Hóa phân tích Đại cương về sắc ký

Đại Cương Về Sắc Ký

(Chromatography)
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Đại Cương Về Sắc Ký
Mục tiêu
- Trình bày được đònh nghóa sắc ký, các giai đoạn của quá trình
sắc ký, phân loại sắc ký, hai yếu tố chủ yếu quyết đònh quá trình
tách sắc ký, nguyên tắc của sắc ký hấp phụ, phân bố, trao đổi ion,
rây phân tử, ái lực

- Giải thích được ý nghóa của các thông số sắc ký
- Ứng dụng được cách đònh tính, đònh lượng bằng phương pháp sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Đại Cương Về Sắc Ký
Dàn bài
-

Lòch sử - Đònh nghóa

-

Quá trình sắc ký

-

Phân loại các phương pháp sắc ký

-

Sự tách sắc ký và sắc ký đồ

-

Các thông số đặc trưng của sắc ký

-

Ứng dụng của sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Lòch sử - Đònh nghóa
 1906: Mikhail Tswett – sắc ký lỏng

hấp phụ trên cột

Ether dầu hỏa
Sắc tố
TV

 1938: Izmailov & Schraiber – xây
dựng phương pháp SKLM
Chlorophyl
Xanthophyl

CaCO3

 1958: Stahl – hoàn thiện phương
pháp SKLM

 1941: Martin & Synge – đặt nền tảng
cho sắc ký phân bố: SKG và SKK
 1952: Martin & James – bài báo đầu
tiên về SKK

 Cuối năm 1960: sắc ký lỏng cao áp
ra đời
 1937 – 1972: 12 giải Nobel về sắc ký

 Đầu năm 2005: sắc ký lỏng siêu áp

t0
Nguyễn Đức Tuấn

t1

 2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu năng
Đại học Y Dược TPHCM


Lòch sử - Đònh nghóa
 Qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dòch chuyển
khác nhau về động lực học của chúng trong một hệ thống hai hay nhiều
pha. Một trong các pha này chuyển động một cách liên tục theo một hướng
nhất đònh và trong pha này các chất riêng biệt thể hiện linh độ khác nhau là
do có sự khác nhau về phân bố, hấp phụ, điện tích, kích thước phân tử, độ
hòa tan và áp suất hơi
 Sắc ký đòi hỏi hai pha:
 Pha động: lỏng, khí, lỏng siêu tới hạn
 Pha tónh: cố đònh trong cột hay trên bề mặt chất mang rắn trơ hóa học
 Chất rắn hay chất lỏng được tẩm, hấp phụ hay liên kết hóa học
chất mang
 Tương tác với chất tan theo các cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, ái lực
 Phương pháp sắc ký được áp dụng trong các ngành khoa học khác nhau
 Ngành Dược: nghiên cứu, phân tích, kiểm nghiệm thuốc
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Hợp chất B

Hợp chất A

A
B


Quá trình sắc ký
 Đưa hỗn hợp lên pha tónh
 Khai triển sắc ký

F

 Sắc ký khai triển

X

 Sắc ký rửa giải:

A

 Quá trình rửa giải
 Dung môi rửa giải (eluent)

O

x

x

x

 Dung dòch rửa giải (eluate)
 Phát hiện các chất
 Màu của chất

 Đèn tử ngoại

Mẫu

 Phun thuốc thử
 Đầu dò (detector)
Nguyễn Đức Tuấn

Triển khai sắc ký
Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại các phương pháp sắc ký
 Theo bản chất vật lý các pha
Tên kỹ thuật

Pha tónh

Loại cân bằng

Sắc ký lỏng (liquid
chromatography): pha
động là chất lỏng

- Chất lỏng được hấp
phụ trên 1 chất rắn
(chất mang)
- Pha liên kết
- Chất rắn

- Phân bố giữa hai pha
lỏng
- Phân bố giữa pha lỏng và
bề mặt pha liên kết
- Hấp phụ

Sắc ký khí (gas
chromatography, GC):
pha động là chất khí

- Chất lỏng được hấp - Phân bố giữa pha khí và
phụ trên chất rắn
pha lỏng
- Pha liên kết
- Phân bố giữa pha khí và
pha liên kết
- Chất rắn
- Hấp phụ

