giấy lọc và rơm
rạ cao nhất, đồng thời cho thấy khả năng sử dụng ưu tiên giấy lọc hơn là rơm rạ.
Giấy lọc có thành phần cấu tạo đơn giản hơn so với rơm rạ với thành phần chủ yếu
là cellulose nên hoạt tính enzyme phân hủy chúng không bị cản trở bởi những
thành phần lignin, hemicellulose, spectin… như trong rơm rạ. Các chủng vi khuẩn
để thích nghi với môi trường có giấy lọc và rơm rạ là nguồn carbon duy nhất đã
tiết ra một số enzyme cellulase để sử dụng giấy lọc làm nguồn cơ chất cho sự phát
triển và biến dưỡng.

58


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào
Các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệ,t sinh cellulase có cấu trúc cellulosome
trên màng ngoài của tế bào. Cấu trúc này có thể bị phá hủy và giải phóng ra các
thành phần cellulase ra ngoài môi trường bằng dung dịch cellulosome lysis buffer.
Các thành phần enzyme này được định lượng bằng phương pháp Bradford để so
sánh lượng protein được xử lý và không được xử lý cellulosome lysis buffer. Các
dung dịch protein A và protein B được pha loãng 50 lần cho định lượng protein
ngoại bào. Kết quả định lượng được trình bày trong biểu đồ 3.3.:
Nồng Độ Protein

Nồng Độ Protein µg/ml

250

200

150
Protein B
Protein A

100

50

0
C.Sbu

DM5-1

DM7-1

DR5-1

DM8-1

DT2-1

TQ1-2

Chủng Vi Khuẩn

Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng
Kết quả định lượng cho thấy, các dung dịch protein B thường có nồng độ

protein cao hơn đôi chút dung dịch protein A trong cùng một chủng. Chứng tỏ,
cellulosome lysis buffer có khả năng gia tăng thu nhận protein trong dịch nuôi cấy.
Đặc biệt là chủng TQ1-2, nồng độ dung dịch protein B cao hơn nhiều so với
protein A cho thấy có thể sau thời gian nuôi cấy 20 ngày, một lượng nhất định
protein trên màng tế bào hay trong các sợi rơm rạ vẫn còn dính trên màng tế bào
đòi hỏi phải được xử lý cellulosome lysis buffer để phân tách ra khỏi màng. Hai
chủng DM8-1 và DT2-1 có hàm lượng protein không khác nhau giữa hai dung
dịch protein B và protein A.
Nồng độ protein ngoại bào của các chủng là khá cao 132.4–199.0 µg/ml
dịch nuôi cấy. Trong đó, chủng TQ1-2 có nồng độ protein cao nhất khi được xử lý

59


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

với cellulosome lysis buffer là 199.0 µg/ml dịch nuôi cấy. Nồng độ protein trong
1ml dịch nuôi cấy là cao hơn 2-3 lần so với chủng Clostridium thermocellum (Eric
A. Johnson, 1985), khoảng 65 µg/ml khi được nuôi cấy trên môi trường chỉ có
cellulose tinh thể là nguồn cơ chất duy nhất. Tuy nhiên, so sánh với các chủng
nấm mốc sản xuất cellulase Aspergillus awamori, Trichoderma harzianum có khả
năng sản xuất cellulase cao tương ứng 25.3 mg/g, 23.93mg/g canh trường nuôi cấy
(Võ Thị Xuyến, 2006). Điều này phù hợp với lý thuyết cho rằng các chủng vi
khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase có khả năng tạo hệ thống cellulase ngoại bào
được tổ chức tốt thành các hệ thống cellulosome. Các cellulase này có thể sử dụng
lại nhiều lần nhằm tiết kiệm năng lượng cũng như các đường tạo ra được vi khuẩn
hấp thu hiệu quả cho quá trình biến dưỡng của chúng.
Các vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase có đặc điểm hình thành cấu trúc

