định lượng tolperison hydrochlorid trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (951.24 KB, 45 trang )
LỜI CẢM ƠN
Những dòng đầu tiên của bản luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc đối với PGS. TS Thái Nguyễn Hùng Thu người đã giao đề tài, tận tình
hướng dẫn em rất nhiều trong những năm học tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Đoàn Cao Sơn - Viện trưởng Viện kiểm
nghiệm thuốc Trung ương, chị Lục Thị Vân phó phòng Hóa Lý II cùng toàn
thể các anh chị tại phòng Hóa Lý II đã đồng hướng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng.
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong bộ môn hóa phân tích
đã nhiệt tình giảng dạy và hướng dẫn em trong suốt thời gian học tập tại
trường.
Cuối cùng, em xin chân thành gửi cảm ơn tới gia đình và các bạn đã luôn
đông viên giúp đỡ em hoàn thành bản luận văn này.
Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2011
Sinh viên
Vũ Thị Phượng
MỤC LỤC
!"##$%!&'()
*#$!+, (/)0()
123#456# (7)0(1)
/8#9989:;-6'-9<=>?'@5='#-'=>5/
A8>>BCD
%@E!F#'&!:GD
1G!?H! ?HIJ!%K!!='D
/8#LG9K#M,CG!B!HN
/
2OPQRPSTUV/
2OPQUV/
WXRYZ[/
+,#$!/
>\!L;/
1]RPSTUV^
1G>5%>E#"%^
1989>E#"%^
1_
AY`R`a_
1A`T2AbcAd_
1e,#f9,:Ggh#G!?F#I.()0(1)0(/)0(^)0(D)0(7)_
1e,#fLi#?+(D)j
11e,#f!H#:G5k(^)0(D)N
1l2[PSmcAd2no(D)0(_)
1Ap'?8!4:3#>B%
1Ap'?8!I'p!%@\4^
11Ap'?8!:G-39-&>D
1/Ap'?8!:G:q_
1^>i>&98!>Brsgh>i>&:;-6rs7
11V2[PQUtj
Kuv!wp,>Cx%!y!=E:z%#+hC-6:&!I'pj7{hC-6>!=E|05'
:+:&!}E%#%~gzhC-6#M,g>Evrj^{•N^{s!<'}E%#%~21
11ZRa1
/AYa11
/2€X11
RbA`1^
>\>B!1^
>\1^
DANH MỤC HÌNH
Hình1.1. Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2 Error: Reference source not
found
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo một hệ thống HPLC hoàn chỉnh Error: Reference
source not found
Hình 3.1. Sắc ký đồ với pha động đệm phosphats pH 3: acetonitril
(45:55) Error: Reference source not found
Hình 3.2. Sắc ký đồ với pha động có chứa natri laurylsulfat Error:
Reference source not found
Hình 3.3. Phổ hấp thụ UV – VIS của Tolperison Error: Reference source
not found
Hình 3.4. Sắc ký đồ của dung dịch mẫu tá dược Error: Reference source
not found
Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn Error: Reference source not found
Hình 3.6. Sắc ký đồ của mẫu thử tự tạo Error: Reference source not found
Hình 3.7. Đánh giá sự tương đồng giữa phổ chuẩn và thử Error:
Reference source not found
Hình 3.8. Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính Error: Reference source not
found
Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu thử Mydocam 50mg Error: Reference source
not found
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thử Myderison 50mg Error: Reference source
not found
!"##$%!&'()
*#$!+, (/)0()
123#456# (7)0(1)
16#:Gf#
18#5•gh##\
11‚:;
1^K!=fI>5ƒ1
1D!8#!%H#1
1_8#5•9•1
17>z%-6/
„…>-iw/
1j%8->z%/
/8#9989:;-6'-9<=>?'@5='#-'=>5/
/989#%~:G!='C >!=…I,()0(^)0(7)/
/989†%,9‡„(7)0(N)0()^
A8>>BCD
%@E!F#'&!:GD
1G!?H! ?HIJ!%K!!='D
1/B?H9ˆLH_
1…>>,-%_
11‰4#-%7
1/B?H5%-67
1^B?H#f-f#7
1D>B%-e##G!gh?H:Š, !%@\!j
1_2G9ˆ>p>rsj
17B?HL$!:H>u"wN
/8#LG9K#M,CG!B!HN
/Z‹#",9,:G
/ZC
/1B}ECCx%
//G!?F#I.