Sắc ký lỏng siêu tới
hạn (supercritical fluid
chromatography, SFC):
pha động là chất lỏng
siêu tới hạn

- Pha liên kết

Nguyễn Đức Tuấn

- Phân bố giữa pha lỏng
siêu tới hạn và pha liên kết

Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại các phương pháp sắc ký
 Theo phương cách cho pha động đi qua pha tónh
 Sắc ký khai triển
 Sắc ký rửa giải
 Theo phương cách lưu giữ pha tónh
 Sắc ký cột
 Sắc ký lớp mỏng

 Sắc ký giấy

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại các phương pháp sắc ký
 Theo bản chất của quá trình sắc ký
 Sắc ký hấp phụ

 Sắc ký rây phân tử

 Sắc ký phân bố

 Sắc ký ái lực

 Sắc ký trao đổi ion

 Sắc ký cặp ion

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Phân loại các phương pháp sắc ký
 Thông thường
 Sắc ký cột (Column Chromatography, CC)

 Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)
 Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)
 Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC)
 Sắc ký lỏng siêu “hiệu năng” (Ultra Performance Liquid
Chromatography, UPLC), UHPLC hoặc UFLC (Ultra Fast
Liquid Chromatography)

 Sắc ký hội tụ siêu “hiệu năng” (Ultra Performance
Convergence Chromatography, UPCC, UPC2)

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – Phân bố
Chất phân tích
hòa tan trong
pha tónh lỏng
bao trên bề
mặt chất mang
rắn trơ

S1 (pha 1)

Chất
mang
rắn

Nguyễn Đức Tuấn

<====>

S2 (pha 2)

[S ]
K  2 K: hệ số phân bố
[S ]
1

KD
Pha
tónh

K

C


C

B
A

KD: hệ số phân bố
biểu kiến

Chất
phân
tích

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – Hấp phụ
Chất tan hấp
phụ trên bề
mặt pha tónh

S2 + nM1  S1 + nM2

[ S1 ][ M 2 ]n
K
[ S 2 ][ M 1 ]n

S2
S1
M2
M1

: phân tử chất tan trong pha động
: phân tử chất tan bò hấp phụ
: phân tử pha động
: phân tử pha động bò hấp phụ
: bề mặt hoạt động của pha tónh

n: số mol pha động bò thay thế từ bề mặt

- Pha động luôn chạy theo một chiều nhất đònh nên luôn xảy ra quá trình
hấp phụ và phản hấp phụ
- Các chất tan sẽ bò kéo theo pha động và có ái lực khác nhau với pha tónh
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – Trao đổi ion
Pha tónh là các chất trao đổi ion. Gồm 2 loại:
 Nhựa trao đổi cation (cationit):
Cationit acid mạnh -SO3-H+

Cationit acid yếu -COO-H+
 Nhựa trao đổi anion (anionit):
Anionit base mạnh -N(CH3)3+OHAnionit base yếu -NH3+OHTiến trình trao đổi:

(Mx+

và

Ax-:

Cation: xRSO3-H+ + Mx+
Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax-

Điện tích
cố đònh

Ion
phân
tích

ion chất tan)

Ionit

Ion trái
dấu

Quá trình trao đổi ion

(RSO3-)xMx+ + xH+

[RN(CH3)3+]xAx-+ xOH-

- Pha động thường là các dung dòch đệm có pH và chất điện ly thích hợp.
- Pha động có thêm một số dung môi hữu cơ như MeOH, EtOH,…để làm
tăng độ hòa tan hay độ chọn lọc cho chất tan  các ion chất tan cạnh
tranh trên mạng ion
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – Trao đổi ion

Sử dụng nhựa trao đổi ion để khử khống nước

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – Rây phân tử
- Ở trạng thái cân bằng: Cs  Cm
Cs, Cm: nồng độ chất tan trong pha tónh và pha động
Hệ số K được tính theo phương trình:

Cs VR Vm
K

Vs
Cm

Trong đó:
Vm: tổng thể tích của pha động nằm trong các lỗ xốp
của các hạt pha tónh
VS: thể tích dung môi giữa các lỗ
VR: thể tích bò lưu giữ của chất tan
- Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel.
- Dùng trong sinh hóa để tách các protein, các carbohydrat,…