cellulosome. Cấu trúc này được hình thành dựa trên sự kết hợp giữa protein khung
scaffodin không có hoạt tính xúc tác với các tiểu phần có hoạt tính cellulase và liên
kết với màng tế bào vi khuẩn. Cấu trúc này tồn tại trên màng tế bào phụ thuộc vào
thời gian nuôi cấy của vi khuẩn. Trong giai đoạn pha lag và pha tăng trưởng các
tiểu phần hoạt tính xúc tác tồn tại chủ yếu trên scaffodin. Khi vào pha ổn định các
tiểu phần lại được phóng thích ra ngoài môi trường. Trong pha suy tàn các tiểu
phần có hoạt tính xúc tác được phóng thích ra ngoài môi trường và tồn tại chủ yếu
trong môi trường cũng như gắn kết vào cơ chất. Sử dụng cellulosome lysis buffer
sau khi nuôi cấy 20 ngày nhằm phân tách các tiểu đơn vị có hoạt tính cellulase xúc
tác còn lại trên màng tế bào. Do đó, nồng độ dung dịch protein B chỉ cao hơn đôi
chút so với dung dịch protein A có thể do các chủng vi khuẩn khảo sát đang vào
pha suy tàn. Các protein chỉ tồn tại chủ yếu trong dịch nuôi cấy tế bào.
3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số
Khả năng tạo vòng phân giải trên thạch chứa cellulose tinh thể là một trong
những đặc tính cơ bản nhất của vi khuẩn sinh cellulase. Đặc điểm này cho phép
định tính hoạt tính cellulase và phân lập chúng từ môi trường. Tuy nhiên, phương
pháp này lại không cho định lượng chính xác hoạt tính của enzym cellulase sinh

60


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

ra. Do đó, hoạt tính của cellulase được đo lường dựa trên phương pháp đo lượng
đường khử tổng số sinh ra bằng thuốc thử DNS.
Các chủng được tiến hành định lượng hoạt tính cellulase trên hai dung dịch
protein B và protein A dựa trên phương pháp định lượng hàm lượng đường khử
bằng thuốc thử DNS. Các dung dịch protein A và protein B được pha loãng 10 lần

cho xác định hoạt tính cellulase tổng số. Kết quả xác định hoạt tính cellulase tổng
số được trình bày trong bảng 3.3. và biểu đồ 3.4.:
Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng
Chủng vi khuẩn

Protein B (UI/ml)

Protein A (UI/ml)

DM5-1

0.057

0.051

DM7-1

0.061

0.059

DR5-1

0.061

0.054

DM8-1

0.051

0.051

DT2-1

0.043

0.041

TQ1-2

0.069

0.046

Hoạt Tính Cellulase Tổng Số

0.09
0.08

Hoạt Tính UI/ml

0.07
0.06
0.05
Protein B

0.04

Protein A

0.03
0.02
0.01
0

-0.01

C. Sbu

DM5-1

DM7-1

DR5-1

DM8-1

DT2-1

TQ1-2

Chủng Vi Khuẩn

Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng
Hoạt tính cellulase của các dung dịch protein B đều lớn hơn hoặc bằng
protein A trong cùng một chủng. Điều này phù hợp với kết quả định lượng với
nồng độ protein ở trên. Trong cùng một chủng, nồng độ protein lớn khi được xử lý
với cellulosome lysis buffer sẽ có hoạt tính lớn hơn. Nồng độ protein tăng thêm
làm gia tăng hoạt tính enzyme cellulase. Chứng tỏ các protein tăng thêm có hoạt

61


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

tính cellulase. Do đó, chúng có khả năng tạo ra lượng đường khử đáng kể trong thí
nghiệm, đặc biệt là chủng TQ1-2.
Hoạt tính cellulase các chủng khảo sát từ 0.041–0.069 UI/ml dịch nuôi cấy.
Chủng có hoạt tính cellulase cao nhất là chủng TQ1-2 có hoạt tính 0.069 UI/ml
dịch nuôi cấy. So với hoạt tính cellulase của các chủng đã được báo cáo, cho thấy
đây là những chủng có khả năng sinh cellulase thấp: chủng Clostridium
thermocellum có hoạt tính 0.267 UI/ml sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường
avicel là nguồn cơ chất (B. H. Lee và cộng sự 1975), chủng vi khuẩn CM120-1
phân lập ở Thái Lan có hoạt tính 0.14 UI/ml dịch nuôi cấy (Sasithon Krairitthichai
và cộng sự, 2009), hoặc vi khuẩn M7 có hoạt tính cellulase 0.089 UI/ml dịch nuôi
cấy khi được nuôi cấy trên cellulose (Lee.B.H và cộng sự, 1975). Hoạt tính
cellulase chủng nấm mốc Aspergillus awamori và Trichoderma harzianum
tương ứng là 1.3 và 0.952 UI/gam canh trường (Võ Thị Xuyến, 2006) cho thấy
hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn kị khí, sinh cellulase là rất thấp nếu so
sánh với các chủng nấm mốc sinh cellulase. Hoạt tính cellulase các chủng khảo sát
thấp phù hợp với định lượng protein ở phần trên. Các chủng vi khuẩn này để tiết
kiệm năng lượng nên không tạo ra lượng lớn mà chỉ tạo ra lượng vủa đủ cho quá
trình sinh trưởng và phát triển do các cellulase có thể tái sử dụng nhiều lần.
3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC
Hoạt tính endoglucanase có thể bán định lượng trên đĩa thạch chứa CMC.
Trên đĩa thạch chứa CMC, đĩa thạch được nhuộm congo red sẽ có màu đỏ. Khi
CMC bị thủy phân bởi hoạt tính endoglucanase, thuốc nhuộm congo red được