/^,:G
/D<!<#!'=1
/
2OPQRPSTUV/
2OPQUV/
WXRYZ[/
+,#$!/
>\!L;/
1]RPSTUV^
1G>5%>E#"%^
1€ˆ@5e#!=‹?F#I.^
1~C:;#!=‹?F#I.:|uˆ@5e^
11V5•9989:|uˆ@5e:‰:;-6'-9<=>?'@5='#-'=>5!='
g>Ev^
1989>E#"%^
1>E#"%:;4w^
1>E#"%:;-6wD
1_
AY`R`a_
1A`T2AbcAd_
1e,#f9,:Ggh#G!?F#I.()0(1)0(/)0(^)0(D)0(7)_
1e,#fLi#?+(D)j
11e,#f!H#:G5k(^)0(D)N
1l2[PSmcAd2no(D)0(_)
1Ap'?8!4:3#>B%
1Ap'?8!I'p!%@\4^
11Ap'?8!:G-39-&>D
1/Ap'?8!:G:q_
1^>i>&98!>Brsgh>i>&:;-6rs7
11V2[PQUtj
Kuv!wp,>Cx%!y!=E:z%#+hC-6:&!I'pj7{hC-6>!=E|05'
:+:&!}E%#%~gzhC-6#M,g>Evrj^{•N^{s!<'}E%#%~21
11ZRa1
/AYa11
/2€X11
RbA`1^
>\>B!1^
>\1^
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tolperison hydrochlorid là một thuốc rất quan trọng, được sử dụng đặc
biệt trong điều trị bệnh liên quan đến tăng trương lực cơ với biệt dược nổi
tiếng là Mydocalm. Toperison hydrochlorid có tác dụng làm bền vững màng
cục bộ nên ức chế phản xạ đơn synap và đa synap đồng thời ức chế dòng Ca
2+
nhập vào synap nên ức chế chất vận chuyển. Vì vậy Toperisin hydrochlorid
có tác dụng giảm trương lực cơ trong những bệnh về thần kinh thực vật, bệnh
co cứng cơ, chuột rút, mất tính tự điều khiển của tủy sống… Ngoài ra,
Tolperison hydrochlorid cải thiện tuần hoàn ngoại biên nên được dùng trong
điều trị các bệnh nghẽn mao mạch và bệnh gây bởi rối loạn thần kinh mao
mạch như: tắc do vữa xơ động mạch nghẽn, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn,
bệnh Raynaud, xơ cứng bì lan tỏa, xanh tím tái đầu chi, chứng khó đi do loạn
thần kinh - mạch từng cơn.
Tolperison hydrochhlorid không phải là một chất mới, đã được sử dụng
nhiều thập kỷ nay. Tuy nhiên cho đến thời điểm hiện nay Toperison
hydrochlorid chưa được đưa vào được điển các nước như: USP, EP, BP… và
cả DĐVN. Việc nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng (chỉ tiêu quan
trọng trong tiêu chuẩn chất lượng) để áp dụng trong kiểm tra chất lượng thuốc
là rất cần thiết. Từ thực tế trên, đề tài “Định lượng Tolperison hydrochlorid
trong viên nén bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”
được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng Tolperison hydrochlorid trong
viên nén bằng HPLC.
2. Triển khai áp dụng phương pháp trên một số chế phẩm viên nén để
kiểm chứng khả năng đáp ứng.
Đề tài này được phối hợp thực hiện tại Phòng kiểm nghiệm và bào chế -
Viện Kiệm thuốc Trung ương.
