Bài giảng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)


SẮC KÝ

2


MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC
2. Trình bày được cấu tạo của máy HPLC
3. Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc
ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái
lực và sắc ký huỳnh quang.
4. Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC.

3


SẮC KÝ
Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất
thành các chất riêng.
Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di
chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh
hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động).

4


SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

•

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm
1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc ký cột cổ
điển.

•

HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng và
pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn,
hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với các nhóm
chức HC

5


Carbohydrates
1.
2.
3.
4.
5.
6.

fructose
Glucose
Saccharose
Palatinose
Trehalulose

isomaltose
5

2

Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm)
70/30 Acetonitrile/Water

3

mAU

4

1

6

1 mL/min Detect=Refractive Index
time

6


Separations
Injector

Separation in based upon differential
migration between the stationary and
mobile phases.

Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica

Mixer

Mobile Phase - carries the sample
through the stationary phase as it
moves through the column.

Pumps

Column

Detector

Solvents

Waste

High Performance Liquid Chromatograph
7


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

High Performance Liquid Chromatograph
8


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

9


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

10


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

11

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

12


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

13


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

14


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

15


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

16

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

17


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

18


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

19


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

20


Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

21

Separations
Injector

Mixer

Chromatogram

mAU

Pumps

Start Injection

time

Column

Detector

Solvents

22


Separations
Tiêm

mAU

Bơm

Bắt đầu tiêm mẫu

Thời gian

Cột

Detector

Dung môi

23


The Chromatogram

tR

tR
mAU

Vùng diện tích (chiều cao)
để định lượng

to
Tiêm

Thời gian
24

Tại sao lại dùng HPLC
• Phân tích đồng thời
• Độ phân giải cao
• Độ nhạy cao
• Tính lặp lại tốt
• Điều kiện phân tích trung bình
• Dễ phân đoạn và tinh khiết
• Không độc hại

25