giải phóng và tạo vòng phân giải trên đĩa thạch. Hoạt tính endoglucanase càng
mạnh khi vòng phân giải càng lớn.
Hút dung dịch protein B và protein A được tính toán sao cho lượng protein
khoảng 30µg vào giếng trên thạch chứa CMC và xác định vòng phân giải CMC
sau 24 giờ. Kết quả vòng phân giải CMC trình bày trong bảng 3.4. và hình 3.5.:

62


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC
Chủng

Dịch protein B

Dịch protein A

DM5-1

30mm

28mm

DM7-1

23mm

22mm

DR5-1

28mm

24mm

DM8-1

30 mm

29mm

DT2-1

26mm

26mm

TQ1-2

29mm

27mm

Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2
Chú thích:
TQ1-2’: Protein B của chủng TQ1-2
TQ1-2: Protein A của chủng TQ1-2

C.Sbu: dung dịch protein đối chứng âm của chủng C.Sbu

Vòng phân giải CMC của các chủng từ 22-30mm. Hai chủng DM5-1 và
DM8-1 có vòng phân giải của dung dịch protein B lớn nhất 30mm nhưng chỉ có
hoạt tính cellulase tổng số tương ứng là 0.057 và 0.051 UI/ml dịch nuôi cấy.
Chủng DM7-1 có vòng phân giải nhỏ nhất 23mm nhưng lại có hoạt tính cellulase
tổng số lớn hơn hai chủng DM5-1 và DM8-1 là 0.061 UI/ml dịch nuôi cấy. Chủng
TQ1-2 có hoạt tính cellulase tổng số cao nhất nhưng không phải là chủng có hoạt
tính endoglucanase cao nhất. Hoạt tính endoglucanase không tỷ lệ thuận với hoạt
63


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

tính enzyme cellulase tổng số. Các hệ cellulase khác nhau sẽ có những thành phần
tỷ lệ các loại enzym khác nhau. Hai chủng DM5-1 và DM8-1 có hoạt
endoglucanase trong hệ cellulase cao hơn các chủng còn lại.
Lượng protein nạp vào trong giếng giống nhau nên giếng có vòng phân giải
CMC lớn sẽ có hoạt tính endoglucanase lớn hơn. Trong cùng một chủng, dung
dịch protein B luôn có vòng phân giải lớn một chút so với protein A. Có thể các
endoglucanase này được gắn trên màng tế bào và giải phóng ra ngoài môi trường
khi xử lý với cellulosome lysis buffer.
3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide
3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC
Phương pháp SDS-PAGE có thể phân tách thành phần protein và phát hiện
hoạt tính endoglucanase trên gel polyacrylamide. Hoạt tính enzyme được phát hiện
khi loại bỏ SDS và hồi tính protein. Khả năng tạo vạch phân giải CMC trên gel
polyacrylamide phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hoạt tính enzyme, nồng độ protein,

thời gian thủy phân. Do đó, khảo sát hoạt tính endoglucanase thủy giải CMC trên
gel polyacrylamide của các chủng khảo sát, lượng protein tối ưu cho khả năng
thủy phân CMC cần được xác định.
Dung dịch protein B của chủng TQ1-2 sử dụng trong thử nghiệm được pha
loãng 1, 2, 4, 8 lần bằng đệm PBS buffer. Lượng protein tương ứng với các giếng
là: 59.7µg, 29.9µg, 14.9µg, 7.5µg. Thời gian phản ứng được cố định trong 24 giờ.
Kết quả xác định lượng protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC trên gel
polyacrylamide được trình bày trong hình 3.6.:

64


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau
của dung dịch Protein B chủng TQ1-2
Chú thích:
1, 2, 3, 4: dung dịch protein B được pha loãng lần lượt 8, 4, 2, 1 lần tương ứng
với lượng protein 7.5µg, 14.9µg, 29.9µg, 59.7µg
DC+: đối chứng dương, mẫu cellulase A của công ty AMANO