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ TOLPERISON HYDROCHLORID
1.1.1 Công thức cấu tạo [12]
O
CH
3
N
CH
3
H
•
HCl
Công thức: C
16
H
23
NO.HCl
Trọng lượng phân tử: M = 281,81
Tên khoa học:
(2RS)-2-Methyl- 1- (4-methylphenyl)- 3- piperidin-1-yl propan-1-one
monohydrochlorid
1.1.2 Tính chất hóa lý [4], [12]
Tolperison hydroclrorid tồn tại dạng bột kết tinh màu trắng, nhẹ, với mùi
đặc trưng, là chất hút ẩm.
Rất dễ hòa tan trong acid acetic (100), dễ tan trong nước và trong ethanol
(95), ít tan trong aceton và thực tế không hòa tan trong benzen hoặc ether.
pH dung dịch Tolperison.HCl (1/20) là 4,5 – 5,5
1.2.3 Đặc tính dược lý [8], [13]
1.1.3.1 Dược động học
Khi uống Tolperison được hấp thu tốt qua ruột non. Nồng độ đỉnh trong
huyết tương trong vòng 0,5 - 1 giờ sau khi dùng thuốc. Do có chuyển hóa
mạnh nên sinh khả dụng của chế phẩm này khoảng 20%. Tolperison được
1
chuyển hóa mạnh qua gan và thận. Hợp chất này được chuyển hóa qua thận
(hơn 90%) dưới dạng chất chuyển hóa. Hoạt tính dược lý của chất chuyển hóa
chưa được biết.
Thời gian bán thải sau khi tiên tĩnh mạch khoảng 1,5 giờ.
1.1.3.2 Tác dụng và cơ chế
Nhờ làm bền vững màng và gây tê cục bộ, Tolperison hydrochlorid ức
chế dẫn truyền trong các sợi thần kinh nguyên phát và các nơron vận động,
qua đó ức chế các phản xạ đơn synap và đa synap. Mặt khác, theo một cơ chế
thứ hai, qua ức chế dòng Ca
2+
nhập vào synap, người ta cho rằng chất này ức
chế chất vận chuyển. Trong thân não,Tolperison ức chế đường phản xạ lưới -
tủy sống. Trên các mô hình động vật khác nhau, chế phẩm này có thể làm
giảm trương lực đã tăng và sự co cứng sau khi mất não.
Tolperison hydrochlorid cải thiện tuần hoàn ngoại biên. Tác dụng làm dễ
dàng tuần hoàn không phụ thuộc vào những tác dụng gặp trong hệ thần kinh
trung ương, tác dụng này có liên quan đến tác dụng chống co thắt nhẹ và tác
dụng kháng adrenergic của Tolperison.
1.1.3.3 Chỉ định
Điều trị sự tăng trương lực cơ xương một cách bệnh lý trong các rối loạn
thần kinh thực thể (tổn thương bó tháp, xơ vữa nhiều chỗ, tai biến mạch máu
não, bệnh tủy sống, bệnh viêm não tủy…).
Tăng trương lực cơ, co thắt cơ và các co thắt kèm theo các bệnh lý về
vận động (ví dụ: thoái hóa đốt sống, thấp khớp sống, các hội chứng thắt lưng
và cổ, bệnh khớp của các khớp lớn). Phục hồi chức năng sau các phẫu thuật
chấn thương chỉnh hình.
Điều trị các bệnh nghẽn mạch (vữa xơ động mạch, bệnh mạch máu do
tiểu đường, viêm mạch tạo huyết khối nghẽn, bệnh Raynaud, xơ cứng bì lan
2
tỏa) cũng như hội chứng xuất hiện trên cơ sở suy giảm sự phân bố thần kinh –
mạch (xanh tím tái đầu chi, chứng khó đi do loạn thần kinh - mạch từng cơn)
Bệnh Little và các bệnh kèm theo loạn trương lực cơ là những chỉ định
nhi khoa đặc biệt của thuốc này.
1.1.3.4 Chống chỉ định
Nhạy cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc, người bị nhược cơ năng.
Vì thiếu các kết quả nghiên cứu thích hợp nên chống chỉ định dùng thuốc tiêm
Tolperison hydroclorid cho trẻ em.
Chống chỉ định tương đối: Mang thai, đặc biệt trong 3 tháng đầu của thai
kỳ. Không nên dùng Tolperison hydrochlorid trong thời kì cho con bú.