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Cơ chế tách – i lực
- Mới và có tính chọn lọc cao
- Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa một
loại phân tử chất tan với một phân tử thứ
hai liên kết cộng hóa trò với pha tónh
Ví dụ: phân tử liên kết cộng hóa trò với
pha tónh là một kháng thể của một
protein. Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn
protein qua cột, chỉ có một pretein phản
ứng với kháng thể được giữ lại trên cột,
các protein còn lại được rửa khỏi cột.
Protein bò giữ lại trên cột sẽ được tách ra
khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH
hay nồng độ ion trong pha động.
Nguyễn Đức Tuấn

Một phân
tương tác
phân tử liên
cộng hóa trò
pha tónh

tử
với
kết
với

Các phân tử
khác được rửa
khỏi cột

Sắc ký ái lực

Đại học Y Dược TPHCM


Quá trình tách sắc ký

AB
A

t1

B

Nồng độ

chất tan tại
các dãi A và
B trên cột

t2
Hai cách
tách hai chất
xen phủ

Sự tách sắc ký và
sắc ký đồ
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Các thông số đặc trưng trong sắc ký

Để tách sắc ký được tốt:
 Tốc độ di chuyển của các
chất tan
 Hiện tượng giãn pic
 Pic hẹp và cân đối

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Tốc độ di chuyển của các chất

 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng
Vò trí các vết trên sắc ký đồ có thể xác đònh nhờ chỉ số Rf (Retardation factor)

dR
v
Rf 

d M V0

===>

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển, nằm
tại điểm xuất phát
- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của
dung môi
- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách
- dM: khoảng di chuyển được của dung môi
- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách
- V0: vận tốc di chuyển của dung môi
Nguyễn Đức Tuấn

Đường
dung
môi

0  Rf  1

dM

dR

x x
1 2
Đại học Y Dược TPHCM


Tốc độ di chuyển của các chất
 Sắc ký khí và sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thời gian lưu tR (phút): thời gian cần thiết để một chất di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ
lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic).
 tM (hoặc to): thời gian lưu của
một chất không bò lưu giữ, còn
gọi là thời gian chết của cột.
 tR càng lớn, chất tan bò lưu giữ
càng mạnh và tốc độ di chuyển
của nó càng nhỏ.
 Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R được
tính theo công thức:
t'R = tR - tM (hay t'R = tR - to)
Nguyễn Đức Tuấn

Thể tích chết của cột (mL)
vM  0,5 x 10-3 x L x d2

L: chiều dài cột (mm)
d: đường kính trong của cột (mm)
Đại học Y Dược TPHCM

Máy HPLC
1

8

6
9

10

7
2

3

11

4

12
5

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

9.
10.
11.
12.
13.
14.

detector
18

17

15

16

14

13

15.
16.
17.
18.

Nguyễn Đức Tuấn

Nguồn heli
Bình dung môi
Đầu phun

Đầu lọc
Van tỷ lệ dung môi
Bơm
Van kiểm tra vào
Van kiểm tra ra
Khử xung
Đầu thải
Van xả
Mồi bơm
Lọc dung môi
Điều hòa áp suất
ngược
Chuyển đổi áp suất
Van tiêm mẫu
Cột bảo vệ + cột
sắc ký
Tới detector.

Đại học Y Dược TPHCM


Tốc độ di chuyển của các chất
Thời gian lưu
t’R = tR – tM
Diện tích pic, chiều cao pic
Hệ số dung lượng k’
tR = tM (1 + k’)
k’: bản chất các pha, chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột
2 < k’ < 10 (có thể chấp nhận đến 1 < k’ < 20)

K B k ' B t ' R,B


Hệ số chọn lọc  =
K A k ' A t ' R, A
B lưu giữ mạnh hơn A nên  > 1
1,05 <  < 2,00

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Hình dạng pic – Sự bất đối của pic

Đường cong phân bố
chuẩn Gaussian

Hệ số đối xứng AF 

BC
AC

(0,8 < AF < 1,5)

BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở
1/10 chiều cao của pic.
AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở
1/10 chiều cao của pic.
Hệ số kéo đuôi As  AC  BC (1/20 chiều cao)

2 AC
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Hình dạng pic – Sự bất đối của pic

BC
Hệ số đối xứng AF 
AC

Nguyễn Đức Tuấn

(0,8 < AF < 1,5)

Đại học Y Dược TPHCM