Kết quả điện di cho thấy, lượng protein 7.5µg pha loãng 8 lần không thấy
vạch phân giải CMC trên gel, độ pha loãng 4 lần chỉ cho thấy 1 vạch trong tổng số
2 vạch được thấy ở hai nồng độ pha loãng còn lại là 1, 2 lần, tương ứng với hàm
lượng 59.7µg, 29.9µg.
o Giếng 1 có lượng protein 7.5µg: lượng protein này rất thấp nên hoạt
tính endoglucanase thấp chúng không có khả năng thủy giải CMC trên
gel sau 24 giờ.

o Giếng 2 có lượng protein 14.9µg: cao hơn giếng 1 cho thấy có 1
vạch phân giải CMC có trọng lượng phân tử khoảng 49093 Dalton nhưng
không cho thấy vạch phân giải có trọng lượng phân tử khoảng 84020
Dalton như trong giếng 3 và giếng 4. Chứng tỏ với lượng này vẫn chưa đủ
để thực hiện điện di.
o Hai giếng 3 và 4 có lượng tương ứng 29.9µg và 59.7µg: cho thấy rõ
2 vạch phân giải CMC có trọng lượng phân tử 84020 và 49093 Dalton.
Chứng tỏ hai nồng độ này phù hợp với khả năng tạo vạch phân giải trên
CMC sau 24 giờ. Tuy nhiên, vạch phân giải tại giếng 4 hơi rộng, do đó nếu
hai vạch enzyme endoglucanase kề nhau sẽ rất khó được phân biệt.
65


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Vì vậy, lượng protein khoảng 30µg trong mẫu điện di sẽ được áp dụng cho
phần điện di SDS-PAGE của các chủng ở phần sau.
3.3.6.2.

Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A

Hai dung dịch protein B và protein A của các chủng được dùng điện di
SDS-PAGE, cùng với dịch enzyme đối chứng âm của chủng C.Sbu và dịch enzym
cellulase A của công ty AMANO. Gel polyacrylamide sau khi điện di sẽ được
nhuộm với thuốc nhuộm coomassie blue và xác định trọng lượng phân tử của các
protein có trong dung dịch mẫu. Các dung dịch điện di được tính toán có hàm
lượng khoảng 30µg trong mẫu điện di phù hợp với kết quả được xác định ở trên.
Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.7a. và 3.7b.:

Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE của các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1

Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE của các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2
66


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Chú thích :
TC: thang chuẩn protein
DM5-1', DM7-1', DR5-1', DM8-1', DT2-1', TQ1-2': dung dịch protein B
DM5-1, DM7-1, DR5-1, DM8-1, DT2-1, TQ1-2: dung dịch protein A
C.Sbu: mẫu enzyme của chủng C.Sbu đối chứng âm
DC+: đối chứng dương, mẫu enzyme cellulase A của công ty AMANO

Để xác định trọng lượng phân tử protein có trong mẫu, phương trình hồi qui
tuyến tính liên quan giữa giá trị Rf và lg(trọng lượng phân tử) của các protein
trong thang chuẩn được xây dựng và trình bày theo đường chuẩn sau:
Sự Tương Quan Giữa Lg(Trọng Lượng Phân Tử) Các Protein Trong Thang Chuẩn
Với Rf
L g(T rọng L ư ợng P hân T ử )

5.20
5.00

y = -0.9609x + 5.0342

4.80

R = 0.9873

2

4.60
4.40
4.20
4.00
0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

Rf

Biểu đồ 3.5. Tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với Rf
Chú thích:
Y: Lg(trọng lượng phân tử)
X : là Rf, tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển
của thuốc nhuộm bromophenol blue

Kết quả xây dựng phương trình hồi qui tuyến tính liên quan giữa giá trị Rf
và lg(trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn đã cho thấy trọng
lượng phân tử của các vạch protein của các mẫu khảo sát được xác định theo
phương trình : y= -0.9609x + 5.0342.
Kết quả điện di các dung dịch protein có nhiều vạch tương ứng với các kích
thước khác nhau. Mỗi mẫu điện di có trọng lượng phân tử tập trung chủ yếu ở

67


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

50000-85000 Dalton. Trọng lượng phân tử của các vạch được trình bày trong bảng
3.5.:
Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE
Vi khuẩn
DM5-1'
DM5-1