1.1.3.5 Thận trọng khi dùng
Với các liều thấp hàng ngày nên dùng Tolperison hydrochlorid viên nén
bao phin 50mg để điều trị cho trẻ em, phụ nữ có thai và cho con bú. Vì chưa
có các dữ kiện lâm sàng thích hợp, không nên dùng Tolperison hydrochlorid
cho người mang thai (đặc biệt trong 3 tháng đầu), trừ khi tác dụng có lợi cho
mẹ vượt hẳn bất kỳ độc tính với phôi có thể có. Tương tự, việc Tolperison có
bài tiết qua sữa mẹ hay không cũng chưa được xác định nên không dùng
Tolperison hydrochlorid trong thời kỳ cho con bú.
1.1.3.6 Tương tác thuốc
Chưa biết rõ tương tác thuốc làm hạn chế sử dụng Tolperison
hydrochlorid. Mặc dù Tolperison là một hợp chất tác dụng trung ương, nhưng
không gây buồn ngủ nên có thể dùng kết hợp với thuốc ngủ, thuốc an thần
kinh. Tolperison làm tăng mạnh tác dụng của acid nifluminic, vì vậy, khi
dùng đồng thời nên giảm liều acid nifluminic.
1.1.3.7 Tác dụng phụ
Nhược cơ, nhức đầu, hạ huyết áp, buồn nôn, nôn đau bụng. Những tác
3
dụng ngoại ý này thường biến mất khi giảm liều. Hiếm khi xảy ra phản ứng quá
mẫn (ngứa, hồng ban, mề đay, phù dây thần kinh mạch, sốc phản vệ, khó thở).
1.1.3.8 Liều lượng
- Người lớn:
Dùng đường uống: liều hàng ngày là 150 – 450mg, được chia làm 3 phần
bằng nhau tùy theo nhu cầu uống và dung nạp thuốc của người bệnh.
Dùng đường tiêm: tiêm bắp với liều 100mg x 2 lần/ngày hay liều đơn
100mg/ngày, nếu tiêm tĩnh mạch chậm.
- Trẻ em:
Thuốc tiêm không dùng cho trẻ em. Nếu dùng các viên nén bao phim,
trẻ em dưới 6 tuổi có thể uống với liều 5mg/kg thể trọng/ngày, những liều
này được chia thành 3 phần bằng nhau. Trong nhóm tuổi 6 -14, liều dùng
hàng ngày là 2-4mg/kg thể trọng, những liều này cũng được chia thành 3
phần bằng nhau.
1.1.3.9 Quá liều
Những trường hợp quá liều Tolperison hydrochlorid rất hiếm. Tolperison
hydrochlorid có giới hạn điều trị rộng và trong y văn ngay cả dùng liều uống
600mg cho trẻ em cũng không gây những triệu trứng nhiễm độc trầm trọng
nào. Có gặp hiện tượng kích ứng sau khi điều trị trẻ em với liều uống 600mg.
Trong những nghiên cứu độc tính cấp tiền lâm sàng, thì liều cao Tolperison có
thể gây thất điều, co giật cứng run, khó thở, liệt hô hấp.
Tolperison hydrochlorid không có thuốc giải độc đặc hiệu. Nếu gặp quá
liều nên hỗ trợ và điều trị triệu trứng.
1.1.4 Các phương pháp định lượng Tolperison hydrochlorid
1.1.4.1 Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan [1], [5], [8]
Trong phân tử Tolperison chứa nhóm amin bậc 3 nên có tính base yếu.
4
Vì vậy chúng ta có thể định lượng Tolperison hydrochlorid bằng phương pháp
chuẩn độ trong môi trường khan: hòa tan 0,5g Tolperison hydroclorid trong
70ml hỗn hợp anhydrid acetic – acid acetic (7:3), đem chuẩn độ bằng acid
percloric 0,1mol/l với chỉ thị tím tinh thể.
Phương pháp này không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, dung môi hóa
chất đắt tiền, thực hiện dễ dàng và cũng khá nhanh, có thể thực hiện ở tất cả
các phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, phương pháp này có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố làm
thay đổi kết quả do ảnh hưởng của tạp chất liên quan và thành phần tá dược.
Vì vậy, phương pháp này chỉ sử dụng để định lượng các nguyên liệu.
1.1.4.2 Phương pháp quang phổ UV-VIS [8], [10], [11].
Phương pháp này dựa trên định luật Lambert – Beer, độ hấp thụ của
dung dịch một chất tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày của dung dịch đem đo.
Phổ hấp thụ UV – VIS của 5mg Tolperison hydrochlorid trong 500ml ethanol
95
0
có độ hấp thụ riêng tại 257nm trong khoảng 555 – 585. Do đó ta có thể
dựa vào phổ hấp thụ UV- VIS của Tolperisone hydrochlorid trong ethanol có
cực đại hấp thụ tại bước sóng 257nm để định lượng.
Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS cũng có ưu điểm thực hiện
nhanh, dễ dàng, không đòi hỏi trang thiết bị hóa chất đắt tiền, có thể thực hiện
tại tất cả các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này độ chính xác
không cao do ảnh hưởng của tạp chất liên quan và các thành phần tá dược. Vì
vậy, phương pháp này ít được áp dụng cho định lượng chế phẩm mà chủ yếu
chỉ sử dụng để định lượng các hoạt chất trong phép thử độ hòa tan của viên
nén và viên nang.
Dựa trên những ưu điểm của phương pháp HPLC và những phân tích ở
trên nên tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng Tolperison
hydrochlorid bằng phương pháp HPLC.
5
1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) [5], [6]
1.2.1 Khái niệm
HPLC (High performent liquid chromatography) là kỹ thuật phân tích
dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ
dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao.
1.2.2 Nguyên tắc hoạt động
Pha cố định hay còn gọi là pha tĩnh có thể là chất rắn mang lỗ, chất rắn
phân chia dưới dạng hạt mịn, chất lỏng bao trên bề mặt chất rắn hoặc chất rắn
đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Yêu cầu phải có kích thước
càng bé, càng đồng dạng càng tốt để có diện tích bề mặt lớn.
Pha động có thể là một chất lỏng (dưới dạng tinh khiết hay dung dịch),
một chất khí (dưới dạng tinh khiết hay hỗn hợp đồng dạng) hay một chất lưu
siêu giới hạn.
Pha cố định là nền và pha tĩnh di chuyển xuyên qua hoặc trên bề mặt
của pha cố định. Ái lực tương đối của các chất tan đối với từng pha có tính
thuận nghịch nhằn đảm bảo sự di chuyển khối lượng của có thể xảy ra trong
quá trình phân tách sắc ký. Do có sự khác nhau về phân bố, hấp thụ, hòa tan,
về áp suất hơi, kích thước phân tử, mật độ điện tích ion… nên các chất tan có
độ linh động khác nhau trong hệ thống do đó chúng được tách rời nhau.
1.2.3 Một số thông số kỹ thuật trong HPLC
Kết quả quá trình phân tách các chất được detector phát hiện thành sắc
ký đồ như hình vẽ:
6
Hóa chất 1 Hóa chất 2
Thời
gian
Tín hiệu
Pic dung môi
Hình1.1. Giản đồ sắc ký hai chất 1 và 2.
Từ các thông số của các pic trên đây, nhiều thông số đặc trưng về lý
thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một thông
số thường dùng trong thực tế.
1.2.3.4 Hệ số phân bố
Hệ số phân bố là tỷ số giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và nồng độ
của nó trong pha động.
Trong đó: K: Hệ số phân bố
C
s
: Nồng độ chất tan trong pha tĩnh
C
M
: Nồng độ chất tan trong pha động
1.2.3.2 Thời gian lưu
Thời gian lưu (t
R
) của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến
khi xuất hiện giá trị cực đại của chất tan trên sắc kí đồ.
Thời gian chết (t
o
) là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký.
Thời gian lưu thực (t’
R
) = t
R
– t
o.