DM7-1'
DM7-1
DR5-1'
DR5-1
DM8-1'
DM8-1
DT2-1'
DT2-1
TQ1-2'
TQ1-2

92377
92377
89503
89503
86718
86718
86718
86718
95344
95344
84020
84020

71738
71738
74041
71738
71738
67343

67343
69506
69506
71738

Trọng lượng phân tử Daltons
67343 53976 46086 30557
67343 53976 46086 30557
65248 44652 40612 25279
65248 44652 40612 25279
59345 53976 28685 22276
59345 53976 28685 22276
63218 57499 53976 49093
63218 57499 53976 49093
67343 63218 30557 25279
67343 63218 30557 25279
67343 61251 49093 26090
67343 61251 49093 26090

24492 22276
24492 22276
13434

41917 20261
41917 20261

21583 17299
21583 17299

số vạch

8
8
6
4
5
5
8
8
5
5
8
7

Hai mẫu điện di protein B và protein A của cùng một chủng có nhiều vạch
tương ứng giống nhau. Tuy nhiên, mẫu protein B xuất hiện một số vạch mà mẫu
protein A không thấy xuất hiện. Các chủng DM5-1, DR5-1 và DM8-1, DT2-1 có
các vạch trong hai mẫu protein B và protein A giống nhau, còn các chủng còn lại
có sự khác biệt giữa hai mẫu protein này tại một số vạch.
Chủng DM7-1, dung dịch protein B có nhiều hơn hai vạch so với dung dịch
protein A có trọng lượng phân tử 74041 và 13434 Dalton và chủng TQ1-2 là vạch
71738 Dalton. Cho thấy các vạch protein này được xuất hiện khi được xử lý với
cellulosome lysis buffer chứng tỏ các vạch này xuất hiện có thể tồn tại chủ yếu
trên màng tế bào khi nuôi cấy 20 ngày.
Tổng số vạch protein của các chủng khảo sát là tương đối thấp 4-8 vạch.
Chủng C. thermocellum khi được nuôi cấy trong môi trường có avicel là nguồn cơ
chấty duy nhất cho thấy hơn 20 vạch protein khi điện di trên SDS-PAGE (Edward
A. Bayer, 1985). Có thể do một số protein có trong mẫu dung dịch điện di quá nhỏ
nên không biểu hiện một số vạch trên gel polyacrylamide.
3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát
Dựa vào kết quả khảo sát nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy

68


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

giải CMC ở trên. Các dung dịch điện di được tính toán có hàm lượng khoảng
30µg trong mẫu điện di phù hợp với kết quả được xác định. Thực hiện điện di
SDS-PAGE các chủng khảo sát và xác định vạch thủy giải CMC với mẫu đối
chứng âm là dịch enzyme nuôi cấy C.Sbu và đối chứng dương là chế phẩm
cellulase A của công ty AMANO. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.8a.
và 3.8b.:

Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A
chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1

Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A
chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2

69


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Chú thích :
DM5-1', DM7-1', DR5-1', DM8-1', DT2-1', TQ1-2': các mẫu enzym được xử lý

dung dịch cellulosome lysis buffer (protein B)
DM5-1, DM7-1, DR5-1, DM8-1, DT2-1, TQ1-2: các mẫu enzym không được xử lý
dung dịch cellulosome lysis buffer (protein A)
C.Sbu: mẫu enzyme của chủng đối chứng âm
DC+: đối chứng dương, mẫu enzyme cellulase A của công ty AMANO

Dung dịch protein đối chứng âm C.Sbu không thấy vạch phân giải và mẫu
protein đối chứng dương cho thấy vạch phân giải CMC. Trên cả 6 chủng khảo sát
ta thấy đều xuất hiện những vạch thủy phân CMC với nhiều kích thước khác nhau.
Chủng TQ1-2 xuất hiện 2 vạch thủy giải CMC có trọng lượng phân tử 84020 và
49093 Dalton tương ứng với vạch có cùng kích thước trong phần trên. Tương tự,
dựa vào đường chuẩn trên ta xác định được kích thước các vạch phân thủy giải
CMC và được trình bày trong Bảng 3.6.:
Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử vạch protein phân giải CMC trên gel
Chủng vi khuẩn
DM5-1'
DM5-1
DM7-1'
DM7-1
DR5-1'
DR5-1
DM8-1'
DM8-1
DT2-1'
DT2-1
TQ1-2'
TQ1-2

Trọng lượng phân tử Daltons
53976

46086
53976
46086
44652
44652
59345
59345
57499
53976
57499
53976
67343
67343
84020
49093
84020
49093

Số vạch
2
2
1
1
1
1
2
2
1
1
2

2

.