Thời gian lưu thực phụ thuộc vào bản
chất pha tĩnh, bản chất, thành phần, tốc độ, pH pha động, cấu tạo và bản chất
phân tử chất tan,
7
1.2.3.3 Thể tích lưu
Thể tích lưu (V
R
) của một chất tan là thể tích của lượng pha động bị đẩy
ra khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan
trên sắc ký đồ.
Trong đó:
V
R
: Thể tích lưu
t
R
: Thời gian lưu
F: Lưu lượng pha động
Thể tích lưu lý tưởng là thể tích lưu của một chất tan không bị giữ lại bởi
pha tĩnh. Trên thực tế thể tích lưu lý tưởng là tổng cộng pha động tính từ lúc
tiêm mẫu đến khi ra khỏi hệ thống.
1.2.3.4 Hệ số dung lượng
Hệ số dung lượng (k’) là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh là lượng
chất tan trong pha động:
Trong đó:
V
S
và V
M
: Thể tích pha tĩnh và thể tích pha động
Q
S
và Q
M
: Lượng chất trong pha tĩnh và trong pha động
Cần chọn cột, pha động, phân tử chất tan, pH sao cho k’ nằm trong
khoảng từ 1- 5 là tốt nhất. Nếu k’ > 5 thì thời gian phân tích sẽ kéo dài hơn,
đỉnh pic bị dãn rộng và độ nhạy tín hiệu thấp. Nếu k’ bé thì chất phân tách bị
rửa giải ở thời điểm gần với thời điểm bơm mẫu nên khả năng tách không tốt.
1.2.3.5 Hệ số chọn lọc
Hệ số chọn lọc (α) là một biểu hiện về mức độ tách giữa hai đỉnh.
)'k'(k
tt
tt
'k
'k
α
12
0R,1
0R,2
1
2
>
−
−
==
8
Để tách riêng 2 chất thường chọn α từ 1,05 đến 2,0. Lưu ý, nếu chỉ dựa
và hiệu lực tách đơn thuần chúng ta không biết được hiệu lực tách của quá
trình sắc ký.
1.2.3.6 Hiệu lực cột và số đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột là thông số về hiệu suất phân tích của cột, được biểu hiện thông
qua số đĩa lý thuyết (N). Trong đó số đĩa lý thuyết được tính theo công thức :
2
1/2
R
2
b
R
t
5,54
t
16N
=
=
ww
Trong đó:
w
b
: Độ rộng đáy pic
w
1/2
: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic
Khi số đĩa lý thuyết N càng lớn hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp).
N
max
= 4000. L/d
p
Trong đó:
L : Chiều dài cột
d
p
: Đường kính tiểu phân tính bằng micromet.
Số đĩa lý thuyết phụ thuộc đường kính và độ hấp thụ của pha tĩnh, tốc độ
và độ nhớt của pha động, hệ số khuếch tán của các chất trong cột.
1.2.3.7 Độ phân giải ( R )
Hệ số phân giải thể hiện hai yếu tố:
- Độ nhọn của đỉnh
- Khoảng cách giữa các đỉnh
( ) ( )
1/2,21/2,1
R,1R,2
b,2b,1
R,1R,2
tt 1,177tt 2
R
wwww
+
−
=
+
−
=
Vì độ nhọn của đỉnh phụ thuộc hiệu lực cột, khoảng cách giữa các đỉnh
phụ thuộc hiệu lực dung môi. Dó đó hệ số phân giải cũng thể hiện mối quan
hệ giữa hiệu lực cột và hiệu lực dung môi trên sắc ký đồ.
Độ phân giải phụ thuộc hệ số dung lượng k, độ chọn loc α và số đĩa lý
thuyết theo phương trình:
9
Yêu cầu để hai chất tách nhau là R > 1.
1.2.3.8 Hệ số bất đối xứng:
Hệ số bất đối xứng A
S
thường được dùng để đánh giá sự cân đối của pic.
Trong đó:
W
1/20
: Độ rộng đỉnh ở 1/20 chiều cao.
f: Khoảng cách từ chân đường cao của đỉnh đến chân trước của đỉnh ở
1/20 chiều cao.
Đỉnh cân xứng tuyệt đối khi A
s
= 1. Thông thường, trị số A
s
chấp nhận
trong khoảng 0,8 – 1,5.
1.2.4 Các bộ phận của một hệ thống HPLC
10
2
2
k'1
k'
x
1
x
4
N
R
+
−
=
α
α
Bộ
phận
phát
hiện
Hệ thống
gradient
Buồng
điều
nhiệt
Bình
chứa
dung
môi
Lọc
&
khử
khí
Hệ
thống
bơm
Các bộ phận
điều biến cảm
ứng dòng chảy
Bộ
phận
tiêm
Cột
sắc ký
Thiết bị
xử lý
dữ liệu
Bộ phận
ghi
Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo một hệ thống HPLC hoàn chỉnh
1.2.4.1 Bình chứa pha động
Đơn giản nhất là bình làm bằng thủy tinh, có nắp và gắn với một ống
bằng polytetrafluoroetylen để dẫn pha động từ bình chứa đến bơm.
Điều quan trọng là chất lỏng vào bơm không được chứa bụi hoặc các tiểu
phân khác vì chúng có thể can thiệp vào hoạt động và gây tổn hại cho bơm và
cột. Vì vậy, pha động cần phải được lọc trước khi vào bơm. Điều này có thể
thực hiện bởi một lọc thép không rỉ được nhấn khít vào bề mặt của ống
polytetrafluorolen đặt trong bình chứa hoặc có thể dùng lọc trực tiếp. Kích
thước đường kính lọc sử dụng thông thường là 2μm.
Khí hòa tan nếu còn sót lại trong dung môi sẽ làm cho thời gian lưu của
pic thay đổi, gây tác động lạ cho bộ phận phát hiện và nặng có thể gây ngừng
bơm. Trên thực tế một số phương pháp khử khí đã được áp dụng trong hoặc
trước khi cho vào bình chứa.
1.2.4.2 Bơm
Mục đích để bơm pha động vào cột nhằm thực hiện quá trình chia tách
sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 – 6000 psi hoặc 250 –
500 at. Lưu lượng bơm từ 0,1 – 10ml/phút, và có thể thay đổi tốc độ dòng một
cách dễ dàng. Phải tạo ra dòng chảy liên tục, sự chảy dung môi không tạo ra
các xung (hoặc có bộ phận đệm xung). Đồng thời bơm phải không bị ăn mòn
bởi các thành phần pha động, tháo nắp dễ dàng.
11
1.2.4.3 Hệ tiêm mẫu
Có nhiều cách đưa mẫu vào cột như tiêm mẫu trực tiếp bằng ống tiêm
hoặc phương pháp chảy gián đoạn, cả hai phương pháp đều đơn giản ít tốn
kém, tiện lợi nhưng có khuyết điểm là độ lặp lại không cao. Ngày nay người ta
thường sử dụng van tiêm (valve – loop injector) có vòng chứa mẫu, có dung
tích xác định và chính xác, có thể thay đổi dòng với các dung tích khác nhau.
Các máy HPLC hiện nay đều sử dụng van tiêm tự động hoặc bán tự động.
1.2.4.4 Cột sắc ký
Cột sắc ký hay cột chứa pha tĩnh thường làm bằng thép không rỉ, chiều
dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong từ 1 – 10mm, hạt nhồi cột cỡ 5 -
10μm (ngoài ra còn có một số trường hợp dặc biệt về kích thước hạt và kích
cỡ hạt…). Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc Silicagel
đã được silan hóa hoặc được bao một chất lỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra
người ta còn dùng các hạt khác như nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion.
Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc
thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt thêm bộ phận điều nhiệt (Oven
column).
1.2.4.5 Pha động
Ái lực của một chất với pha tĩnh được điều khiển bằng độ phân cực của
pha động. Pha động có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp và có thể thay đổi
độ phân cực bằng cách thay đổi tỷ lệ thành phần dung môi trong hỗn hợp.
Dựa vào pha động và pha tĩnh người ta phân loại ra thành:
- Pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động ít phân cực.
- Pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực.