Tất cả các chủng đều có hoạt tính endoglucanase phân giải CMC trên gel
polyacrylamide. Trong đó, các chủng DM5-1, DM8-1, TQ1-2 có 2 vạch thủy giải
CMC. Các dung dịch protein A đều có những vạch phân giải CMC tương tự
những dung dịch protein B trong cùng 1 chủng. Cho thấy, các enzyme có hoạt tính
endoglucanase đều được tạo ra từ sớm trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Sau 20
ngày nuôi cấy, các endoglucanase này tồn tại một phần lớn tự do trong môi trường
PCS. Các endoglucanase được tạo ra sớm trong quá trình nuôi cấy trên môi trường

70


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

PCS để phá vỡ cấu trúc vô định hình của cơ chất cellulose giấy lọc, tạo ra những
đoạn oligosaccharide ngắn hơn. Sau đó các đoạn oligosaccharide được thủy phân
tiếp theo bởi hoạt tính exoglucanase và β-glucosidase tạo thành đường đơn sử
dụng cho sự phát triển.
Tuy nhiên vạch phân giải của dung dịch protein A thường mờ hơn so với
dung dịch protein B cho thấy vẫn có một ít enzyme endoglucanase trên màng tế
bào, phù hợp với kết quả khảo sát bán định lượng hoạt tính endoglucanase ở trên.

3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase
Đối với các chủng vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase, các protein của
cellulosome được tiết ra ngoại bào và được gắn kết trên bề mặt tế bào.

Cellulosome gắn vào bề mặt tế bào trong suốt pha lag, bắt đầu được phóng thích
vào môi trường trong pha tăng trưởng, và tồn tại tự do trong môi trường hoặc gắn
vào cellulose trong pha ổn định. Do đó thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến số
lượng cellulase trong môi trường nuôi cấy.
Tác động của thời gian nuôi cấy lên sự sản xuất cellulase được xác định
bằng cách nuôi cấy các chủng vi khuẩn tại nhiệt độ 60oC trong môi trường PCS và
xác định hoạt tính cellulase sau 4, 8, 12, 16 và 20 ngày nuôi cấy. Dịch nuôi cấy
được xử lý dung dịch cellulosome lysis buffer trong 30 phút, lắc nhẹ trên máy lắc
và lọc qua giấy lọc. Phần dịch được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 2 phút loại bỏ
tủa, thu dịch lỏng. Phần dịch được tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm
13000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tủa và hòa tan trong đệm PBS buffer. Kết
quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính của enzym cellulase
được trình bày trong biểu đồ 3.6.:

71


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Ảnh Hưởng Của Thời Gian Nuôi Cấy Lên Khả Năng Sinh Cellulase
0.09

Hoạt Tính Enzym UI/ml

0.08
0.07

C.Sbu

0.06

DM5-1

0.05

DM7-1
DR5-1

0.04

DM8-1

0.03

DT2-1
TQ1-2

0.02
0.01
0
4

8

12

16

20

Thời gian Nuôi Cấy (ngày)

Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính của enzym
Hoạt tính cellulase tổng số gia tăng theo thời gian nuôi cấy. Thời gian nuôi
cấy càng lâu hoạt tính enzyme càng lớn. Các chủng DM7-1, DT2-1, TQ1-2 hoạt
tính vẫn gia tăng sau 20 ngày nuôi cấy chứng tỏ các chủng đang tồn tại ở pha tăng
trưởng, còn có khả năng sản xuất enzyme cellulase. Các chủng còn lại có hoạt tính
enzyme cao nhất tại thời gian nuôi cấy 16 ngày và có xu hướng giảm nhẹ sau thời
điểm này, cho thấy có thể đang vào giai đoạn suy tàn của quá trình phát triển, một
số chất biến dưỡng cuối cùng có thể được tạo ra làm kìm hãm sự phát triển. Hai
chủng có hoạt tính enzyme cao nhất sau 20 ngày nuôi cấy là:
o Chủng DR5-1 có hoạt tính enzyme cellulase tăng nhanh sau thời gian
nuôi cấy 4 ngày và đạt hoạt tính cao nhất tại thời điểm 16 ngày nuôi cấy.
Sau 16 ngày nuôi cấy hoạt tính bắt đầu giảm nhẹ.
o Chủng TQ1-2 có hoạt tính enzyme cellulase tăng nhanh ngay sau khi
được nuôi cấy và và hoạt tính vẫn tăng tại thời điểm khảo sát sau 20 ngày
nuôi cấy.
Hoạt tính enzyme vẫn gia tăng sau thời gian nuôi cấy dài, trong 16 ngày đối
với các chủng DM5-1, DM8-1, DR5-1 và hơn 20 ngày đối với các chủng DM7-1,
DT2-1, TQ1-2. Cho thấy các chủng vi khuẩn kị khí có khả năng phát triển chậm
hơn các chủng vi khuẩn sản xuất cellulase trước đây: Bacillus pumilus EB3 (H.
Ariffin và cộng sự, 2006), Bacillus subtilis (Trần Thị Ánh Tuyết và cộng sự,
2010). Chủng vi khuẩn hiếu khí Bacillus pumilus EB3 và Bacillus subtilis có khả
72