Trong kiểm nghiệm pha sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng nhiều nhất
vì khả năng tách cao, thực hiện dễ dàng, nhanh hơn và tính lặp lại cao hơn sắc
12
ký phân bố pha thuận.
1.2.4.6 Detector
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu
ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của
các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải
thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.
A = k.C
Trong đó:
A: Là tín hiệu đo được
C: Nồng độ chất phân tích
k: Hằng số thực nghiệm của detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ
điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết xuất…
13
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là viên nén có chứa Tolperison hydrocholorid.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các chế phẩm sau:
- Viên nén Mydocalm 50mg: Geneon Richter Pharma, Hungary sản xuất,
do Geneon Richter Việt Nam phân phối.
- Viên nén Myderison 50mg: Meditop Pharma, Hungary sản xuất, do
Egis Pharma phân phối.
2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1 Hóa chất
- Chất chuẩn: Tolperison hydrochlorid dạng bột hàm lượng 99,20%, độ
ẩm 0,10%. (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
- Dung môi tinh khiết dùng cho sắc ký: acetonitril, nước, dung dịch đệm
phosphat pH = 3 (pha theo DĐVN IV).
- Natri laurylsunphat tinh khiết.
- Các tá dược thường dùng cho viên nén như: lactose, titan dioxyd,
magnesi stearat, avicel, bột Talc, tinh bột ngô (đạt tiêu chuẩn DĐVN IV)
- HPMC (tiêu chuẩn USP 30)
- PEG 600 (tiêu chuẩn BP 2009).
2.2.2 Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao SHIMARDZU LC – 20A serises
- Cột sắc ký
- Máy đo pH 632 pH – Metter Mettrohm
- Máy lắc siêu âm Branson 5210
- Thiết bị lọc hút chân không Millipore M15 – 047 – 05
14
- Cân kỹ thuật Mettler PE 1600
- Cân phân tích Mettler Toledo 245
- Các dụng cụ: pipet, bình định mức, bình nón, phễu lọc… đạt yêu cầu
dùng cho kiểm nghiệm thuốc.
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nội dung nghiên cứu
2.3.1.1 Xây dựng chương trình sắc ký
- Chọn cột sắc ký.
- Lưa chọn pha động.
- Lựa chọn bước sóng thích hợp.
2.3.1.2 Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng
- Tính đặc hiệu.
- Độ lặp lại của hệ thống và phương pháp.
- Độ đúng.
- Độ tuyến tính.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
2.3.1.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Tolperison
Hydrochlorid trong viên nén.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành thực nghiệm trên hệ thống HPLC để tìm ra điều kiện sắc ký
thích hợp, sau đó xử lý thống kê các kết quả thu được.
2.3.2.1 Nghiên cứu định tính:
- Dựa vào thời gian lưu: So sánh thời gian lưu của pic trên mẫu thử và
pic trên mẫu chuẩn.
- Kết hợp với phổ hấp thụ UV- VIS thu được nhờ DAD: so sánh phổ hấp
thụ của pic trên mẫu thử với pic mẫu chuẩn, chồng phổ và tính hệ số Match.
15
2.3.2.2 Nghiên cứu định lượng:
Dựa vào kết quả định tính để đánh giá sự có mặt của Tolperison
hydrochlorid và dựa vào tín hiệu từ pic chuẩn và thử (diện tích hoặc chiều cao
pic) trong một điều kiện sắc ký đã xác định là cơ sở của phép định lượng. Từ
đó dựa vào nồng độ dung dịch chuẩn để xác định nồng độ Tolperison
hydrochlorid trong mẫu thử.
Một số công thức toán thống kê được sử dụng:
Giá trị trung
bình
:
∑
=
=
n
1i
i
x
n
1
X
Độ lệch chuẩn :
( )
1n
xx
S
n
1i
2
i
−
−
=
∑
=
Sai số chuẩn :
n
S
S
X
=
Sai số thông kê :
nS/
XX
t
0
−
=
Sai số tương đối :
100% .
X
t . S
%
X α
ε
=
Trong đó :
Xi : Kết quả xác định của lần thứ n
N : Số lần xác định
t
α
: Chỉ số student
16