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

năng tạo enzyme cellulase tối ưu tại thời gian nuôi cấy lần lượt sau 48 và 32 giờ
nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy dài của các chủng vi khuẩn kị khí có nhiều thuận lợi
trong việc lên men và thu nhận một số sản phẩm lên men cuối cùng như ethanol.
3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase
3.5.1. Nhiệt độ tối ưu
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzym. Khi nhiệt độ gia
tăng trong một giới hạn sẽ hoạt hóa các phản ứng xúc tác enzym, nhưng nếu nhiệt
độ quá cao thì làm biến tính và mất hoạt tính enzym. Do đó cần tìm được nhiệt độ
tối ưu của enzym để áp dụng phù hợp nhằm gia tăng hoạt tính tối ưu của nó.
Để xác định nhiệt độ hoạt động tối ưu tác động lên hoạt tính cellulase tổng
số, enzym cellulase sẽ được tiến hành phản ứng trong các nhiệt độ khác nhau từ
30, 40, 50, 60, 70, 80oC tại pH 5. Dung dịch protein B được pha loãng 10 lần và
sử dụng cho thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính
của enzym cellulase được trình bày trong biểu đồ 3.7.:
Ảnh Hưởng Của Nhiệt Độ Lên Hoạt Tính Của Enzym
0.09

Hoạt Tính Enzym UI/ml

0.08
0.07

C.Sbu

0.06

DM5-1

0.05

DM7-1
DR5-1

0.04

DM8-1

0.03

DT2-1
TQ1-2

0.02
0.01
0
30

40

50 Nhiệt Độ 60

70

80

Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính cellylase
Hoạt tính enzyme cellulase tổng số của các chủng khảo sát cao nhất tại
khoảng nhiệt độ 50-70oC, tại nhiệt độ 30oC hoạt tính enzyme rất thấp. Hoạt tính

của enzyme giảm nhanh chóng tại 80oC. Hai chủng DM8-1 và DT2-1 có hoạt tính

73


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

cao nhất tại 50oC còn các chủng còn lại đều đạt hoạt tính tối ưu khi nhiệt độ phản
ứng tại 60oC.
o Chủng DM8-1 có hoạt tính enzyme tăng nhanh từ 40-50oC cho thấy
hoạt tính enzyme của chủng này nhạy cảm với nhiệt độ.
o Chủng DM5-1 có hoạt tính enzyme hầu như không thay đổi trong
khoảng nhiệt độ 50-70oC cho thấy khả năng bền nhiệt cao.
o Chủng TQ1-2 có hoạt tính enzyme cao nhất tại nhiệt độ 60oC và cao
nhất trong số những chủng khảo sát đạt 0.0822UI/ml dịch nuôi cấy.
Các chủng vi khuẩn này có khả năng tạo ra hệ enzyme chịu được nhiệt độ
cao. Khả năng chịu được nhiệt độ cao của hệ enzyme là một thuận lợi cho lên men
ethanol trong công nghiệp.
3.5.2. pH tối ưu
Các vi khuẩn trong nhóm kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase được hiện diện rộng
rãi ở trong môi trường. Chúng có thể tồn tại ở trong nhiều điều kiện pH khác nhau.
Sự tác động của pH ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của enzym cellulase. Hoạt tính
enzyme cellulase sẽ bị ảnh hưởng khi thay đổi pH hoạt động. Giá trị pH thuận lợi
nhất - là điểm mà enzyme hoạt động tốt nhất - được gọi là độ pH tối ưu.
Tác động của pH môi trường lên hoạt tính của enzym cellulase được xác
định bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch đệm với các pH 4, 5, 6 của đệm
citrate và 7, 8, 9 của đệm Tris-HCl tại nhiệt độ 5 0 o C . Dung dịch protein B được
pha loãng 10 lần và sử dụng cho thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH

lên hoạt tính của enzym cellulase được trình bày trong biểu đồ 3.8.:

74


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Ảnh Hưởng pH Lên Hoạt Tính Enzym
0.09

Hoạt Tính UI/ml

0.08
0.07

C.Sbu

0.06

DM5-1

0.05

DM7-1
DR5-1

0.04

DM8-1

0.03

DT2-1

0.02

TQ1-2

0.01
0
pH4

pH5

pH6

pH

pH7

pH8

pH9

Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính cellulase
Kết quả khảo sát cho thấy khoảng pH tối ưu cho hoạt tính enzyme cellulase
nằm trong khoảng pH 5-6. Hai chủng DM7-1 và DM8-1 có pH tối ưu tại 5 còn các
chủng còn lại có pH tối ưu tại 6. Hoạt tính enzyme giảm nhanh chóng khi pH lớn

hơn 7, tại pH 9 hoạt tính enzyme rất thấp. Hoạt tính enzyme cellulase của các
chủng cao hơn khi đệm pH có tính acid hơn là đệm pH có tính kiềm. Chủng TQ1-2
có hoạt tính tăng nhanh khi pH từ 4-6, và hoạt tính enzyme cao nhất tại pH 6 và
cao nhất trong số những chủng khảo sát đạt 0.0816UI/ml.
Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo ra hệ enzyme chịu được pH có tính
acid. Đặc điểm này có thể thấy rằng các chủng có có thể tăng trưởng tốt khi trong
môi trường nuôi cấy có những chất biến dưỡng có tính chất acid.
3.6.

Định danh vi khuẩn

Vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase có nhiều nhu cầu dinh dưỡng và tăng
trưởng tương tự nhau vì thế thường khó cho việc định danh theo phương pháp sinh
hóa truyền thống. Hiện nay việc ứng dụng sinh học phân tử nhằm định danh các vi
khuẩn ngày càng phổ biến. Do tính bảo tồn cao của vùng gen DNA ribosome mã
hóa cho tiểu phần 16S nên các đoạn gen trong vùng này thường sử dụng cho việc
định danh.

75


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng
cho vi khuẩn Clostridium
Vi khuẩn kị khí sinh cellulase thường chủ yếu thuộc nhóm Clostridiales kị
khí và được phân bố chủ yếu thuộc 3 giống chính Clostridium, Ruminococcus và
Caldicellulosiruptor. Tuy nhiên, với khả năng sống được ở nhiệt độ cao và có khả

năng tạo bào tử các chủng này thuộc chủ yếu ở giống Clostridium. Vì vậy, để định
danh nhanh các chủng vi khuẩn này, cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos1205-A-21 đặc trưng cho giống Clostridium được sử dụng cho phản ứng PCR. Cặp
mồi này cho phép khuếch đại một đoạn rDNA 16S của vi khuẩn thuộc giống
Clostridium nhưng không khuếch đại những chủng thuộc giống khác. Sản phẩm
khuếch đại của cặp mồi này có kích thước 619 bp. Chủng vi khuẩn C.Sbu được
dùng làm chủng đối chứng dương và chủng E.Coli được dùng làm chủng đối
chứng âm. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.9.

Hình 3.9. Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21
Chú thích:
TC: Thang chuẩn
E.coli: đối chứng âm
C.Sbu: đối chứng dương

76


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18

Hoàng Nguyên

Từ kết quả điện di cho thấy các chủng DR5-1 và TQ1-2 có vạch tương ứng
với gen mục tiêu có kích thước khoảng 619 bp, tương tự như chủng đối chứng
dương C.Sbu. Còn các chủng DM5-1, DM7-1, DM8-1 và DT2-1 cho kết quả âm
tính, tương tự như chủng đối chứng âm E.Coli. Chứng tỏ chủng DR5-1 và TQ1-2
thuộc giống Clostridium và các chủng còn lại DM5-1, DM7-1, DM8-1 và DT2-1
không thuộc giống Clostridium. Tuy nhiên, việc định danh này lại không cho định
danh chính xác loài hoặc phân loài các chủng đang khảo sát nên tôi tiếp tục thực
hiện việc định danh dựa trên việc giải trình tự và xây dựng cây phân loại loài bằng
cặp mồi universal.

3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại
Để xây dựng cây phân loại loài, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi
universal (Shuichi Karita và cộng sự, 2003). Cặp mồi này cho phép khuếch đại gần
như toàn bộ đoạn rDNA 16S của vi khuẩn. Sản phẩm khuếch đại của cặp mồi này
có kích thước 1526 bp. Chủng vi khuẩn C.Sbu được dùng làm chủng đối chứng
dương. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.10.:

Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal

77